Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku. Neke funkcije ove web stranice neće raditi kada je javascript onemogućen.
Registrujte se sa svojim specifičnim podacima i specifičnim lijekom koji vas zanima, a mi ćemo upariti informacije koje navedete sa člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i odmah vam poslati PDF kopiju e-poštom.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fizella, 1 Department C. i eksperimentalnu medicinu, Univerzitet u Kataniji, Katanija, 95123, Italija;2 Centar za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija; 3 Medicinska onkologija, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italija; 5 Medicinska genetika, ASP, Sirakuza, 96100, Italija; 6 Odsjek za biomedicinske i biotehnološke nauke, Univerzitet u Cataniji, Medicinska genetika, Catania, Italija, 95123; 7 Istraživački institut Oasi - IRCCS, Troina, 94018, Italija Komunikacije: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-pošta [email protected]; [email protected] Svrha: Mutacije germinativne linije u BRCA1 i BRCA2 i utvrđeni rak dojke (BC), jajnika (OC) i drugi povezani s doživotnim rizikom od raka. Testiranje na BRCA gen ključno je za procjenu individualnog rizika, kao i za pronalaženje metoda prevencije kod zdravih nosioca i prilagođavanje tretmana kod pacijenata oboljelih od raka. Prevalencija promjena BRCA1 i BRCA2 uveliko varira u različitim geografskim regijama i iako postoje podaci o patogenim varijantama BRCA u sicilijanskim porodicama, nedostaju studije koje su posebno usmjerene na populacije u istočnoj Siciliji. Cilj naše studije bio je istražiti incidenciju i distribuciju patogenih promjena germinativne linije BRCA u kohorti pacijenata s BC iz istočne Sicilije i procijeniti njihovu povezanost sa specifičnim osobinama BC korištenjem sekvenciranja sljedeće generacije. Prisutnost promjena korelirala je sa stupnjem tumora i indeksom proliferacije. REZULTATI: Ukupno, 35 pacijenata (9%) imalo je patogenu varijantu BRCA, 17 (49%) u BRCA1 i 18 (51%) u BRCA2. Promjene BRCA1 su prisutne kod pacijenata s trostruko negativnim BC, dok su mutacije BRCA2 češće kod pacijenata s luminalnim BC. U poređenju sa Osobe s BRCA1 varijantama koje nisu bile nosioci mutacije imale su značajno viši gradus tumora i proliferativni indeks. Zaključci: Naši nalazi pružaju pregled mutacijskog statusa BRCA kod pacijenata s rakom dojke iz istočne Sicilije i potvrđuju ulogu NGS analize u identifikaciji pacijenata s nasljednim rakom dojke. Sveukupno, ovi podaci su u skladu s prethodnim dokazima koji podržavaju BRCA skrining za pravilnu prevenciju i liječenje raka kod nositelja mutacija.
Rak dojke (RKD) je najčešći maligni tumor u svijetu i najsmrtonosniji rak kod žena.1 Biološke karakteristike koje određuju prognozu i kliničko ponašanje RKD-a su opsežno proučavane i djelimično razjašnjene tokom vremena. U stvari, trenutno se koristi nekoliko surogat markera za klasifikaciju RKD-a u različite molekularne podtipove. To su estrogenski (ER) i/ili progesteronski receptor (PgR), amplifikacija receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2), indeks proliferacije Ki-67 i gradus tumora (G).2 Kombinacija ovih varijabli identifikovala je sljedeće kategorije RKD-a: 1) Luminalni tumori, koji pokazuju ekspresiju ER i/ili PgR, činili su 75% RKD-a. Ovi tumori su dalje podijeljeni na Luminalni A, kada je Ki-67 bio ispod 20% i HER2 negativan, i Luminalni B, kada je Ki-67 bio jednak ili iznad 20% i u prisustvu HER2 amplifikacije, bez obzira na indeks proliferacije; 2) HER2+ tumori koji su ER i PgR negativni, ali pokazuju HER2 amplifikaciju. Ova grupa čini 10% svih tumora dojke; 3) Trostruko negativni rak dojke (TNBC), koji ne pokazuje ekspresiju ER i PgR i amplifikaciju HER2, čini oko 15% slučajeva raka dojke.2-4
Među ovim podtipovima raka dojke, gradus tumora i indeks proliferacije predstavljaju presječne biomarkere koji su direktno i nezavisno povezani s agresivnošću i prognozom tumora.5,6
