Javascript is momenteel uitgeschakeld in uw browser. Sommige functies van deze website werken niet als Javascript is uitgeschakeld.
Registreer u met uw specifieke gegevens en het specifieke geneesmiddel waarin u geïnteresseerd bent. Wij vergelijken de door u verstrekte informatie met artikelen in onze uitgebreide database en sturen u zo snel mogelijk een PDF-kopie per e-mail.
Met Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Afdeling Klinische en Experimentele Geneeskunde, Universiteit van Catania, Catania, 95123, Italië;2 Centrum voor Experimentele Oncologie en Hematologie, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italië; 3 Medische oncologie, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italië; 4 Medische Genetica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italië; 5 Geneeskunde Genetica, ASP, Syracuse, 96100, Italië; 6 Afdeling Biomedische en Biotechnologische Wetenschappen, Universiteit van Catania, Medische Genetica, Catania, Italië, 95123; 7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Italië Communicatie: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, e-mail [email protected]; [email protected] Doel: Kiemlijnmutaties in BRCA1 en BRCA2 en vastgestelde borstkanker (BC), eierstokkanker (OC) en andere geassocieerd met een levenslang risico op kanker. Testen op het BRCA-gen is essentieel voor het beoordelen van het individuele risico, evenals voor het vinden van preventiemethoden bij gezonde dragers en het afstemmen van behandelingen bij kankerpatiënten. De prevalentie van BRCA1- en BRCA2-afwijkingen varieert sterk tussen geografische regio's en hoewel er gegevens bestaan ​​over pathogene BRCA-varianten in Siciliaanse families, ontbreken er studies die specifiek gericht zijn op populaties in Oost-Sicilië. Het doel van onze studie was om de incidentie en verspreiding van pathogene kiemlijnafwijkingen van BRCA in een cohort BC-patiënten uit Oost-Sicilië te onderzoeken en hun associatie met specifieke BC-kenmerken te beoordelen met behulp van next-generation sequencing. De aanwezigheid van afwijkingen correleerde met de tumorgraad en proliferatie-index. RESULTATEN: In totaal hadden 35 patiënten (9%) een pathogene BRCA-variant, 17 (49%) in BRCA1 en 18 (51%) in BRCA2.BRCA1-afwijkingen komen veel voor bij patiënten met triple-negatieve borstkanker, terwijl BRCA2-mutaties vaker voorkomen bij patiënten met luminaal borstkanker. Vergeleken met niet-dragers hadden proefpersonen met BRCA1-varianten een significant hogere tumorgraad en proliferatieve index. Conclusies: Onze bevindingen bieden een overzicht van de BRCA-mutatiestatus bij borstkankerpatiënten uit Oost-Sicilië en bevestigen de rol van NGS-analyse bij het identificeren van patiënten met erfelijke borstkanker. Over het algemeen komen deze gegevens overeen met eerder bewijs ter ondersteuning van BRCA-screening voor de juiste preventie en behandeling van kanker bij mutatiedragers.
Borstkanker (BC) is wereldwijd de meest voorkomende maligniteit en de dodelijkste kanker bij vrouwen.1 De biologische kenmerken die de prognose en het klinisch gedrag van BC bepalen, zijn in de loop van de tijd uitgebreid bestudeerd en gedeeltelijk opgehelderd. Sterker nog, er worden momenteel verschillende surrogaatmarkers gebruikt om BC in verschillende moleculaire subtypes te classificeren. Dit zijn oestrogeen (ER) en/of progesteronreceptor (PgR), amplificatie van humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2), proliferatie-index Ki-67 en tumorgraad (G).2 De combinatie van deze variabelen identificeerde de volgende BC-categorieën: 1) Luminal tumoren, met ER- en/of PgR-expressie, waren goed voor 75% van de BC's. Deze tumoren werden verder onderverdeeld in Luminal A, wanneer Ki-67 lager was dan 20% en HER2-negatief was, en Luminal B, wanneer Ki-67 gelijk was aan of hoger was dan 20% en in aanwezigheid van HER2-amplificatie, ongeacht de proliferatie-index; 2) HER2+ tumoren die ER en PgR-negatief zijn, maar HER2-amplificatie vertonen. Deze groep vertegenwoordigt 10% van alle borsttumoren; 3) Triple-negatieve borstkanker (TNBC), die geen ER en PgR-expressie en HER2-amplificatie vertoont, vertegenwoordigt ongeveer 15% van de borstkankers.2-4
Onder deze BC-subtypen vertegenwoordigen de tumorgraad en de proliferatie-index cross-sectionele biomarkers die direct en onafhankelijk verband houden met de agressiviteit en prognose van de tumor.5,6
