Javascript je ve vašem prohlížeči momentálně zakázán. Některé funkce tohoto webu nebudou fungovat, pokud je javascript zakázán.
Zaregistrujte se s konkrétními údaji a lékem, o který máte zájem, a my vámi poskytnuté informace porovnáme s články v naší rozsáhlé databázi a obratem vám e-mailem zašleme kopii ve formátu PDF.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 12, Univerzitní klinika Livia Manzella, Univerzita Catania Manzella Catania, 95123, Itálie;2 Centrum pro experimentální onkologii a hematologii, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania , 95123, Itálie; 3 Lékařská onkologie, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itálie; 4 Lékařská genetika, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Itálie; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Itálie; 6 Katedra biomedicínských a biotechnologických věd, Univerzita v Catanii, Lékařská genetika, Catania, Itálie, 95123; 7 Výzkumný institut Oasi - IRCCS, Troina, 94018, Itálie Komunikace: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, e-mail [email protected]; [email protected] Účel: Mutace v zárodečné linii genů BRCA1 a BRCA2 a rozvinutý karcinom prsu (BC), vaječníků (OC) a další spojené s celoživotním rizikem rakoviny. Testování genu BRCA je klíčové pro posouzení individuálního rizika, stejně jako pro nalezení preventivních metod u zdravých nositelů a pro přizpůsobení léčby pacientkám s rakovinou. Prevalence změn BRCA1 a BRCA2 se v různých geografických oblastech značně liší a ačkoli existují údaje o patogenních variantách BRCA v sicilských rodinách, studie zaměřené konkrétně na populace ve východní Sicílii chybí. Cílem naší studie bylo zkoumat výskyt a distribuci patogenních změn v zárodečné linii BRCA v kohortě pacientek s BC z východní Sicílie a posoudit jejich souvislost se specifickými znaky BC pomocí sekvenování nové generace. Přítomnost změn korelovala se stupněm nádoru a indexem proliferace. VÝSLEDKY: Celkově mělo 35 pacientek (9 %) patogenní variantu BRCA, 17 (49 %) BRCA1 a 18 (51 %) BRCA2. Změny BRCA1 jsou rozšířené u pacientek s trojitě negativním BC, zatímco mutace BRCA2 jsou častější u pacientek s luminálním BC. Ve srovnání s U nenositelů mutací měly subjekty s variantami BRCA1 významně vyšší stupeň nádoru a proliferativní index. Závěry: Naše zjištění poskytují přehled o mutačním stavu BRCA u pacientek s rakovinou prsu z východní Sicílie a potvrzují roli NGS analýzy při identifikaci pacientek s hereditární rakovinou prsu. Celkově jsou tato data v souladu s předchozími důkazy podporujícími screening BRCA pro správnou prevenci a léčbu rakoviny u nositelů mutací.
Rakovina prsu (RC) je celosvětově nejčastějším maligním onemocněním a zároveň nejsmrtelnějším typem rakoviny u žen.1 Biologické znaky, které určují prognózu a klinické chování RC, byly v průběhu času rozsáhle studovány a částečně objasněny. V současnosti se k rozdělení RC do různých molekulárních podtypů používá několik náhradních markerů. Jsou to estrogenní (ER) a/nebo progesteronový receptor (PgR), amplifikace receptoru 2 lidského epidermálního růstového faktoru (HER2), proliferační index Ki-67 a stupeň nádoru (G).2 Kombinace těchto proměnných identifikovala následující kategorie RC: 1) Luminální nádory, vykazující expresi ER a/nebo PgR, tvořily 75 % RC. Tyto nádory byly dále rozděleny na Luminální A, kdy Ki-67 byla pod 20 % a HER2 negativní, a Luminální B, kdy Ki-67 byla rovna nebo vyšší než 20 % a v přítomnosti amplifikace HER2, bez ohledu na proliferační index; 2) HER2+ nádory, které jsou ER a PgR negativní, ale vykazují amplifikaci HER2. Tato skupina představuje 10 % všech nádorů prsu; 3) Trojitě negativní karcinom prsu (TNBC), který nevykazuje expresi ER a PgR a amplifikaci HER2, představuje přibližně 15 % případů rakoviny prsu.2-4
Mezi těmito podtypy karcinomu prsu představují stupeň nádoru a proliferační index průřezové biomarkery, které jsou přímo a nezávisle spojeny s agresivitou a prognózou nádoru.5,6
