Javascript je v vašem brskalniku trenutno onemogočen. Nekatere funkcije tega spletnega mesta ne bodo delovale, če je javascript onemogočen.
Registrirajte se s svojimi specifičnimi podatki in specifičnim zdravilom, ki vas zanima, in vaše podatke bomo uskladili s članki v naši obsežni bazi podatkov ter vam nemudoma poslali kopijo v PDF obliki po e-pošti.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Oddelek za klinično in Eksperimentalna medicina, Univerza v Catanii, Catania, 95123, Italija;2 Center za eksperimentalno onkologijo in hematologijo, AOU Policlinico »G.Rodolico – San Marco«, Catania, 95123, Italija; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italija; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Italija; 6 Oddelek za biomedicinske in biotehnološke znanosti, Univerza v Cataniji, Medicinska genetika, Catania, Italija, 95123; 7Raziskovalni inštitut Oasi - IRCCS, Troina, 94018, Italija Komunikacije: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, e-pošta [email protected]; [email protected] Namen: Mutacije zarodne linije v genih BRCA1 in BRCA2 ter uveljavljen rak dojke (RD), jajčnikov (RJ) in drugi, povezani z življenjskim tveganjem za raka. Testiranje gena BRCA je ključnega pomena za oceno individualnega tveganja, pa tudi za iskanje metod preprečevanja pri zdravih nosilcih in prilagajanje zdravljenja pri bolnikih z rakom. Razširjenost sprememb BRCA1 in BRCA2 se med geografskimi regijami zelo razlikuje in čeprav obstajajo podatki o patogenih variantah BRCA v sicilijanskih družinah, primanjkuje študij, ki bi bile posebej usmerjene na populacije v vzhodni Siciliji. Cilj naše študije je bil raziskati incidenco in porazdelitev patogenih sprememb zarodne linije BRCA v kohorti bolnikov z RD iz vzhodne Sicilije in oceniti njihovo povezavo s specifičnimi lastnostmi RD z uporabo sekvenciranja naslednje generacije. Prisotnost sprememb je bila v korelaciji s stopnjo tumorja in indeksom proliferacije. REZULTATI: Skupno je imelo 35 bolnikov (9 %) patogeno varianto BRCA, 17 (49 %) BRCA1 in 18 (51 %) BRCA2. Spremembe BRCA1 so razširjene pri bolnikih s trojno negativnim RD, medtem ko so mutacije BRCA2 pogostejše pri bolnikih z luminalnim RD. V primerjavi z Preiskovanci z variantami BRCA1, ki niso bili nosilci mutacije, so imeli bistveno višjo stopnjo tumorja in proliferativni indeks. Zaključki: Naše ugotovitve ponujajo pregled mutacijskega statusa BRCA pri bolnikih z rakom dojke iz vzhodne Sicilije in potrjujejo vlogo analize NGS pri prepoznavanju bolnikov z dednim rakom dojke. Na splošno so ti podatki skladni s prejšnjimi dokazi, ki podpirajo presejalne preglede za BRCA za pravilno preprečevanje in zdravljenje raka pri nosilcih mutacij.
Rak dojke (RD) je najpogostejša maligna bolezen na svetu in najsmrtonosnejši rak pri ženskah.1 Biološke značilnosti, ki določajo prognozo in klinično vedenje RD, so bile sčasoma obsežno preučene in delno pojasnjene. Pravzaprav se trenutno uporablja več nadomestnih označevalcev za razvrščanje RD v različne molekularne podtipe. To so estrogenski (ER) in/ali progesteronski receptor (PgR), amplifikacija receptorja 2 za humani epidermalni rastni faktor (HER2), indeks proliferacije Ki-67 in stopnja tumorja (G).2 Kombinacija teh spremenljivk je opredelila naslednje kategorije RD: 1) Luminalni tumorji, ki kažejo izražanje ER in/ali PgR, so predstavljali 75 % RD. Ti tumorji so bili nadalje razdeljeni na Luminalni A, ko je bil Ki-67 pod 20 % in HER2 negativen, in Luminalni B, ko je bil Ki-67 enak ali večji od 20 % in v prisotnosti amplifikacije HER2, ne glede na indeks proliferacije; 2) HER2+ tumorji, ki so negativni za ER in PgR, vendar kažejo amplifikacijo HER2. Ta skupina predstavlja 10 % vseh tumorjev dojke; 3) Trojno negativni rak dojke (TNBC), ki ne kaže izražanja ER in PgR ter amplifikacije HER2, predstavlja približno 15 % rakov dojke.2-4
Med temi podtipi BC predstavljata stopnja tumorja in indeks proliferacije presečna biomarkerja, ki sta neposredno in neodvisno povezana z agresivnostjo tumorja in prognozo.5,6