Naast de bovengenoemde biologische kenmerken is de rol van erfelijke genetische veranderingen die leiden tot de ontwikkeling van borstkanker de afgelopen jaren steeds belangrijker geworden.7 Ongeveer 1 op de 10 borsttumoren wordt geërfd als gevolg van kiemlijnveranderingen in specifieke genen.8 Twee grote epidemiologische onderzoeken waaraan meer dan 180.000 vrouwen deelnamen, hebben onlangs een groep van acht genen geïdentificeerd (te weten ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C en RAD51D) die primair verantwoordelijk zijn voor erfelijke borstkanker. Van deze genen vertoonden BRCA1 en BRCA2 (hierna BRCA1/2 genoemd) de sterkste correlatie met de ontwikkeling van borsttumoren.9-12 In feite verhogen kiemlijnmutaties van BRCA1/2 het levenslange risico op borstkanker en andere maligniteiten, waaronder eierstok-, prostaat-, pancreas-, colorectale en melanoom, aanzienlijk.Van 13 tot 80 jaar is de cumulatieve incidentie van BC is 72% bij vrouwen met een pathogene BRCA1-variant (PV) en 69% bij vrouwen met een BRCA2 PV.14
Opvallend is dat uit een recente publicatie blijkt dat het risico op borstkanker afhankelijk is van het type PV. Sterker nog, in vergelijking met pathogene, afkappende varianten, worden opvallende missense-varianten, met name in het BRCA1-gen, geassocieerd met een verlaagd risico op borstkanker, vooral bij oudere vrouwen.15
De aanwezigheid van BRCA1 of BRCA2 PV werd geassocieerd met verschillende biologische en klinisch-pathologische kenmerken.16,17 BRCA1-geassocieerde borstkankers zijn doorgaans klinisch agressief, slecht gedifferentieerd en zeer proliferatief. Deze tumoren zijn meestal triple-negatief en beginnen op jonge leeftijd. Tumoren die voorkomen bij patiënten met een BRCA2-mutatie vertonen doorgaans matige tot goed gedifferentieerde graden en variabele proliferatieve indices. Deze tumoren komen vaker voor in lumen B en komen meestal voor bij oudere volwassenen.16-18 Mutaties in BRCA1 en BRCA2 verhogen met name de gevoeligheid voor specifieke behandelingen, waaronder platinazouten en doelgerichte geneesmiddelen zoals poly(ADP-ribose)polymeraseremmers (PARPi).19,20
De implementatie van next-generation sequencing (NGS) in de klinische praktijk heeft de afgelopen jaren ervoor gezorgd dat steeds meer patiënten met borstkanker moleculair getest kunnen worden op kankergevoeligheidssyndromen, waaronder BRCA1/2.21 Tegelijkertijd zijn er definities gebaseerd op precieze criteria met betrekking tot familiegeschiedenis, demografische en klinisch-pathologische kenmerken om individuen die in aanmerking komen voor BRCA1/2-testen beter te kunnen identificeren.22,23 In deze context stapelt het bewijsmateriaal zich op over BRCA1/2-screening in specifieke populaties, waarbij de verschillen tussen geografische regio's worden benadrukt.24–27 Hoewel er rapporten zijn over het borstkankercohort in West-Sicilië, zijn er minder gegevens beschikbaar over BRCA1/2-screening in de bevolking van Oost-Sicilië.28,29
We beschrijven hier de resultaten van BRCA1/2-kiemlijnscreening bij borstkankerpatiënten uit Oost-Sicilië, waarbij we de aanwezigheid van BRCA1- of BRCA2-mutaties verder in verband brengen met de belangrijkste klinisch-pathologische kenmerken van deze tumoren.
Er werd een retrospectieve studie uitgevoerd in het "Centrum voor Experimentele Oncologie en Hematologie" van het Policlinico Ziekenhuis, Rodolico - San Marco in Catania. Van januari 2017 tot en met maart 2021 werden in totaal 455 patiënten met borst- en eierstokkanker, melanoom, alvleesklierkanker of prostaatkanker doorverwezen naar ons moleculair diagnostisch laboratorium voor BRCA/2-genetische tests. Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en alle deelnemers gaven voorafgaand aan de moleculaire analyse schriftelijke geïnformeerde toestemming.
Histologische en biologische kenmerken (ER, PgR, HER2-status, Ki-67 en graad) van BC werden beoordeeld op basis van kernbiopsie- of chirurgische monsters, waarbij alleen agressieve tumorcomponenten in aanmerking werden genomen. Op basis van deze kenmerken werden BC's als volgt geclassificeerd: luminaal A (ER+ en/of PgR+, HER2-, Ki-67 < 20%), luminaal B (ER+ en/of PgR+, HER2-, Ki-67 ≥ 20%), luminaal B-HER2+ (ER en/of PgR+, HER2+), HER2+ (ER en PgR-, HER2+) of triple-negatief (ER en PgR-, HER2-).
