Javascript наразі вимкнено у вашому браузері. Деякі функції цього веб-сайту не працюватимуть, коли JavaScript вимкнено.
Зареєструйтесь, вказавши свої конкретні дані та конкретний препарат, який вас цікавить, і ми зіставимо надану вами інформацію зі статтями в нашій великій базі даних і негайно надішлемо вам копію у форматі PDF електронною поштою.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Стефанія Стелла, 1,2 Сільвія Ріта Вітале, 1,2 Федеріка Марторана, 1,2 Мікеле Массіміно, 1,2 Джуліана Павоне, 3 Катя Ланцафаме, 3 Себастьяно Б’янка, 4 К’яра Бароне, 5 Крістіна Горгоне, 6 Марко Фічера, 6, 7 Лівія Манзелла1,21 Відділ клінічної та Експериментальна медицина, Університет Катанії, Катанія, 95123, Італія;2 Центр експериментальної онкології та гематології, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Катанія, 95123, Італія; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Катанія, 95123, Італія; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Катанія, 95123, Італія; 5 Medicine Genetics, ASP, Сіракузи, 96100, Італія; 6 Кафедра біомедичних та біотехнологічних наук, Університет Катанії, Медична генетика, Катанія, Італія, 95123; 7 Науково-дослідний інститут Oasi-IRCCS, Тройна, 94018, Італія Зв'язок з громадськістю: Стефанія Стелла, тел. +39 095 378 1946, електронна пошта [email protected]; [email protected] Мета: Мутації зародкової лінії в генах BRCA1 та BRCA2 та встановлений рак молочної залози (РМЗ), яєчників (ЯЯ) та інші, пов'язані з довічним ризиком раку. Тестування на ген BRCA є ключовим для оцінки індивідуального ризику, а також для пошуку методів профілактики у здорових носіїв та адаптації лікування для онкологічних хворих. Поширеність змін BRCA1 та BRCA2 значно варіюється в різних географічних регіонах, і хоча існують дані про патогенні варіанти BRCA в сицилійських сім'ях, досліджень, спеціально спрямованих на популяції у східній Сицилії, бракує. Метою нашого дослідження було дослідити частоту та розподіл патогенних змін зародкової лінії BRCA в когорті пацієнтів з РМЗ зі східної Сицилії та оцінити їх зв'язок зі специфічними ознаками РМЗ за допомогою секвенування наступного покоління. Наявність змін корелювала зі ступенем пухлини та індексом проліферації. РЕЗУЛЬТАТИ: Загалом, 35 ​​пацієнтів (9%) мали патогенний варіант BRCA, 17 (49%) - BRCA1 та 18 (51%) - BRCA2. Зміни BRCA1 поширені у пацієнтів з тричі негативним РМЗ, тоді як мутації BRCA2 частіше зустрічаються у пацієнтів з люмінальною РМЗ. Порівняно з У пацієнтів з варіантами BRCA1, які не були носіями, спостерігалося значно вищий ступінь злоякісності пухлини та проліферативний індекс. Висновки: Наші результати надають огляд мутаційного статусу BRCA у пацієнтів з раком молочної залози зі східної Сицилії та підтверджують роль NGS-аналізу у виявленні пацієнтів зі спадковим раком молочної залози. Загалом ці дані узгоджуються з попередніми доказами, що підтверджують скринінг BRCA для належної профілактики та лікування раку у носіїв мутацій.