Pored prethodno spomenutih bioloških karakteristika, uloga naslijeđenih genetskih promjena koje dovode do razvoja karcinoma dojke postala je sve važnija u posljednjih nekoliko godina.7 Oko 1 od 10 tumora dojke naslijeđen je zbog promjena germinativne linije u specifičnim genima.8 Dvije velike epidemiološke studije koje su obuhvatile više od 180.000 žena nedavno su identificirale grupu od osam gena (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C i RAD51D) primarno odgovornih za nasljedni karcinom dojke. Među ovim genima, BRCA1 i BRCA2 (u daljnjem tekstu BRCA1/2) pokazali su najjaču korelaciju s razvojem tumora dojke.9-12 U stvari, mutacije germinativne BRCA1/2 značajno povećavaju doživotni rizik od karcinoma dojke, kao i drugih maligniteta, uključujući tumore jajnika, prostate, gušterače, kolorektuma i melanoma. Od 13. do 80. godine života, kumulativna incidencija karcinoma dojke iznosi 72% kod žena s patogenom varijantom (PV) BRCA1 i 69% kod žena s BRCA2. PV.14
Značajno je da nedavna publikacija sugerira da rizik od raka dojke ovisi o vrsti poliva. U stvari, u usporedbi s patogenim skraćenim varijantama, upadljive missense varijante, posebno u genu BRCA1, povezane su sa smanjenim rizikom od raka dojke, posebno kod starijih žena.15
Prisustvo BRCA1 ili BRCA2 PV povezano je s različitim biološkim i kliničkopatološkim karakteristikama.16,17 BRCA1-povezani karcinomi dojke imaju tendenciju da budu klinički agresivni, slabo diferencirani i visoko proliferativni. Ovi tumori su obično trostruko negativni i imaju ranu dob početka. Tumori koji se javljaju kod pacijenata s BRCA2 mutacijom obično pokazuju umjerene do dobro diferencirane graduse i varijabilne proliferativne indekse. Ovi tumori su češći u lumenu B i obično se javljaju kod starijih osoba.16-18 Posebno je važno napomenuti da mutacije u BRCA1 i BRCA2 povećavaju osjetljivost na specifične tretmane, uključujući soli platine i ciljane lijekove kao što su inhibitori poli(ADP-riboza) polimeraze (PARPi).19,20
Tokom proteklih nekoliko godina, implementacija sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) u kliničkoj praksi omogućila je sve većem broju pacijenata s rakom dojke da se podvrgnu molekularnom testiranju na sindrome predispozicije za rak, uključujući BRCA1/2.21 Istovremeno, definicije zasnovane na preciznim kriterijima u vezi s porodičnom anamnezom, demografskim i kliničkopatološkim karakteristikama bolje identificiraju osobe vrijedne testiranja na BRCA1/2.22,23 U tom kontekstu, akumuliraju se dokazi o skriningu BRCA1/2 u specifičnim populacijama, ističući razlike među geografskim regijama.24–27 Iako postoje izvještaji o kohorti pacijenata s rakom dojke u zapadnoj Siciliji, manje je podataka dostupno o skriningu BRCA1/2 u populaciji istočne Sicilije.28,29
Ovdje opisujemo rezultate skrininga germinativne linije BRCA1/2 kod pacijenata s rakom dojke iz istočne Sicilije, dodatno korelirajući prisutnost mutacija BRCA1 ili BRCA2 s glavnim kliničkopatološkim karakteristikama ovih tumora.
Retrospektivna studija provedena je u „Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju“ u bolnici Policlinico Rodolico – San Marco u Cataniji. Od januara 2017. do marta 2021. godine, ukupno 455 pacijenata s rakom dojke i jajnika, melanomom, pankreasom ili prostatom upućeno je u našu molekularno-dijagnostičku laboratoriju na genetsko testiranje BRCA/2. Ova studija provedena je u skladu s Helsinškom deklaracijom, a svi učesnici su dali pismeni informirani pristanak prije molekularne analize.
Histološke i biološke karakteristike (ER, PgR, HER2 status, Ki-67 i gradus) karcinoma dojke (BC) procijenjene su na uzorcima biopsije jezgre ili hirurških uzoraka, uzimajući u obzir samo agresivne komponente tumora. Na osnovu ovih karakteristika, karcinomi dojke su klasifikovani na sljedeći način: luminalni A (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminalni B (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalni B-HER2+ (ER i/ili PgR+, HER2+), HER2+ (ER i PgR-, HER2+) ili trostruko negativni (ER i PgR-, HER2-).