Poleg zgoraj omenjenih bioloških značilnosti je v zadnjih nekaj letih postala vse pomembnejša vloga podedovanih genetskih sprememb, ki vodijo do razvoja raka dojke.7 Približno 1 od 10 tumorjev dojke je podedovanih zaradi sprememb zarodne linije v specifičnih genih.8 Dve veliki epidemiološki študiji, v kateri je sodelovalo več kot 180.000 žensk, sta nedavno identificirali skupino osmih genov (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C in RAD51D), ki so primarno odgovorni za dedni rak dojke. Med temi geni sta BRCA1 in BRCA2 (v nadaljevanju BRCA1/2) pokazala najmočnejšo korelacijo z razvojem tumorjev dojke.9–12 Pravzaprav mutacije zarodnega BRCA1/2 znatno povečajo življenjsko tveganje za rak dojke, pa tudi za druge malignome, vključno z rakom jajčnikov, prostate, trebušne slinavke, kolorektuma in melanomom. Od 13. do 80. leta starosti je kumulativna incidenca raka dojke 72 % pri ženskah s patogeno varianto (PV) BRCA1 in 69 % pri ženskah z BRCA2. PV.14
Omeniti velja, da nedavna publikacija nakazuje, da je tveganje za BC odvisno od vrste PV. Pravzaprav so v primerjavi s patogenimi skrajšanimi variantami očitne missense variante, zlasti v genu BRCA1, povezane z zmanjšanim tveganjem za BC, zlasti pri starejših ženskah.15
Prisotnost poliarnih tumorjev BRCA1 ali BRCA2 je bila povezana z različnimi biološkimi in kliničnopatološkimi značilnostmi.16,17 Z BRCA1 povezani raki dojke so običajno klinično agresivni, slabo diferencirani in zelo proliferativni. Ti tumorji so običajno trojno negativni in se pojavijo zgodaj. Tumorji, ki se pojavijo pri bolnikih z mutacijo BRCA2, običajno kažejo zmerno do dobro diferencirane stopnje in spremenljive proliferativne indekse. Ti tumorji so pogostejši v lumnu B in se običajno pojavijo pri starejših odraslih.16-18 Omeniti velja, da mutacije v BRCA1 in BRCA2 povečajo občutljivost na specifična zdravljenja, vključno s platinovimi solmi in ciljnimi zdravili, kot so zaviralci poli(ADP-riboze) polimeraze (PARPi).19,20
V zadnjih nekaj letih je uvedba sekvenciranja naslednje generacije (NGS) v klinično prakso omogočila molekularno testiranje sindromov dovzetnosti za raka pri vse večjem številu bolnikov z rakom dojke, vključno z BRCA1/2.21 Hkrati so bile uporabljene definicije, ki temeljijo na natančnih merilih glede družinske anamneze, demografskih in klinično-patoloških značilnosti, za boljšo identifikacijo posameznikov, ki so vredni testiranja na BRCA1/2.22,23 V tem kontekstu se kopičijo dokazi o presejanju BRCA1/2 v specifičnih populacijah, kar poudarja razlike med geografskimi regijami.24–27 Čeprav obstajajo poročila o kohorti bolnikov z rakom dojke v zahodni Siciliji, je na voljo manj podatkov o presejanju BRCA1/2 v populaciji vzhodne Sicilije.28,29
Tukaj opisujemo rezultate presejalnih testov za zarodno linijo BRCA1/2 pri bolnikih z rakom dojke iz vzhodne Sicilije, ki dodatno povezujejo prisotnost mutacij BRCA1 ali BRCA2 z glavnimi klinično-patološkimi značilnostmi teh tumorjev.
V »Centru za eksperimentalno onkologijo in hematologijo« v bolnišnici Policlinico Rodolico – San Marco v Cataniji je bila izvedena retrospektivna študija. Od januarja 2017 do marca 2021 je bilo v naš molekularno-diagnostični laboratorij napotenih skupno 455 bolnic z rakom dojke in jajčnikov, melanomom, rakom trebušne slinavke ali prostate na genetsko testiranje BRCA/2. Ta študija je bila izvedena v skladu s Helsinško deklaracijo in vsi udeleženci so pred molekularno analizo podali pisno informirano soglasje.
Histološke in biološke značilnosti (ER, PgR, status HER2, Ki-67 in stopnja) tumorskega karcinoma (BC) so bile ocenjene na podlagi biopsije jedra ali kirurških vzorcev, pri čemer so bile upoštevane le agresivne tumorske komponente. Na podlagi teh značilnosti so bili BC razvrščeni na naslednji način: luminalni A (ER+ in/ali PgR+, HER2-, Ki-67 < 20 %), luminalni B (ER+ in/ali PgR+, HER2-, Ki-67 ≥ 20 %), luminalni B-HER2+ (ER in/ali PgR+, HER2+), HER2+ (ER in PgR-, HER2+) ali trojno negativni (ER in PgR-, HER2-).
