Tarayıcınızda JavaScript şu anda devre dışı bırakılmış durumda. JavaScript devre dışı bırakıldığında bu web sitesinin bazı özellikleri çalışmayacaktır.
Lütfen bilgilerinizi ve ilgilendiğiniz ilacı belirterek kayıt olun; biz de verdiğiniz bilgileri kapsamlı veri tabanımızdaki makalelerle eşleştirip size en kısa sürede PDF kopyasını e-posta ile göndereceğiz.
Oyuncular Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Katanya Üniversitesi Klinik ve Deneysel Tıp Bölümü, Catania, 95123, İtalya;2 Deneysel Onkoloji ve Hematoloji Merkezi, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, İtalya; 3 Tıbbi Onkoloji, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, İtalya; 4 Tıbbi Genetik, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, İtalya; 5 Tıp Genetiği, ASP, Syracuse, 96100, İtalya; 6 Biyomedikal ve Biyoteknoloji Bilimleri Bölümü, Catania Üniversitesi, Tıp Genetiği, Catania, İtalya, 95123; 7 Oasi Araştırma Enstitüsü-IRCCS, Troina, 94018, İtalya İletişim: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-posta [email protected]; [email protected] Amaç: BRCA1 ve BRCA2'deki germ hattı mutasyonları ve yerleşik meme kanseri (BC), yumurtalık kanseri (OC) ve diğer kanser türleri, yaşam boyu kanser riskiyle ilişkilidir. BRCA geni için test, bireysel riski değerlendirmek, sağlıklı taşıyıcılarda önleme yöntemleri bulmak ve kanser hastalarında tedavileri kişiselleştirmek için çok önemlidir. BRCA1 ve BRCA2 değişikliklerinin yaygınlığı coğrafi bölgeler arasında büyük farklılıklar göstermektedir ve Sicilya ailelerinde BRCA patojenik varyantları hakkında veriler mevcut olsa da, özellikle Doğu Sicilya'daki popülasyonları hedef alan çalışmalar eksiktir. Çalışmamızın amacı, Doğu Sicilya'dan bir BC hasta kohortunda BRCA patojenik germ hattı değişikliklerinin insidansını ve dağılımını araştırmak ve yeni nesil sekanslama kullanarak bunların belirli BC özellikleri ile ilişkisini değerlendirmektir. Değişikliklerin varlığı, tümör derecesi ve proliferasyon indeksi ile korelasyon göstermiştir. SONUÇLAR: Genel olarak, 35 hastada (%9) BRCA patojenik varyantı bulunmuştur; bunların 17'sinde (%49) BRCA1 ve 18'inde (%51) BRCA2 mevcuttur. BRCA1 değişiklikleri BRCA1 mutasyonları, üçlü negatif meme kanseri hastalarında daha yaygınken, BRCA2 mutasyonları luminal meme kanseri hastalarında daha yaygındır. BRCA1 varyantı taşıyan bireyler, taşımayanlara kıyasla anlamlı derecede daha yüksek tümör derecesine ve proliferasyon indeksine sahipti. Sonuçlar: Bulgularımız, Doğu Sicilya'daki meme kanseri hastalarında BRCA mutasyon durumuna genel bir bakış sağlamakta ve kalıtsal meme kanseri olan hastaların belirlenmesinde NGS analizinin rolünü doğrulamaktadır. Genel olarak, bu veriler, mutasyon taşıyıcılarında kanserin uygun şekilde önlenmesi ve tedavisi için BRCA taramasını destekleyen önceki kanıtlarla tutarlıdır.
Meme kanseri (MK), dünya çapında en yaygın malignite ve kadınlarda en ölümcül kanserdir.¹ MK prognozunu ve klinik davranışını belirleyen biyolojik özellikler zaman içinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve kısmen aydınlatılmıştır. Aslında, MK'yi farklı moleküler alt tiplere ayırmak için şu anda çeşitli dolaylı belirteçler kullanılmaktadır. Bunlar östrojen (ER) ve/veya progesteron reseptörü (PgR), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2) amplifikasyonu, proliferasyon indeksi Ki-67 ve tümör derecesidir (G).² Bu değişkenlerin kombinasyonu aşağıdaki MK kategorilerini belirlemiştir: 1) ER ve/veya PgR ekspresyonu gösteren Luminal tümörler, MK'lerin %75'ini oluşturmaktadır. Bu tümörler, Ki-67 %20'nin altında ve HER2 negatif olduğunda Luminal A ve Ki-67 %20'ye eşit veya üzerinde olduğunda ve proliferasyon indeksinden bağımsız olarak HER2 amplifikasyonu mevcut olduğunda Luminal B olarak daha da ayrılmıştır; 2) ER ve PgR negatif olup HER2 amplifikasyonu gösteren HER2+ tümörler. Bu grup tüm meme tümörlerinin %10'unu oluşturur; 3) ER ve PgR ekspresyonu ve HER2 amplifikasyonu göstermeyen üçlü negatif meme kanseri (TNBC), meme kanserlerinin yaklaşık %15'ini oluşturur.2-4
Bu meme kanseri alt tipleri arasında, tümör derecesi ve proliferasyon indeksi, tümör agresifliği ve prognozu ile doğrudan ve bağımsız olarak ilişkili olan kesitsel biyobelirteçleri temsil etmektedir.5,6