Рак молочної залози (РМЗ) є найпоширенішим злоякісним новоутворенням у світі та найсмертельнішим видом раку у жінок.1 Біологічні особливості, що визначають прогноз та клінічну поведінку РМЗ, були ретельно вивчені та частково з'ясовані з часом. Фактично, наразі для класифікації РМЗ на різні молекулярні підтипи використовується кілька сурогатних маркерів. Це рецептор естрогену (ЕР) та/або прогестерону (PgR), ампліфікація рецептора 2 епідермального фактора росту людини (HER2), індекс проліферації Ki-67 та ступінь злоякісності пухлини (G).2 Поєднання цих змінних визначило такі категорії РМЗ: 1) Пухлини просвіту, що демонструють експресію ЕР та/або PgR, становили 75% РМЗ. Ці пухлини були додатково розділені на люмінальні A, коли Ki-67 був нижче 20% та HER2-негативний, та люмінальні B, коли Ki-67 дорівнював або перевищував 20% та за наявності ампліфікації HER2, незалежно від індексу проліферації; 2) HER2+ пухлини, які є ER та PgR-негативними, але демонструють ампліфікацію HER2. Ця група становить 10% усіх пухлин молочної залози; 3) Потрійно негативний рак молочної залози (TNBC), який не демонструє експресії ER та PgR та ампліфікації HER2, становить близько 15% випадків раку молочної залози.2-4
Серед цих підтипів раку молочної залози, ступінь злоякісності пухлини та індекс проліферації представляють собою перехресні біомаркери, які безпосередньо та незалежно пов'язані з агресивністю пухлини та прогнозом.5,6
Окрім вищезгаданих біологічних особливостей, роль успадкованих генетичних змін, що призводять до розвитку раку молочної залози (РМЗ), стала дедалі важливішою протягом останніх кількох років.7 Близько 1 з 10 пухлин молочної залози успадковується через зміни зародкової лінії в певних генах.8 Два великих епідеміологічних дослідження, що охопили понад 180 000 жінок, нещодавно виявили групу з восьми генів (тобто ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C та RAD51D), які в першу чергу відповідають за спадковий РМЗ. Серед цих генів BRCA1 та BRCA2 (далі BRCA1/2) показали найсильнішу кореляцію з розвитком пухлин молочної залози.9-12 Фактично, мутації BRCA1/2 зародкової лінії значно підвищують ризик розвитку РМЗ протягом усього життя, а також інших злоякісних новоутворень, включаючи захворювання яєчників, простати, підшлункової залози, колоректального раку та меланому. У віці від 13 до 80 років кумулятивна захворюваність на РМЗ становить 72% у жінок з патогенним варіантом (ПВ) BRCA1 та 69% у жінок з BRCA2. ПВ.14
Примітно, що нещодавня публікація показує, що ризик розвитку раку молочної залози залежить від типу паралічу. Фактично, порівняно з патогенними усіченими варіантами, яскраво виражені міссенс-варіанти, особливо в гені BRCA1, пов'язані зі зниженим ризиком розвитку раку молочної залози, особливо у жінок старшого віку.15
Наявність BRCA1 або BRCA2 PV була пов'язана з різними біологічними та клініко-патологічними особливостями.16,17 BRCA1-асоційовані ракові утворення (РМЗ) мають тенденцію до клінічно агресивних, низько диференційованих та високо проліферативних захворювань. Ці пухлини зазвичай є тричі негативними та мають ранній вік початку. Пухлини, що виникають у пацієнтів з мутацією BRCA2, зазвичай демонструють помірний або добре диференційований ступінь диференціації та варіабельні проліферативні індекси. Ці пухлини частіше зустрічаються в просвіті B та зазвичай виникають у людей похилого віку.16-18 Примітно, що мутації в BRCA1 та BRCA2 підвищують чутливість до специфічного лікування, включаючи солі платини та цільові препарати, такі як інгібітори полі(АДФ-рибоза)-полімерази (PARPi).19,20
Протягом останніх кількох років впровадження секвенування наступного покоління (NGS) у клінічну практику дозволило зростаючій кількості пацієнтів з раком молочної залози (РМЗ) пройти молекулярне тестування на синдроми схильності до раку, включаючи BRCA1/2.21 Одночасно, визначення, засновані на точних критеріях щодо сімейного анамнезу, демографічних та клініко-патологічних характеристик, дозволяють краще ідентифікувати осіб, гідних тестування на BRCA1/2.22,23 У цьому контексті накопичуються докази щодо скринінгу BRCA1/2 у певних популяціях, що підкреслює відмінності між географічними регіонами.24–27 Хоча є повідомлення про когорту РМЗ у західній Сицилії, менше даних доступно щодо скринінгу BRCA1/2 у популяції східної Сицилії.28,29
Тут ми описуємо результати скринінгу зародкової лінії BRCA1/2 у пацієнтів з раком молочної залози зі східної Сицилії, додатково корелюючи наявність мутацій BRCA1 або BRCA2 з основними клініко-патологічними особливостями цих пухлин.
Ретроспективне дослідження було проведено в «Центрі експериментальної онкології та гематології» при лікарні Policlinico Hospital.Rodolico – San Marco in Catania. З січня 2017 року по березень 2021 року загалом 455 пацієнтів з раком молочної залози та яєчників, меланомою, підшлункової залози або простати були направлені до нашої молекулярно-діагностичної лабораторії для генетичного тестування BRCA/2. Це дослідження було проведено відповідно до Гельсінської декларації, і всі учасники надали письмову інформовану згоду перед молекулярним аналізом.