Voordat de mutatiestatus van BRCA1 en BRCA2 werd beoordeeld, voerde een multidisciplinair team, bestaande uit een oncoloog, een geneticus en een psycholoog, een consult over tumorgenetica uit bij elke patiënt om de aanwezigheid van BRCA1 en/of BRCA1 vast te stellen. of personen met een hoog risico op PV in het BRCA2-gen. De patiëntenselectie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Italiaanse Vereniging voor Medische Oncologie (AIOM) en de lokale Siciliaanse aanbevelingen.30,31 Deze criteria omvatten: (i) familiegeschiedenis van bekende pathogene varianten in vatbaarheidsgenen (bijv. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) mannen met BC; (iii) degenen met BC en OC; (iv) vrouwen met BC <36 jaar, TNBC <60 jaar of bilaterale BC <50 jaar; (v) persoonlijke medische geschiedenis van BC <50 jaar en ten minste één familielid in de eerste graad: (a) BC <50 jaar; (b) niet-mucineus en niet-borderline OC van elke leeftijd; (c) bilaterale BC; (d) mannelijke BC; (e) alvleesklierkanker; (f) prostaatkanker; (vi) twee of meer Persoonlijke voorgeschiedenis van BC > 50 jaar en familiegeschiedenis van BC, OC of alvleesklierkanker voor familieleden die eerstegraadsverwanten van elkaar zijn (inclusief familieleden met wie zij eerstegraadsverwanten is); (vii) Persoonlijke voorgeschiedenis van OC en minstens één eerstegraadsverwant: (a) BC < 50 jaar; (b) NOC; (c) bilaterale BC; (d) mannelijke BC; (vii) vrouw met ernstige sereuze OC.
Van elke patiënt werd een perifeer bloedmonster van 20 ml afgenomen en verzameld in EDTA-buisjes (BD Biosciences). Genomisch DNA werd geïsoleerd uit 0,7 ml volbloedmonsters met behulp van de QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italië), volgens de instructies van de fabrikant, en werd door een Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) geleid. Voer kwantificering uit. Doelverrijking en bibliotheekvoorbereiding worden uitgevoerd door de Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, klaar om te worden geladen in de Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit voor geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding volgens de instructies van de fabrikant. De kit bestaat uit twee multiplex PCR-primerpools die kunnen worden gebruikt om alle BRCA1 (NM_007300.3) en BRCA2 (NM_000059.3) genen te bestuderen. Kort gezegd werd 15 µL van elk verdund monster-DNA (10 ng) toegevoegd aan barcodeplaten voor bibliotheekvoorbereiding en werden alle reagentia en verbruiksartikelen geladen op het Ion Chef™-instrument. Geautomatiseerde bibliotheekvoorbereiding en barcodemonsterbibliotheekpooling werden vervolgens uitgevoerd op het Ion Chef™-instrument. Het aantal voorbereide bibliotheken werd vervolgens beoordeeld door een Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Tot slot werden de bibliotheken worden gecombineerd in equimolaire verhoudingen in Ion Chef™-bibliotheekmonsterbuizen (buisjes met barcode) en geladen op het Ion Chef™-instrument. De sequencing werd uitgevoerd met een Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific)-instrument (Thermo Fisher Scientific) met behulp van een Ion 510-chip (Thermo Fisher Scientific). De gegevensanalyse werd uitgevoerd door Amplicon Suite (SmartSeq srl) en Ion Reporter Software.
Alle variantennomenclatuur volgde de huidige richtlijnen van het Human Genome Variation Consortium, online beschikbaar (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). De klinische betekenis van BRCA1/2-varianten werd gedefinieerd met behulp van de classificatie van het International Consortium ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) en door verschillende databases te raadplegen, zoals ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD en UMD. De classificatie omvat vijf verschillende risicocategorieën: goedaardig (categorie I), waarschijnlijk goedaardig (categorie II), variant van onzekere significantie (VUS, categorie III), waarschijnlijk pathogeen (categorie IV) en pathogeen (categorie V). VarSome analyseerde ook het effect van mutaties op de eiwitstructuur en -functie, een informatief hulpmiddel met toegang tot 30 databases.32
Om aan elke VUS de potentiële klinische significantie toe te kennen, werden de volgende computationele algoritmen voor eiwitvoorspelling gebruikt: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) en Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianten die als klasse 1 en 2 werden geclassificeerd, werden als wildtype beschouwd.
