Javascript מושבת כעת בדפדפן שלך. חלק מהתכונות של אתר זה לא יפעלו כאשר Javascript מושבת.
הירשמו עם הפרטים הספציפיים שלכם והתרופה הספציפית שמעניינת אתכם, ואנחנו נתאים את המידע שתספקו למאמרים במאגר הנתונים הנרחב שלנו ונשלח לכם עותק PDF בדוא"ל בהקדם.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
סטפניה סטלה, 1,2 סילביה ריטה ויטלה, 1,2 פדריקה מרטורנה, 1,2 מישל מאסימינו, 1,2 ג'וליאנה פאבונה, 3 קטיה לנזפאמה, 3 סבסטיאנו ביאנקה, 4 קיארה ברון, 5 כריסטינה גורגונה, 6 מרקו פיצ'רה, 6, 7 ליוויה מנצ'ל, המחלקה לרפואה באוניברסיטת C1lin, 7 Livia Manzella קטניה, קטניה, 95123, איטליה; 2 המרכז לאונקולוגיה והמטולוגיה ניסיונית, AOU Policlinico "G.Rodolico – San Marco", קטניה, 95123, איטליה; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico "G. Rodolico – San Marco", Catania, 95123, איטליה; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, איטליה; 5 Medicine Genetics, ASP, סירקיוז, 96100, איטליה; 6 המחלקה למדעי הביו-רפואה והביוטכנולוגיה, אוניברסיטת קטניה, גנטיקה רפואית, קטניה, איטליה, 95123; 7מכון המחקר Oasi-IRCCS, טרוינה, 94018, איטליה תקשורת: סטפניה סטלה, טל' +39 095 378 1946, דוא"ל [email protected]; מטרה: מוטציות בקו הנבט ב-BRCA1 ו-BRCA2 וסרטן שד (BC) מבוסס, סרטן שחלות (OC) ואחר הקשור לסיכון לסרטן לאורך החיים. בדיקת גן BRCA היא המפתח להערכת הסיכון האישי, כמו גם למציאת שיטות מניעה אצל נשאים בריאים והתאמת טיפולים בחולי סרטן. שכיחות השינויים ב-BRCA1 ו-BRCA2 משתנה באופן נרחב בין אזורים גיאוגרפיים, ולמרות שקיימים נתונים על וריאנטים פתוגניים של BRCA במשפחות סיציליאניות, חסרים מחקרים המכוונים ספציפית לאוכלוסיות במזרח סיציליה. מטרת המחקר שלנו הייתה לחקור את שכיחותם והתפלגות השינויים הפתוגניים בקו הנבט של BRCA בקבוצה של חולי סרטן שד ממזרח סיציליה ולהעריך את הקשר שלהם לתכונות סרטן שד ספציפיות באמצעות ריצוף הדור הבא. נוכחות השינויים הייתה בקורלציה עם דרגת הגידול ומדד התפשטות הגידול. תוצאות: בסך הכל, 35 חולים (9%) היו עם וריאנט פתוגני של BRCA, 17 (49%) ב-BRCA1 ו-18 (51%) ב-BRCA2. שינויים ב-BRCA1 שכיחים בחולי סרטן שד שלילי משולש, בעוד שמוטציות BRCA2 שכיחות יותר בחולי סרטן שד לומינלי. בהשוואה ל- נבדקים שאינם נשאים, עם וריאנטים של BRCA1 היו בעלי דרגת גידול גבוהה משמעותית ומדד פרוליפרטיבי. מסקנות: הממצאים שלנו מספקים סקירה כללית של סטטוס המוטציה של BRCA בחולי סרטן סרטן ממזרח סיציליה ומאשרים את תפקיד ניתוח NGS בזיהוי חולים עם סרטן סרטן תורשתי. בסך הכל, נתונים אלה עולים בקנה אחד עם ראיות קודמות התומכות בבדיקת BRCA למניעה וטיפול נאותים בסרטן אצל נשאים של מוטציה.