Kromě výše zmíněných biologických rysů se v posledních několika letech stala stále důležitější role zděděných genetických změn vedoucích k rozvoji rakoviny prsu (BC).7 Přibližně 1 z 10 nádorů prsu je zděděn v důsledku zárodečných změn ve specifických genech.8 Dvě velké epidemiologické studie zahrnující více než 180 000 žen nedávno identifikovaly skupinu osmi genů (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C a RAD51D) primárně zodpovědných za dědičný BC. Mezi těmito geny BRCA1 a BRCA2 (dále jen BRCA1/2) vykazovaly nejsilnější korelaci s rozvojem nádorů prsu.9-12 Ve skutečnosti zárodečné mutace BRCA1/2 významně zvyšují celoživotní riziko BC, stejně jako dalších malignit, včetně ovariálních, prostatických, pankreatických, kolorektálních a melanomových onemocnění. Ve věku 13 až 80 let je kumulativní incidence BC 72 % u žen s patogenní variantou BRCA1 (PV) a 69 % u žen s BRCA2. PV.14
Je pozoruhodné, že nedávná publikace naznačuje, že riziko rakoviny prsu závisí na typu fotosenzitivní encefalitidy. Ve skutečnosti, ve srovnání s patogenními zkrácenými variantami, jsou zjevné missense varianty, zejména v genu BRCA1, spojeny se sníženým rizikem rakoviny prsu, a to zejména u starších žen.15
Přítomnost pervitinálních karcinomů (PV) v genu BRCA1 nebo BRCA2 byla spojena s různými biologickými a klinicko-patologickými znaky.16,17 Rakovina prsu asociovaná s BRCA1 bývá klinicky agresivní, špatně diferencovaná a vysoce proliferativní. Tyto nádory jsou obvykle trojitě negativní a mají časný nástup. Nádory, které se vyskytují u pacientů s mutací BRCA2, obvykle vykazují středně až dobře diferencovaný stupeň a variabilní proliferační indexy. Tyto nádory jsou častější v lumen B a obvykle se vyskytují u starších dospělých.16-18 Je pozoruhodné, že mutace v genu BRCA1 a BRCA2 zvyšují citlivost na specifickou léčbu, včetně platinových solí a cílených léků, jako jsou inhibitory poly(ADP-ribóza)polymerázy (PARPi).19,20
V posledních několika letech umožnilo zavedení sekvenování nové generace (NGS) do klinické praxe rostoucímu počtu pacientů s karcinomem prsu (BC) podstoupit molekulární testování na syndromy náchylnosti k rakovině, včetně BRCA1/2.21 Současně byly definice založené na přesných kritériích týkajících se rodinné anamnézy, demografických a klinicko-patologických charakteristik, aby bylo možné lépe identifikovat osoby vhodné pro testování BRCA1/2.22,23 V této souvislosti se hromadí důkazy o screeningu BRCA1/2 u specifických populací, což zdůrazňuje rozdíly mezi geografickými oblastmi.24–27 Ačkoli existují zprávy o kohortě BC v západní Sicílii, o screeningu BRCA1/2 u populace východní Sicílie je k dispozici méně údajů.28,29
Zde popisujeme výsledky screeningu zárodečné linie BRCA1/2 u pacientek s karcinomem prsu z východní Sicílie a dále korelujeme přítomnost mutací BRCA1 nebo BRCA2 s hlavními klinicko-patologickými rysy těchto nádorů.
V „Centru pro experimentální onkologii a hematologii“ v nemocnici Policlinico Hospital Rodolico – San Marco v Catanii byla provedena retrospektivní studie. Od ledna 2017 do března 2021 bylo do naší molekulárně diagnostické laboratoře odesláno celkem 455 pacientek s rakovinou prsu a vaječníků, melanomem, slinivky břišní nebo prostaty ke genetickému testování BRCA/2. Tato studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací a všichni účastníci poskytli před molekulární analýzou písemný informovaný souhlas.
Histologické a biologické charakteristiky (ER, PgR, HER2 status, Ki-67 a grade) karcinomu prsu (BC) byly hodnoceny na základě biopsie jádra nebo chirurgických vzorků, přičemž se bral v úvahu pouze agresivní složky nádoru. Na základě těchto charakteristik byly karcinomy prsu klasifikovány následovně: luminální A (ER+ a/nebo PgR+, HER2-, Ki-67 < 20 %), luminální B (ER+ a/nebo PgR+, HER2-, Ki-67 ≥ 20 %), luminální B-HER2+ (ER a/nebo PgR+, HER2+), HER2+ (ER a PgR-, HER2+) nebo trojitě negativní (ER a PgR-, HER2-).