Pred oceno statusa mutacij BRCA1 in BRCA2 je multidisciplinarna ekipa, ki je vključevala onkologa, genetika in psihologa, pri vsakem pacientu opravila posvet o tumorski genetiki, da bi ugotovila prisotnost BRCA1 in/ali BRCA1 ali posameznikov z visokim tveganjem za paracetamol v genu BRCA2. Izbor pacientov je bil izveden v skladu s smernicami Italijanskega združenja za medicinsko onkologijo (AIOM) in lokalnimi sicilijanskimi priporočili.30,31 Ta merila vključujejo: (i) družinsko anamnezo znanih patogenih variant v genih za občutljivost (npr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) moške z rakom dojke; (iii) tiste z rakom dojke in rakom raka dojke; (iv) ženske z rakom dojke <36 let, tritonialnim rakom dojke <60 let ali bilateralnim rakom dojke <50 let; (v) osebno zdravstveno anamnezo raka dojke <50 let in vsaj enega sorodnika prve stopnje: (a) rak dojke < 50 let; (b) nemucinozni in nemejni rak dojke katere koli starosti; (c) bilateralni rak dojke; (d) moški rak dojke; (e) rak trebušne slinavke; (f) rak prostate; (vi) dva ali več primerov osebne anamneze raka dojk > 50 let in družinske anamneze raka dojk, raka prsnega koša ali raka trebušne slinavke pri sorodnikih, ki so si v sorodstvu prve stopnje (vključno s sorodniki, s katerimi je v sorodstvu prve stopnje); (vii) osebna anamneza raka dojk in vsaj en sorodnik prve stopnje: (a) rak dojk < 50 let; (b) rak brez raka dojk; (c) bilateralni rak dojk; (d) moški rak dojk; (vii) ženska z visokostopenjskim seroznim rakom dojk.
Od vsakega pacienta smo odvzeli 20 ml perifernega vzorca krvi in ​​ga zbrali v epruvete z EDTA (BD Biosciences). Genomsko DNK smo izolirali iz 0,7 ml vzorcev polne krvi z uporabo kompleta za izolacijo QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Hilden, Italija) v skladu z navodili proizvajalca in jo spustili skozi fluorometer Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Izvedli smo kvantifikacijo. Obogatitev tarč in pripravo knjižnice izvede Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pripravljen za nalaganje v komplet Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 za avtomatizirano pripravo knjižnice v skladu z navodili proizvajalca. Komplet je sestavljen iz dveh multipleksnih PCR primerjev, ki jih je mogoče uporabiti za preučevanje vseh genov BRCA1 (NM_007300.3) in BRCA2 (NM_000059.3). Na kratko, 15 µL vsakega razredčenega vzorca DNK (10 ng) je bilo dodanih na plošče s črtno kodo za pripravo knjižnice, vsi reagenti in potrošni material pa so bili naloženi v instrument Ion Chef™. Nato sta bila na instrumentu Ion Chef™ izvedena avtomatizirana priprava knjižnice in združevanje vzorčne knjižnice s črtno kodo. Število pripravljenih knjižnic je bilo nato ocenjeno s fluorometrom Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Na koncu so knjižnice združene v ekvimolarnih razmerjih v epruvetah za vzorce knjižnice Ion Chef™ (epruvete s črtno kodo) in naložene na instrument Ion Chef™. Sekvenciranje je bilo izvedeno z instrumentom Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) z uporabo čipa Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Analiza podatkov je bila izvedena s programsko opremo Amplicon Suite (SmartSeq srl) in programsko opremo Ion Reporter.
Vsa nomenklatura variant je sledila trenutnim smernicam Konzorcija za variacije človeškega genoma, ki so na voljo na spletu (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinični pomen variant BRCA1/2 je bil opredeljen z uporabo klasifikacije Mednarodnega konzorcija ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) in s posvetovanjem z različnimi bazami podatkov, kot so ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD in UMD. Klasifikacija vključuje pet različnih kategorij tveganja: benigne (kategorija I), verjetno benigne (kategorija II), variante negotovega pomena (VUS, kategorija III), verjetno patogene (kategorija IV) in patogene (kategorija V). VarSome je analiziral tudi vpliv mutacij na strukturo in delovanje beljakovin, kar je informativno orodje z dostopom do 30 baz podatkov.32
Za določitev potencialnega kliničnega pomena vsakemu VUS so bili uporabljeni naslednji računalniški algoritmi za napovedovanje beljakovin: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) in Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Različice, razvrščene v razred 1 in 2, so bile obravnavane kot divji tip.