סרטן השד (BC) הוא המחלה הממאירה הנפוצה ביותר בעולם והסרטן הקטלני ביותר בקרב נשים.1 המאפיינים הביולוגיים הקובעים את הפרוגנוזה של סרטן השד ואת ההתנהגות הקלינית נחקרו בהרחבה והובהרו חלקית לאורך זמן. למעשה, כיום משתמשים במספר סמנים פונדקאיים לסיווג סרטן השד לתת-סוגים מולקולריים שונים. הם קולטן אסטרוגן (ER) ו/או פרוגסטרון (PgR), הגברת קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2), מדד התפשטות Ki-67 ודרגת גידול (G).2 השילוב של משתנים אלה זיהה את קטגוריות סרטן השד הבאות: 1) גידולים לומינליים, המראים ביטוי ER ו/או PgR, היוו 75% מסרטני השד. גידולים אלה חולקו עוד ללומינל A, כאשר Ki-67 היה מתחת ל-20% ו-HER2 שלילי, ולומינל B, כאשר Ki-67 היה שווה או מעל 20% ובנוכחות הגברת HER2, ללא קשר למדד התפשטות; 2) גידולי HER2+ שהם שליליים ל-ER ו-PgR אך מציגים הגברת HER2. קבוצה זו מהווה 10% מכלל גידולי השד; 3) סרטן שד טריפל-נגטיב (TNBC), שאינו מראה ביטוי ER ו-PgR והגברת HER2, מהווה כ-15% מסוגי סרטן השד.2-4
בין תת-הסוגים הללו של סרטן המעי הגס, דרגת הגידול ומדד התפשטות הגידול מייצגים סמנים ביולוגיים חתכיים הקשורים באופן ישיר ועצמאי לאגרסיביות הגידול ולפרוגנוזה.5,6
בנוסף למאפיינים הביולוגיים שהוזכרו לעיל, תפקידם של שינויים גנטיים תורשתיים המובילים להתפתחות סרטן השד (BC) הפך לחשוב יותר ויותר בשנים האחרונות.7 כ-1 מכל 10 גידולי שד עוברים בתורשה עקב שינויים בקו הנבט בגנים ספציפיים.8 שני מחקרים אפידמיולוגיים גדולים שכללו יותר מ-180,000 נשים זיהו לאחרונה קבוצה של שמונה גנים (כלומר, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C ו-RAD51D) האחראים בעיקר לסרטן השד התורשתי. מבין גנים אלה, BRCA1 ו-BRCA2 (להלן BRCA1/2) הראו את המתאם החזק ביותר עם התפתחות גידולי שד.9-12 למעשה, מוטציות בקו הנבט BRCA1/2 מגבירות משמעותית את הסיכון לסרטן השד לאורך החיים, כמו גם לגידולים ממאירים אחרים, כולל שחלות, ערמונית, לבלב, מעי גס ומלנומה. מגיל 13 עד 80, השכיחות המצטברת של סרטן השד היא 72% בנשים עם וריאנט פתוגני (PV) של BRCA1 ו-69% בנשים עם BRCA2. PV.14
ראוי לציין כי פרסום שפורסם לאחרונה מצביע על כך שהסיכון לסרטן השד תלוי בסוג ה-PV. למעשה, בהשוואה לווריאנטים קטומים פתוגניים, וריאנטים בולטים של missense, במיוחד בגן BRCA1, קשורים לסיכון מופחת לסרטן השד, במיוחד אצל נשים מבוגרות.15