Prije procjene statusa mutacija BRCA1 i BRCA2, multidisciplinarni tim koji je uključivao onkologa, genetičara i psihologa proveo je konsultacije o tumorskoj genetici za svakog pacijenta kako bi se utvrdilo prisustvo BRCA1 i/ili BRCA1 ili osoba s visokim rizikom od plućnih bolesti u genu BRCA2. Odabir pacijenata izvršen je u skladu sa smjernicama Italijanskog društva za medicinsku onkologiju (AIOM) i lokalnim sicilijanskim preporukama.30,31 Ovi kriteriji uključuju: (i) porodičnu anamnezu poznatih patogenih varijanti u genima predispozicije (npr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) muškarce s karcinomom dojke; (iii) one s karcinomom dojke i karcinomom orbite; (iv) žene s karcinomom dojke <36 godina, trigliceridom dojke <60 godina ili bilateralnim karcinomom dojke <50 godina; (v) lična medicinska anamneza karcinoma dojke <50 godina i najmanje jednog rođaka prvog stepena: (a) karcinom dojke < 50 godina; (b) nemucinozni i negranični karcinom orbite bilo koje dobi; (c) bilateralni karcinom dojke; (d) muški karcinom dojke; (e) rak gušterače; (f) rak prostate; (vi) dvije ili više lična anamneza raka dojke > 50 godina i porodična anamneza raka dojke, raka prostate ili raka gušterače za rođake koji su međusobno u srodstvu prvog stepena (uključujući rođake s kojima je u srodstvu prvog stepena); (vii) lična anamneza raka dojke i najmanje jedan rođak prvog stepena: (a) rak dojke < 50 godina; (b) neonatalni rak dojke; (c) bilateralni rak dojke; (d) muški rak dojke; (vii) žena sa visokogradusnim seroznim rakom dojke.
Od svakog pacijenta je uzet uzorak periferne krvi od 20 mL i sakupljen u EDTA epruvete (BD Biosciences). Genomska DNK je izolovana iz 0,7 mL uzoraka pune krvi korištenjem QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italija) prema uputama proizvođača i propuštena kroz Qubit® 3.0 fluorometar (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Izvršena je kvantifikacija. Obogaćivanje cilja i priprema biblioteke vrše se pomoću Oncomine™ BRCA Research Assay Chef uređaja, spremnog za ubacivanje u Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit za automatiziranu pripremu biblioteke prema uputama proizvođača. Kit se sastoji od dva multipleks PCR primer poola koji se mogu koristiti za proučavanje svih gena BRCA1 (NM_007300.3) i BRCA2 (NM_000059.3). Ukratko, 15 µL svakog razrijeđenog uzorka DNK (10 ng) dodano je na ploče s barkodom za pripremu biblioteke, a svi reagensi i potrošni materijal su uneseni u Ion Chef™ instrument. Automatizirana priprema biblioteke i objedinjavanje biblioteke uzoraka s barkodom zatim su izvršeni na Ion Chef™ instrumentu. Broj pripremljenih biblioteka zatim je procijenjen pomoću Qubit® 3.0 fluorometra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača. Konačno, biblioteke se kombiniraju u ekvimolarnim omjerima u Ion Chef™ epruvetama za uzorke biblioteke (epruvete s barkodom) i unesene na instrumentom Ion Chef™. Sekvenciranje je provedeno korištenjem instrumenta Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) uz korištenje čipa Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Analiza podataka provedena je pomoću programa Amplicon Suite (SmartSeq srl) i softvera Ion Reporter.
Sva nomenklatura varijanti slijedila je trenutne smjernice Konzorcija za varijacije ljudskog genoma, dostupne online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinički značaj BRCA1/2 varijanti definiran je korištenjem klasifikacije Međunarodnog konzorcija ENIGMA (Mreža zasnovana na dokazima za tumačenje alela mutiranih zametnih linija, https://enigmaconsortium.org/) i konsultovanjem različitih baza podataka kao što su ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD i UMD. Klasifikacija uključuje pet različitih kategorija rizika: benigna (kategorija I), vjerovatno benigna (kategorija II), varijanta neizvjesnog značaja (VUS, kategorija III), vjerovatno patogena (kategorija IV) i patogena (kategorija V). VarSome je također analizirao učinak mutacija na strukturu i funkciju proteina, informativni alat s pristupom 30 baza podataka.32
Da bi se svakom VUS-u dodijelio potencijalni klinički značaj, korišteni su sljedeći algoritmi za računarsko predviđanje proteina: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) i Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varijante klasifikovane kao klasa 1 i 2 smatrane su divljim tipom.