Гістологічні та біологічні характеристики (ER, PgR, HER2-статус, Ki-67 та ступінь злоякісного новоутворення) РГЗ оцінювали на основі біопсії ядра або хірургічних зразків, враховуючи лише агресивні компоненти пухлини. На основі цих характеристик РГЗ класифікували наступним чином: люмінальний A (ER+ та/або PgR+, HER2-, Ki-67 <20%), люмінальний B (ER+ та/або PgR+, HER2-, Ki-67 ≥20%), люмінальний B-HER2+ (ER та/або PgR+, HER2+), HER2+ (ER та PgR-, HER2+) або тричі негативний (ER та PgR-, HER2-).
Перед оцінкою статусу мутацій BRCA1 та BRCA2, багатопрофільна команда, що включала онколога, генетика та психолога, провела консультацію з генетики пухлини для кожного пацієнта, щоб визначити наявність BRCA1 та/або BRCA1, або осіб з високим ризиком паралічу в гені BRCA2. Відбір пацієнтів проводився відповідно до рекомендацій Італійського товариства медичної онкології (AIOM) та місцевих сицилійських рекомендацій.30,31 Ці критерії включають: (i) сімейний анамнез відомих патогенних варіантів генів схильності (наприклад, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) чоловіки з раком молочної залози (РМЗ); (iii) ті, хто має РМЗ та рак яєчників (РОЯ); (iv) жінки з РМЗ <36 років, немутаційним РМЗ <60 років або двостороннім РМЗ <50 років; (v) особистий медичний анамнез РМЗ <50 років та принаймні один родич першого ступеня споріднення: (a) РМЗ <50 років; (b) немуцинозний та не прикордонний РЯ будь-якого віку; (c) двосторонній РМЗ; (d) чоловічий РМЗ; (e) рак підшлункової залози; (f) рак передміхурової залози; (vi) два або більше випадків раку молочної залози в особистому анамнезі > 50 років та сімейний анамнез раку молочної залози, раку простати або раку підшлункової залози для родичів, які є родичами першого ступеня споріднення один з одним (включаючи родичів, з якими вона є родичами першого ступеня споріднення); (vii) випадки раку молочної залози в особистому анамнезі та принаймні один родич першого ступеня споріднення: (a) рак молочної залози <50 років; (b) без раку нижчого ступеня споріднення; (c) двосторонній рак молочної залози; (d) рак молочної залози у чоловіків; (vii) жінка з високодиференційованим серозним раком молочної залози.
Від кожного пацієнта було отримано 20 мл зразка периферичної крові та зібрано в пробірки з ЕДТА (BD Biosciences). Геномну ДНК виділяли з 0,7 мл зразків цільної крові за допомогою набору для ізоляції QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Хілден, Італія) згідно з інструкціями виробника та пропускали через флуориметр Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Провели кількісну оцінку. Збагачення мішеней та підготовка бібліотеки виконуються за допомогою Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, готового до завантаження в набір Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 для автоматизованої підготовки бібліотеки відповідно до інструкцій виробника. Набір складається з двох пулів мультиплексних ПЛР-праймерів, які можна використовувати для вивчення всіх генів BRCA1 (NM_007300.3) та BRCA2 (NM_000059.3). Коротко кажучи, 15 мкл кожного розведеного зразка ДНК (10 нг) було додано до планшетів зі штрих-кодом для підготовки бібліотеки, а всі реагенти та витратні матеріали було завантажено на прилад Ion Chef™. Потім було виконано автоматизовану підготовку бібліотеки та об'єднання штрих-кодованих зразків бібліотеки на приладі Ion Chef™. Кількість підготовлених бібліотек потім оцінювали за допомогою флуорометра Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) відповідно до інструкцій виробника. Нарешті, бібліотеки об'єднують в еквімолярних співвідношеннях у пробірках для зразків бібліотек Ion Chef™ (пробірки зі штрих-кодом) та завантажують на прилад Ion Chef™. Секвенування проводили за допомогою приладу Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) з використанням чіпа Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Аналіз даних проводили за допомогою Amplicon Suite (SmartSeq srl) та програмного забезпечення Ion Reporter.
Вся номенклатура варіантів відповідала чинним рекомендаціям Консорціуму з варіацій геному людини, доступним онлайн (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Клінічне значення варіантів BRCA1/2 було визначено за допомогою класифікації Міжнародного консорціуму ENIGMA (Мережа, що базується на доказах, для інтерпретації алелів мутантів зародкової лінії, https://enigmaconsortium.org/) та консультацій з різними базами даних, такими як ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD та UMD. Класифікація включає п'ять різних категорій ризику: доброякісний (категорія I), ймовірно доброякісний (категорія II), варіант невизначеного значення (VUS, категорія III), ймовірно патогенний (категорія IV) та патогенний (категорія V). VarSome також проаналізував вплив мутацій на структуру та функцію білка, що є інформативним інструментом з доступом до 30 баз даних.32
Для визначення потенційної клінічної значущості кожного ВУС були використані такі обчислювальні алгоритми прогнозування білків: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) та Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Варіанти, класифіковані як клас 1 та 2, вважалися варіантами дикого типу.