Sangerjevo sekvenciranje je potrdilo prisotnost vsake patogene variante. Na kratko, za vsako zaznano varianto je bil zasnovan par specifičnih začetnih oligonukleotidov z uporabo referenčnih zaporedij genov BRCA1 in BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 in NG_012772.3, NM_000059.3). Zato je bila izvedena ciljna PCR, ki ji je sledilo Sangerjevo sekvenciranje.
Bolniki, pri katerih je bil test za gen BRCA1/2 negativen, so bili testirani z multipleksno ligacijsko odvisno amplifikacijo sond (MLPA) v skladu z navodili proizvajalca za oceno prisotnosti velikih genomskih preureditev (LGR). Na kratko, vzorci DNK so denaturirani in uporabljenih je do 60 sond, specifičnih za gen BRCA1 in BRCA2, od katerih vsaka zazna specifično zaporedje DNK, dolgo približno 60 nukleotidov. Produkti amplifikacije sond, ki so bili sestavljeni iz edinstvenega nabora PCR amplikonov, so bili nato analizirani s kapilarno elektroforezo in s programsko opremo Cofalyser.Net v povezavi z ustreznimi tabelami Cofalyser, specifičnimi za posamezne serije (www.mrcholland.com).
Izbrane kliničnopatološke spremenljivke (histološka stopnja in indeks proliferacije Ki-67%) so bile povezane s prisotnostjo BRCA1/2 PV, izračunano z uporabo programske opreme Prism različice 8.4 z uporabo Fisherjevega natančnega testa, ob predpostavki, da je p-vrednost < 0,05 pomembna.
Med januarjem 2017 in marcem 2021 je bilo 455 bolnikov pregledanih glede mutacij zarodne linije BRCA1/2. Testiranje mutacij je bilo opravljeno v Centru za eksperimentalno onkologijo in hematologijo bolnišnice Policlinico. V skladu s sicilijanskimi smernicami (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, št. 02-Venerdì 10 Jannaio 2020) je bilo v bolnišnici Rodolico de Catania – San Marco” skupno 389 bolnikov. Od tega je bilo 37 bolnikov z rakom dojke, 37 z rakom jajčnikov, 16 z rakom trebušne slinavke, 8 z rakom prostate in 5 z melanomom. Porazdelitev bolnikov glede na vrsto raka in rezultate analize je prikazana na sliki 1.
Slika 1 prikazuje diagram poteka, ki prikazuje pregled študije. Bolnice s tumorji dojke, melanoma, trebušne slinavke, prostate ali jajčnikov so bile testirane na mutacije v genih BRCA1 in BRCA2.
Okrajšave: PV, patogena varianta; VUS, varianta negotovega pomena; WT, zaporedje BRCA1/2 divjega tipa.
Naše študije smo selektivno osredotočili na kohorte z rakom dojke. Bolnice so imele mediano starost 49 let (razpon 23–89) in so bile pretežno ženske (n=376 oziroma 97 %).
Od teh preiskovank jih je imelo 64 (17 %) mutacije BRCA1/2 in vse so bile ženske. Petintrideset (9 %) jih je imelo PV in 29 (7,5 %) VUS. Sedemnajst (48,6 %) od 35 patogenih variant se je pojavilo pri BRCA1 in 18 (51,4 %) pri BRCA2, medtem ko se je 5 VUS pojavilo pri BRCA1 (17,2 %) in 24 (82,8 %) pri BRCA2 (sliki 1 in 2). LGR ni bil prisoten v analizi MLPA.
Slika 2. Analiza mutacij BRCA1 in BRCA2 pri 389 bolnicah z rakom dojke. (A) Porazdelitev patogenih variant (PV) (rdeča), variant z negotovim pomenom (VUS) (oranžna) in WT (modra) pri 389 bolnicah z rakom dojke; (B) 389 bolnic z rakom dojke Petintrideset (9 %) je imelo patogene variante (PV) BRCA1/2. Med njimi jih je bilo 17 (48,6 %) nosilcev BRCA1 PV (temno rdeča) in 18 (51,4 %) nosilcev BRCA2 (svetlo rdeča); (C) 29 (7,5 %) od 389 preiskovank je nosilo VUS, 5 (17,2 %) genov BRCA1 (temno oranžna) in 24 (82,8 %) genov BRCA2 (svetlo oranžna).
Okrajšave: PV, patogena varianta; VUS, varianta negotovega pomena; WT, zaporedje BRCA1/2 divjega tipa.