Sanger-sequencing bevestigde de aanwezigheid van elke pathogene variant. Kort gezegd werd er voor elke gedetecteerde variant een paar specifieke primers ontworpen met behulp van de genreferentiesequenties van BRCA1 en BRCA2 (respectievelijk NG_005905.2, NM_007294.3 en NG_012772.3, NM_000059.3). Daarom werd er een gerichte PCR uitgevoerd, gevolgd door Sanger-sequencing.
Patiënten die negatief testten voor het BRCA1/2-gen, werden getest met behulp van multiplex ligatie-afhankelijke probe-amplificatie (MLPA) volgens de instructies van de fabrikant om de aanwezigheid van grote genomische herstructureringen (LGR) vast te stellen. Kort gezegd worden DNA-monsters gedenatureerd en worden er maximaal 60 BRCA1- en BRCA2-genspecifieke probes gebruikt, die elk een specifieke DNA-sequentie van ongeveer 60 nucleotiden lang detecteren. De probe-amplificatieproducten, bestaande uit een unieke set PCR-amplicons, werden vervolgens geanalyseerd met behulp van capillaire elektroforese en met de Cofalyser.Net-software in combinatie met de juiste batch-specifieke Cofalyser-tabellen (www.mrcholland.com).
Geselecteerde klinisch-pathologische variabelen (histologische graad en Ki-67% proliferatie-index) werden geassocieerd met de aanwezigheid van BRCA1/2 PV, berekend met behulp van de Prism-software v. 8.4 waarbij gebruik werd gemaakt van de exacte toets van Fisher, waarbij werd aangenomen dat de p-waarde <0,05 significant was.
Tussen januari 2017 en maart 2021 werden 455 patiënten gescreend op BRCA1/2-kiemlijnmutaties. De mutatietests werden uitgevoerd in het Centrum voor Experimentele Oncologie en Hematologie van het Policlinico Ziekenhuis. Volgens de Siciliaanse richtlijn (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, nr. 02 - Vrijdag 10 januari 2020) werden in totaal 389 patiënten in het Rodolico van Catania – San Marco gediagnosticeerd. Er waren 37 patiënten met borstkanker, 37 met eierstokkanker, 16 met alvleesklierkanker, 8 met prostaatkanker en 5 met melanoom. De verdeling van de patiënten naar kankertype en analyseresultaten is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1 toont een stroomdiagram met een overzicht van het onderzoek. Patiënten met borst-, melanoom-, alvleesklier-, prostaat- of ovariumtumoren werden getest op mutaties in de BRCA1- en BRCA2-genen.
Afkortingen: PVs, pathogene variant; VUS, variant van onzekere betekenis; WT, wildtype BRCA1/2-sequentie.
Wij hebben onze onderzoeken selectief gericht op borstkankercohorten. De patiënten hadden een mediane leeftijd van 49 jaar (bereik 23-89) en waren overwegend vrouw (n=376 of 97%).
Van deze proefpersonen hadden 64 (17%) BRCA1/2-mutaties en waren allemaal vrouwen. Vijfendertig (9%) hadden PV en 29 (7,5%) hadden VUS. Zeventien (48,6%) van de 35 pathogene varianten kwamen voor in BRCA1 en 18 (51,4%) in BRCA2, terwijl 5 VUS voorkwamen in BRCA1 (17,2%) en 24 (82,8%) in BRCA2 (figuren 1 en 2). LGR was niet aanwezig in de MLPA-analyse.
Figuur 2. Analyse van BRCA1- en BRCA2-mutaties bij 389 borstkankerpatiënten. (A) Verdeling van pathogene varianten (PV) (rood), varianten van onzekere significantie (VUS) (oranje) en WT (blauw) bij 389 borstkankerpatiënten; (B) 389 borstkankerpatiënten hadden 35 (9%) pathogene BRCA1/2-varianten (PV's). Van hen waren er 17 (48,6%) drager van BRCA1 PV (donkerrood) en 18 (51,4%) drager van BRCA2 (lichtrood); (C) 29 (7,5%) van de 389 proefpersonen drager van VUS, 5 (17,2%) van BRCA1-genen (donkeroranje) en 24 (82,8%) van BRCA2-genen (lichtoranje).
Afkortingen: PVs, pathogene variant; VUS, variant van onzekere betekenis; WT, wildtype BRCA1/2-sequentie.