Před posouzením statusu mutací BRCA1 a BRCA2 provedl multidisciplinární tým zahrnující onkologa, genetika a psychologa u každého pacienta konzultaci zaměřenou na genetiku nádorů, aby se určila přítomnost BRCA1 a/nebo BRCA1, nebo u jedinců s vysokým rizikem paracetamolu v genu BRCA2. Výběr pacientek byl proveden podle pokynů Italské společnosti pro lékařskou onkologii (AIOM) a místních sicilských doporučení.30,31 Tato kritéria zahrnují: (i) rodinnou anamnézu známých patogenních variant v genech náchylnosti (např. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) muži s karcinomem prsu (BC); (iii) pacienti s karcinomem prsu a karcinomem ovarií (OC); (iv) ženy s karcinomem prsu <36 let, triglyceridem prsu <60 let nebo bilaterálním karcinomem prsu <50 let; (v) osobní anamnéza karcinomu prsu <50 let a alespoň jeden příbuzný prvního stupně: (a) BC < 50 let; (b) nehlucenózní a nehraniční OC jakéhokoli věku; (c) bilaterální BC; (d) mužský BC; (e) rakovina slinivky břišní; (f) rakovina prostaty; (vi) dva nebo více případů rakoviny slinivky břišní v osobní anamnéze > 50 let a rodinná anamnéza rakoviny slinivky břišní, karcinomu očního kanálu nebo rakoviny slinivky břišní v rodinné anamnéze u příbuzných, kteří jsou vzájemně příbuzní prvního stupně (včetně příbuzných, se kterými je pacientka příbuzná prvního stupně); (vii) Osobní anamnéza rakoviny slinivky břišní a alespoň jeden příbuzný prvního stupně: (a) rakovina slinivky břišní <50 let; (b) bez rakoviny břicha; (c) bilaterální rakovina slinivky břišní; (d) rakovina slinivky břišní u muže; (vii) žena s vysoce závažným serózním karcinomem slinivky břišní.
Od každého pacienta byl odebrán 20ml vzorek periferní krve a sbírán do zkumavek s EDTA (BD Biosciences). Genomická DNA byla izolována z 0,7ml vzorků plné krve za použití izolační sady QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Hilden, Itálie) dle pokynů výrobce a následně propuštěna fluorometrem Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Provedena byla kvantifikace. Obohacení cíle a příprava knihovny se provádějí pomocí přístroje Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, který je připraven k naložení do sady Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 pro automatickou přípravu knihovny dle pokynů výrobce. Sada se skládá ze dvou multiplexních PCR primerů, které lze použít ke studiu všech genů BRCA1 (NM_007300.3) a BRCA2 (NM_000059.3). Stručně řečeno, 15 µL každého zředěného vzorku DNA (10 ng) bylo přidáno na destičky s čárovým kódem pro přípravu knihovny a všechny činidla a spotřební materiál byly naloženy do přístroje Ion Chef™. Automatizovaná příprava knihovny a sdružování vzorků s čárovým kódem byly poté provedeny na přístroji Ion Chef™. Počet připravených knihoven byl poté vyhodnocen fluorometrem Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dle pokynů výrobce. Nakonec jsou knihovny sloučeny v ekvimolárních poměrech ve zkumavkách s knihovnami Ion Chef™ (zkumavky s čárovým kódem) a naloženy na... přístroj Ion Chef™. Sekvenování bylo provedeno pomocí přístroje Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) s použitím čipu Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Analýza dat byla provedena pomocí softwaru Amplicon Suite (SmartSeq srl) a softwaru Ion Reporter.
Veškerá nomenklatura variant se řídila aktuálními pokyny Konsorcia pro variace lidského genomu, které jsou k dispozici online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinický význam variant BRCA1/2 byl definován pomocí klasifikace Mezinárodního konsorcia ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) a konzultací různých databází, jako jsou ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD a UMD. Klasifikace zahrnuje pět odlišných rizikových kategorií: benigní (kategorie I), pravděpodobně benigní (kategorie II), varianta s nejistým významem (VUS, kategorie III), pravděpodobně patogenní (kategorie IV) a patogenní (kategorie V). VarSome také analyzoval vliv mutací na strukturu a funkci proteinů, což je informativní nástroj s přístupem k 30 databázím.32
Pro přiřazení potenciálního klinického významu každému VUS byly použity následující algoritmy pro výpočetní predikci proteinů: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) a Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianty klasifikované jako třída 1 a 2 byly považovány za divoký typ.
