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著者 ステラ S、ヴィターレ SR、マルトラーナ F、マッシミノ M、パヴォーネ G、ランザファーム K、ビアンカ S、バローネ C、ゴルゴーネ C、フィケラ M、マンゼラ L
ステファニア・ステラ、1,2 シルヴィア・リタ・ヴィターレ、1,2 フェデリカ・マルトラーナ、1,2 ミケーレ・マッシミノ、1,2 ジュリアナ・パヴォーネ、3 カティア・ランザファメ、3 セバスティアーノ・ビアンカ、4 キアラ・バローネ、5 クリスティーナ・ゴルゴーネ、6 マルコ・フィチェラ、6、7 リヴィア・マンゼラ1,21実験医学、カターニア大学、カターニア、95123、イタリア;2 実験腫瘍学および血液学センター、AOU ポリクリニコ「G.ロドリコ – サンマルコ」、カターニア、95123、イタリア。 3 腫瘍内科、AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”、カターニア、95123、イタリア; 4 Medical Genetics、ARNAS Garibaldi、カターニア、95123、イタリア; 5 医学遺伝学、ASP、シラキュース、96100、イタリア; 6 カターニア大学生物医学・バイオテクノロジー科学部、医学遺伝学、カターニア、イタリア、95123; 7 Oasi 研究所-IRCCS、トロイナ、94018、イタリア 連絡先: Stefania Stella、電話 +39 095 378 1946、メール [email protected]; [email protected] 目的: BRCA1およびBRCA2の生殖細胞系列変異と確立された乳がん(BC)、卵巣がん(OC)およびその他のがんは、生涯にわたるがんリスクと関連しています。BRCA遺伝子の検査は、個々のリスクを評価するだけでなく、健康な保因者における予防法を見つけ、がん患者の治療を個別化するためにも重要です。BRCA1およびBRCA2変異の有病率は地理的地域によって大きく異なり、シチリアの家族におけるBRCA病原性変異に関するデータは存在しますが、東シチリアの集団を対象とした研究は不足しています。本研究の目的は、東シチリアのBC患者コホートにおけるBRCA病原性生殖細胞系列変異の発生率と分布を調査し、次世代シーケンシングを使用して特定のBC特性との関連性を評価することでした。変異の存在は、腫瘍グレードおよび増殖指数と相関していました。結果: 全体として、35人の患者(9%)がBRCA病原性変異を有し、17人(49%)がBRCA1とBRCA2の変異は18（51％）でした。BRCA1変異はトリプルネガティブ乳がん患者に多く見られますが、BRCA2変異はルミナル乳がん患者に多く見られます。非保因者と比較して、BRCA1変異を有する被験者は腫瘍グレードと増殖指数が有意に高くなりました。結論：今回の調査結果は、東シチリアの乳がん患者におけるBRCA変異状態の概要を示し、遺伝性乳がん患者の特定におけるNGS解析の役割を裏付けています。全体として、これらのデータは、変異保因者におけるがんの適切な予防と治療のためのBRCAスクリーニングを支持するこれまでの証拠と一致しています。
乳がん（BC）は、世界で最も一般的な悪性腫瘍であり、女性にとって最も致死率の高いがんです。1 BCの予後と臨床的挙動を決定する生物学的特徴は、長年にわたって広範囲に研究され、部分的に解明されてきました。実際、現在ではいくつかの代替マーカーがBCを異なる分子サブタイプに分類するために使用されています。それらは、エストロゲン（ER）および/またはプロゲステロン受容体（PgR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）増幅、増殖指数Ki-67、および腫瘍グレード（G）です。2 これらの変数の組み合わせにより、次のBCカテゴリーが特定されました。1）ERおよび/またはPgR発現を示すルミナル腫瘍は、BCの75％を占めていました。これらの腫瘍は、Ki-67が20％未満でHER2陰性の場合のルミナルAと、増殖指数に関係なく、Ki-67が20％以上でHER2増幅が存在する場合のルミナルBにさらに分けられました。 2) ERおよびPgR陰性であるがHER2増幅を示すHER2陽性腫瘍。このグループは全乳がんの10%を占める。3) ERおよびPgR発現がなくHER2増幅も示さないトリプルネガティブ乳がん（TNBC）は、乳がんの約15%を占める。2-4