Секвенування за Сангером підтвердило наявність кожного патогенного варіанту. Коротко кажучи, для кожного виявленого варіанту було розроблено пару специфічних праймерів з використанням референтних послідовностей генів BRCA1 та BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 та NG_012772.3, NM_000059.3 відповідно). Тому було проведено цільову ПЛР з подальшим секвенуванням за Сангером.
Пацієнтів, у яких тест на ген BRCA1/2 був негативним, тестували за допомогою мультиплексної лігаційно-залежної ампліфікації зондів (MLPA) згідно з інструкціями виробника для оцінки наявності великих геномних перебудов (LGR). Коротко кажучи, зразки ДНК денатурували, і використовували до 60 специфічних для генів BRCA1 та BRCA2 зондів, кожен з яких виявляв певну послідовність ДНК довжиною приблизно 60 нуклеотидів. Продукти ампліфікації зондів, що складалися з унікального набору ПЛР-ампліконів, потім аналізували за допомогою капілярного електрофорезу та за допомогою програмного забезпечення Cofalyser.Net у поєднанні з відповідними таблицями Cofalyser для кожної партії (www.mrcholland.com).
Вибрані клініко-патологічні змінні (гістологічний ступінь та індекс проліферації Ki-67%) були пов'язані з наявністю BRCA1/2 PV, розрахованих за допомогою програмного забезпечення Prism версії 8.4 з використанням точного критерію Фішера, припускаючи, що p-значення <0,05 є значущим.
У період з січня 2017 року по березень 2021 року 455 пацієнтів пройшли скринінг на наявність мутацій BRCA1/2 зародкової лінії. Тестування на мутації проводилося в Центрі експериментальної онкології та гематології лікарні Policlinico. Згідно з сицилійськими рекомендаціями (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), загалом у лікарні Rodolico of Catania – San Marco було обстежено 389 пацієнтів. З них були рак молочної залози, 37 рак яєчників, 16 рак підшлункової залози, 8 рак передміхурової залози та 5 меланома. Розподіл пацієнтів за типом раку та результатами аналізу показано на рисунку 1.
На рисунку 1 показано блок-схему, що показує огляд дослідження. Пацієнтів з пухлинами молочної залози, меланоми, підшлункової залози, передміхурової залози або яєчників тестували на мутації в генах BRCA1 та BRCA2.
Скорочення: PV – патогенний варіант; VUS – варіант невизначеного значення; WT – послідовність BRCA1/2 дикого типу.
Ми вибірково зосередили наші дослідження на когортах хворих на рак молочної залози. Медіанний вік пацієнток становив 49 років (діапазон 23-89), і вони були переважно жінками (n=376, або 97%).
З цих суб'єктів 64 (17%) мали мутації BRCA1/2 і всі були жінками. Тридцять п'ять (9%) мали параліч (PV), а 29 (7,5%) - VUS. Сімнадцять (48,6%) з 35 патогенних варіантів зустрічалися в BRCA1 та 18 (51,4%) в BRCA2, тоді як 5 VUS зустрічалися в BRCA1 (17,2%) та 24 (82,8%) в BRCA2 (рисунки 1 та 2). LGR не був присутній в аналізі MLPA.
Рисунок 2. Аналіз мутацій BRCA1 та BRCA2 у 389 пацієнток з раком молочної залози. (A) Розподіл патогенних варіантів (PV) (червоний), варіантів невизначеної значущості (VUS) (помаранчевий) та WT (синій) у 389 пацієнток з раком молочної залози; (B) 389 пацієнток з раком молочної залози. Тридцять п'ять (9%) мали патогенні варіанти (PV) BRCA1/2. Серед них 17 (48,6%) були носіями PV BRCA1 (темно-червоний) та 18 (51,4%) були носіями BRCA2 (світло-червоний); (C) 29 (7,5%) з 389 суб'єктів мали VUS, 5 (17,2%) генів BRCA1 (темно-помаранчевий) та 24 (82,8%) гени BRCA2 (світло-помаранчевий).
Скорочення: PV – патогенний варіант; VUS – варіант невизначеного значення; WT – послідовність BRCA1/2 дикого типу.