Sangerovo sekvenování potvrdilo přítomnost každé patogenní varianty. Stručně řečeno, pro každou detekovanou variantu byl navržen pár specifických primerů s použitím referenčních sekvencí genů BRCA1 a BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 a NG_012772.3, NM_000059.3). Proto byla provedena cílená PCR následovaná Sangerovým sekvenováním.
Pacienti s negativním testem na gen BRCA1/2 byli testováni multiplexní ligačně závislou amplifikací sond (MLPA) podle pokynů výrobce k posouzení přítomnosti velkých genomových přeskupení (LGR). Stručně řečeno, vzorky DNA jsou denaturovány a je použito až 60 sond specifických pro geny BRCA1 a BRCA2, z nichž každá detekuje specifickou sekvenci DNA o délce přibližně 60 nukleotidů. Produkty amplifikace sond, sestávající z unikátní sady PCR amplikonů, byly poté analyzovány kapilární elektroforézou a pomocí softwaru Cofalyser.Net ve spojení s příslušnými tabulkami Cofalyser specifickými pro danou šarži (www.mrcholland.com).
Vybrané klinicko-patologické proměnné (histologický stupeň a proliferační index Ki-67%) byly asociovány s přítomností BRCA1/2 PV, vypočítané pomocí softwaru Prism v. 8.4 s použitím Fisherova exaktního testu za předpokladu, že p-hodnota < 0,05 je významná.
Mezi lednem 2017 a březnem 2021 bylo 455 pacientů vyšetřeno na zárodečné mutace BRCA1/2. Testování mutací bylo provedeno v Centru pro experimentální onkologii a hematologii nemocnice Policlinico. Podle sicilských směrnic (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020) bylo v nemocnici Rodolico de Catania – San Marco vyšetřeno celkem 389 pacientů s rakovinou prsu, 37 s rakovinou vaječníků, 16 s rakovinou slinivky břišní, 8 s rakovinou prostaty a 5 s melanomem. Rozložení pacientů podle typu rakoviny a výsledků analýzy je znázorněno na obrázku 1.
Obrázek 1 ukazuje vývojový diagram zobrazující přehled studie. Pacientky s nádory prsu, melanomu, slinivky břišní, prostaty nebo vaječníků byly testovány na mutace v genech BRCA1 a BRCA2.
Zkratky: PV, patogenní varianta; VUS, varianta nejistého významu; WT, sekvence BRCA1/2 divokého typu.
Naše studie jsme selektivně zaměřili na kohorty s rakovinou prsu. Pacientky měly medián věku 49 let (rozmezí 23–89) a byly to převážně ženy (n=376, tj. 97 %).
Z těchto subjektů mělo 64 (17 %) mutace BRCA1/2 a všechny byly ženy. Třicet pět (9 %) mělo PV a 29 (7,5 %) mělo VUS. Sedmnáct (48,6 %) z 35 patogenních variant se vyskytlo u BRCA1 a 18 (51,4 %) u BRCA2, zatímco 5 VUS se vyskytlo u BRCA1 (17,2 %) a 24 (82,8 %) u BRCA2 (obrázky 1 a 2). LGR nebyl v analýze MLPA přítomen.
Obrázek 2. Analýza mutací BRCA1 a BRCA2 u 389 pacientek s rakovinou prsu. (A) Distribuce patogenních variant (PV) (červená), variant s nejistým významem (VUS) (oranžová) a WT (modrá) u 389 pacientek s rakovinou prsu; (B) 389 pacientek s rakovinou prsu Třicet pět (9 %) mělo patogenní varianty (PV) BRCA1/2. Z nich bylo 17 (48,6 %) nositelů PV BRCA1 (tmavě červená) a 18 (51,4 %) nositelů BRCA2 (světle červená); (C) 29 (7,5 %) z 389 subjektů neslo VUS, 5 (17,2 %) genů BRCA1 (tmavě oranžová) a 24 (82,8 %) genů BRCA2 (světle oranžová).
Zkratky: PV, patogenní varianta; VUS, varianta nejistého významu; WT, sekvence BRCA1/2 divokého typu.