Sanger sekvenciranje potvrdilo je prisustvo svake patogene varijante. Ukratko, par specifičnih prajmera je dizajniran za svaku detektovanu varijantu korištenjem referentnih sekvenci gena BRCA1 i BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 i NG_012772.3, NM_000059.3, respektivno). Stoga je provedena ciljana PCR, a zatim Sanger sekvenciranje.
Pacijenti koji su bili negativni na gen BRCA1/2 testirani su multipleks ligacijom zavisnom amplifikacijom sonde (MLPA) prema uputama proizvođača kako bi se procijenilo prisustvo velikih genomskih preuređenja (LGR). Ukratko, uzorci DNK se denaturiraju i koristi se do 60 sondi specifičnih za gene BRCA1 i BRCA2, od kojih svaka detektuje specifičnu sekvencu DNK dužine približno 60 nukleotida. Produkti amplifikacije sonde, koji se sastoje od jedinstvenog seta PCR amplikona, zatim su analizirani kapilarnom elektroforezom i Cofalyser.Net softverom u kombinaciji s odgovarajućim Cofalyser tabelama specifičnim za seriju (www.mrcholland.com).
Odabrane kliničkopatološke varijable (histološki gradus i Ki-67% indeks proliferacije) bile su povezane s prisustvom BRCA1/2 PV, izračunato korištenjem Prism softvera v. 8.4 korištenjem Fisherovog egzaktnog testa, pretpostavljajući da je p-vrijednost <0,05 značajna.
Između januara 2017. i marta 2021. godine, 455 pacijenata je testirano na mutacije germinativne linije BRCA1/2 gena. Testiranje mutacija provedeno je u Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju bolnice Policlinico. Prema sicilijanskim smjernicama (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Jannaio 2020), u Rodoliku u Cataniji – San Marco” ukupno je 389 pacijenata imalo rak dojke, 37 rak jajnika, 16 rak gušterače, 8 rak prostate i 5 melanom. Raspodjela pacijenata prema vrsti raka i rezultatima analize prikazana je na Slici 1.
Slika 1 prikazuje dijagram toka koji prikazuje pregled studije. Pacijentice s tumorima dojke, melanoma, gušterače, prostate ili jajnika testirane su na mutacije u genima BRCA1 i BRCA2.
Skraćenice: PV, patogena varijanta; VUS, varijanta neizvjesnog značaja; WT, sekvenca divljeg tipa BRCA1/2.
Selektivno smo fokusirali naše studije na kohorte oboljelih od raka dojke. Pacijentice su imale srednju dob od 49 godina (raspon 23-89) i bile su pretežno ženskog spola (n=376, ili 97%).
Od ovih ispitanika, 64 (17%) imalo je mutacije BRCA1/2 i sve su bile ženskog spola. Trideset pet (9%) imalo je PV, a 29 (7,5%) VUS. Sedamnaest (48,6%) od 35 patogenih varijanti javilo se u BRCA1 i 18 (51,4%) u BRCA2, dok se 5 VUS javilo u BRCA1 (17,2%) i 24 (82,8%) u BRCA2 (Slike 1 i 2). LGR nije bio prisutan u MLPA analizi.
Slika 2. Analiza mutacija BRCA1 i BRCA2 kod 389 pacijentica s rakom dojke. (A) Distribucija patogenih varijanti (PV) (crvena), varijanti neizvjesnog značaja (VUS) (narandžasta) i WT (plava) kod 389 pacijentica s rakom dojke; (B) 389 pacijentica s rakom dojke Trideset pet (9%) imalo je patogene varijante (PV) BRCA1/2. Među njima, 17 (48,6%) bili su nosioci BRCA1 PV (tamnocrvena), a 18 (51,4%) bili su nosioci BRCA2 (svijetlocrvena); (C) 29 (7,5%) od 389 ispitanica nosilo je VUS, 5 (17,2%) gene BRCA1 (tamnonarandžasta) i 24 (82,8%) gene BRCA2 (svijetlonarandžasta).
Skraćenice: PV, patogena varijanta; VUS, varijanta neizvjesnog značaja; WT, sekvenca divljeg tipa BRCA1/2.