Далі ми дослідили поширеність молекулярних підтипів раку молочної залози (РМЗ) у пацієнтів з паралічем BRCA1/2. Розподіл включав 2 (5,7%) пацієнти з люмінальною формою A, 15 (42,9%) пацієнти з люмінальною формою B, 3 (8,6%) пацієнти з люмінальною формою B-HER2+, 2 (5,7%) пацієнти з HER2+ та 13 (37,1%) пацієнти з нелінійним раком молочної залози (TNBC). Серед BRCA1-позитивних пацієнтів 5 (29,4%) мали рак молочної залози типу B, 2 (11,8%) мали HER2+ захворювання, а 10 (58,8%) мали TNBC. Пухлини без мутацій BRCA1 були або люмінальною формою A, або люмінальною формою B-HER2+ (Рисунок 3). У BRCA2-позитивній підгрупі 10 (55,6%) пухлин були люмінальною формою B, 3 (16,7%) були люмінальною формою B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC та 2 (11,1%) були люмінальною формою A (Рисунок 3). HER2+ пухлин не було. були присутні в цій групі. Таким чином, мутації BRCA1 поширені у пацієнтів з TNBC, тоді як зміни BRCA2 переважають у осіб з просвітом B.
Рисунок 3. Поширеність підтипів раку молочної залози у пацієнток з патогенними варіантами BRCA1 та BRCA2. Гістограми, що показують розподіл паравентрикулярних варикозів BRCA1- (темно-червоний) та BRCA2- (світло-червоний) серед молекулярних підтипів пацієнток з раком молочної залози. Числа, зазначені в кожному полі, представляють відсоток пацієнток з паравентрикулярними варикозами BRCA1 та BRCA2 для кожного підтипу раку молочної залози.
Скорочення: PV – патогенний варіант; HER2+ – рецептор 2 епідермального фактора росту людини (ЕРФЛ) – позитивний; TNBC – потрійно негативний рак молочної залози.
Згодом ми оцінили тип та локалізацію генів поліморфізмів BRCA1 та BRCA2. У поліморфізмі BRCA1 ми спостерігали 7 однонуклеотидних варіантів (SNV), 6 делецій, 3 дуплікації та 1 інсерцію. Лише одна мутація (c.5522delG) є новим відкриттям. Найпоширенішим поліморфізмом BRCA1, виявленим у обох суб'єктів, був c.5035_5039delCTAAT. Ця зміна включає делецію п'яти нуклеотидів (CTAAT) в екзоні 15 BRCA1, що призводить до заміщення амінокислоти лейцину тирозином у кодоні 1679, і через зсув рамки трансляції з передбачуваним альтернативним стоп-кодоном призводить до передчасного укорочення білка. Всі інші зміни виявлені лише в одному випадку. Примітно, що один із зареєстрованих поліморфізмів був розташований у консенсусній області сайту сплайсингу (c.4357+1G>T) (Таблиця 1).
Щодо BRCA2 PV, ми спостерігали 6 делецій, 6 однонуклеотидних варіантів (SNV) та 2 дуплікації. Жодна з виявлених змін не є новою. У нашій популяції повторилися три мутації: c.428dup та c.8487+1G>A спостерігалися у 3 суб'єктів, а потім c.5851_5854delAGTT була виявлена ​​у двох випадках. Зміна c.428dup включає повтор C в екзоні 5 BRCA2, який, як передбачається, кодує укорочений, нефункціональний білок. Мутація c.8487+1G>A виникає в інтронній області інтрона 19 BRCA2 (± 1,2) та впливає на консенсусну послідовність сплайсингу, що призводить до зміненого сплайсингу, що спричиняє аномальний або відсутній білок. Патогенний варіант c.5851_5854delAGTT зумовлений 4-нуклеотидною делецією з нуклеотидних позицій 5851 по 5854 в кодуючому екзоні 10 гена BRCA2 та призводить до трансляції. зсув рамки зчитування з передбачуваним альтернативним стоп-кодоном (p.S1951WfsTer). Примітно, що, як повідомлялося раніше, обидві зміни c.631G>A та c.7008-2A>T були виявлені у одного пацієнта.34 Перша мутація включає заміну аденозину (A) в екзоні 7 BRCA2 нуклеотидом, що містить гуанін (G), що призводить до зміни валіну на ізолейцин у кодоні 211, ізолейцин - це амінокислота з дуже схожими властивостями. Ця зміна впливає на нормальний сплайсинг мРНК. Другий варіант розташований в інтронній області та призводить до подвійної заміни А на тимін (T) перед екзоном 13 гена, що кодує BRCA2. Зміна c.7008-2A>T може генерувати кілька транскриптів різної довжини. Крім того, у групі PV BRCA2 4 з 18 змін (22,2%) були інтронними.