Nato smo raziskali prevalenco molekularnih podtipov BC pri bolnicah z BRCA1/2 PV. Porazdelitev je vključevala 2 (5,7 %) bolnic z luminalnim A, 15 (42,9 %) z luminalnim B, 3 (8,6 %) z luminalnim B-HER2+, 2 (5,7 %) z HER2+ in 13 (37,1 %) bolnic s TNBC. Med bolnicami, pozitivnimi na BRCA1, jih je imelo 5 (29,4 %) luminalni B BC, 2 (11,8 %) z boleznijo HER2+ in 10 (58,8 %) z TNBC. Tumorji brez mutacij BRCA1 so bili bodisi luminalni A bodisi luminalni B-HER2+ (slika 3). V podskupini, pozitivni na BRCA2, je bilo 10 (55,6 %) tumorjev z luminalnim B, 3 (16,7 %) z luminalnim B-HER2+, 3 (16,7 %) z TNBC in 2 (11,1 %) z luminalnim A (slika 3). Ni bilo tumorjev HER2+. so bile prisotne v tej skupini. Tako so mutacije BRCA1 razširjene pri bolnikih s TNBC, medtem ko so spremembe BRCA2 prevladujoče pri posameznikih z lumenom B.
Slika 3 Razširjenost podtipov raka dojke pri bolnicah s patogenimi variantami v BRCA1 in BRCA2. Histogrami, ki prikazujejo porazdelitev paralize BRCA1- (temno rdeča) in BRCA2- (svetlo rdeča) med molekularnimi podtipi bolnic z rakom dojke. Številke, navedene v vsakem okvirčku, predstavljajo odstotek bolnic s paralizo BRCA1 in BRCA2 za vsako podvrsto raka dojke.
Okrajšave: PV, patogena varianta; HER2+, pozitiven na receptor 2 za humani epidermalni rastni faktor; TNBC, trojno negativni rak dojke.
Nato smo ocenili vrsto in lokalizacijo genov PV BRCA1 in BRCA2. Pri PV BRCA1 smo opazili 7 enojnih nukleotidnih variant (SNV), 6 delecij, 3 podvajanja in 1 insercijo. Le ena mutacija (c.5522delG) predstavlja novo odkritje. Najpogostejši PV BRCA1, odkrit pri obeh preiskovancih, je bil c.5035_5039delCTAAT. Ta sprememba vključuje delecijo petih nukleotidov (CTAAT) v eksonu BRCA1 15, kar povzroči zamenjavo aminokisline levcin s tirozinom na kodonu 1679 in zaradi premika bralnega okvira prevajanja s predvidenim alternativnim stop kodonom povzroči prezgodnjo skrajšanje beljakovin. Vse druge spremembe so odkrite le v enem primeru. Omeniti velja, da se je eden od poročanih PV nahajal v konsenzni regiji mesta spajanja (c.4357+1G>T) (tabela 1).
Glede BRCA2 PV smo opazili 6 delecij, 6 SNV in 2 podvajanja. Nobena od najdenih sprememb ni nova. V naši populaciji so se ponovile tri mutacije, c.428dup in c.8487+1G>A, opaženi pri 3 osebah, sledi pa c.5851_5854delAGTT, odkrita v dveh primerih. Sprememba c.428dup vključuje ponovitev C v eksonu 5 gena BRCA2, za katerega se predvideva, da kodira okrnjen, nefunkcionalen protein. Mutacija c.8487+1G>A se pojavi v intronski regiji introna 19 gena BRCA2 (± 1,2) in vpliva na konsenzno zaporedje spajanja, kar povzroči spremenjeno spajanje, kar povzroči nenormalen ali odsoten protein. Patogena varianta c.5851_5854delAGTT je posledica 4-nukleotidne delecije z nukleotidnih položajev 5851 do 5854 v kodirajočem eksonu 10 gena BRCA2 in povzroči translacijsko... premik bralnega okvira s predvidenim alternativnim stop kodonom (p.S1951WfsTer). Omeniti velja, da sta bili, kot je bilo že poročano, obe spremembi c.631G>A in c.7008-2A>T odkriti pri istem pacientu.34 Prva mutacija vključuje zamenjavo adenozina (A) v eksonu 7 gena BRCA2 z nukleotidom, ki vsebuje gvanin (G), kar povzroči spremembo valina v izolevcin pri kodonu 211, izolevcin pa je aminokislina z zelo podobnimi lastnostmi. Ta sprememba vpliva na normalno spajanje mRNA. Druga varianta se nahaja v intronski regiji in povzroči dvojno zamenjavo A s timinom (T) pred eksonom 13 gena, ki kodira BRCA2. Sprememba c.7008-2A>T lahko povzroči več transkriptov različnih dolžin. Poleg tega so bile v skupini PV BRCA2 4 od 18 sprememb (22,2 %) intronske.