これらの乳がんサブタイプの中で、腫瘍グレードと増殖指数は、腫瘍の悪性度と予後に直接的かつ独立して関連する横断的バイオマーカーである。5,6
前述の生物学的特徴に加え、過去数年間で、乳がんの発症につながる遺伝性遺伝子変異の役割がますます重要になってきています。7 乳がんの約1割は、特定の遺伝子の生殖細胞系列変異によって遺伝的に受け継がれます。8 18万人以上の女性を対象とした2つの大規模疫学研究により、遺伝性乳がんの主な原因となる8つの遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、CHK2、PALB2、RAD51C、RAD51D）が最近特定されました。これらの遺伝子のうち、BRCA1とBRCA2（以下、BRCA1/2と呼ぶ）は乳がんの発症と最も強い相関関係を示しました。9-12 実際、生殖細胞系列のBRCA1/2変異は、乳がんだけでなく、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、大腸がん、黒色腫などの他の悪性腫瘍の生涯リスクも大幅に増加させます。13歳から80歳までの累積リスクは、 BRCA1病原性変異（PV）を有する女性における乳がんの発症率は72%であり、BRCA2 PVを有する女性では69%である。14
注目すべきことに、最近の論文では、乳がんリスクは病原性変異の種類によって異なると示唆されている。実際、病原性切断型変異と比較して、特にBRCA1遺伝子の明らかなミスセンス変異は、特に高齢女性において、乳がんリスクの低下と関連している。15
BRCA1またはBRCA2の病的変異の存在は、異なる生物学的および臨床病理学的特徴と関連していた。16,17 BRCA1関連乳がんは、臨床的に悪性度が高く、分化度が低く、増殖性が高い傾向がある。これらの腫瘍は通常トリプルネガティブであり、発症年齢が若い。BRCA2変異患者に発生する腫瘍は、通常、中等度から高分化度を示し、増殖指数は様々である。これらの腫瘍はルーメンBに多く、通常は高齢者に発生する。16-18 特に、BRCA1およびBRCA2の変異は、プラチナ製剤やポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ阻害剤(PARPi)などの標的薬を含む特定の治療に対する感受性を高める。19,20
ここ数年、次世代シーケンシング（NGS）の臨床現場への導入により、BRCA1/2を含む癌感受性症候群の分子検査を受ける乳がん患者が増加している。21 同時に、BRCA1/2検査を受けるに値する個人をより適切に特定するために、家族歴、人口統計学的特徴、臨床病理学的特徴に関する正確な基準に基づく定義が確立されている。22,23 このような状況において、特定の集団におけるBRCA1/2スクリーニングに関するエビデンスが蓄積されつつあり、地理的地域による違いが明らかになっている。24–27 西シチリアの乳がんコホートに関する報告はあるものの、東シチリアの集団におけるBRCA1/2スクリーニングに関するデータは少ない。28,29
本稿では、シチリア島東部の乳がん患者における生殖細胞系BRCA1/2スクリーニングの結果について述べ、BRCA1またはBRCA2変異の存在とこれらの腫瘍の主な臨床病理学的特徴との関連性をさらに明らかにする。
カターニアのポリクリニコ病院ロドリコ・サンマルコにある「実験腫瘍学・血液学センター」で、後向き研究が実施されました。2017年1月から2021年3月にかけて、乳がん、卵巣がん、黒色腫、膵臓がん、前立腺がんの患者455人が、BRCA/2遺伝子検査のために当センターの分子診断検査室に紹介されました。この研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、すべての参加者は分子解析の前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
BCの組織学的および生物学的特徴（ER、PgR、HER2の状態、Ki-67、およびグレード）は、コア生検または外科的サンプルで評価され、攻撃的な腫瘍成分のみが考慮されました。これらの特徴に基づいて、BCは次のように分類されました：ルミナルA（ER+および/またはPgR+、HER2-、Ki-67<20%）、ルミナルB（ER+および/またはPgR+、HER2-、Ki-67≥20%）、ルミナルB-HER2+（ERおよび/またはPgR+、HER2+）、HER2+（ERおよびPgR-、HER2+）、またはトリプルネガティブ（ERおよびPgR-、HER2-）。