Потім ми картували шкідливі мутації BRCA1/2 у функціональних доменах та білково-зв'язуючих ділянках (рис. 4). У гені BRCA1 50% PV були розташовані в кластерній області раку молочної залози (BCCR), тоді як 22% мутацій були розташовані в кластерній області раку яєчників (OCCR) (рис. 4A). У PV BRCA2 35,7% варіантів були розташовані в області BCCR, а 42,8% мутацій були розташовані в OCCR (рис. 4B). Далі ми оцінили розташування PV в білкових доменах BRCA1 та BRCA2. Для білка BRCA1 ми виявили три PV в петльовому та спірально-спіральному доменах, а також дві мутації в домені BRCT (рис. 4A). Для білка BRCA2 4 PV були картовані в повторюваному домені BRC, тоді як 3 інтронні та 3 екзонічні зміни були виявлені в оліго/олігосахарид-зв'язуючому (OB) та баштовому (T) доменах (рис. 4B).
Рисунок 4. Схематичне зображення білків BRCA1 та BRCA2 та локалізація патогенних варіантів. На цьому рисунку показано розподіл патогенних варіантів BRCA1 (A) та BRCA2 (B) у пацієнток з раком молочної залози. Екзонні мутації показані синім кольором, а інтронні варіанти – помаранчевим. Висота стовпчика відображає кількість випадків. Повідомляється про білки BRCA1 та BRCA2 та їхні функціональні домени. (A) Білок BRCA1 містить петлевий домен (RING) та послідовність ядерної локалізації (NLS), спірально-клубковий домен, кластерний домен SQ/TQ (SCD) та C-кінцевий домен BRCA1 (BRCT). (B) Білок BRCA2 містить вісім повторів BRC, ДНК-зв'язуючий домен зі спіральним доменом (Helical), три складки, що зв'язують олігонуклеотиди/олігосахариди (OB), баштовий домен (T) та NLS на C-боці. Внизу показано області, які називаються кластерною областю раку молочної залози (BCCR) та кластерною областю раку яєчників (OCCR).*Представляє мутації, що визначають зупинку кодони.
Потім ми дослідили клініко-патологічні особливості раку молочної залози, які можуть корелювати з наявністю паралічу BRCA1/2. Повні клінічні записи були доступні для 181 пацієнта з негативним геном BRCA1/2 (без носіїв) та всіх носіїв (n = 35). Спостерігалася кореляція між швидкістю проліферації пухлини та її ступенем.
Ми розрахували розподіл Ki-67 на основі медіани нашої когорти (25%, діапазон <10-90%). Суб'єкти з Ki-67 < 25% були визначені як «низький Ki-67», тоді як особи зі значеннями ≥ 25% вважалися «високим Ki-67». Значні відмінності Ki-67 (p <0,01) були виявлені між неносіями та носіями BRCA1 PV (рис. 5A).
Рисунок 5. Кореляція Ki-67 з розподілом ступеня у жінок з раком молочної залози з мутаціями BRCA1 та BRCA2 та без них. (A) Блокова діаграма, що показує медіанні значення Ki-67 у 181 пацієнтки з раком молочної залози без носіїв порівняно з пацієнтками з мутаціями BRCA1 (18) або BRCA2 (17). Значення P нижче 0,5 вважалися статистично значущими. (B) Гістограма, що відображає розподіл пацієнток з раком молочної залози на групи гістологічного ступеня (G2 та G3) відповідно до статусу мутацій BRCA1 та BRCA2 (суб'єкти дикого типу, носії мутацій BRCA1 та BRCA2).
Аналогічно, ми досліджували, чи корелює ступінь злоякісності пухлини з наявністю парагенезів BRCA1/2. Оскільки рак пухлини G1 був відсутній у нашій популяції, ми розділили пацієнтів на дві групи (G2 або G3). Відповідно до результатів Ki-67, аналіз виявив статистично значущу кореляцію між ступенем злоякісності пухлини та мутацією BRCA1, з вищою часткою пухлин G3 у носіїв BRCA1 порівняно з неносіями (p<0,005) (Рисунок 5B).