Dále jsme zkoumali prevalenci molekulárních podtypů karcinomu prsu (BC) u pacientek s BRCA1/2 parapsychopatií. Distribuce zahrnovala 2 (5,7 %) pacientky s luminálním A, 15 (42,9 %) pacientky s luminálním B, 3 (8,6 %) pacientky s luminálním B-HER2+, 2 (5,7 %) pacientky s HER2+ a 13 (37,1 %) pacientky s TNBC. Mezi pacientkami s pozitivním genem BRCA1 mělo 5 (29,4 %) pacientky s luminálním B BC, 2 (11,8 %) pacientky s HER2+ onemocněním a 10 (58,8 %) pacientky s TNBC. Nádory bez mutací BRCA1 byly buď luminální A, nebo luminální B-HER2+ (obrázek 3). V podskupině s pozitivním genem BRCA2 bylo 10 (55,6 %) nádorů s luminálním B, 3 (16,7 %) s luminálním B-HER2+, 3 (16,7 %) s TNBC a 2 (11,1 %) pacientky s luminálním A (obrázek 3). Žádné HER2+ nádory. byly v této skupině přítomny. Mutace BRCA1 jsou tedy u pacientek s TNBC prevalentní, zatímco změny BRCA2 jsou dominantní u jedinců s lumen B.
Obrázek 3 Prevalence podtypů rakoviny prsu u pacientek s patogenními variantami genů BRCA1 a BRCA2. Histogramy znázorňující distribuci paralytických vaziv BRCA1 (tmavě červená) a BRCA2 (světle červená) mezi molekulárními podtypy pacientek s rakovinou prsu. Čísla uvedená v každém rámečku představují procento pacientek s paralytickými vazivy BRCA1 a BRCA2 pro každý podtyp rakoviny prsu.
Zkratky: PV, patogenní varianta; HER2+, pozitivní na receptor 2 lidského epidermálního růstového faktoru; TNBC, trojitě negativní karcinom prsu.
Následně jsme posoudili typ a genovou lokalizaci paranukleotidových variant BRCA1 a BRCA2. U paranukleotidových variant BRCA1 jsme pozorovali 7 jednonukleotidových variant (SNV), 6 delecí, 3 duplikace a 1 inzerci. Pouze jedna mutace (c.5522delG) představuje nový objev. Nejčastějším detekovaným paranukleotidovým variantem BRCA1 u obou subjektů byl c.5035_5039delCTAAT. Tato změna zahrnuje deleci pěti nukleotidů (CTAAT) v exonu 15 genu BRCA1, což vede k substituci aminokyseliny leucinu tyrosinem v kodonu 1679 a v důsledku posunu translačního rámce s předpokládaným alternativním stop kodonem vede k předčasnému zkrácení proteinu. Všechny ostatní změny jsou detekovány pouze v jednom případě. Je pozoruhodné, že jeden z hlášených paranukleotidových variant byl umístěn v konsenzuální oblasti místa sestřihu (c.4357+1G>T) (tabulka 1).
Pokud jde o BRCA2 PV, pozorovali jsme 6 delecí, 6 jednonukleotidových variant (SNV) a 2 duplikace. Žádná z nalezených změn není nová. V naší populaci se opakovaly tři mutace, c.428dup a c.8487+1G>A pozorované u 3 subjektů, následované c.5851_5854delAGTT získanou ve dvou případech. Změna c.428dup zahrnuje opakování C v exonu 5 genu BRCA2, u kterého se předpokládá, že kóduje zkrácený, nefunkční protein. Mutace c.8487+1G>A se vyskytuje v intronové oblasti intronu 19 genu BRCA2 (± 1,2) a ovlivňuje konsenzuální sekvenci sestřihu, což vede ke změněnému sestřihu, který má za následek abnormální nebo chybějící protein. Patogenní varianta c.5851_5854delAGTT je způsobena 4nukleotidovou delecí z nukleotidových pozic 5851 až 5854 v kódujícím exonu 10 genu BRCA2 a vede k translačnímu... posun čtecího rámce s předpokládaným alternativním stop kodonem (p.S1951WfsTer). Je pozoruhodné, že jak již bylo dříve popsáno, obě změny c.631G>A a c.7008-2A>T byly detekovány u stejného pacienta.34 První mutace zahrnuje nahrazení adenosinu (A) v exonu 7 genu BRCA2 nukleotidem obsahujícím guanin (G), což vede ke změně valinu na isoleucin v kodonu 211, což je aminokyselina isoleucin s velmi podobnými vlastnostmi. Tato změna ovlivňuje normální sestřih mRNA. Druhá varianta se nachází v intronové oblasti a vede k dvojité substituci A za thymin (T) před exonem 13 genu kódujícího BRCA2. Změna c.7008-2A>T může generovat více transkriptů různých délek. Navíc ve skupině PV genu BRCA2 byly 4 z 18 změn (22,2 %) intronové.