Yukarıda bahsedilen biyolojik özelliklere ek olarak, meme kanseri gelişimine yol açan kalıtsal genetik değişikliklerin rolü son birkaç yıldır giderek daha önemli hale gelmiştir.7 Meme tümörlerinin yaklaşık 10'da 1'i, belirli genlerdeki germ hattı değişiklikleri nedeniyle kalıtsaldır.8 Son zamanlarda 180.000'den fazla kadını içeren iki büyük epidemiyolojik çalışma, kalıtsal meme kanserinden öncelikle sorumlu olan sekiz gen grubunu (yani ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C ve RAD51D) tanımlamıştır. Bu genler arasında BRCA1 ve BRCA2 (bundan sonra BRCA1/2 olarak anılacaktır) meme tümörlerinin gelişimiyle en güçlü korelasyonu göstermiştir.9-12 Aslında, germ hattı BRCA1/2 mutasyonları, meme kanseri ve yumurtalık, prostat, pankreas, kolorektal ve melanom dahil olmak üzere diğer malignitelerin yaşam boyu riskini önemli ölçüde artırmaktadır. 13 ila 80 yaşları arasında kümülatif risk... BRCA1 patojenik varyantı (PV) olan kadınlarda meme kanseri görülme sıklığı %72, BRCA2 PV'si olan kadınlarda ise %69'dur.14
Özellikle yakın zamanda yayınlanan bir çalışma, meme kanseri riskinin PV tipine bağlı olduğunu öne sürmektedir. Aslında, patojenik kesici varyantlarla karşılaştırıldığında, özellikle BRCA1 genindeki belirgin yanlış anlamlı varyantlar, özellikle yaşlı kadınlarda meme kanseri riskinde azalmayla ilişkilidir.15
BRCA1 veya BRCA2 PV varlığı, farklı biyolojik ve klinikopatolojik özelliklerle ilişkilendirilmiştir.16,17 BRCA1 ile ilişkili meme kanserleri klinik olarak agresif, kötü diferansiye ve yüksek proliferatif olma eğilimindedir. Bu tümörler genellikle üçlü negatiftir ve erken yaşta ortaya çıkar. BRCA2 mutasyonlu hastalarda görülen tümörler tipik olarak orta ila iyi diferansiye dereceler ve değişken proliferatif indeksler sergiler. Bu tümörler B lümeninde daha yaygındır ve genellikle yaşlı yetişkinlerde görülür.16-18 Özellikle, BRCA1 ve BRCA2'deki mutasyonlar, platin tuzları ve poli(ADP-riboz) polimeraz inhibitörleri (PARPi) gibi hedefli ilaçlar da dahil olmak üzere belirli tedavilere duyarlılığı artırır.19,20
Son birkaç yıldır, klinik uygulamada yeni nesil sekanslamanın (NGS) uygulanması, BRCA1/2 dahil olmak üzere kanser yatkınlığı sendromları için moleküler testlerden geçen meme kanseri hastalarının sayısının artmasını sağlamıştır.21 Eş zamanlı olarak, BRCA1/2 testi için uygun bireyleri daha iyi belirlemek amacıyla aile öyküsü, demografik ve klinikopatolojik özelliklere ilişkin kesin kriterlere dayalı tanımlamalar yapılmaktadır.22,23 Bu bağlamda, belirli popülasyonlarda BRCA1/2 taramasına ilişkin kanıtlar birikmekte ve coğrafi bölgeler arasında farklılıklar vurgulanmaktadır.24–27 Batı Sicilya'daki meme kanseri kohortuna ilişkin raporlar mevcut olsa da, Doğu Sicilya popülasyonunda BRCA1/2 taramasına ilişkin daha az veri bulunmaktadır.28,29
Burada, Doğu Sicilya'daki meme kanseri hastalarında germ hattı BRCA1/2 taramasının sonuçlarını açıklıyoruz ve BRCA1 veya BRCA2 mutasyonlarının varlığını bu tümörlerin başlıca klinikopatolojik özellikleriyle ilişkilendiriyoruz.
Catania'daki Rodolico – San Marco Poliklinik Hastanesi'ndeki "Deneysel Onkoloji ve Hematoloji Merkezi"nde retrospektif bir çalışma yürütüldü. Ocak 2017 ile Mart 2021 tarihleri ​​arasında, meme ve yumurtalık, melanom, pankreas veya prostat kanseri olan toplam 455 hasta, BRCA/2 genetik testi için moleküler tanı laboratuvarımıza yönlendirildi. Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütüldü ve tüm katılımcılar moleküler analizden önce yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.
Meme kanserinin histolojik ve biyolojik özellikleri (ER, PgR, HER2 durumu, Ki-67 ve evre) sadece agresif tümör bileşenleri dikkate alınarak, iğne biyopsisi veya cerrahi örnekler üzerinde değerlendirildi. Bu özelliklere dayanarak, meme kanserleri şu şekilde sınıflandırıldı: luminal A (ER+ ve/veya PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminal B (ER+ ve/veya PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminal B-HER2+ (ER ve/veya PgR+, HER2+), HER2+ (ER ve PgR-, HER2+) veya üçlü negatif (ER ve PgR-, HER2-).