נוכחות של BRCA1 או BRCA2 PV נקשרה למאפיינים ביולוגיים וקליניים-פתולוגיים שונים.16,17 תאי סרטן בקר הקשורים ל-BRCA1 נוטים להיות אגרסיביים קלינית, בעלי ממוין גרוע ופרוליפרטיביות גבוהה. גידולים אלה הם בדרך כלל שליליים לשלושה ובעלי גיל הופעה מוקדם. גידולים המופיעים בחולים עם מוטציה ב-BRCA2 מציגים בדרך כלל דרגות בינוניות עד ממוינות היטב ומדדי פרוליפרטיביות משתנים. גידולים אלה שכיחים יותר בלומן B ומופיעים בדרך כלל אצל מבוגרים.16-18 ראוי לציין כי מוטציות ב-BRCA1 ו-BRCA2 מגבירות את הרגישות לטיפולים ספציפיים, כולל מלחי פלטינה ותרופות ממוקדות כגון מעכבי פולימראז (PARPi) (poly(ADP-ribose)).19,20
במהלך השנים האחרונות, יישום ריצוף הדור הבא (NGS) בפרקטיקה הקלינית אפשר למספר גדל והולך של חולי סרטן ראש לעבור בדיקות מולקולריות לתסמונות רגישות לסרטן, כולל BRCA1/2.21 במקביל, הגדרות המבוססות על קריטריונים מדויקים בנוגע להיסטוריה משפחתית, מאפיינים דמוגרפיים וקליניים-פתולוגיים משמשות לזיהוי טוב יותר של אנשים הראויים לבדיקת BRCA1/2.22,23 בהקשר זה, מצטברות ראיות לגבי בדיקות BRCA1/2 באוכלוסיות ספציפיות, תוך הדגשת הבדלים בין אזורים גיאוגרפיים.24–27 למרות שקיימים דיווחים על קבוצת סרטן ראש במערב סיציליה, קיימים פחות נתונים זמינים על בדיקות BRCA1/2 באוכלוסיית מזרח סיציליה.28,29
אנו מתארים כאן את תוצאות סקר BRCA1/2 בקו הנבט בחולי קולורדו ממזרח סיציליה, ומקשרים עוד יותר את נוכחותן של מוטציות BRCA1 או BRCA2 עם המאפיינים הקליניים-פתולוגיים העיקריים של גידולים אלה.
מחקר רטרוספקטיבי נערך ב"מרכז לאונקולוגיה ניסויית והמטולוגיה" בבית החולים פוליקליניקו רודוליקו - סן מרקו בקטניה. מינואר 2017 ועד מרץ 2021, הופנו למעבדת האבחון המולקולרית שלנו 455 חולים עם סרטן השד והשחלות, מלנומה, לבלב או הערמונית לבדיקות גנטיות BRCA/2. מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי, וכל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני הניתוח המולקולרי.
מאפיינים היסטולוגיים וביולוגיים (ER, PgR, סטטוס HER2, Ki-67 ודרגה) של סרטן ראשי (BC) הוערכו בביופסיה של הליבה או דגימות כירורגיות, תוך התחשבות רק במרכיבים תוקפניים של הגידול. בהתבסס על מאפיינים אלה, סרטני ראשי ראשי סווגו כדלקמן: לומינל A (ER+ ו/או PgR+, HER2-, Ki-67<20%), לומינל B (ER+ ו/או PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), לומינל B-HER2+ (ER ו/או PgR+, HER2+), HER2+ (ER ו-PgR-, HER2+) או טריפל שלילי (ER ו-PgR-, HER2-).