Následně jsme zmapovali škodlivé mutace genu BRCA1/2 ve funkčních doménách a oblastech vázajících proteiny (obr. 4). V genu BRCA1 se 50 % PV nacházelo v oblasti klastru rakoviny prsu (BCCR), zatímco 22 % mutací se nacházelo v oblasti klastru rakoviny vaječníků (OCCR) (obr. 4A). V genu BRCA2 se 35,7 % variant nacházelo v oblasti BCCR a 42,8 % mutací se nacházelo v OCCR (obr. 4B). Dále jsme posoudili umístění PV v doménách proteinů BRCA1 a BRCA2. U proteinu BRCA1 jsme našli tři PV v doménách smyček a coiled coil a dvě mutace v doméně BRCT (obr. 4A). U proteinu BRCA2 se 4 PV mapovaly na doménu opakování BRC, zatímco v doménách vázajících oligo/oligosacharidy (OB) a tower (T) byly detekovány 3 intronové a 3 exonové změny (obrázek 4B).
Obrázek 4 Schematické znázornění proteinů BRCA1 a BRCA2 a lokalizace patogenních variant. Tento obrázek ukazuje distribuci patogenních variant BRCA1 (A) a BRCA2 (B) u pacientek s rakovinou prsu. Exonické mutace jsou zobrazeny modře, zatímco intronové varianty oranžově. Výška sloupce představuje počet případů. Jsou uvedeny proteiny BRCA1 a BRCA2 a jejich funkční domény. (A) Protein BRCA1 obsahuje smyčkovou doménu (RING) a sekvenci nukleární lokalizace (NLS), doménu se spirálovou spirálou, klastrovou doménu SQ/TQ (SCD) a C-terminální doménu BRCA1 (BRCT). (B) Protein BRCA2 obsahuje osm opakování BRC, doménu vázající DNA se helikální doménou (Helikální), tři záhyby vázající oligonukleotidy/oligosacharidy (OB), věžovou doménu (T) a NLS na C straně. Oblasti nazývané oblast klastru rakoviny prsu (BCCR) a oblast klastru rakoviny vaječníků (OCCR) jsou zobrazeny dole. *Představuje mutace, které určují stop kodony.
Následně jsme zkoumali klinicko-patologické znaky karcinomu prsu, které by mohly korelovat s přítomností pankreatu BRCA1/2. Kompletní klinické záznamy byly k dispozici pro 181 pacientů s negativním genem BRCA1/2 (nenosičů) a všech nosičů (n = 35). Mezi mírou proliferace nádoru a jeho stupněm byla zjištěna korelace.
Distribuci Ki-67 jsme vypočítali na základě mediánu naší kohorty (25 %, rozmezí <10–90 %). Subjekty s Ki-67 < 25 % byly definovány jako „nízké Ki-67“, zatímco jedinci s hodnotami ≥ 25 % byli považováni za „vysoké Ki-67“. Mezi nenositeli a nositeli genu BRCA1 PV byly zjištěny významné rozdíly v Ki-67 (p < 0,01) (obr. 5A).
Obrázek 5 Korelace Ki-67 s distribucí stupně u žen s karcinomem prsu s mutacemi BRCA1 a BRCA2 a bez nich. (A) Krabicový graf znázorňující medián hodnot Ki-67 u 181 pacientek s karcinomem prsu bez mutace versus pacientky s mutacemi BRCA1 (18) nebo BRCA2 (17). Hodnoty P pod 0,5 byly považovány za statisticky významné. (B) Histogram znázorňující zařazení pacientek s karcinomem prsu do skupin histologického stupně (G2 a G3) podle statusu mutací BRCA1 a BRCA2 (subjekty s WT, nositelky mutací BRCA1 a BRCA2).
Stejně tak jsme zkoumali, zda stupeň nádoru koreluje s přítomností BRCA1/2 paraventrikulární mutace. Vzhledem k tomu, že v naší populaci chyběla mutace G1, rozdělili jsme pacientky do dvou skupin (G2 nebo G3). V souladu s výsledky Ki-67 analýza odhalila statisticky významnou korelaci mezi stupněm nádoru a mutací BRCA1, s vyšším podílem nádorů G3 u nositelů BRCA1 ve srovnání s nenositeli (p<0,005) (obrázek 5B).