BRCA1 ve BRCA2 mutasyon durumunu değerlendirmeden önce, onkolog, genetikçi ve psikologdan oluşan multidisipliner bir ekip, her hasta için BRCA1 ve/veya BRCA1 varlığını veya BRCA2 geninde yüksek PV riski taşıyan bireyleri belirlemek üzere tümör genetiği konsültasyonu gerçekleştirdi. Hasta seçimi, İtalyan Tıbbi Onkoloji Derneği (AIOM) kılavuzlarına ve yerel Sicilya önerilerine göre yapıldı.30,31 Bu kriterler şunları içerir: (i) duyarlılık genlerinde (örneğin, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN) bilinen patojenik varyantların aile öyküsü; (ii) meme kanseri olan erkekler; (iii) meme kanseri ve yumurtalık kanseri olanlar; (iv) 36 yaşından küçük meme kanseri, 60 yaşından küçük üçlü negatif meme kanseri veya 50 yaşından küçük iki taraflı meme kanseri olan kadınlar; (v) 50 yaşından küçük meme kanseri ve en az bir birinci derece akrabada şu özelliklerin kişisel tıbbi öyküsü: (a) 50 yaşından küçük meme kanseri; (b) herhangi bir yaşta mukozal olmayan ve sınırda olmayan yumurtalık kanseri; (c) iki taraflı meme kanseri; (d) erkek meme kanseri; (e) pankreas kanseri; (f) prostat kanseri; (vi) 50 yaş üstü iki veya daha fazla kişisel meme kanseri öyküsü ve birbirleriyle birinci derece akraba olan akrabalarda meme kanseri, yumurtalık kanseri veya pankreas kanseri aile öyküsü (kendisiyle birinci derece akraba olan akrabalar dahil); (vii) Kişisel yumurtalık kanseri öyküsü ve en az bir birinci derece akraba: (a) 50 yaş altı meme kanseri; (b) yumurtalık kanseri yok; (c) iki taraflı meme kanseri; (d) erkek meme kanseri; (vii) yüksek dereceli seröz yumurtalık kanseri olan kadın.
Her hastadan 20 mL periferik kan örneği alındı ​​ve EDTA tüplerine (BD Biosciences) toplandı. Genomik DNA, üreticinin talimatlarına göre QIAsymphony DSP DNA Midi kit İzolasyon Kiti (QIAGEN, Hilden, İtalya) kullanılarak 0,7 mL tam kan örneğinden izole edildi ve Qubit® 3.0 Fluorometre (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) cihazından geçirilerek kantifikasyonu gerçekleştirildi. Hedef zenginleştirme ve kütüphane hazırlığı, üreticinin talimatlarına göre otomatik kütüphane hazırlığı için Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kitine yüklenmeye hazır hale getirilmiş Oncomine™ BRCA Research Assay Chef tarafından gerçekleştirilir. Kit, tüm BRCA1 (NM_007300.3) ve BRCA2 (NM_000059.3) genlerini incelemek için kullanılabilen iki çoklu PCR primer havuzundan oluşmaktadır. Kısaca, seyreltilmiş her bir örnek DNA'dan (10 ng) 15 µL, kütüphane hazırlığı için barkodlu plakalara eklendi ve tüm reaktifler ve sarf malzemeleri Ion Chef™ cihazına yüklendi. Daha sonra, Ion Chef™ cihazında otomatik kütüphane hazırlığı ve barkodlu örnek kütüphane havuzlama işlemi gerçekleştirildi. Hazırlanan kütüphane sayısı daha sonra üreticinin talimatlarına göre bir Qubit® 3.0 Fluorometre (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) ile değerlendirildi. Son olarak, kütüphaneler Ion Chef™ kütüphane örneğinde eşit molar oranlarda birleştirildi. Barkodlu tüpler, Ion Chef™ cihazına yüklendi. Dizileme, Ion 510 Çipi (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak bir Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) cihazı (Thermo Fisher Scientific) ile gerçekleştirildi. Veri analizi, Amplicon Suite (SmartSeq srl) ve Ion Reporter Yazılımı ile yapıldı.
Tüm varyant isimlendirmesi, çevrimiçi olarak erişilebilen İnsan Genom Varyasyon Konsorsiyumu'nun (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen) mevcut yönergelerini takip etti. BRCA1/2 varyantlarının klinik önemi, Uluslararası Konsorsiyum ENIGMA'nın (Germ Hattı Mutant Allellerini Yorumlamak için Kanıta Dayalı Ağ, https://enigmaconsortium.org/) sınıflandırması kullanılarak ve ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD ve UMD gibi farklı veritabanlarına başvurularak tanımlandı. Sınıflandırma beş farklı risk kategorisi içerir: iyi huylu (kategori I), muhtemelen iyi huylu (kategori II), belirsiz öneme sahip varyant (VUS, kategori III), muhtemelen patojenik (kategori IV) ve patojenik (kategori V). VarSome ayrıca, 30 veritabanına erişim sağlayan bilgilendirici bir araç olarak, mutasyonların protein yapısı ve işlevi üzerindeki etkisini de analiz etti.32
Her bir VUS'a potansiyel klinik önem atamak için aşağıdaki hesaplamalı protein tahmin algoritmaları kullanıldı: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ve Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Sınıf 1 ve 2 olarak sınıflandırılan varyantlar vahşi tip olarak kabul edildi.