Vervolgens onderzochten we de prevalentie van moleculaire BC-subtypen bij patiënten met BRCA1/2 PV. De verdeling omvatte 2 (5,7%) luminaal A, 15 (42,9%) luminaal B, 3 (8,6%) luminaal B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ en 13 (37,1%) TNBC-patiënten. Van de BRCA1-positieve patiënten had 5 (29,4%) luminaal B BC, 2 (11,8%) HER2+-ziekte en 10 (58,8%) TNBC. Tumoren zonder BRCA1-mutaties waren ofwel luminaal A ofwel luminaal B-HER2+ (Figuur 3). In de BRCA2-positieve subgroep waren 10 (55,6%) tumoren luminaal B, 3 (16,7%) luminaal B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC en 2 (11,1%) waren luminaal A (Figuur 3). In deze groep waren geen HER2+-tumoren aanwezig. BRCA1-mutaties komen dus veel voor bij TNBC-patiënten, terwijl BRCA2-veranderingen overheersen bij personen met lumen B.
Figuur 3 Prevalentie van borstkanker-subtypen bij patiënten met pathogene varianten in BRCA1 en BRCA2. Histogrammen die de verdeling van BRCA1- (donkerrood) en BRCA2- (lichtrood) PV's over de moleculaire subtypen van borstkankerpatiënten laten zien. De getallen in elk vak geven het percentage patiënten met BRCA1- en BRCA2-PV voor elk borstkanker-subtype weer.
Afkortingen: PVs, pathogene variant; HER2+, humane epidermale groeifactorreceptor 2 positief; TNBC, triple-negatieve borstkanker.
Vervolgens hebben we het type en de genlokalisatie van BRCA1- en BRCA2-PV's beoordeeld. In BRCA1-PV observeerden we 7 enkelvoudige nucleotidevarianten (SNV's), 6 deleties, 3 duplicaties en 1 insertie. Slechts één mutatie (c.5522delG) vertegenwoordigt een nieuwe ontdekking. De meest voorkomende BRCA1-PV die bij beide proefpersonen werd gedetecteerd, was c.5035_5039delCTAAT. Deze verandering betreft een deletie van vijf nucleotiden (CTAAT) in BRCA1-exon 15, wat resulteert in de vervanging van het aminozuur leucine door tyrosine bij codon 1679. Een translatieframeshift met een voorspeld alternatief stopcodon leidde tot voortijdige eiwitafkapping. Alle andere veranderingen werden slechts in één geval gedetecteerd. Opvallend is dat één van de gerapporteerde PV's zich bevond in de consensusregio van de splice-site (c.4357+1G>T) (tabel 1).
Wat betreft BRCA2 PV hebben we 6 deleties, 6 SNV's en 2 duplicaties waargenomen. Geen van de gevonden veranderingen is nieuw. Drie mutaties keerden terug in onze populatie, c.428dup en c.8487+1G>A waargenomen bij 3 proefpersonen, gevolgd door c.5851_5854delAGTT dat in twee gevallen werd teruggevonden. De c.428dup-verandering betreft een herhaling van C in exon 5 van BRCA2, waarvan wordt voorspeld dat deze codeert voor een afgeknot, niet-functioneel eiwit. De c.8487+1G>A-mutatie treedt op in de intronische regio van BRCA2-intron 19 (± 1,2) en beïnvloedt de splicing-consensussequentie, wat resulteert in een gewijzigde splicing die resulteert in een abnormaal of afwezig eiwit. De pathogene variant c.5851_5854delAGTT wordt veroorzaakt door een deletie van 4 nucleotiden van nucleotideposities 5851 tot 5854 in het coderende exon 10 van het BRCA2-gen en resulteert in een translationele frameshift met een voorspeld alternatief stopcodon (p.S1951WfsTer). Opmerkelijk is dat, zoals eerder gerapporteerd, beide veranderingen c.631G>A en c.7008-2A>T werden gedetecteerd bij dezelfde patiënt.34 De eerste mutatie betreft de vervanging van adenosine (A) in BRCA2 exon 7 met een guanine (G) bevattende nucleotide, wat resulteert in een verandering van valine naar isoleucine bij codon 211, isoleucine. Aminozuur is een aminozuur met zeer vergelijkbare eigenschappen. Deze verandering beïnvloedt normale mRNA-splicing. De tweede variant bevindt zich in een intronische regio en resulteert in een dubbele A naar thymine (T) substitutie vóór exon 13 van het gen dat codeert voor BRCA2. De c.7008-2A>T verandering kan meerdere transcripten van verschillende lengtes genereren. Bovendien, in de groep BRCA2 PVs, 4 van de 18 veranderingen (22,2%) waren intronisch.