BRCA1 および BRCA2 変異状態を評価する前に、腫瘍医、遺伝学者、心理学者を含む学際的なチームが各患者に対して腫瘍遺伝学の相談を行い、BRCA1 および/または BRCA1 の存在を判定しました。または BRCA2 遺伝子に PV のリスクが高い個人。患者の選択は、イタリア臨床腫瘍学会 (AIOM) のガイドラインとシチリアのローカル推奨事項に従って行われました。30,31 これらの基準には、次のものが含まれます。(i) 感受性遺伝子 (例: BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN) の既知の病原性変異の家族歴。(ii) BC の男性。(iii) BC と OC の両方を持つ人。(iv) BC <36 歳、TNBC <60 歳、または両側 BC <50 歳の女性。(v) BC <50 歳で、少なくとも 1 人の第 1 度の親族に 1 人の既往歴がある人: (a) BC < 50 歳。 (b) 年齢を問わない非粘液性および非境界型卵巣がん、(c) 両側性乳がん、(d) 男性乳がん、(e) 膵臓がん、(f) 前立腺がん、(vi) 50 歳以上の乳がんの既往歴が 2 人以上あり、かつ互いに第 1 親族である親族 (本人が第 1 親族である親族を含む) に乳がん、卵巣がん、または膵臓がんの家族歴がある場合、(vii) 卵巣がんの既往歴があり、かつ少なくとも 1 人の第 1 親族がいる場合: (a) 50 歳未満の乳がん、(b) NOC、(c) 両側性乳がん、(d) 男性乳がん、(vii) 高悪性度漿液性卵巣がんの女性。
各患者から20 mLの末梢血サンプルを採取し、EDTAチューブ（BD Biosciences）に収集した。0.7 mLの全血サンプルから、QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit（QIAGEN、イタリア、ヒルデン）を用いて製造元の指示に従ってゲノムDNAを分離し、Qubit® 3.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に通して定量を行った。ターゲット濃縮とライブラリー調製は、Oncomine™ BRCA Research Assay Chef によって実行され、製造元の指示に従って自動ライブラリー調製のために Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit にロードする準備ができています。このキットは、すべての BRCA1 (NM_007300.3) および BRCA2 (NM_000059.3) 遺伝子の研究に使用できる 2 つのマルチプレックス PCR プライマー プールで構成されています。簡単に説明すると、各希釈サンプル DNA (10 ng) 15 µL をライブラリー調製用のバーコード付きプレートに追加し、すべての試薬と消耗品を Ion Chef™ 装置にロードしました。次に、Ion Chef™ 装置で自動ライブラリー調製とバーコード付きサンプルライブラリーのプーリングを実行しました。次に、製造元の指示に従って、Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) で調製されたライブラリーの数を評価しました。最後に、ライブラリーを等モル比で混合します。 Ion Chef™ライブラリーサンプルチューブ（バーコード付きチューブ）に入れ、Ion Chef™装置にロードした。シーケンスは、Ion Torrent S5（Thermo Fisher Scientific）装置（Thermo Fisher Scientific）とIon 510チップ（Thermo Fisher Scientific）を使用して実行した。データ解析は、Amplicon Suite（SmartSeq srl）とIon Reporterソフトウェアを使用して実行した。