Sanger dizileme yöntemi, her bir patojenik varyantın varlığını doğruladı. Kısaca, BRCA1 ve BRCA2 gen referans dizileri (sırasıyla NG_005905.2, NM_007294.3 ve NG_012772.3, NM_000059.3) kullanılarak tespit edilen her varyant için spesifik bir primer çifti tasarlandı. Bu nedenle, hedefli PCR yapıldı ve ardından Sanger dizileme gerçekleştirildi.
BRCA1/2 geni için negatif test sonucu veren hastalar, büyük genomik yeniden düzenlemelerin (LGR) varlığını değerlendirmek için üreticinin talimatlarına göre çoklu ligasyon bağımlı prob amplifikasyonu (MLPA) ile test edildi. Kısaca, DNA örnekleri denatüre edilir ve her biri yaklaşık 60 nükleotit uzunluğunda belirli bir DNA dizisini tespit eden 60'a kadar BRCA1 ve BRCA2 genine özgü prob kullanılır. Benzersiz bir PCR amplikon seti oluşturan prob amplifikasyon ürünleri daha sonra kapiler elektroforez ve uygun partiye özgü Cofalyser tablolarıyla birlikte Cofalyser.Net yazılımı (www.mrcholland.com) kullanılarak analiz edildi.
Seçilen klinikopatolojik değişkenler (histolojik derece ve Ki-67% proliferasyon indeksi), Prism yazılımı v. 8.4 kullanılarak ve p-değeri <0,05 anlamlı kabul edilerek Fisher'ın kesin testi ile hesaplanan BRCA1/2 PV varlığı ile ilişkilendirildi.
Ocak 2017 ile Mart 2021 arasında, 455 hastada germ hattı BRCA1/2 mutasyonları taraması yapıldı. Mutasyon testleri, Policlinico Hastanesi Deneysel Onkoloji ve Hematoloji Merkezi'nde gerçekleştirildi. Sicilya kılavuzuna (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Cuma 10 Ocak 2020) göre, Catania – San Marco Rodolico'sunda toplam 389 hastada meme kanseri, 37 hastada yumurtalık kanseri, 16 hastada pankreas kanseri, 8 hastada prostat kanseri ve 5 hastada melanom tespit edildi. Hastaların kanser türüne göre dağılımı ve analiz sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1, çalışmanın genel bir özetini gösteren bir akış şemasını göstermektedir. Meme, melanom, pankreas, prostat veya yumurtalık tümörleri olan hastalar, BRCA1 ve BRCA2 genlerindeki mutasyonlar açısından test edilmiştir.
Kısaltmalar: PV'ler, patojenik varyant; VUS, belirsiz öneme sahip varyant; WT, vahşi tip BRCA1/2 sekansı.
Çalışmalarımızda özellikle meme kanseri kohortlarına odaklandık. Hastaların medyan yaşı 49 (aralık 23-89) olup, çoğunluğu kadındı (n=376 veya %97).
Bu deneklerden 64'ünde (%17) BRCA1/2 mutasyonu vardı ve hepsi kadındı. Otuz beşinde (%9) PV ve 29'unda (%7,5) VUS vardı. 35 patojenik varyantın 17'si (%48,6) BRCA1'de ve 18'i (%51,4) BRCA2'de görülürken, 5 VUS BRCA1'de (%17,2) ve 24'ü (%82,8) BRCA2'de görüldü (Şekil 1 ve 2). LGR, MLPA analizinde mevcut değildi.
Şekil 2. 389 meme kanseri hastasında BRCA1 ve BRCA2 mutasyonlarının analizi. (A) 389 meme kanseri hastasında patojenik varyantların (PV) (kırmızı), belirsiz öneme sahip varyantların (VUS) (turuncu) ve WT'nin (mavi) dağılımı; (B) 389 meme kanseri hastasının otuz beşinde (%9) BRCA1/2 patojenik varyant (PV) vardı. Bunların 17'si (%48,6) BRCA1 PV taşıyıcısı (koyu kırmızı) ve 18'i (%51,4) BRCA2 taşıyıcısıydı (açık kırmızı); (C) 389 hastanın 29'unda (%7,5) VUS vardı; 5'inde (%17,2) BRCA1 geni (koyu turuncu) ve 24'ünde (%82,8) BRCA2 geni (açık turuncu).
Kısaltmalar: PV'ler, patojenik varyant; VUS, belirsiz öneme sahip varyant; WT, vahşi tip BRCA1/2 sekansı.