לפני הערכת סטטוס המוטציות BRCA1 ו-BRCA2, צוות רב-תחומי, שכלל אונקולוג, גנטיקאי ופסיכולוג, ערך ייעוץ גנטי לגידולים עבור כל מטופל כדי לקבוע את נוכחותם של BRCA1 ו/או BRCA1, או עבור אנשים עם סיכון גבוה לסרטן פלא בגן BRCA2. בחירת המטופלים בוצעה בהתאם להנחיות האגודה האיטלקית לאונקולוגיה רפואית (AIOM) והמלצות סיציליאניות מקומיות.30,31 קריטריונים אלה כוללים: (i) היסטוריה משפחתית של וריאנטים פתוגניים ידועים בגנים רגישות (למשל, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) גברים עם סרטן ראשוני; (iii) אלו עם סרטן ראשוני וסרטן אוקסידנטלי; (iv) נשים עם סרטן ראשוני <36 שנים, סרטן אוקסידנטלי TNBC <60 שנים, או סרטן דו-צדדי <50 שנים; (v) היסטוריה רפואית אישית של סרטן ראשוני <50 שנים ולפחות קרוב משפחה מדרגה ראשונה אחד: (א) סרטן ראשוני <50 שנים; (ב) סרטן אוקסידנטלי לא רירי ולא גבולי בכל גיל; (ג) סרטן ראשוני דו-צדדי; (ד) סרטן ראשוני גברי; (ה) סרטן הלבלב; (ו) סרטן הערמונית; (vi) שתי היסטוריה אישית או יותר של סרטן לבלב > 50 שנה והיסטוריה משפחתית של סרטן לבלב, סרטן אוברול, או סרטן הלבלב עבור קרובי משפחה שהם קרובי משפחה מדרגה ראשונה זה של זה (כולל קרובי משפחה שאיתם היא קרובת משפחה מדרגה ראשונה); (vii) היסטוריה אישית של סרטן אוברול ולפחות קרוב משפחה אחד מדרגה ראשונה: (א) סרטן לבלב <50 שנה; (ב) סרטן לא סרטני; (ג) סרטן לבלב דו-צדדי; (ד) סרטן לבלב זכר; (vii) נקבה עם סרטן אוברול סרוזי בדרגה גבוהה.
דגימת דם היקפית של 20 מ"ל נלקחה מכל מטופל ונאספה לתוך מבחנות EDTA (BD Biosciences). DNA גנומי בודד מדגימות דם מלא של 0.7 מ"ל באמצעות ערכת הבידוד QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, הילדן, איטליה) בהתאם להוראות היצרן והועבר דרך פלואורומטר Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב). בצע כימות. העשרת מטרות והכנת ספרייה מבוצעות על ידי Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, מוכנות לטעינה לתוך ערכת Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 להכנת ספרייה אוטומטית בהתאם להוראות היצרן. הערכה מורכבת משני מאגרי פריימרים מרובי-מולריים של PCR שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את כל הגנים BRCA1 (NM_007300.3) ו-BRCA2 (NM_000059.3). בקצרה, 15 מיקרוליטר מכל DNA מדולל של דגימה (10 ננוגרם) נוספו לצלחות עם ברקוד להכנת ספרייה וכל הריאגנטים והחומרים המתכלים הועמסו על מכשיר Ion Chef™. לאחר מכן בוצעה הכנת ספרייה אוטומטית ואיגום ספריות דגימות עם ברקוד על מכשיר Ion Chef™. מספר הספריות שהוכנו הוערך לאחר מכן על ידי Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, הספריות משולבות ביחסים אקווימולריים במבחנות דגימה של ספריית Ion Chef™ (עם ברקוד). (מבחנות) והועמסו על מכשיר Ion Chef™. ריצוף בוצע באמצעות מכשיר Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) תוך שימוש בשבב Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). ניתוח הנתונים בוצע באמצעות Amplicon Suite (SmartSeq srl) ותוכנת Ion Reporter.
כל המינוח של הווריאנטים עקב אחר ההנחיות הנוכחיות של קונסורציום השונות של הגנום האנושי, הזמינות באינטרנט (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). המשמעות הקלינית של הווריאנטים של BRCA1/2 הוגדרה באמצעות הסיווג של הקונסורציום הבינלאומי ENIGMA (רשת מבוססת ראיות לפירוש אללים מוטנטיים של קו נבט, https://enigmaconsortium.org/) ועיון במאגרי מידע שונים כגון ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD ו-UMD. הסיווג כולל חמש קטגוריות סיכון שונות: שפיר (קטגוריה I), כנראה שפיר (קטגוריה II), וריאנט בעל משמעות לא ודאית (VUS, קטגוריה III), כנראה פתוגני (קטגוריה IV) ופתוגני (קטגוריה V). חלק מהחוקרים ניתחו גם את השפעת המוטציות על מבנה ותפקוד החלבון, כלי אינפורמטיבי עם גישה ל-30 מאגרי מידע.32
כדי להקצות משמעות קלינית פוטנציאלית לכל VUS, נעשה שימוש באלגוריתמים החישוביים הבאים לחיזוי חלבונים: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ו-Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). וריאנטים שסווגו כמחלקה 1 ו-2 נחשבו לסוג בר.