すべての変異命名法は、オンラインで入手可能なヒトゲノム変異コンソーシアム（HGVS、http://www.hgvs.org/mutnomen）の現行ガイドラインに従った。BRCA1/2変異の臨床的意義は、国際コンソーシアムENIGMA（生殖細胞系変異アレル解釈のためのエビデンスに基づくネットワーク、https://enigmaconsortium.org/）の分類を用い、ARUP、BRCAEXCHANGE、ClinVar、IARC_LOVD、UMDなどの様々なデータベースを参照して定義した。この分類には、良性（カテゴリーI）、良性の可能性が高い（カテゴリーII）、意義不明変異（VUS、カテゴリーIII）、病原性の可能性が高い（カテゴリーIV）、病原性（カテゴリーV）の5つの異なるリスクカテゴリーが含まれる。また、一部の研究者は、30のデータベースにアクセスできる有益なツールである、タンパク質の構造と機能に対する変異の影響も分析した。32
各VUSに潜在的な臨床的意義を割り当てるために、以下の計算タンパク質予測アルゴリズムが使用されました：MUTATION TASTER、PROVEAN-SIFT（http://provean.jcvi.org/index.php）、POLYPHEN-2（http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Align-GVGD（http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php）。クラス1および2に分類されたバリアントは野生型とみなされました。
サンガーシーケンスにより、各病原性変異の存在が確認された。簡単に説明すると、BRCA1およびBRCA2遺伝子の参照配列（それぞれNG_005905.2、NM_007294.3およびNG_012772.3、NM_000059.3）を使用して、検出された各変異に対して特異的なプライマーペアが設計された。そのため、標的PCRを実施し、続いてサンガーシーケンスを行った。
BRCA1/2遺伝子検査で陰性だった患者は、製造元の指示に従って多重連結依存性プローブ増幅法（MLPA）で検査され、大規模ゲノム再編成（LGR）の存在が評価されました。簡単に説明すると、DNAサンプルを変性させ、最大60個のBRCA1およびBRCA2遺伝子特異的プローブを使用し、それぞれが長さ約60ヌクレオチドの特定のDNA配列を検出します。その後、固有のPCR増幅産物からなるプローブ増幅産物を、キャピラリー電気泳動と、適切なバッチ固有のCofalyserテーブル（www.mrcholland.com）と併用したCofalyser.Netソフトウェアで分析しました。
選択された臨床病理学的変数（組織学的グレードおよびKi-67%増殖指数）は、BRCA1/2 PVの存在と関連しており、Prismソフトウェアv.8.4を使用してFisherの正確確率検定で計算され、p値<0.05を有意とみなした。
2017年1月から2021年3月の間に、455人の患者が生殖細胞系BRCA1/2変異のスクリーニングを受けました。変異検査は、ポリクリニコ病院の実験腫瘍学および血液学センターで実施されました。シチリア州のガイドライン（http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm、N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020）によると、カターニアのロドリコ – サンマルコでは、合計389人の患者が乳がん、37人が卵巣がん、16人が膵臓がん、8人が前立腺がん、5人がメラノーマでした。がんの種類と分析結果による患者の分布を図1に示します。
図1は、研究の概要を示すフローチャートです。乳がん、悪性黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がんの患者を対象に、BRCA1およびBRCA2遺伝子の変異検査を実施しました。
略語：PVs、病原性変異；VUS、意義不明変異；WT、野生型BRCA1/2配列。
我々は乳がん患者群に絞って研究を行った。患者の年齢中央値は49歳（範囲23～89歳）で、大多数が女性であった（n=376、97%）。
これらの被験者のうち、64人（17%）はBRCA1/2変異を有しており、全員女性であった。35人（9%）はPV、29人（7.5%）はVUSであった。35個の病原性変異のうち、17個（48.6%）はBRCA1に、18個（51.4%）はBRCA2に発生し、5個のVUSはBRCA1（17.2%）に、24個（82.8%）はBRCA2に発生した（図1および図2）。LGRはMLPA解析では認められなかった。