Daha sonra, BRCA1/2 PV'li hastalarda BC moleküler alt tiplerinin yaygınlığını araştırdık. Dağılım, 2 (%5,7) luminal A, 15 (%42,9) luminal B, 3 (%8,6) luminal B-HER2+, 2 (%5,7) HER2+ ve 13 (%37,1) TNBC hastasını içeriyordu. BRCA1 pozitif hastalar arasında 5'inde (%29,4) luminal B BC, 2'sinde (%11,8) HER2+ hastalığı ve 10'unda (%58,8) TNBC vardı. BRCA1 mutasyonu olmayan tümörler ya luminal A ya da luminal B-HER2+ idi (Şekil 3). BRCA2 pozitif alt grupta, 10 (%55,6) tümör luminal B, 3'ü (%16,7) luminal B-HER2+, 3'ü (%16,7) TNBC ve 2'si (%11,1) luminal A idi (Şekil 3). Bu grupta HER2+ tümör bulunmamaktaydı. Dolayısıyla, BRCA1 mutasyonları TNBC hastalarında yaygınken, BRCA2 değişiklikleri lumen B bireylerinde baskındır.
Şekil 3. BRCA1 ve BRCA2'de patojenik varyantları olan hastalarda meme kanseri alt tiplerinin yaygınlığı. Meme kanseri hastalarının moleküler alt tipleri arasında BRCA1- (koyu kırmızı) ve BRCA2- (açık kırmızı) PV'lerinin dağılımını gösteren histogramlar. Her kutu içinde bildirilen sayılar, her meme kanseri alt tipi için BRCA1 ve BRCA2 PV'si olan hastaların yüzdesini temsil etmektedir.
Kısaltmalar: PV'ler, patojenik varyant; HER2+, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 pozitif; TNBC, üçlü negatif meme kanseri.
Daha sonra, BRCA1 ve BRCA2 PV'lerinin tipini ve gen lokalizasyonunu değerlendirdik. BRCA1 PV'lerinde 7 tek nükleotid varyantı (SNV), 6 delesyon, 3 duplikasyon ve 1 insersiyon gözlemledik. Sadece bir mutasyon (c.5522delG) yeni bir keşiftir. Her iki denekte de tespit edilen en yaygın BRCA1 PV'si c.5035_5039delCTAAT idi. Bu değişiklik, BRCA1 ekzon 15'te beş nükleotidin (CTAAT) delesyonunu içerir ve 1679. kodonda lösin amino asidinin tirozin ile değiştirilmesine neden olur ve tahmini alternatif bir durdurma kodonu ile translasyon çerçeve kayması nedeniyle erken protein kesilmesine yol açar. Diğer tüm değişiklikler sadece bir vakada tespit edildi. Özellikle, bildirilen PV'lerden biri ekleme bölgesi konsensüs bölgesinde yer alıyordu (c.4357+1G>T) (Tablo 1).
BRCA2 PV ile ilgili olarak, 6 delesyon, 6 SNV ve 2 duplikasyon gözlemledik. Bulunan değişikliklerin hiçbiri yeni değildir. Popülasyonumuzda üç mutasyon tekrarlandı: 3 kişide gözlemlenen c.428dup ve c.8487+1G>A, ardından iki vakada saptanan c.5851_5854delAGTT. c.428dup değişikliği, BRCA2'nin 5. ekzonunda C'nin tekrarını içerir ve kısaltılmış, işlevsiz bir proteini kodladığı tahmin edilmektedir. c.8487+1G>A mutasyonu, BRCA2 intron 19'un (± 1,2) intronik bölgesinde meydana gelir ve ekleme konsensüs dizisini etkileyerek, anormal veya eksik proteinle sonuçlanan değiştirilmiş eklemeye neden olur. c.5851_5854delAGTT patojenik varyantı, 5851 ila 5854 nükleotid pozisyonlarından 4 nükleotidlik bir delesyondan kaynaklanmaktadır. BRCA2 geninin 10. kodlama ekzonunda meydana gelen ve tahmini alternatif bir durdurma kodonu (p.S1951WfsTer) ile sonuçlanan bir translasyonel çerçeve kayması görülmektedir. Özellikle, daha önce bildirildiği gibi, hem c.631G>A hem de c.7008-2A>T değişiklikleri aynı hastada tespit edilmiştir.34 İlk mutasyon, BRCA2 ekzon 7'deki adenozinin (A) guanin (G) içeren bir nükleotit ile değiştirilmesini içerir ve bu da 211. kodonda valinin izolösin ile değiştirilmesine neden olur. İzolösin amino asidi, oldukça benzer özelliklere sahip bir amino asittir. Bu değişiklik normal mRNA eklenmesini etkiler. İkinci varyant, intronik bir bölgede yer alır ve BRCA2'yi kodlayan genin 13. ekzonundan önce çift A'dan timine (T) ikamesine neden olur. c.7008-2A>T değişikliği, farklı uzunluklarda birden fazla transkript oluşturabilir. Ayrıca, BRCA2 PV'leri grubunda, 4'ü 18 değişiklik (%22,2) intronikti.