Nato smo preslikali škodljive mutacije BRCA1/2 v funkcionalnih domenah in regijah, ki vežejo beljakovine (slika 4). V genu BRCA1 se je 50 % PV nahajalo v regiji grozda raka dojke (BCCR), medtem ko se je 22 % mutacij nahajalo v regiji grozda raka jajčnikov (OCCR) (slika 4A). V PV BRCA2 se je 35,7 % variant nahajalo v regiji BCCR in 42,8 % mutacij se je nahajalo v OCCR (slika 4B). Nato smo ocenili lokacijo PV znotraj domen beljakovin BRCA1 in BRCA2. Pri beljakovini BRCA1 smo našli tri PV v domenah zanke in coiled coil ter dve mutaciji v domeni BRCT (slika 4A). Pri beljakovini BRCA2 so se 4 PV preslikali na domeno ponavljanja BRC, medtem ko so bile v domenah oligo/oligosaharidov (OB) in stolpnicah (T) zaznane 3 intronske in 3 eksonske spremembe (slika 4B).
Slika 4 Shematski prikaz proteinov BRCA1 in BRCA2 ter lokalizacija patogenih variant. Ta slika prikazuje porazdelitev patogenih variant BRCA1 (A) in BRCA2 (B) pri bolnicah z rakom dojke. Eksonske mutacije so prikazane v modri barvi, intronske variante pa v oranžni. Višina stolpca predstavlja število primerov. Prikazani so proteini BRCA1 in BRCA2 ter njihove funkcionalne domene. (A) Beljakovina BRCA1 vsebuje zančno domeno (RING) in zaporedje jedrne lokalizacije (NLS), domeno z zvitimi vijačnicami, domeno gruče SQ/TQ (SCD) in C-terminalno domeno BRCA1 (BRCT). (B) Beljakovina BRCA2 vsebuje osem ponovitev BRC, domeno, ki veže DNA, z vijačno domeno (Helic), tri gube, ki vežejo oligonukleotide/oligosaharide (OB), domeno stolpa (T) in NLS na strani C. Območja, imenovana regija gruče raka dojke (BCCR) in regija gruče raka jajčnikov (OCCR), so prikazana spodaj. *Predstavlja mutacije, ki določajo zaustavitev kodoni.
Nato smo raziskali klinično-patološke značilnosti dojk, ki bi lahko bile povezane s prisotnostjo paracetamola BRCA1/2. Na voljo so bili popolni klinični zapisi za 181 bolnikov z negativnim statusom BRCA1/2 (brez nosilcev) in vse nosilce (n = 35). Obstajala je korelacija med stopnjo proliferacije tumorja in stopnjo.
Porazdelitev Ki-67 smo izračunali na podlagi mediane naše kohorte (25 %, razpon <10–90 %). Preiskovanci s Ki-67 < 25 % so bili opredeljeni kot »nizki Ki-67«, medtem ko so bili posamezniki z vrednostmi ≥ 25 % obravnavani kot »visoki Ki-67«. Ugotovljene so bile pomembne razlike v Ki-67 (p < 0,01) med ne-nosilci in nosilci BRCA1 PV (slika 5A).
Slika 5 Korelacija Ki-67 s porazdelitvijo stopnje pri ženskah z rakom dojke z in brez paralize BRCA1 in BRCA2. (A) Škatlasti diagram, ki prikazuje mediane vrednosti Ki-67 pri 181 bolnicah z rakom dojke brez nosilk v primerjavi z bolnicami z BRCA1 (18) ali BRCA2 (17) paraliza. Vrednosti P pod 0,5 so bile ocenjene kot statistično pomembne. (B) Histogram, ki predstavlja razvrstitev bolnic z rakom dojke v histološke skupine stopnje (G2 in G3) glede na status mutacij BRCA1 in BRCA2 (osebice z WT, nosilke BRCA1 in BRCA2 paralize).
Prav tako smo preučili, ali je stopnja tumorja povezana s prisotnostjo BRCA1/2 PV. Ker v naši populaciji ni bilo G1 BC, smo bolnice razdelili v dve skupini (G2 ali G3). V skladu z rezultati Ki-67 je analiza pokazala statistično pomembno korelacijo med stopnjo tumorja in mutacijo BRCA1, z večjim deležem tumorjev G3 pri nosilcih BRCA1 v primerjavi z nenosilci (p < 0,005) (slika 5B).