図2. 389人の乳がん患者におけるBRCA1およびBRCA2変異の解析。(A) 389人の乳がん患者における病原性変異(PV)(赤)、意義不明変異(VUS)(オレンジ)、およびWT(青)の分布。(B) 389人の乳がん患者のうち、35人(9%)がBRCA1/2病原性変異(PV)を有していた。そのうち、17人(48.6%)がBRCA1 PVキャリア(濃い赤)、18人(51.4%)がBRCA2キャリア(薄い赤)であった。(C) 389人の被験者のうち29人(7.5%)がVUSを有しており、そのうち5人(17.2%)がBRCA1遺伝子(濃いオレンジ)、24人(82.8%)がBRCA2遺伝子(薄いオレンジ)であった。
略語：PVs、病原性変異；VUS、意義不明変異；WT、野生型BRCA1/2配列。
次に、BRCA1/2 PV患者におけるBC分子サブタイプの有病率を調査した。分布には、ルミナルAが2例（5.7%）、ルミナルBが15例（42.9%）、ルミナルB-HER2+が3例（8.6%）、HER2+が2例（5.7%）、TNBCが13例（37.1%）含まれていた。BRCA1陽性患者のうち、5例（29.4%）がルミナルB BC、2例（11.8%）がHER2+疾患、10例（58.8%）がTNBCであった。BRCA1変異のない腫瘍は、ルミナルAまたはルミナルB-HER2+であった（図3）。BRCA2陽性サブグループでは、10例（55.6%）がルミナルB、3例（16.7%）がルミナルB-HER2+、3例（16.7%）がTNBCであった。 2例（11.1%）はルミナルA型であった（図3）。このグループにはHER2陽性腫瘍は存在しなかった。したがって、BRCA1変異はTNBC患者に多く見られるのに対し、BRCA2変異はルミナルB型患者に多く見られる。
図3 BRCA1およびBRCA2の病原性変異を有する患者における乳がんサブタイプの有病率。乳がん患者の分子サブタイプにおけるBRCA1-（濃い赤）およびBRCA2-（薄い赤）PVの分布を示すヒストグラム。各ボックス内に示されている数値は、各乳がんサブタイプにおけるBRCA1およびBRCA2 PVを有する患者の割合を表します。
略語：PVs、病原性変異；HER2+、ヒト上皮成長因子受容体2陽性；TNBC、トリプルネガティブ乳がん。
続いて、BRCA1 および BRCA2 PV のタイプと遺伝子局在を評価しました。BRCA1 PV では、7 つの一塩基変異 (SNV)、6 つの欠失、3 つの重複、および 1 つの挿入が観察されました。1 つの変異 (c.5522delG) のみが新しい発見です。両被験者で検出された最も一般的な BRCA1 PV は c.5035_5039delCTAAT でした。この変化は、BRCA1 エクソン 15 の 5 つのヌクレオチド (CTAAT) の欠失を伴い、コドン 1679 でアミノ酸ロイシンがチロシンに置換され、予測される代替終止コドンによる翻訳フレームシフトにより、タンパク質の早期切断につながります。その他のすべての変化は、1 つの症例でのみ検出されました。注目すべきことに、報告された PV の 1 つはスプライス部位コンセンサス領域 (c.4357+1G>T) に位置していました (表 1)。
BRCA2 PVに関して、6つの欠失、6つのSNV、および2つの重複が観察されました。発見された変化はいずれも新規のものではありません。3つの変異が私たちの集団で繰り返し見られ、c.428dupとc.8487+1G>Aは3人の被験者で観察され、続いてc.5851_5854delAGTTが2例で検出されました。c.428dup変異はBRCA2のエキソン5におけるCの繰り返しに関係しており、切断された機能不全タンパク質をコードすると予測されます。c.8487+1G>A変異はBRCA2イントロン19（±1,2）のイントロン領域で発生し、スプライシングコンセンサス配列に影響を与え、スプライシングの変化を引き起こし、異常または欠損タンパク質をもたらします。c.5851_5854delAGTT病原性変異は、コードエキソンのヌクレオチド位置5851から5854までの4ヌクレオチドの欠失によるものです。 BRCA2遺伝子のエクソン10に変異が生じ、翻訳フレームシフトが起こり、予測される代替終止コドン（p.S1951WfsTer）が生じる。注目すべきことに、以前に報告されたように、c.631G>Aとc.7008-2A>Tの両方の変異が同じ患者で検出された。