Daha sonra, BRCA1/2'deki zararlı mutasyonları fonksiyonel alanlarda ve protein bağlama bölgelerinde haritalandırdık (Şekil 4). BRCA1 geninde, PV'lerin %50'si meme kanseri küme bölgesinde (BCCR), mutasyonların %22'si ise yumurtalık kanseri küme bölgesinde (OCCR) yer alıyordu (Şekil 4A). BRCA2 PV'lerinde, varyantların %35,7'si BCCR bölgesinde ve mutasyonların %42,8'i OCCR'de yer alıyordu (Şekil 4B). Ardından, PV'lerin BRCA1 ve BRCA2 protein alanlarındaki konumunu değerlendirdik. BRCA1 proteini için, döngü ve sarmal bobin alanlarında üç PV ve BRCT alanında iki mutasyon bulduk (Şekil 4A). BRCA2 proteini için, 4 PV BRC tekrar alanına haritalanırken, 3 intronik ve 3 eksonik değişiklik tespit edildi. oligo/oligosakkarit bağlayıcı (OB) ve kule (T) alanları (Şekil 4B).
Şekil 4 BRCA1 ve BRCA2 proteinlerinin şematik gösterimi ve patojenik varyantların lokalizasyonu. Bu şekil, meme kanseri hastalarında BRCA1 (A) ve BRCA2 (B) patojenik varyantlarının dağılımını göstermektedir. Eksonik mutasyonlar mavi, intronik varyantlar ise turuncu renkte gösterilmiştir. Çubuk yüksekliği vaka sayısını temsil etmektedir. BRCA1 ve BRCA2 proteinleri ve fonksiyonel alanları rapor edilmiştir. (A) BRCA1 proteini bir döngü alanı (RING) ve bir nükleer lokalizasyon dizisi (NLS), bir sarmal alan, bir SQ/TQ küme alanı (SCD) ve bir BRCA1 C-terminal alanı (BRCT) içerir. (B) BRCA2 proteini sekiz BRC tekrarı, sarmal bir alan (Helical) içeren bir DNA bağlama alanı, üç oligonükleotid/oligosakkarit bağlama (OB) katlanması, bir kule alanı (T) ve C tarafında bir NLS içerir. Meme Kanseri Küme Bölgesi (BCCR) ve Yumurtalık Kanseri olarak adlandırılan alanlar. Küme Bölgesi (OCCR) altta gösterilmiştir.*Durdurma kodonlarını belirleyen mutasyonları temsil eder.
Daha sonra, BRCA1/2 PV varlığıyla ilişkili olabilecek meme kanseri klinikopatolojik özelliklerini araştırdık. 181 BRCA1/2 negatif hasta (taşıyıcı olmayan) ve tüm taşıyıcılar (n = 35) için eksiksiz klinik kayıtlar mevcuttu. Tümör proliferasyon hızı ile tümör derecesi arasında bir korelasyon vardı.
Kohortumuzun medyan değerine (25%, aralık <10-90%) dayanarak Ki-67 dağılımını hesapladık. Ki-67 değeri <%25 olan bireyler "düşük Ki-67" olarak tanımlanırken, değeri ≥%25 olan bireyler "yüksek Ki-67" olarak kabul edildi. Taşıyıcı olmayanlar ve BRCA1 PV taşıyıcıları arasında anlamlı Ki-67 farklılıkları (p<0,01) bulundu (Şekil 5A).
Şekil 5. BRCA1 ve BRCA2 PV'si olan ve olmayan meme kanserli kadınlarda Ki-67'nin derece dağılımıyla korelasyonu. (A) 181 taşıyıcı olmayan meme kanseri hastasında ve BRCA1 (18) veya BRCA2 (17) PV'si olan hastalarda medyan Ki-67 değerlerini gösteren kutu grafiği. 0,5'in altındaki P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. (B) Meme kanseri hastalarının BRCA1 ve BRCA2 mutasyon durumuna (WT bireyler, BRCA1 ve BRCA2 PV taşıyıcıları) göre histolojik derece gruplarına (G2 ve G3) atanmasını temsil eden histogram.
Benzer şekilde, tümör derecesinin BRCA1/2 PV varlığıyla ilişkili olup olmadığını inceledik. Popülasyonumuzda G1 BC bulunmadığı için hastaları iki gruba (G2 veya G3) ayırdık. Ki-67 sonuçlarıyla tutarlı olarak, analiz, tümör derecesi ile BRCA1 mutasyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğunu ortaya koydu; BRCA1 taşıyıcılarında G3 tümörlerinin oranı, taşıyıcı olmayanlara göre daha yüksekti (p<0.005) (Şekil 5B).
DNA dizileme teknolojisindeki ilerlemeler, kanser öyküsü olan hastalar için hayati önem taşıyan BRCA1/2 genetik testlerinde benzeri görülmemiş ilerlemeler sağlamıştır. Bugüne kadar, yaklaşık 20.000 BRCA1/2 varyantı tanımlanmış ve Amerikan Tıbbi Genetik Derneği 35 ve ENIGMA sistemine göre sınıflandırılmıştır.35,36 BRCA1/2 mutasyon spektrumunun coğrafi bölgeler arasında büyük farklılıklar gösterdiği iyi bilinmektedir.37 İtalya'da, BRCA1/2 PV oranı %8 ile %37 arasında değişmekte olup, ülke içi geniş bir değişkenlik göstermektedir.38,39 Yaklaşık 5 milyonluk nüfusuyla Sicilya, nüfus bakımından İtalya'nın beşinci büyük bölgesidir. Batı Sicilya'da BRCA1/2 dağılımı hakkında veriler mevcut olsa da, adanın doğu kesiminde kapsamlı bir kanıt bulunmamaktadır.