Napredek v tehnologiji sekvenciranja DNK je omogočil doslej neverjeten napredek pri genetskem testiranju BRCA1/2, kar ima ključne posledice za bolnike z družinsko anamnezo raka. Do danes je bilo identificiranih in razvrščenih približno 20.000 variant BRCA1/2 v skladu z Ameriškim združenjem za medicinsko genetiko35 in sistemom ENIGMA.35,36 Dobro je znano, da se mutacijski spekter BRCA1/2 med geografskimi regijami zelo razlikuje.37 V Italiji se je delež mutacij BRCA1/2 gibal od 8 % do 37 %, kar kaže na veliko variabilnost znotraj države.38,39 Sicilija s skoraj 5 milijoni prebivalcev je peta največja regija v Italiji po številu prebivalcev. Čeprav obstajajo podatki o razširjenosti BRCA1/2 v zahodni Siciliji, v vzhodnem delu otoka ni obsežnih dokazov.
Naša študija je eno prvih poročil o incidenci BRCA1/2 PV pri bolnikih z BC v vzhodni Siciliji.28 Našo analizo smo osredotočili na BC, saj je to daleč najpogostejša bolezen v naši kohorti.
Pri testiranju 389 bolnikov z rakom dojke je 9 % imelo paralize BRCA1/2, enakomerno porazdeljene med BRCA1 in BRCA2. Ti rezultati so skladni s tistimi, ki so bili predhodno zabeleženi v italijanski populaciji.28 Zanimivo je, da je bilo 3 % (13/389) v naši kohorti moških. Ta stopnja je višja od pričakovane za moški rak dojke (1 % vseh rakov dojke),40 kar odraža našo izbiro populacij na podlagi tveganja za mutacijo BRCA1/2. Vendar pa pri nobenem od teh moških ni prišlo do razvoja paralize BRCA1/2, zato so bili kandidati za nadaljnjo molekularno analizo, da bi izključili prisotnost manj pogostih mutacij, kot so med drugim PALB2, RAD51C in D. Različice negotovega pomena so bile odkrite pri 7 % preiskovancev, pri katerih je bila BRCA2 VUS očitna. Tudi ta rezultat je skladen s predhodnimi dokazi.28,41,42
Ko smo analizirali porazdelitev molekularnih podtipov BC pri ženskah z mutacijo BRCA1/2, smo potrdili znane povezave med TNBC in BRCA1 PV (58,8 %) ter med luminalnim B BC in BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Luminalni A in HER2+ tumorji pri nosilkah BRCA1 in BRCA2 PV so skladni z obstoječimi podatki iz literature.16,43
Nato se osredotočimo na vrsto in lokacijo PV BRCA1/2. V naši kohorti je bil najpogostejši PV BRCA1 c.5035_5039delCTAAT. Čeprav so Incorvaia et al. te variante v svoji sicilijanski kohorti niso opisali, drugi avtorji pa so jo poročali kot zarodni BRCA1 PV.34 V naši kohorti so našli več BRCA1 PV – npr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA in c.5266dupC – ki so jih opazili na Siciliji.28 Od teh sta dve ustanoviteljski mutaciji BRCA1 (c.181T>G in c.5266dupC) pogosto prisotni pri aškenaških Judih vzhodne in srednje Evrope (Poljska, Češka), Slovenija, Avstrija, Madžarska, Belorusija in Nemčija),44,45 in je bila v Združenih državah Amerike in Argentini nedavno opredeljena kot "ponavljajoča se zarodna varianta" pri italijanskih bolnicah z rakom dojke in rakom dojke. Varianta 34c.514del je bila predhodno identificirana pri 8 bolnicah z rakom dojke iz severne Sicilije v Palermu in Messini. Zanimivo je, da so celo Incorvaia in sod. V nekaterih družinah v Cataniji so odkrili varianto c.3253dupA.28 Najbolj reprezentativni BRCA2 PV so c.428dup, c.5851_5854delAGTT in intronska varianta c.8487+1G>A, ki so bile podrobneje opisane28 pri pacientu v Palermu s c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV so opazili v gospodinjstvih na severozahodni Siciliji, predvsem v regijah Trapani in Palermo, medtem ko so PV c.5851_5854delAGTT opazili v gospodinjstvih na severozahodni Siciliji. Varianta 8487+1G>A je bila pogostejša pri osebah iz Messine, Palerma in Caltanissette.28 Rebbeck et al. prej opisana sprememba c.5851_5854delAGTT v Kolumbiji.37 Drug BRCA2 PV, c.631+1G>A, je bil najden pri bolnikih z BC in OC iz Sicilije (Agrigento, Siracusa in Ragusa).28 Omeniti velja, da smo pri istem bolniku opazili soobstoj dveh variant BRCA2 (BRCA2 c.631G>A in c.7008-2A>T), za kateri smo domnevali, da sta ločeni v cis načinu, kot je bilo že prej opisano.34,46 Te nepredvidljive mutacije BRCA2 so v italijanski regiji res pogosto opažene in ugotovljeno je bilo, da uvajajo prezgodnje stop kodone, kar vpliva na spajanje informacijske RNA in povzroča odpoved proteina BRCA2.47,48
Prav tako smo preslikali PV BRCA1 in BRCA2 v domnevnih regijah OCCR in BCCR proteinskih domen in genov. Rebbeck in sodelavci so te regije opisali kot območja tveganja za razvoj raka jajčnikov oziroma raka dojke.49 Vendar pa dokazi o povezavi med lokacijo variant zarodne linije in tveganjem za raka dojke ali jajčnikov ostajajo sporni.28,50-52 V naši populaciji so bili PV BRCA1 pretežno locirani v regiji BCCR, medtem ko so bili PV BRCA2 pretežno locirani v regiji OCCR. Vendar nismo mogli najti nobene povezave med domnevnimi regijami OCCR in BCCR ter značilnostmi BC. To je lahko posledica omejenega števila bolnikov z mutacijami BRCA1/2. Z vidika proteinske domene so PV BRCA1 porazdeljeni vzdolž celotne beljakovine, spremembe BRCA2 pa se prednostno nahajajo v domeni ponovitve BRC.