34 最初の変異は、BRCA2エクソン7のアデノシン（A）がグアニン（G）を含むヌクレオチドに置換されることで、コドン211のバリンがイソロイシンに変化する。イソロイシンアミノ酸は、非常に類似した性質を持つアミノ酸である。この変化は、正常なmRNAスプライシングに影響を与える。2番目の変異はイントロン領域に位置し、BRCA2をコードする遺伝子のエクソン13の前に、二重のAからチミン（T）への置換が生じる。c.7008-2A>Tの変化は、長さの異なる複数の転写産物を生成する可能性がある。さらに、BRCA2 PV群では、4/ 18個の変異（22.2%）はイントロン領域におけるものであった。
次に、BRCA1/2の有害変異を機能ドメインとタンパク質結合領域にマッピングしました（図4）。BRCA1遺伝子では、PVの50%が乳がんクラスター領域（BCCR）に位置し、変異の22%が卵巣がんクラスター領域（OCCR）に位置していました（図4A）。BRCA2 PVでは、変異の35.7%がBCCR領域に位置し、変異の42.8%がOCCRに位置していました（図4B）。次に、BRCA1およびBRCA2タンパク質ドメイン内のPVの位置を評価しました。BRCA1タンパク質では、ループおよびコイルドコイルドメインに3つのPV、BRCTドメインに2つの変異が見つかりました（図4A）。BRCA2タンパク質では、4つのPVがBRCリピートドメインにマッピングされ、3つのイントロン変化と3つのエクソン変化が検出されました。オリゴ/オリゴ糖結合（OB）ドメインとタワー（T）ドメイン（図4B）。
図4 BRCA1およびBRCA2タンパク質の模式図と病原性変異の局在。この図は、乳がん患者におけるBRCA1（A）およびBRCA2（B）病原性変異の分布を示しています。エクソン変異は青色で、イントロン変異はオレンジ色で示されています。棒グラフの高さは症例数を表しています。BRCA1およびBRCA2タンパク質とその機能ドメインが報告されています。（A）BRCA1タンパク質は、ループドメイン（RING）と核局在化配列（NLS）、コイルドコイルドメイン、SQ/TQクラスタードメイン（SCD）、およびBRCA1 C末端ドメイン（BRCT）を含んでいます。（B）BRCA2タンパク質は、8つのBRCリピート、ヘリックスドメイン（Helical）を持つDNA結合ドメイン、3つのオリゴヌクレオチド/オリゴ糖結合（OB）フォールド、タワードメイン（T）、およびC側のNLSを含んでいます。乳がんクラスター領域（BCCR）と呼ばれる領域下部には卵巣がんクラスター領域（OCCR）が示されています。*終止コドンを決定する変異を表します。
次に、BRCA1/2 PVの存在と相関する可能性のある乳がんの臨床病理学的特徴を調査した。完全な臨床記録は、BRCA1/2陰性患者（非キャリア）181名と全キャリア（n = 35）について入手可能であった。腫瘍増殖率とグレードの間には相関関係があった。
我々は、コホートの中央値（25%、範囲<10-90%）に基づいてKi-67の分布を計算した。Ki-67が25%未満の被験者は「低Ki-67」と定義され、25%以上の値は「高Ki-67」とみなされた。非キャリアとBRCA1 PVキャリアの間で有意なKi-67の差（p<0.01）が認められた（図5A）。
図5 BRCA1およびBRCA2 PVの有無にかかわらず乳がん女性におけるKi-67とグレード分布の相関。(A) 181人の非キャリアBC患者とBRCA1(18)またはBRCA2(17)PV患者におけるKi-67の中央値を示すボックスプロット。p値が0.5未満の場合を統計的に有意とみなした。(B) BRCA1およびBRCA2変異状態(WT被験者、BRCA1およびBRCA2 PVキャリア)に従ってBCがん患者を組織学的グレードグループ(G2およびG3)に分類したヒストグラム。
同様に、腫瘍グレードがBRCA1/2 PVの存在と相関するかどうかを調べた。我々の集団にはG1 BCが存在しなかったため、患者を2つのグループ（G2またはG3）に分けた。Ki-67の結果と一致して、解析により、腫瘍グレードとBRCA1変異の間に統計的に有意な相関が明らかになり、BRCA1キャリアでは非キャリアと比較してG3腫瘍の割合が高かった（p<0.005）（図5B）。