Çalışmamız, Doğu Sicilya'daki meme kanseri hastalarında BRCA1/2 PV insidansına ilişkin ilk raporlardan biridir.28 Analizimizi, kohortumuzdaki en yaygın hastalık olduğu için meme kanserine odakladık.
389 meme kanseri hastası üzerinde yapılan testlerde, hastaların %9'unda BRCA1/2 PV'leri saptandı ve bu varyantlar BRCA1 ve BRCA2 arasında eşit olarak dağılmıştı. Bu sonuçlar, daha önce İtalyan popülasyonunda bildirilenlerle tutarlıdır.28 İlginç bir şekilde, kohortumuzun %3'ü (13/389) erkekti. Bu oran, erkek meme kanseri için beklenen orandan (%1) daha yüksektir,40 ve popülasyon seçimimizin BRCA1/2 mutasyon riski temelinde yapıldığını yansıtmaktadır. Bununla birlikte, bu erkeklerin hiçbirinde BRCA1/2 PV gelişmedi, bu nedenle PALB2, RAD51C ve D gibi daha az yaygın mutasyonların varlığını dışlamak için daha ileri moleküler analiz için aday oldular. BRCA2 VUS'un belirgin olduğu deneklerin %7'sinde belirsiz öneme sahip varyantlar bulundu. Bu sonuç bile önceden var olan kanıtlarla tutarlıdır.28,41,42
BRCA1/2 mutant kadınlarda BC moleküler alt tiplerinin dağılımını analiz ettiğimizde, TNBC ile BRCA1 PV (%58,8) ve luminal B BC ile BRCA2 PV (%55,6) arasındaki bilinen ilişkileri doğruladık.16,43 BRCA1 ve BRCA2 PV taşıyıcılarındaki luminal A ve HER2+ tümörler, mevcut literatür verileriyle tutarlıdır.16,43
Daha sonra BRCA1/2 PV'nin tipine ve konumuna odaklanıyoruz. Kohortumuzda en yaygın BRCA1 PV, c.5035_5039delCTAAT idi. Incorvaia ve ark. Bu varyantı Sicilya kohortlarında tanımlamamış olsalar da, diğer yazarlar bunu germ hattı BRCA1 PV'si olarak bildirmişlerdir.34 Kohortumuzda birkaç BRCA1 PV'si bulundu - örneğin c.181T>G, c.514del, c.3253dupA ve c.5266dupC - bunlar Sicilya'da da gözlemlenmiştir.28 Bunlardan iki BRCA1 kurucu mutasyonu (c.181T>G ve c.5266dupC), Doğu ve Orta Avrupa'daki Aşkenazi Yahudilerinde (Polonya, Çek Cumhuriyeti), Slovenya, Avusturya, Macaristan, Belarus ve Almanya'da yaygın olarak bulunur) 44,45 ve Amerika Birleşik Devletleri ve Arjantin'de yakın zamanda İtalyan meme kanseri ve yumurtalık kanseri hastalarında "tekrarlayan germ hattı varyantı" olarak tanımlanmıştır. 34c.514del varyantı daha önce Palermo ve Messina'daki kuzey Sicilya'dan 8 meme kanseri hastasında tespit edilmiştir. İlginç bir şekilde, Incorvaia ve ark. Catania'daki bazı ailelerde c.3253dupA varyantı bulundu.28 En temsili BRCA2 PV'leri c.428dup, c.5851_5854delAGTT ve intronik varyant c.8487+1G>A'dır; bunlar Palermo'da c.428dup'lu bir hastada daha ayrıntılı olarak bildirilmiştir.28 c.5851_5854delAGTT PV'si, özellikle Trapani ve Palermo bölgelerinde olmak üzere, kuzeybatı Sicilya'daki hanelerde gözlemlenmiştir; c.5851_5854delAGTT PV'si ise kuzeybatı Sicilya'daki hanelerde gözlemlenmiştir. 8487+1G>A varyantı Messina, Palermo ve Caltanissetta'daki bireylerde daha yaygındı.28 Rebbeck ve ark. Kolombiya'da daha önce c.5851_5854delAGTT değişikliği tanımlanmıştı.37 Başka bir BRCA2 PV'si olan c.631+1G>A, Sicilya'dan (Agrigento, Siracusa ve Ragusa) BC ve OC hastalarında bulunmuştur.28 Özellikle, aynı hastada iki BRCA2 varyantının (BRCA2 c.631G>A ve c.7008-2A>T) bir arada bulunduğunu gözlemledik ve daha önce bildirildiği gibi cis modunda ayrıştığını varsaydık.34,46 Bu BRCA2 çift mutasyonları gerçekten de İtalyan bölgesinde sıklıkla gözlemlenmekte ve erken durdurma kodonları oluşturarak haberci RNA eklenmesini etkilediği ve BRCA2 proteininin başarısız olmasına neden olduğu bulunmuştur.47,48
Ayrıca, protein alanlarının ve genlerin varsayımsal OCCR ve BCCR bölgelerinde BRCA1 ve BRCA2 PV'lerini haritalandırdık. Bu bölgeler, Rebbeck ve ark. tarafından sırasıyla yumurtalık ve meme kanseri gelişimi için risk alanları olarak tanımlanmıştır.49 Bununla birlikte, germ hattı varyantlarının konumu ile meme veya yumurtalık kanseri riski arasındaki ilişkiye dair kanıtlar tartışmalı olmaya devam etmektedir.28,50-52 Popülasyonumuzda, BRCA1 PV'leri ağırlıklı olarak BCCR bölgesinde, BRCA2 PV'leri ise ağırlıklı olarak OCCR bölgesinde yer almıştır. Bununla birlikte, varsayımsal OCCR ve BCCR bölgeleri ile meme kanseri özellikleri arasında herhangi bir ilişki bulamadık. Bu, BRCA1/2 mutasyonlarına sahip hasta sayısının sınırlı olmasından kaynaklanıyor olabilir. Protein alanı perspektifinden bakıldığında, BRCA1 PV'leri proteinin tamamı boyunca dağılmıştır ve BRCA2 değişiklikleri tercihen BRC tekrar alanında bulunur.