ריצוף סנגר אישר את נוכחותו של כל וריאנט פתוגני. בקצרה, זוג פריימרים ספציפיים תוכנן עבור כל וריאנט שזוהה באמצעות רצפי הייחוס של הגנים BRCA1 ו-BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 ו-NG_012772.3, NM_000059.3, בהתאמה). לכן, בוצע PCR ממוקד ולאחר מכן ריצוף סנגר.
חולים שנמצאו שליליות לגן BRCA1/2 נבדקו באמצעות הגברת גששים תלוית קשירה (MLPA) בהתאם להוראות היצרן כדי להעריך את נוכחותם של סידורים גנומיים גדולים (LGR). בקצרה, דגימות DNA עוברות דנטורציה ומשתמשים בעד 60 גששים ספציפיים לגנים של BRCA1 ו-BRCA2, שכל אחד מהם מזהה רצף DNA ספציפי באורך של כ-60 נוקלאוטידים. לאחר מכן, תוצרי הגברת הגששים, המורכבים מקבוצה ייחודית של אמפליקונים של PCR, נותחו באמצעות אלקטרופורזה קפילרית ובאמצעות תוכנת Cofalyser.Net בשילוב עם טבלאות Cofalyser המתאימות הספציפיות לקבוצה (www.mrcholland.com).
משתנים קליני-פתולוגיים נבחרים (דרגה היסטולוגית ומדד התפשטות Ki-67%) נקשרו לנוכחות של BRCA1/2 PV, שחושב באמצעות תוכנת Prism גרסה 8.4 תוך שימוש במבחן המדויק של פישר בהנחה שערך p <0.05 מובהק.
בין ינואר 2017 למרץ 2021, 455 חולים עברו סקר לאיתור מוטציות BRCA1/2 בקו הנבט. בדיקות מוטציה בוצעו במרכז לאונקולוגיה ניסויית והמטולוגיה בבית החולים פוליקליניקו. על פי ההנחיות הסיציליאניות (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, מס' 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), ברודוליקו של קטניה - סן מרקו "בסך הכל, 389 חולים היו בסרטן השד, 37 סרטן השחלות, 16 סרטן הלבלב, 8 סרטן הערמונית ו-5 מלנומה. התפלגות החולים לפי סוג הסרטן ותוצאות הניתוח מוצגת באיור 1.
איור 1 מציג תרשים זרימה המציג סקירה כללית של המחקר. חולים עם גידולי שד, מלנומה, לבלב, ערמונית או שחלות נבדקו עבור מוטציות בגנים BRCA1 ו-BRCA2.
קיצורים: PV, וריאנט פתוגני; VUS, וריאנט בעל משמעות לא ודאית; WT, רצף BRCA1/2 מסוג בר.
התמקדנו באופן סלקטיבי במחקרים שלנו בקבוצות סרטן השד. גיל החולות היה חציוני 49 שנים (טווח 23-89) והן היו בעיקר נשים (n=376, או 97%).
מבין נבדקים אלו, 64 (17%) היו עם מוטציות BRCA1/2 וכולם היו נשים. שלושים וחמישה (9%) היו עם PV ו-29 (7.5%) עם VUS. שבעה עשר (48.6%) מתוך 35 הווריאנטים הפתוגניים התרחשו ב-BRCA1 ו-18 (51.4%) ב-BRCA2, בעוד ש-5 VUS התרחשו ב-BRCA1 (17.2%) ו-24 (82.8%) ב-BRCA2 (איורים 1 ו-2). LGR לא נכח בניתוח MLPA.