Zatim smo istražili prevalenciju molekularnih podtipova karcinoma dojke kod pacijenata sa BRCA1/2 paracetamolom. Distribucija je uključivala 2 (5,7%) luminalni A, 15 (42,9%) luminalni B, 3 (8,6%) luminalni B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ i 13 (37,1%) pacijentica sa TNBC. Među BRCA1-pozitivnim pacijenticama, 5 (29,4%) imalo je luminalni B karcinom dojke, 2 (11,8%) HER2+ bolest, a 10 (58,8%) TNBC. Tumori bez BRCA1 mutacija bili su ili luminalni A ili luminalni B-HER2+ (Slika 3). U BRCA2-pozitivnoj podgrupi, 10 (55,6%) tumora bili su luminalni B, 3 (16,7%) luminalni B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC i 2 (11,1%) luminalni A (Slika 3). Nije bilo HER2+ tumora. bile su prisutne u ovoj grupi. Dakle, mutacije BRCA1 su prisutne kod pacijenata sa TNBC, dok su promjene BRCA2 predominantne kod osoba sa lumenom B.
Slika 3. Prevalencija podtipova raka dojke kod pacijenata sa patogenim varijantama u BRCA1 i BRCA2. Histogrami koji prikazuju distribuciju BRCA1- (tamnocrveno) i BRCA2- (svijetlocrveno) PV među molekularnim podtipovima pacijenata sa rakom dojke. Brojevi prikazani unutar svakog okvira predstavljaju procenat pacijenata sa BRCA1 i BRCA2 PV za svaki podtip raka dojke.
Skraćenice: PV, patogena varijanta; HER2+, pozitivan na receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta; TNBC, trostruko negativni rak dojke.
Nakon toga, procijenili smo tip i lokalizaciju gena BRCA1 i BRCA2 PV. Kod BRCA1 PV uočili smo 7 jednonukleotidnih varijanti (SNV), 6 delecija, 3 duplikacije i 1 inserciju. Samo jedna mutacija (c.5522delG) predstavlja novo otkriće. Najčešći BRCA1 PV otkriven kod oba ispitanika bio je c.5035_5039delCTAAT. Ova promjena uključuje deleciju pet nukleotida (CTAAT) u BRCA1 eksonu 15, što rezultira zamjenom aminokiseline leucina tirozinom na kodonu 1679, a zbog pomaka okvira čitanja translacije s predviđenim alternativnim stop kodonom dolazi do preranog skraćivanja proteina. Sve ostale promjene otkrivene su samo u jednom slučaju. Značajno je da je jedan od prijavljenih PV bio smješten u konsenzus regiji mjesta splajsovanja (c.4357+1G>T) (Tabela 1).
Što se tiče BRCA2 PV, uočili smo 6 delecija, 6 SNV-ova i 2 duplikacije. Nijedna od pronađenih promjena nije nova. Tri mutacije su se ponovile u našoj populaciji, c.428dup i c.8487+1G>A uočene su kod 3 ispitanika, a zatim c.5851_5854delAGTT pronađena je u dva slučaja. Promjena c.428dup uključuje ponavljanje C u eksonu 5 BRCA2, za koji se predviđa da kodira skraćeni, nefunkcionalni protein. Mutacija c.8487+1G>A javlja se u introničkoj regiji introna 19 BRCA2 (± 1,2) i utiče na konsenzus sekvencu splajsovanja, što rezultira izmijenjenim splajsovanjem, što rezultira abnormalnim ili odsutnim proteinom. Patogena varijanta c.5851_5854delAGTT nastaje zbog delecije od 4 nukleotida sa nukleotidnih pozicija 5851 do 5854 u kodirajućem eksonu 10 gena BRCA2 i rezultira translacijskom... pomicanje okvira čitanja s predviđenim alternativnim stop kodonom (p.S1951WfsTer). Značajno je da su, kao što je prethodno objavljeno, obje promjene c.631G>A i c.7008-2A>T otkrivene kod istog pacijenta.34 Prva mutacija uključuje zamjenu adenozina (A) u BRCA2 eksonu 7 nukleotidom koji sadrži gvanin (G), što rezultira promjenom valina u izoleucin na kodonu 211, izoleucin. Aminokiselina je aminokiselina s vrlo sličnim svojstvima. Ova promjena utječe na normalno splajsovanje mRNA. Druga varijanta se nalazi u introničnoj regiji i rezultira dvostrukom zamjenom A timinom (T) prije eksona 13 gena koji kodira BRCA2. Promjena c.7008-2A>T može generirati više transkripata različitih dužina. Nadalje, u grupi BRCA2 PV, 4 od 18 promjena (22,2%) bile su intronične.