Досягнення в технології секвенування ДНК дозволили досягти безпрецедентного прогресу в генетичному тестуванні BRCA1/2, що має вирішальне значення для пацієнтів із сімейним анамнезом раку. На сьогоднішній день приблизно 20 000 варіантів BRCA1/2 було ідентифіковано та класифіковано відповідно до Американського товариства медичної генетики35 та системи ENIGMA.35,36 Загальновідомо, що мутаційний спектр BRCA1/2 значно варіюється в різних географічних регіонах.37 В Італії рівень BRCA1/2 PV коливався від 8% до 37%, що демонструє широку внутрішньокраїнну варіабельність.38,39 З населенням майже 5 мільйонів, Сицилія є п'ятим за величиною регіоном Італії за кількістю жителів. Хоча існують дані про поширення BRCA1/2 у західній Сицилії, немає ґрунтовних доказів у східній частині острова.
Наше дослідження є одним з перших повідомлень про частоту виникнення паралічу BRCA1/2 у пацієнтів з раком молочної залози (РМЗ) у східній Сицилії.28 Ми зосередили наш аналіз на РМЗ, оскільки це, безумовно, найпоширеніше захворювання в нашій когорті.
Під час тестування 389 пацієнтів з раком молочної залози (РМЗ) у 9% виявлені парагенези BRCA1/2, рівномірно розподілені між BRCA1 та BRCA2. Ці результати узгоджуються з результатами, про які повідомлялося раніше в італійській популяції.28 Цікаво, що 3% (13/389) нашої когорти були чоловіками. Цей показник вищий, ніж очікувалося для раку молочної залози у чоловіків (1% від усіх РМЗ),40 що відображає наш відбір популяцій на основі ризику мутації BRCA1/2. Однак, жоден з цих чоловіків не розвинув парагенез BRCA1/2, тому вони були кандидатами на подальший молекулярний аналіз, щоб виключити наявність менш поширених мутацій, таких як PALB2, RAD51C та D, серед інших. Варіанти невизначеної значущості були виявлені у 7% суб'єктів, у яких була очевидна мутація BRCA2. Навіть цей результат узгоджується з існуючими даними.28,41,42
Коли ми проаналізували розподіл молекулярних підтипів раку молочної залози (РМЗ) у жінок з мутацією BRCA1/2, ми підтвердили відомі зв'язки між раком просвіту легень (TNBC) та паралічем BRCA1 (58,8%), а також між раком просвіту B та паралічем BRCA2 (55,6%).16,43 Пухлини просвіту A та HER2+ у носіїв BRCA1 та паралічу BRCA2 узгоджуються з існуючими літературними даними.16,43
Потім ми зосереджуємося на типі та розташуванні паралічного вузла BRCA1/2. У нашій когорті найпоширенішим паралічним вузлом BRCA1 був c.5035_5039delCTAAT. Хоча Incorvaia та ін. не описали цей варіант у своїй сицилійській когорті, інші автори повідомили про нього як про зародковий варіант BRCA1 PV.34 У нашій когорті було виявлено кілька BRCA1 PV, наприклад, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA та c.5266dupC, які спостерігалися на Сицилії.28 З них дві засновницькі мутації BRCA1 (c.181T>G та c.5266dupC) зазвичай зустрічаються у євреїв-ашкеназі Східної та Центральної Європи (Польща, Чехія), Словенія, Австрія, Угорщина, Білорусь та Німеччина),44,45 а в Сполучених Штатах та Аргентині нещодавно був визначений як «рецидивний зародковий варіант» у італійських пацієнтів з раком молочної залози та раком молочної залози. Варіант 34c.514del був раніше виявлений у 8 пацієнток з раком молочної залози з північної Сицилії в Палермо та Мессіні. Цікаво, що навіть Incorvaia та ін. виявили варіант c.3253dupA у деяких сім'ях у Катанії.28 Найбільш репрезентативними паравентрикулярними варіантами BRCA2 є c.428dup, c.5851_5854delAGTT та інтронний варіант c.8487+1G>A, які були описані більш детально28 у пацієнта в Палермо з c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV спостерігався в домогосподарствах на північному заході Сицилії, головним чином у регіонах Трапані та Палермо, тоді як c.5851_5854delAGTT PV спостерігався в домогосподарствах на північному заході Сицилії. Варіант 8487+1G>A був частіше зустрічався у суб'єктів з Мессіни, Палермо та Кальтаніссетти.28 Реббек та ін. раніше описали зміну c.5851_5854delAGTT у Колумбії.37 Інший BRCA2 PV, c.631+1G>A, був виявлений у пацієнтів з раком молочної залози та раком яєчників із Сицилії (Агрідженто, Сіракузи та Рагуза).28 Примітно, що ми спостерігали співіснування двох варіантів BRCA2 (BRCA2 c.631G>A та c.7008-2A>T) у одного пацієнта, які, як ми припустили, розділені в цис-режимі, як повідомлялося раніше.34,46 Ці мутації BRCA2 дійсно часто спостерігаються в італійському регіоні та, як було виявлено, вводять передчасні стоп-кодони, впливаючи на сплайсинг матричної РНК та спричиняючи збій білка BRCA2.47,48