איור 2. ניתוח של מוטציות BRCA1 ו-BRCA2 ב-389 חולות סרטן השד. (א) התפלגות וריאנטים פתוגניים (PV) (אדום), וריאנטים בעלי משמעות לא ודאית (VUS) (כתום) ו-WT (כחול) ב-389 חולות סרטן השד; (ב) 389 חולות סרטן השד. שלושים וחמש (9%) היו בעלי וריאנטים פתוגניים (PV) של BRCA1/2. מתוכם, 17 (48.6%) היו נשאים של BRCA1 PV (אדום כהה) ו-18 (51.4%) היו נשאים של BRCA2 (אדום בהיר); (ג) 29 (7.5%) מתוך 389 נבדקות נשאו VUS, 5 (17.2%) גנים של BRCA1 (כתום כהה) ו-24 (82.8%) גנים של BRCA2 (כתום בהיר).
קיצורים: PV, וריאנט פתוגני; VUS, וריאנט בעל משמעות לא ודאית; WT, רצף BRCA1/2 מסוג בר.
לאחר מכן חקרנו את שכיחות תת-הסוגים המולקולריים של BC בחולים עם BRCA1/2 PV. ההתפלגות כללה 2 (5.7%) חולים עם לומינל A, 15 (42.9%) עם לומינל B, 3 (8.6%) עם לומינל B-HER2+, 2 (5.7%) עם HER2+ ו-13 (37.1%) עם TNBC. בקרב חולים חיוביים ל-BRCA1, 5 (29.4%) היו עם לומינל B BC, 2 (11.8%) היו עם מחלת HER2+, ו-10 (58.8%) היו עם TNBC. גידולים ללא מוטציות BRCA1 היו לומינל A או לומינל B-HER2+ (איור 3). בתת-הקבוצה החיובית ל-BRCA2, 10 (55.6%) גידולים היו לומינל B, 3 (16.7%) היו לומינל B-HER2+, 3 (16.7%) עם TNBC ו-2 (11.1%) היו לומינל A (איור 3). 3). לא נמצאו גידולי HER2+ בקבוצה זו. לפיכך, מוטציות BRCA1 שכיחות בחולי TNBC, בעוד ששינויים ב-BRCA2 שולטים בקרב אנשים עם לומן B.
איור 3: שכיחות תת-סוגי סרטן השד בחולות עם וריאנטים פתוגניים ב-BRCA1 ו-BRCA2. היסטוגרמות המציגות את התפלגות ערכי ה-PV של BRCA1- (אדום כהה) ו-BRCA2- (אדום בהיר) בקרב תת-סוגים מולקולריים של חולות סרטן השד. המספרים המדווחים בכל תיבה מייצגים את אחוז החולות עם ערכי PV של BRCA1 ו-BRCA2 עבור כל תת-סוג של סרטן השד.
קיצורים: PV, וריאנט פתוגני; HER2+, קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 חיובי; TNBC, סרטן שד טריפל-נגטיב.
לאחר מכן, הערכנו את הסוג ואת לוקליזציה הגנטית של PVs BRCA1 ו-BRCA2. ב-PV BRCA1, צפינו ב-7 וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים (SNVs), 6 מחיקות, 3 כפילויות והכנסה אחת. רק מוטציה אחת (c.5522delG) מייצגת תגלית חדשה. PV BRCA1 הנפוץ ביותר שזוהה בשני הנבדקים היה c.5035_5039delCTAAT. שינוי זה כרוך במחיקה של חמישה נוקלאוטידים (CTAAT) באקסון 15 של BRCA1, וכתוצאה מכך החלפת חומצת האמינו לאוצין בטירוזין בקודון 1679, ובשל הזזת מסגרת תרגום עם קודון עצירה חלופי צפוי מובילה לקיצוץ מוקדם של חלבון. כל שאר השינויים זוהו רק במקרה אחד. ראוי לציין, שאחד ה-PVs שדווחו היה ממוקם באזור הקונצנזוס של אתר השחבור (c.4357+1G>T) (טבלה 1).