DNA シーケンス技術の進歩により、BRCA1/2 遺伝子検査において前例のない進歩が実現し、がんの家族歴のある患者にとって重要な意味を持つようになりました。現在までに、約 20,000 の BRCA1/2 変異が特定され、米国医学遺伝学会 35 および ENIGMA システム 35,36 に従って分類されています。BRCA1/2 変異スペクトルは地理的な地域によって大きく異なることはよく知られています。37 イタリア国内では、BRCA1/2 PV の割合は 8% から 37% の範囲で、国内で大きなばらつきが見られます。38,39 人口が 500 万人近くいるシチリア島は、人口数でイタリアで 5 番目に大きい地域です。西シチリアにおける BRCA1/2 の分布に関するデータは存在しますが、島の東部については広範な証拠はありません。
私たちの研究は、東シチリアの乳がん患者におけるBRCA1/2 PVの発生率に関する最初の報告の1つです。28 私たちのコホートでは乳がんが圧倒的に多い疾患であるため、分析は乳がんに焦点を当てました。
389人の乳がん患者を検査したところ、9%がBRCA1/2 PVを保有しており、BRCA1とBRCA2に均等に分布していました。これらの結果は、イタリア人集団で以前に報告された結果と一致しています。28 興味深いことに、私たちのコホートの3%（13/389）は男性でした。この割合は、男性の乳がん（全乳がんの1%）40 に予想されるよりも高く、BRCA1/2変異リスクに基づいて集団を選択したことを反映しています。しかし、これらの男性はいずれもBRCA1/2 PVを発症しなかったため、PALB2、RAD51CおよびDなどのよりまれな変異の存在を除外するためのさらなる分子解析の候補となりました。BRCA2 VUSが明らかになった被験者の7%で、意義不明の変異が検出されました。この結果も、既存の証拠と一致しています。28,41,42
BRCA1/2変異を有する女性における乳がん分子サブタイプの分布を解析したところ、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）とBRCA1 PV（58.8%）、およびルミナルB乳がんとBRCA2 PV（55.6%）との既知の関連性が確認されました。16,43 BRCA1およびBRCA2 PVキャリアにおけるルミナルAおよびHER2+腫瘍は、既存の文献データと一致しています。16,43
次に、BRCA1/2 PV の種類と位置に焦点を当てます。私たちのコホートでは、最も一般的な BRCA1 PV は c.5035_5039delCTAAT でした。Incorvaia らは、シチリアのコホートではこの変異は説明されていませんが、他の著者らはこれを生殖細胞系BRCA1 PVとして報告しています。34 私たちのコホートでは、シチリアで観察されたc.181T>G、c.514del、c.3253dupA、c.5266dupCなど、いくつかのBRCA1 PVが見つかりました。28 これらのうち、2つのBRCA1創始者変異（c.181T>Gとc.5266dupC）は、東欧および中央ヨーロッパ（ポーランド、チェコ）、スロベニア、オーストリア、ハンガリー、ベラルーシ、ドイツのアシュケナージ系ユダヤ人によく見られ、44,45 米国とアルゼンチンでは、最近、イタリアの乳がんおよび卵巣がん患者の「再発性生殖細胞系変異」として定義されました。34c.514del変異は、以前にシチリア北部のパレルモとメッシーナの8人の乳がん患者で確認されています。 Incorvaia らもカターニアのいくつかの家族で c.3253dupA 変異を発見しました。28 最も代表的な BRCA2 PV は c.428dup、c.5851_5854delAGTT、およびイントロン変異 c.8487+1G>A であり、これらはパレルモの患者でより詳細に報告されています。28 c.428dup、c.5851_5854delAGTT PV はシチリア島北西部、主にトラパニとパレルモ地域の家庭で観察されましたが、c.5851_5854delAGTT PV はシチリア島北西部の家庭で観察されました。8487+1G>A 変異はメッシーナ、パレルモ、カルタニッセッタの被験者でより一般的でした。28 Rebbeck ら以前にコロンビアでc.5851_5854delAGTT変異が報告されている。37 シチリア島（アグリジェント、シラクーサ、ラグーザ）の乳がんおよび卵巣がん患者では、別のBRCA2 PVであるc.631+1G>Aが見つかっている。28 注目すべきことに、我々は同一患者において2つのBRCA2変異（BRCA2 c.631G>Aおよびc.7008-2A>T）の共存を観察した。これは以前に報告されているように、シスモードで分離されていると推測される。34,46 これらのBRCA2二重変異はイタリア地域で頻繁に観察されており、早期終止コドンを導入し、メッセンジャーRNAスプライシングに影響を与え、BRCA2タンパク質の機能不全を引き起こすことがわかっている。47,48