Vervolgens brachten we schadelijke BRCA1/2-mutaties in kaart in functionele domeinen en eiwitbindende regio's (Fig. 4). In het BRCA1-gen bevonden 50% van de PV's zich in de borstkankerclusterregio (BCCR), terwijl 22% van de mutaties zich bevonden in de eierstokkankerclusterregio (OCCR) (Fig. 4A). In BRCA2 PV bevonden 35,7% van de varianten zich in de BCCR-regio en 42,8% van de mutaties zich in de OCCR (Fig. 4B). Vervolgens beoordeelden we de locatie van PV binnen de BRCA1- en BRCA2-eiwitdomeinen. Voor het BRCA1-eiwit vonden we drie PV's in de lus- en coiled-coildomeinen en twee mutaties in het BRCT-domein (Fig. 4A). Voor het BRCA2-eiwit werden 4 PV's toegewezen aan het BRC-herhalingsdomein, terwijl 3 intronische en 3 exonische veranderingen werden gedetecteerd in de oligo-/oligosaccharidebindende (OB) en toren (T) domeinen (Figuur 4B).
Figuur 4 Schematische weergave van BRCA1- en BRCA2-eiwitten en lokalisatie van pathogene varianten. Deze afbeelding toont de distributie van pathogene varianten van BRCA1 (A) en BRCA2 (B) bij patiënten met borstkanker. Exonische mutaties worden in blauw weergegeven, terwijl intronische varianten in oranje worden weergegeven. De hoogte van de balk geeft het aantal gevallen weer. De BRCA1- en BRCA2-eiwitten en hun functionele domeinen worden gerapporteerd. (A) Het BRCA1-eiwit bevat een lusdomein (RING) en een nucleaire lokalisatiesequentie (NLS), een coiled-coildomein, een SQ/TQ-clusterdomein (SCD) en een BRCA1 C-terminaal domein (BRCT). (B) Het BRCA2-eiwit bevat acht BRC-herhalingen, een DNA-bindend domein met een helixdomein (Helical), drie oligonucleotide/oligosaccharide-bindende (OB) vouwen, een torendomein (T) en een NLS aan de C-zijde. Gebieden genaamd de borstkankerclusterregio (BCCR) en de eierstokkankerclusterregio (OCCR) worden onderaan weergegeven.*Vertegenwoordigt mutaties die stopcodons bepalen.
Vervolgens onderzochten we klinisch-pathologische kenmerken van BC die mogelijk correleren met de aanwezigheid van BRCA1/2 PV. Van 181 BRCA1/2-negatieve patiënten (geen dragers) en alle dragers (n = 35) waren volledige klinische dossiers beschikbaar. Er was een correlatie tussen de snelheid van tumorproliferatie en de graad ervan.
We berekenden de verdeling van Ki-67 op basis van de mediaan van ons cohort (25%, bereik <10-90%). Onderwerpen met Ki-67 < 25% werden gedefinieerd als "lage Ki-67", terwijl individuen met waarden ≥ 25% werden beschouwd als "hoge Ki-67". Er werden significante Ki-67-verschillen (p <0,01) gevonden tussen niet-dragers en BRCA1 PV-dragers (Figuur 5A).
Figuur 5 Correlatie van Ki-67 met graadverdeling bij vrouwen met borstkanker met en zonder BRCA1- en BRCA2-PV's. (A) Boxplot met mediane Ki-67-waarden bij 181 BC-patiënten die geen drager zijn versus BRCA1- (18) of BRCA2-PV-patiënten (17). P-waarden lager dan 0,5 werden als statistisch significant beschouwd. (B) Histogram van de toewijzing van BC-kankerpatiënten aan histologische graadgroepen (G2 en G3) volgens de BRCA1- en BRCA2-mutatiestatus (WT-proefpersonen, dragers van BRCA1- en BRCA2-PV's).
Op dezelfde manier hebben we onderzocht of de tumorgraad correleerde met de aanwezigheid van BRCA1/2 PV. Omdat G1 BC afwezig was in onze populatie, hebben we de patiënten in twee groepen verdeeld (G2 of G3). In overeenstemming met de Ki-67-resultaten onthulde de analyse een statistisch significante correlatie tussen tumorgraad en BRCA1-mutatie, met een hoger percentage G3-tumoren bij BRCA1-dragers vergeleken met niet-dragers (p < 0,005) (Figuur 5B).
Vooruitgang in de technologie voor DNA-sequentiebepaling heeft ongekende vooruitgang in genetische BRCA1/2-testen mogelijk gemaakt, met cruciale gevolgen voor patiënten met een familiegeschiedenis van kanker. Tot op heden zijn er ongeveer 20.000 BRCA1/2-varianten geïdentificeerd en geclassificeerd volgens de American Society of Medical Genetics 35 en het ENIGMA-systeem.35,36 Het is bekend dat het mutatiespectrum van BRCA1/2 sterk varieert tussen geografische regio's.37 In Italië varieerde het percentage BRCA1/2 PV's van 8% tot 37%, wat wijst op een grote intra-landvariatie.38,39 Met een bevolking van bijna 5 miljoen is Sicilië de vijfde grootste regio in Italië qua aantal inwoners. Hoewel er gegevens bestaan ​​over de verspreiding van BRCA1/2 in West-Sicilië, is er geen uitgebreid bewijs voor het oostelijke deel van het eiland.