בנוגע ל-BRCA2 PV, ראינו 6 מחיקות, 6 SNVs ו-2 כפילויות. אף אחד מהשינויים שנמצאו אינו חדש. שלוש מוטציות חזרו על עצמן באוכלוסייה שלנו, c.428dup ו-c.8487+1G>A שנצפו ב-3 נבדקים, ואחריהם c.5851_5854delAGTT שנמצא בשני מקרים. השינוי ב-c.428dup כרוך בחזרה של C באקסון 5 של BRCA2, שצפוי לקודד חלבון קטום ולא פונקציונלי. המוטציה c.8487+1G>A מתרחשת באזור האינטרוני של אינטרון 19 של BRCA2 (± 1.2) ומשפיעה על רצף הקונצנזוס של שחבור, וכתוצאה מכך שחבור שונה שמביא לחלבון לא תקין או חסר. הווריאנט הפתוגני c.5851_5854delAGTT נובע ממחיקה של 4 נוקלאוטידים ממיקומי נוקלאוטידים 5851 עד 5854 באקסון 10 המקודד של הגן BRCA2 וגורם ל... הזזת מסגרת תרגומית עם קודון עצירה חלופי צפוי (p.S1951WfsTer). ראוי לציין, כפי שדווח בעבר, שני השינויים c.631G>A ו- c.7008-2A>T זוהו באותו מטופל.34 המוטציה הראשונה כוללת החלפה של אדנוזין (A) באקסון 7 של BRCA2 עם נוקלאוטיד המכיל גואנין (G), וכתוצאה מכך שינוי של ואלין לאיזולאוצין בקודון 211. חומצת אמינו איזולאוצין היא חומצת אמינו בעלת תכונות דומות מאוד. שינוי זה משפיע על שחבור mRNA תקין. הווריאנט השני ממוקם באזור אינטרוני וגורם להחלפה כפולה של A לתימין (T) לפני אקסון 13 של הגן המקודד ל- BRCA2. השינוי c.7008-2A>T עשוי לייצר תמלילים מרובים באורכים שונים. יתר על כן, בקבוצת ה-PV של BRCA2, 4 מתוך 18 שינויים (22.2%) היו אינטרוניים.
לאחר מכן, מיפינו מוטציות מזיקות של BRCA1/2 בתחומים פונקציונליים ואזורים הקושרים חלבונים (איור 4). בגן BRCA1, 50% מה-PVs היו ממוקמים באזור אשכול סרטן השד (BCCR), בעוד ש-22% מהמוטציות היו ממוקמות באזור אשכול סרטן השחלות (OCCR) (איור 4A). בגן BRCA2 PV, 35.7% מהווריאציות היו ממוקמות באזור BCCR ו-42.8% מהמוטציות היו ממוקמות ב-OCCR (איור 4B). לאחר מכן, הערכנו את מיקום ה-PV בתוך תחומי החלבון BRCA1 ו-BRCA2. עבור חלבון BRCA1, מצאנו שלושה PVs בתחומי הלולאה והסליל המפותל, ושתי מוטציות בתחום BRCT (איור 4A). עבור חלבון BRCA2, 4 PVs מופו לתחום החזרה של BRC, בעוד ש-3 שינויים אינטרוניים ו-3 שינויים אקסוניים זוהו בתחומי הקישור אוליגו/אוליגוסכריד (OB) ובתחומי ה-tower (T) (איור 4B).
איור 4 ייצוג סכמטי של חלבוני BRCA1 ו-BRCA2 ולוקליזציה של וריאנטים פתוגניים. איור זה מציג את התפלגות הוריאנטים הפתוגניים של BRCA1 (A) ו-BRCA2 (B) בחולות סרטן השד. מוטציות אקסוניות מוצגות בכחול, בעוד וריאנטים אינטרוניים מוצגים בכתום. גובה העמודה מייצג את מספר המקרים. מדווחים על חלבוני BRCA1 ו-BRCA2 והתחומים הפונקציונליים שלהם. (A) חלבון BRCA1 מכיל תחום לולאה (RING) ורצף לוקליזציה גרעיני (NLS), תחום סליל מפותל, תחום אשכול SQ/TQ (SCD) ותחום C-טרמינלי של BRCA1 (BRCT). (B) חלבון BRCA2 מכיל שמונה חזרות BRC, תחום קושר DNA עם תחום סלילי (Helical), שלושה קפלי קשירת אוליגונוקליאוטידים/אוליגוסכרידים (OB), תחום מגדל (T) ו-NLS בצד C. אזורים הנקראים אזור אשכול סרטן השד (BCCR) ואזור אשכול סרטן השחלות (OCCR) מוצגים בתחתית. *מייצג מוטציות הקובעות עצירה. קודונים.