Pokroky v technologii sekvenování DNA umožnily bezprecedentní pokrok v genetickém testování BRCA1/2, což má zásadní důsledky pro pacienty s rodinnou anamnézou rakoviny. Doposud bylo identifikováno a klasifikováno přibližně 20 000 variant BRCA1/2 podle Americké společnosti pro lékařskou genetiku35 a systému ENIGMA.35,36 Je dobře známo, že mutační spektrum BRCA1/2 se v různých geografických oblastech značně liší.37 V Itálii se míra výskytu BRCA1/2 PV pohybovala od 8 % do 37 %, což ukazuje na širokou variabilitu v rámci země.38,39 S populací téměř 5 milionů je Sicílie pátým největším regionem v Itálii z hlediska počtu obyvatel. Ačkoli existují údaje o rozšíření BRCA1/2 v západní Sicílii, ve východní části ostrova neexistují žádné rozsáhlé důkazy.
Naše studie je jednou z prvních zpráv o incidenci BRCA1/2 paraventrikulární choroby u pacientek s karcinomem prsu (BC) ve východní Sicílii.28 Zaměřili jsme se na BC, protože se jedná o zdaleka nejčastější onemocnění v naší kohortě.
Při testování 389 pacientů s karcinomem prsu (BC) mělo 9 % z nich paralytické mutace BRCA1/2, rovnoměrně rozložené mezi BRCA1 a BRCA2. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky dříve hlášenými v italské populaci.28 Je zajímavé, že 3 % (13/389) z naší kohorty byli muži. Tato míra je vyšší, než se očekávalo u mužského karcinomu prsu (1 % všech BC),40 což odráží náš výběr populací na základě rizika mutace BRCA1/2. U žádného z těchto mužů se však nevyvinuly paralytické mutace BRCA1/2, takže byli kandidáty na další molekulární analýzu, která by vyloučila přítomnost méně častých mutací, jako jsou mimo jiné PALB2, RAD51C a D. Varianty s nejistou významností byly nalezeny u 7 % subjektů, u kterých byla evidentní mutace BRCA2. I tento výsledek je v souladu s již existujícími důkazy.28,41,42
Když jsme analyzovali distribuci molekulárních podtypů karcinomu prsu (BC) u žen s mutací BRCA1/2, potvrdili jsme známé asociace mezi TNBC a BRCA1 PV (58,8 %) a mezi luminálním B BC a BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Luminální A a HER2+ nádory u nositelek BRCA1 a BRCA2 PV jsou v souladu s existujícími literárními údaji.16,43
Poté se zaměřujeme na typ a lokalizaci BRCA1/2 PV. V naší kohortě byl nejčastějším BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT. Ačkoli Incorvaia a kol. tuto variantu ve své sicilské kohortě nepopsali, jiní autoři ji uvádějí jako zárodečnou variantu BRCA1 PV.34 V naší kohortě bylo nalezeno několik PV BRCA1 – např. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA a c.5266dupC – které byly pozorovány na Sicílii.28 Z nich se dvě zakladatelské mutace BRCA1 (c.181T>G a c.5266dupC) běžně vyskytují u aškenázských Židů ve východní a střední Evropě (Polsko, Česko), Slovinsko, Rakousko, Maďarsko, Bělorusko a Německo),44,45 a ve Spojených státech a Argentině byla nedávno definována jako „rekurentní zárodečná varianta“ u italských pacientek s karcinomem prsu a karcinomem prsu. Varianta 34c.514del byla dříve identifikována u 8 pacientek s rakovinou prsu ze severní Sicílie v Palermu a Messině. Je zajímavé, že i Incorvaia a kol. v některých rodinách v Catanii nalezli variantu c.3253dupA.28 Nejreprezentativnějšími variantami BRCA2 jsou c.428dup, c.5851_5854delAGTT a intronová varianta c.8487+1G>A, které byly podrobněji popsány28 u pacienta v Palermu s c.428dup. Varianta c.5851_5854delAGTT byla pozorována v domácnostech v severozápadní Sicílii, zejména v regionech Trapani a Palermo, zatímco varianta c.5851_5854delAGTT byla pozorována v domácnostech v severozápadní Sicílii. Varianta 8487+1G>A byla častější u subjektů z Messiny, Palerma a Caltanissetty.28 Rebbeck a kol. dříve popsali alteraci c.5851_5854delAGTT v Kolumbii.37 Další BRCA2 PV, c.631+1G>A, byl nalezen u pacientek s karcinomem prsu a karcinomem ovarií ze Sicílie (Agrigento, Siracusa a Ragusa).28 Je pozoruhodné, že jsme u stejné pacientky pozorovali koexistenci dvou variant BRCA2 (BRCA2 c.631G>A a c.7008-2A>T), o kterých jsme předpokládali, že jsou segregované v cis módu, jak bylo dříve popsáno.34,46 Tyto mutace BRCA2 jsou v italském regionu skutečně často pozorovány a bylo zjištěno, že zavádějí předčasné stop kodony, které ovlivňují sestřih messenger RNA a způsobují selhání proteinu BRCA2.47,48
Také jsme zmapovali PV BRCA1 a BRCA2 v putativních oblastech OCCR a BCCR proteinových domén a genů. Tyto oblasti byly Rebbeckem a kol. popsány jako rizikové oblasti pro rozvoj rakoviny vaječníků a prsu.49 Důkazy týkající se souvislosti mezi lokalizací zárodečných variant a rizikem rakoviny prsu nebo vaječníků však zůstávají kontroverzní.28,50-52 V naší populaci byly PV BRCA1 převážně lokalizovány v oblasti BCCR, zatímco PV BRCA2 byly převážně lokalizovány v oblasti OCCR. Nebyli jsme však schopni nalézt žádnou souvislost mezi putativními oblastmi OCCR a BCCR a znaky BC. To může být způsobeno omezeným počtem pacientek s mutacemi BRCA1/2. Z pohledu proteinové domény jsou PV BRCA1 rozloženy podél celého proteinu a změny BRCA2 se přednostně nacházejí v repetitivní doméně BRC.