Ми також картували поліморфізми BRCA1 та BRCA2 у передбачуваних регіонах OCCR та BCCR білкових доменів та генів. Ці регіони були описані Реббеком та ін. як зони ризику розвитку раку яєчників та молочної залози відповідно.49 Однак докази щодо зв'язку між розташуванням варіантів зародкової лінії та ризиком раку молочної залози або яєчників залишаються суперечливими.28,50-52 У нашій популяції поліморфізми BRCA1 переважно розташовувалися в регіоні BCCR, тоді як поліморфізми BRCA2 переважно розташовувалися в регіоні OCCR. Однак нам не вдалося знайти жодного зв'язку між передбачуваними регіонами OCCR та BCCR та ознаками раку молочної залози. Це може бути пов'язано з обмеженою кількістю пацієнтів з мутаціями BRCA1/2. З точки зору білкового домену, поліморфізми BRCA1 розподілені вздовж усього білка, а зміни BRCA2 переважно виявляються в повторюваному домені BRC.
Зрештою, ми корелювали клініко-патологічні особливості раку молочної залози (РМЗ) з пухлинами BRCA1/2. Через обмежену кількість включених пацієнтів ми виявили значну кореляцію лише між Ki-67 та ступенем злоякісності пухлини. Хоча оцінка та інтерпретація Ki-67 залишаються дещо суперечливими, безперечно, що високі показники проліферації пов'язані з підвищеним ризиком рецидиву захворювання та зниженням виживання. На сьогоднішній день порогове значення для розрізнення «високого» та «низького» Ki-67 становить 20%. Однак це порогове значення не застосовується до нашої популяції пацієнтів з мутацією BRCA1/2, яка має медіане значення Ki-67 25%. Цю тенденцію до високих показників Ki-67 можна пояснити поширеністю в наших когортах люмінального B та TNBC, серед яких було присутньо мало пухлин люмінального A. Однак деякі дані свідчать про те, що вищий поріг Ki-67 (25–30%) може краще стратифікувати пацієнтів відповідно до їхнього прогнозу.53,54 З результатів нашого аналізу значна кореляція не є дивною. Спостерігається між високим Ki-67 та ступенями злоякісності, а також наявністю BRCA1. ПВ. Фактично, пухлини, пов'язані з BRCA1, є типовими для TNBC та демонструють більш агресивні ознаки.16,17
На завершення, це дослідження надає звіт про мутаційний статус BRCA1/2 у когорті пацієнтів з раком молочної залози зі східної Сицилії. Загалом, наші результати узгоджуються з існуючими даними, як щодо поширеності мутацій, так і клініко-патологічних особливостей раку молочної залози. Необхідні додаткові дослідження у більших популяціях пацієнтів з раком молочної залози з мутацією BRCA1/2, такі як використання розширеного багатогеномного мутаційного аналізу, для оцінки наявності паравентрикулярних мутацій (ПВ), які є відмінними та менш поширеними, ніж BRCA1/2. Це дозволить ідентифікувати та належним чином лікувати зростаючу кількість пацієнтів з підвищеним ризиком раку через генетичні мутації.
Ми підтвердили, що пацієнти підписали інформовану згоду на анонімне надання зразків своїх пухлин для дослідницьких цілей. Усі пацієнти підписали письмову інформовану згоду відповідно до Гельсінської декларації. Відповідно до політики AOU Policlinico «G.Rodolico – S.Marco», це дослідження було звільнено від етичного розгляду, оскільки аналіз BRCA1/2 було проведено відповідно до клінічної практики, і всі пацієнти надали письмову інформовану згоду. Пацієнти також погоджуються на використання своїх даних для дослідницьких цілей.
Ми дякуємо професору Паоло Віньєрі за його допомогу в догляді за пацієнтами з раком молочної залози, як того хотів Етичний комітет.
Федеріка Марторана повідомляє про гонорари від Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Інші автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів у цій роботі.
1. Сунг Х., Ферлей Дж., Сігел Р.Л. та ін. Глобальна статистика раку 2020: GLOBOCAN оцінює захворюваність та смертність від 36 видів раку у 185 країнах світу. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660