Zatim smo mapirali štetne mutacije BRCA1/2 u funkcionalnim domenima i regijama koje vežu proteine ​​(Slika 4). U genu BRCA1, 50% PV-a (perforirajućih proteina) nalazilo se u regiji klastera raka dojke (BCCR), dok se 22% mutacija nalazilo u regiji klastera raka jajnika (OCCR) (Slika 4A). U BRCA2 PV-u, 35,7% varijanti nalazilo se u BCCR regiji, a 42,8% mutacija nalazilo se u OCCR-u (Slika 4B). Zatim smo procijenili lokaciju PV-a unutar proteinskih domena BRCA1 i BRCA2. Za protein BRCA1 pronašli smo tri PV-a u domenama petlje i spiralne zavojnice, te dvije mutacije u domenu BRCT (Slika 4A). Za protein BRCA2, 4 PV-a mapirana su na domen ponavljanja BRC-a, dok su 3 intronske i 3 egzonske promjene otkrivene u domenima koji vežu oligo/oligosaharid (OB) i toranj (T) (Slika 4B).
Slika 4. Shematski prikaz proteina BRCA1 i BRCA2 i lokalizacija patogenih varijanti. Ova slika prikazuje distribuciju patogenih varijanti BRCA1 (A) i BRCA2 (B) kod pacijenata oboljelih od raka dojke. Egzonske mutacije su prikazane plavom bojom, dok su intronske varijante prikazane narandžastom bojom. Visina stupca predstavlja broj slučajeva. Prikazani su proteini BRCA1 i BRCA2 i njihovi funkcionalni domeni. (A) Protein BRCA1 sadrži domen petlje (RING) i sekvencu nuklearne lokalizacije (NLS), domen spiralne zavojnice, SQ/TQ klaster domen (SCD) i C-terminalni domen BRCA1 (BRCT). (B) Protein BRCA2 sadrži osam BRC ponavljanja, domen koji veže DNK sa spiralnim domenom (Helikalni), tri nabora za vezivanje oligonukleotida/oligosaharida (OB), domen tornja (T) i NLS na C strani. Područja koja se nazivaju Regija klastera raka dojke (BCCR) i Regija klastera raka jajnika (OCCR) prikazana su na dnu. *Predstavlja mutacije koje određuju zaustavljanje kodoni.
Zatim smo istražili kliničko-patološke karakteristike karcinoma dojke koje bi mogle biti u korelaciji s prisustvom BRCA1/2 paralize. Kompletni klinički kartoni bili su dostupni za 181 BRCA1/2-negativnog pacijenta (bez nosioca) i sve nosioce (n = 35). Postojala je korelacija između stope proliferacije tumora i njegovog gradusa.
Distribuciju Ki-67 izračunali smo na osnovu medijane naše kohorte (25%, raspon <10-90%). Ispitanici sa Ki-67 < 25% definirani su kao „nizak Ki-67“, dok su osobe s vrijednostima ≥ 25% smatrane „visokim Ki-67“. Značajne razlike u Ki-67 (p<0,01) pronađene su između osoba koje nisu nosioci i nosioca BRCA1 PV gena (slika 5A).
Slika 5 Korelacija Ki-67 sa distribucijom gradusa kod žena sa rakom dojke sa i bez BRCA1 i BRCA2 PV. (A) Boxplot koji prikazuje srednje vrijednosti Ki-67 kod 181 pacijentice sa rakom dojke koja nije nosilac u odnosu na pacijentice sa BRCA1 (18) ili BRCA2 (17) PV. P vrijednosti ispod 0,5 smatrane su statistički značajnim. (B) Histogram koji predstavlja raspoređivanje pacijentica sa rakom dojke u histološke grupe gradusa (G2 i G3) prema statusu mutacije BRCA1 i BRCA2 (WT ispitanice, nosioci BRCA1 i BRCA2 PV).
Isto tako, ispitali smo da li gradus tumora korelira sa prisustvom BRCA1/2 PV. Budući da G1 karcinom dojke nije bio prisutan u našoj populaciji, pacijente smo podijelili u dvije grupe (G2 ili G3). U skladu sa rezultatima Ki-67, analiza je otkrila statistički značajnu korelaciju između gradusa tumora i mutacije BRCA1, sa većim udjelom G3 tumora kod nosioca BRCA1 u poređenju sa nenosiocima (p<0,005) (Slika 5B).