また、タンパク質ドメインと遺伝子の推定OCCRおよびBCCR領域にBRCA1およびBRCA2 PVをマッピングしました。これらの領域は、Rebbeckらによってそれぞれ卵巣がんおよび乳がんの発症リスク領域として記述されています。49 しかし、生殖細胞系列変異の位置と乳がんまたは卵巣がんのリスクとの関連性に関する証拠は依然として議論の的となっています。28,50-52 私たちの集団では、BRCA1 PVは主にBCCR領域に位置し、BRCA2 PVは主にOCCR領域に位置していました。しかし、推定OCCRおよびBCCR領域とBCの特徴との関連性は見つかりませんでした。これは、BRCA1/2変異を有する患者の数が限られているためかもしれません。タンパク質ドメインの観点から見ると、BRCA1 PVはタンパク質全体に分布しており、BRCA2変異はBRCリピートドメインに優先的に見られます。
最後に、BCの臨床病理学的特徴とBRCA1/2 PVとの相関を調べました。含まれる患者数が限られているため、Ki-67と腫瘍グレードの間に有意な相関関係が見られました。Ki-67の評価と解釈は依然として議論の余地がありますが、高い増殖率が疾患再発リスクの増加と生存率の低下に関連していることは確かです。現在、「高」Ki-67と「低」Ki-67を区別するためのカットオフ値は20%です。しかし、この閾値は、Ki-67の中央値が25%であるBRCA1/2変異患者集団には適用されません。この高いKi-67率の傾向は、ルミナルBおよびTNBCコホートにおけるルミナルA腫瘍の少なさによって説明できます。しかし、より高いKi-67カットオフ値（25～30%）の方が、患者の予後に応じてより適切に層別化できるという証拠もあります。53,54 私たちの分析結果から、高いKi-67値とグレード、およびBRCA1 PVの存在との間に有意な相関関係が見られることは驚くべきことではない。実際、BRCA1関連腫瘍はTNBCに典型的であり、より攻撃的な特徴を示す。16,17
結論として、本研究はシチリア島東部の乳がん患者コホートにおけるBRCA1/2の変異状態に関する報告を提供する。全体として、我々の知見は、乳がんにおける変異の頻度と臨床病理学的特徴の両方に関して、既存の証拠と一致している。BRCA1/2変異を有する乳がん患者の大規模集団を対象とした、例えば多ゲノム拡張変異解析を用いたさらなる研究が、BRCA1/2とは異なる頻度の低い病的変異の存在を評価するために必要である。これにより、遺伝子変異によりがんのリスクが高まっている被験者の増加を特定し、適切に管理することが可能になる。
患者が研究目的で匿名で腫瘍サンプルを公開することについてインフォームドコンセントに署名したことを確認しました。すべての患者はヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームドコンセントに署名しました。AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco” の方針に従って、BRCA1/2 分析は臨床診療に従って実施され、すべての患者が書面によるインフォームドコンセントを与えたため、この研究は倫理審査を免除されました。患者はまた、研究目的でのデータの使用にも同意しています。
倫理委員会の要請に基づき、乳がん患者の治療にご協力いただいたパオロ・ヴィニェリ教授に感謝いたします。
フェデリカ・マルトラーナは、ジェンティリ研究所、イーライリリー、ノバルティス、ファイザーから謝礼金を受け取っていることを報告している。他の著者は、本研究において利益相反がないことを表明する。
1. Sung H、Ferlay J、Siegel RLら。「世界の癌統計2020：GLOBOCANは世界185か国における36種類の癌の発生率と死亡率を推定する」CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660