Končno smo klinično-patološke značilnosti raka dojke (BC) povezali s prevalenco BRCA1/2. Zaradi omejenega števila vključenih bolnikov smo ugotovili pomembno korelacijo le med Ki-67 in stopnjo tumorja. Čeprav ostaja ocena in interpretacija Ki-67 nekoliko kontroverzna, je gotovo, da so visoke stopnje proliferacije povezane s povečanim tveganjem za ponovitev bolezni in zmanjšanim preživetjem. Do danes je meja za razlikovanje med "visoko" in "nizko" vrednostjo Ki-67 20 %. Vendar ta prag ne velja za našo populacijo bolnikov z mutacijo BRCA1/2, ki ima mediano vrednost Ki-67 25 %. Ta trend visokih stopenj Ki-67 je mogoče pojasniti s prevalenco v naših kohortah luminalnega B in TNBC, v katerih je bilo prisotnih le malo tumorjev luminalnega A. Vendar pa nekateri dokazi kažejo, da lahko višja meja Ki-67 (25–30 %) bolje stratificira bolnike glede na njihovo prognozo.53,54 Glede na rezultate naše analize pomembna korelacija ni presenetljiva. Pojavi se med visoko vrednostjo Ki-67 in stopnjo ter prisotnostjo BRCA1. PV. Pravzaprav so tumorji, povezani z BRCA1, značilni za TNBC in kažejo bolj agresivne značilnosti.16,17
Skratka, ta študija ponuja poročilo o mutacijskem statusu BRCA1/2 v kohorti bolnikov z rakom dojke iz vzhodne Sicilije. Na splošno so naše ugotovitve skladne z obstoječimi dokazi, tako glede razširjenosti mutacij kot klinično-patoloških značilnosti pri raku dojke. Za oceno prisotnosti paracetamolskih mutacij, ki so različne in manj pogoste kot BRCA1/2, so potrebne nadaljnje študije v večjih populacijah bolnikov z rakom dojke z mutacijo BRCA1/2, na primer z uporabo multigenomske razširjene mutacijske analize. To bo omogočilo identifikacijo in ustrezno zdravljenje naraščajočega števila oseb s povečanim tveganjem za raka zaradi genetskih mutacij.
Potrdili smo, da so pacienti podpisali informirano soglasje za anonimno objavo vzorcev svojih tumorjev v raziskovalne namene. Vsi pacienti so podpisali pisno informirano soglasje v skladu s Helsinško deklaracijo. V skladu s politiko AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco” je bila ta študija izvzeta iz etičnega pregleda, ker je bila analiza BRCA1/2 izvedena v skladu s klinično prakso in so vsi pacienti podali pisno informirano soglasje. Pacienti soglašajo tudi z uporabo svojih podatkov v raziskovalne namene.
Zahvaljujemo se prof. Paolu Vigneriju za njegovo pomoč pri oskrbi bolnic z rakom dojke, kot jo je zahteval Odbor za etiko.
Federica Martorana poroča o honorarjih podjetij Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis in Pfizer. Drugi avtorji izjavljajo, da v tem delu nimajo navzkrižja interesov.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL in sod. Globalna statistika raka 2020: GLOBOCAN ocenjuje incidenco in umrljivost 36 vrst raka v 185 državah po svetu. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-249. doi: 10.3322/caac.21660