Napredak u tehnologiji sekvenciranja DNK omogućio je neviđen napredak u genetskom testiranju BRCA1/2, s ključnim implikacijama za pacijente s porodičnom anamnezom raka. Do danas je identificirano i klasificirano približno 20.000 BRCA1/2 varijanti prema Američkom društvu za medicinsku genetiku35 i ENIGMA sistemu.35,36 Dobro je poznato da se mutacijski spektar BRCA1/2 uveliko razlikuje u različitim geografskim regijama.37 U Italiji, stopa BRCA1/2 PV kretala se od 8% do 37%, što pokazuje široku varijabilnost unutar zemlje.38,39 Sa populacijom od gotovo 5 miliona, Sicilija je peta najveća regija u Italiji po broju stanovnika. Iako postoje podaci o distribuciji BRCA1/2 u zapadnoj Siciliji, nema opsežnih dokaza u istočnom dijelu ostrva.
Naša studija je jedan od prvih izvještaja o incidenciji BRCA1/2 PV kod pacijenata s rakom dojke u istočnoj Siciliji.28 Fokusirali smo našu analizu na rak dojke, jer je to daleko najčešća bolest u našoj kohorti.
Prilikom testiranja 389 pacijenata s rakom dojke, 9% je imalo BRCA1/2 PV, ravnomjerno raspoređene između BRCA1 i BRCA2. Ovi rezultati su u skladu s onima koji su prethodno zabilježeni u italijanskoj populaciji.28 Zanimljivo je da su 3% (13/389) naše kohorte bili muškarci. Ova stopa je veća od očekivane za rak dojke kod muškaraca (1% svih karcinoma dojke),40 što odražava naš odabir populacija na osnovu rizika od mutacije BRCA1/2. Međutim, nijedan od ovih muškaraca nije razvio BRCA1/2 PV, pa su bili kandidati za daljnju molekularnu analizu kako bi se isključilo prisustvo manje uobičajenih mutacija kao što su PALB2, RAD51C i D, između ostalih. Varijacije neizvjesnog značaja pronađene su kod 7% ispitanika kod kojih je bio evidentan BRCA2 VUS. Čak je i ovaj rezultat u skladu s postojećim dokazima.28,41,42
Kada smo analizirali distribuciju molekularnih podtipova BC kod žena s BRCA1/2 mutantima, potvrdili smo poznate veze između TNBC i BRCA1 PV (58,8%) te između luminalnog B BC i BRCA2 PV (55,6%).16,43 Luminalni A i HER2+ tumori kod nositelja BRCA1 i BRCA2 PV su u skladu s postojećim podacima iz literature.16,43
Zatim se fokusiramo na vrstu i lokaciju BRCA1/2 PV. U našoj kohorti, najčešći BRCA1 PV bio je c.5035_5039delCTAAT. Iako su Incorvaia i sar. nisu opisali ovu varijantu u svojoj sicilijanskoj kohorti, drugi autori su je prijavili kao germinativni BRCA1 PV.34 Nekoliko BRCA1 PV pronađeno je u našoj kohorti - npr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA i c.5266dupC - koji su uočeni na Siciliji.28 Od njih, dvije osnivačke mutacije BRCA1 (c.181T>G i c.5266dupC) se često nalaze kod aškenaskih Jevreja istočne i centralne Evrope (Poljska, Češka), Slovenija, Austrija, Mađarska, Bjelorusija i Njemačka), 44,45 a u Sjedinjenim Državama i Argentini nedavno je definirana kao "rekurentna germinativna varijanta" kod italijanskih pacijenata sa rakom dojke i karcinomom dojke. Varijanta 34c.514del je prethodno identificirana kod 8 pacijenata sa rakom dojke sa sjeverne Sicilije u Palermu i Messini. Zanimljivo je da su čak i Incorvaia i sar. pronađena je varijanta c.3253dupA u nekim porodicama u Cataniji.28 Najreprezentativniji BRCA2 PV su c.428dup, c.5851_5854delAGTT i intronička varijanta c.8487+1G>A, koje su detaljnije opisane28 kod pacijenta u Palermu sa c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV je uočen u domaćinstvima na sjeverozapadnoj Siciliji, uglavnom u regijama Trapani i Palermo, dok je c.5851_5854delAGTT PV uočen u domaćinstvima na sjeverozapadnoj Siciliji. Varijanta 8487+1G>A bila je češća kod ispitanika iz Messine, Palerma i Caltanissette.28 Rebbeck i sar. prethodno je opisana promjena c.5851_5854delAGTT u Kolumbiji.37 Još ​​jedan BRCA2 PV, c.631+1G>A, pronađen je kod pacijenata s BC i OC iz Sicilije (Agrigento, Siracusa i Ragusa).28 Značajno je da smo kod istog pacijenta uočili koegzistenciju dvije BRCA2 varijante (BRCA2 c.631G>A i c.7008-2A>T), za koje smo pretpostavili da su odvojene u cis modu, kao što je prethodno objavljeno.34,46 Ove BRCA2 podebljane mutacije se zaista često primjećuju u italijanskoj regiji i utvrđeno je da uvode preuranjene stop kodone, utičući na splajsovanje informacijske RNK i uzrokujući neuspjeh BRCA2 proteina.47,48
Također smo mapirali BRCA1 i BRCA2 PV u pretpostavljenim OCCR i BCCR regijama proteinskih domena i gena. Ove regije su Rebbeck i saradnici opisali kao područja rizika za razvoj raka jajnika i dojke, respektivno.49 Međutim, dokazi o povezanosti između lokacije varijanti germinativne linije i rizika od raka dojke ili jajnika ostaju kontroverzni.28,50-52 U našoj populaciji, BRCA1 PV su se pretežno nalazili u BCCR regiji, dok su BRCA2 PV pretežno bili locirani u OCCR regiji. Međutim, nismo uspjeli pronaći nikakvu povezanost između pretpostavljenih OCCR i BCCR regija i BC karakteristika. To može biti zbog ograničenog broja pacijenata s mutacijama BRCA1/2. Iz perspektive proteinske domene, BRCA1 PV su raspoređeni duž cijelog proteina, a BRCA2 promjene se preferencijalno nalaze u BRC ponavljajućem domenu.