Ons onderzoek is een van de eerste rapporten over de incidentie van BRCA1/2 PV bij BC-patiënten in Oost-Sicilië.28 We hebben onze analyse gericht op BC, omdat dit veruit de meest voorkomende ziekte in ons cohort is.
Bij het testen van 389 patiënten met borstkanker bleek 9% BRCA1/2 PV's te dragen, gelijkmatig verdeeld over BRCA1 en BRCA2. Deze resultaten komen overeen met de resultaten die eerder zijn gerapporteerd in de Italiaanse bevolking.28 Interessant genoeg was 3% (13/389) van ons cohort man. Dit percentage is hoger dan verwacht voor mannelijke borstkanker (1% van alle borstkankers),40 wat onze selectie van populaties op basis van het risico op BRCA1/2-mutaties weerspiegelt. Geen van deze mannen ontwikkelde echter een BRCA1/2 PV, dus kwamen ze in aanmerking voor verdere moleculaire analyse om de aanwezigheid van minder vaak voorkomende mutaties zoals PALB2, RAD51C en D, onder andere, uit te sluiten. Varianten met een onzekere significantie werden gevonden bij 7% van de proefpersonen bij wie BRCA2 VUS evident was. Zelfs dit resultaat komt overeen met reeds bestaand bewijs.28,41,42
Toen we de distributie van moleculaire BC-subtypen analyseerden bij vrouwen met een BRCA1/2-mutatie, bevestigden we bekende associaties tussen TNBC en BRCA1 PV (58,8%) en tussen luminale B BC en BRCA2 PV (55,6%).16,43 De luminale A- en HER2+-tumoren bij BRCA1- en BRCA2 PV-dragers komen overeen met bestaande literatuurgegevens.16,43
Vervolgens richten we ons op het type en de locatie van de BRCA1/2 PV. In ons cohort was de meest voorkomende BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT. Hoewel Incorvaia et al. deze variant niet beschreven in hun Siciliaanse cohort, hebben andere auteurs het gerapporteerd als een kiemlijn BRCA1 PV.34 Verschillende BRCA1 PV's werden gevonden in ons cohort - bijvoorbeeld c.181T>G, c.514del, c.3253dupA en c.5266dupC - die zijn waargenomen op Sicilië.28 Hiervan worden twee BRCA1-oprichtermutaties (c.181T>G en c.5266dupC) vaak gevonden bij Asjkenazische joden van Oost- en Centraal-Europa (Polen, Tsjechië), Sloveens, Oostenrijks, Hongaars, Wit-Russisch en Duits ), 44,45 en werd in de Verenigde Staten en Argentinië onlangs gedefinieerd als een "terugkerende kiemlijnvariant" bij Italiaanse patiënten met BC en OC. De 34c.514del-variant werd eerder geïdentificeerd bij 8 borstkankerpatiënten uit Noord-Sicilië in Palermo en Messina. Interessant is dat zelfs Incorvaia et al. vonden de c.3253dupA-variant in enkele families in Catania.28 De meest representatieve BRCA2 PV's zijn c.428dup, c.5851_5854delAGTT en de intronische variant c.8487+1G>A, die gedetailleerder zijn gerapporteerd 28 bij een patiënt in Palermo waarbij c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV werd waargenomen in huishoudens in het noordwesten van Sicilië, voornamelijk in de regio's Trapani en Palermo, terwijl c.5851_5854delAGTT PV werd waargenomen in huishoudens in het noordwesten van Sicilië. De 8487+1G>A-variant kwam vaker voor bij personen uit Messina, Palermo en Caltanissetta.28 Rebbeck et al. eerder de c.5851_5854delAGTT-afwijking in Colombia beschreven.37 Een andere BRCA2 PV, c.631+1G>A, is aangetroffen bij BC- en OC-patiënten uit Sicilië (Agrigento, Siracusa en Ragusa).28 Opvallend is dat we de co-existentie van twee BRCA2-varianten (BRCA2 c.631G>A en c.7008-2A>T) bij dezelfde patiënt hebben waargenomen, waarvan we aannamen dat ze in cis-modus waren gesegregeerd, zoals eerder op die manier werd gerapporteerd.34,46 Deze BRCA2-variabele mutaties worden inderdaad vaak waargenomen in de Italiaanse regio en blijken voortijdige stopcodons te introduceren, wat de splicing van messenger RNA beïnvloedt en ervoor zorgt dat het BRCA2-eiwit faalt.47,48
We hebben ook BRCA1- en BRCA2-PV's in kaart gebracht in vermoedelijke OCCR- en BCCR-regio's van eiwitdomeinen en genen. Deze regio's werden door Rebbeck et al. beschreven als risicogebieden voor respectievelijk de ontwikkeling van eierstok- en borstkanker.49 Het bewijs met betrekking tot het verband tussen de locatie van kiembaanvarianten en het risico op borst- of eierstokkanker blijft echter controversieel.28,50-52 In onze populatie bevonden BRCA1-PV's zich voornamelijk in de BCCR-regio, terwijl BRCA2-PV's zich voornamelijk in de OCCR-regio bevonden. We konden echter geen verband vinden tussen vermoedelijke OCCR- en BCCR-regio's en BC-kenmerken. Dit kan te wijten zijn aan het beperkte aantal patiënten met BRCA1/2-mutaties. Vanuit het perspectief van het eiwitdomein zijn BRCA1-PV's verdeeld over het gehele eiwit en worden BRCA2-veranderingen bij voorkeur gevonden in het BRC-herhalingsdomein.