Nakonec jsme korelovali klinicko-patologické rysy karcinomu prsu s BRCA1/2 paraventrikulární infekcí. Vzhledem k omezenému počtu zahrnutých pacientek jsme zjistili významnou korelaci pouze mezi Ki-67 a stupněm nádoru. Ačkoli hodnocení a interpretace Ki-67 zůstává poněkud kontroverzní, je jisté, že vysoká míra proliferace je spojena se zvýšeným rizikem recidivy onemocnění a sníženým přežitím. Dosud je hranicí pro rozlišení mezi „vysokou“ a „nízkou“ hladinou Ki-67 20 %. Tato hranice se však nevztahuje na naši populaci pacientek s mutací BRCA1/2, která má medián hodnoty Ki-67 25 %. Tento trend vysokých měr Ki-67 lze vysvětlit prevalencí v našich kohortách luminálního karcinomu prsu B a TNBC, z nichž bylo přítomno jen málo tumorů luminálního karcinomu A. Některé důkazy však naznačují, že vyšší hranice Ki-67 (25–30 %) může lépe stratifikovat pacientky podle jejich prognózy.53,54 Z výsledků naší analýzy vyplývá, že významná korelace není překvapivá. Vyskytuje se mezi vysokou hladinou Ki-67 a stupni a přítomností BRCA1. PV. Ve skutečnosti jsou nádory související s BRCA1 typické pro TNBC a vykazují agresivnější rysy.16,17
Závěrem lze říci, že tato studie poskytuje zprávu o mutačním stavu genu BRCA1/2 v kohortě pacientů s karcinomem prsu z východní Sicílie. Celkově jsou naše zjištění v souladu s již existujícími důkazy, a to jak z hlediska prevalence mutací, tak klinicko-patologických znaků karcinomu prsu. Pro posouzení přítomnosti paracetamolních mutací (PV), které jsou odlišné a méně časté než BRCA1/2, je opodstatněné provést další studie na větších populacích pacientů s karcinomem prsu s mutací BRCA1/2, například s využitím multigenomové rozšířené mutační analýzy. To umožní identifikaci a správnou léčbu rostoucího počtu subjektů se zvýšeným rizikem rakoviny v důsledku genetických mutací.
Potvrdili jsme, že pacienti podepsali informovaný souhlas s anonymním zveřejněním vzorků svých nádorů pro výzkumné účely. Všichni pacienti podepsali písemný informovaný souhlas v souladu s Helsinskou deklarací. V souladu s politikou AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“ byla tato studie vyňata z etického posouzení, protože analýza BRCA1/2 byla provedena v souladu s klinickou praxí a všichni pacienti poskytli písemný informovaný souhlas. Pacienti také souhlasí s použitím svých údajů pro výzkumné účely.
Děkujeme profesoru Paolovi Vignerimu za jeho pomoc při péči o pacientky s rakovinou prsu, jak o to požádala etická komise.
Federica Martorana uvádí honoráře od společností Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis a Pfizer. Ostatní autoři neprohlašují žádný střet zájmů v této práci.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL a kol. Globální statistika rakoviny 2020: GLOBOCAN odhaduje incidenci a úmrtnost 36 druhů rakoviny ve 185 zemích světa. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660