Konačno, korelirali smo kliničko-patološke karakteristike karcinoma dojke sa BRCA1/2 paraliza-ma (PV). Zbog ograničenog broja uključenih pacijenata, pronašli smo značajnu korelaciju samo između Ki-67 i gradusa tumora. Iako procjena i interpretacija Ki-67 ostaju donekle kontroverzni, sigurno je da su visoke stope proliferacije povezane sa povećanim rizikom od recidiva bolesti i smanjenim preživljavanjem. Do danas, granična vrijednost za razlikovanje između "visokog" i "niskog" Ki-67 je 20%. Međutim, ovaj prag se ne odnosi na našu populaciju pacijenata sa mutacijom BRCA1/2, koja ima srednju vrijednost Ki-67 od 25%. Ovaj trend visokih stopa Ki-67 može se objasniti prevalencijom u našim kohortama luminalnog B i TNBC, od kojih je bilo prisutno malo luminalnog A tumora. Međutim, neki dokazi ukazuju na to da viša granična vrijednost Ki-67 (25–30%) može bolje stratificirati pacijente prema njihovoj prognozi.53,54 Iz rezultata naše analize, značajna korelacija nije iznenađujuća. Javlja se između visokog Ki-67 i gradusa i prisustva BRCA1. PV. U stvari, tumori povezani s BRCA1 tipični su za TNBC i pokazuju agresivnije karakteristike.16,17
Zaključno, ova studija pruža izvještaj o mutacijskom statusu BRCA1/2 u kohorti pacijenata s rakom dojke iz istočne Sicilije. Sveukupno, naši nalazi su u skladu s postojećim dokazima, kako u pogledu prevalencije mutacija, tako i kliničko-patoloških karakteristika kod raka dojke. Potrebna su daljnja istraživanja na većim populacijama pacijenata s rakom dojke s mutacijom BRCA1/2, kao što je korištenje multigenomske proširene mutacijske analize, kako bi se procijenilo prisustvo plućnih bunara (PV) koji su različiti i rjeđi od BRCA1/2. Ovo će omogućiti identifikaciju i pravilno liječenje sve većeg broja ispitanika s povećanim rizikom od raka zbog genetskih mutacija.
Potvrdili smo da su pacijenti potpisali informirani pristanak za anonimno izdavanje uzoraka svojih tumora u istraživačke svrhe. Svi pacijenti su potpisali pisani informirani pristanak u skladu s Helsinškom deklaracijom. Prema politici AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“, ova studija je izuzeta od etičkog pregleda jer je analiza BRCA1/2 provedena u skladu s kliničkom praksom i svi pacijenti su dali pisani informirani pristanak. Pacijenti su također pristali na korištenje njihovih podataka u istraživačke svrhe.
Zahvaljujemo prof. Paolu Vigneriju na pomoći u liječenju pacijenata oboljelih od raka dojke, na zahtjev Etičkog odbora.
Federica Martorana izvještava o honorarima od Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Ostali autori izjavljuju da nemaju sukob interesa u ovom radu.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Globalna statistika raka 2020: GLOBOCAN procjenjuje incidenciju i smrtnost od 36 vrsta raka u 185 zemalja širom svijeta. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660