Ten slotte correleerden we klinisch-pathologische kenmerken van BC met BRCA1/2 PV. Vanwege het beperkte aantal opgenomen patiënten vonden we alleen een significante correlatie tussen Ki-67 en tumorgraad. Hoewel de beoordeling en interpretatie van Ki-67 enigszins controversieel blijft, is het zeker dat hoge proliferatieve tarieven geassocieerd zijn met een verhoogd risico op ziekterecidief en verminderde overleving. Tot op heden is de grenswaarde voor het onderscheiden tussen "hoge" en "lage" Ki-67 20%. Deze drempelwaarde is echter niet van toepassing op onze BRCA1/2-mutatiepatiëntenpopulatie, die een mediane Ki-67-waarde van 25% heeft. Deze trend in hoge Ki-67-tarieven kan worden verklaard door de prevalentie in onze luminale B- en TNBC-cohorten, waarvan weinig luminale A-tumoren aanwezig waren. Echter, sommige bewijzen lijken erop te wijzen dat een hogere Ki-67-grenswaarde (25-30%) patiënten beter kan stratificeren volgens hun prognose.53,54 Uit de resultaten van onze analyse blijkt niet dat er een significante correlatie is Verrassend. Komt voor tussen hoge Ki-67- en graden en de aanwezigheid van BRCA1 PV. In feite zijn BRCA1-gerelateerde tumoren typisch voor TNBC en vertonen ze agressievere kenmerken.16,17
Concluderend biedt dit onderzoek een rapport over de mutatiestatus van BRCA1/2 in een BC-cohort uit Oost-Sicilië. Over het algemeen komen onze bevindingen overeen met reeds bestaand bewijs, zowel wat betreft de prevalentie van mutaties als de klinisch-pathologische kenmerken bij BC. Meer onderzoeken bij grotere populaties BC-patiënten met BRCA1/2-mutatie, zoals met behulp van uitgebreide multigenome-mutatieanalyse, zijn gerechtvaardigd om de aanwezigheid van PV's vast te stellen die anders en minder frequent zijn dan BRCA1/2. Dit zal de identificatie en juiste behandeling van het toenemende aantal personen met een verhoogd risico op kanker als gevolg van genetische mutaties mogelijk maken.
We hebben bevestigd dat patiënten een geïnformeerde toestemming hebben ondertekend om hun tumormonsters anoniem vrij te geven voor onderzoeksdoeleinden. Alle patiënten hebben een schriftelijke geïnformeerde toestemming ondertekend in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Volgens het beleid van AOU Policlinico "G.Rodolico - S.Marco" was deze studie vrijgesteld van ethische beoordeling omdat de BRCA1/2-analyse werd uitgevoerd in overeenstemming met de klinische praktijk en alle patiënten schriftelijk geïnformeerde toestemming hebben gegeven. Patiënten stemmen er ook mee in dat hun gegevens voor onderzoeksdoeleinden worden gebruikt.
Wij danken Prof. Paolo Vigneri voor zijn hulp bij de zorg voor borstkankerpatiënten, zoals verzocht door de Ethische Commissie.
Federica Martorana meldt honoraria van Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis en Pfizer. De andere auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met betrekking tot dit werk.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN schat de incidentie en mortaliteit van 36 soorten kanker in 185 landen wereldwijd. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660