Son olarak, BC klinikopatolojik özelliklerini BRCA1/2 PV ile ilişkilendirdik. Dahil edilen hasta sayısının sınırlı olması nedeniyle, yalnızca Ki-67 ile tümör derecesi arasında anlamlı bir korelasyon bulduk. Ki-67'nin değerlendirilmesi ve yorumlanması hala biraz tartışmalı olsa da, yüksek proliferasyon oranlarının hastalık nüksü riskinin artması ve sağkalımın azalmasıyla ilişkili olduğu kesindir. Bugüne kadar, "yüksek" ve "düşük" Ki-67'yi ayırt etmek için kullanılan eşik değer %20'dir. Bununla birlikte, bu eşik değer, ortalama Ki-67 değeri %25 olan BRCA1/2 mutasyonlu hasta popülasyonumuz için geçerli değildir. Yüksek Ki-67 oranlarındaki bu eğilim, az sayıda luminal A tümörü bulunan luminal B ve TNBC kohortlarımızdaki yaygınlıkla açıklanabilir. Bununla birlikte, bazı kanıtlar, daha yüksek bir Ki-67 eşik değerinin (%25-30) hastaları prognozlarına göre daha iyi sınıflandırabileceğini düşündürmektedir.53,54 Analizimizin sonuçlarından, anlamlı bir korelasyon şaşırtıcı değildir. Yüksek Ki-67 ve dereceleri ile BRCA1 PV varlığı. Aslında, BRCA1 ile ilişkili tümörler TNBC'nin tipik özellikleridir ve daha agresif özellikler sergilerler.16,17
Sonuç olarak, bu çalışma Doğu Sicilya'dan bir meme kanseri kohortunda BRCA1/2 mutasyon durumuna ilişkin bir rapor sunmaktadır. Genel olarak, bulgularımız hem mutasyon prevalansı hem de meme kanserindeki klinikopatolojik özellikler açısından önceden var olan kanıtlarla tutarlıdır. BRCA1/2 mutasyonlu meme kanseri hastalarının daha büyük popülasyonlarında, örneğin çoklu genom genişletilmiş mutasyon analizi kullanılarak yapılacak daha fazla çalışma, BRCA1/2'den farklı ve daha az sıklıkta görülen patojenik varyantların varlığını değerlendirmek için gereklidir. Bu, genetik mutasyonlar nedeniyle kanser riski artan bireylerin sayısının artmasının belirlenmesine ve uygun şekilde yönetilmesine olanak sağlayacaktır.
Hastaların tümör örneklerinin araştırma amaçlı olarak anonim bir şekilde verilmesi için bilgilendirilmiş onam formunu imzaladıklarını doğruladık. Tüm hastalar Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yazılı bilgilendirilmiş onam formunu imzaladılar. AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco” politikasına göre, BRCA1/2 analizi klinik uygulamaya göre yapıldığı ve tüm hastalar yazılı bilgilendirilmiş onam verdiği için bu çalışma etik incelemeden muaf tutulmuştur. Hastalar ayrıca verilerinin araştırma amaçlı kullanımına da onay vermektedirler.
Etik Kurulunun talebi doğrultusunda meme kanseri hastalarının bakımında verdiği destekten dolayı Prof. Paolo Vigneri'ye teşekkür ederiz.
Federica Martorana, Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis ve Pfizer'dan telif ücreti aldığını bildirmiştir. Diğer yazarlar bu çalışmada herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, ve diğerleri. Küresel Kanser İstatistikleri 2020: GLOBOCAN, dünyanın 185 ülkesinde 36 kanserin görülme ve ölüm oranlarını tahmin ediyor. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660