לאחר מכן חקרנו מאפיינים קליניים-פתולוגיים של BC שעשויים להיות קשורים לנוכחות של BRCA1/2 PV. רישומים קליניים מלאים היו זמינים עבור 181 חולים שליליים ל-BRCA1/2 (לא נשאים) וכל הנשאים (n = 35). נמצא מתאם בין קצב התפשטות הגידול לדרגתו.
חישבנו את התפלגות ה-Ki-67 על סמך החציון של קבוצת המחקר שלנו (25%, טווח <10-90%). נבדקים עם Ki-67 < 25% הוגדרו כ-"Ki-67 נמוך", בעוד שאנשים עם ערכים ≥ 25% נחשבו ל"Ki-67 גבוה". נמצאו הבדלים משמעותיים ב-Ki-67 (p<0.01) בין אנשים שאינם נשאים לבין נשאים של BRCA1 PV (איור 5A).
איור 5 מתאם של Ki-67 עם התפלגות דרגות בנשים עם סרטן שד ובלי PV של BRCA1 ו-BRCA2. (א) תרשים קופסאות המציג חציון של ערכי Ki-67 ב-181 חולות סרטן שד שאינן נשאיות לעומת חולות PV של BRCA1 (18) או BRCA2 (17). ערכי P מתחת ל-0.5 נחשבו מובהקים סטטיסטית. (ב) היסטוגרמה המייצגת את שיוך חולות סרטן שד לקבוצות דרגה היסטולוגיות (G2 ו-G3) לפי סטטוס המוטציה של BRCA1 ו-BRCA2 (נבדקות WT, נשאיות של PV של BRCA1 ו-BRCA2).
באופן דומה, בדקנו האם דרגת הגידול מתואמת עם נוכחות מוטציה של BRCA1/2. מכיוון שסרטן G1 חסר באוכלוסייה שלנו, חילקנו את החולים לשתי קבוצות (G2 או G3). בהתאם לתוצאות Ki-67, הניתוח גילה מתאם מובהק סטטיסטית בין דרגת הגידול למוטציה BRCA1, עם שיעור גבוה יותר של גידולי G3 אצל נשאים של BRCA1 בהשוואה ללא נשאים (p<0.005) (איור 5B).
התקדמות בטכנולוגיית ריצוף ה-DNA אפשרה התקדמות חסרת תקדים בבדיקות גנטיות של BRCA1/2, עם השלכות מכריעות על חולים עם היסטוריה משפחתית של סרטן. נכון להיום, זוהו וסווגו כ-20,000 וריאנטים של BRCA1/2 לפי האגודה האמריקאית לגנטיקה רפואית 35 ומערכת ENIGMA. 35,36 ידוע היטב כי ספקטרום המוטציות של BRCA1/2 משתנה באופן נרחב בין אזורים גיאוגרפיים. 37 בתוך איטליה, שיעור מקרי המוטנטים של BRCA1/2 נע בין 8% ל-37%, דבר המראה שונות רחבה בתוך המדינה. 38,39 עם אוכלוסייה של כמעט 5 מיליון תושבים, סיציליה היא האזור החמישי בגודלו באיטליה מבחינת מספר התושבים. למרות שקיימים נתונים על תפוצת BRCA1/2 במערב סיציליה, אין ראיות נרחבות בחלק המזרחי של האי.
המחקר שלנו הוא אחד הדיווחים הראשונים על שכיחות BRCA1/2 PV בחולי סרטן המעי הגס במזרח סיציליה.28 התמקדנו בניתוח שלנו בסרטן המעי הגס, מכיוון שזוהי ללא ספק המחלה הנפוצה ביותר בקבוצה שלנו.
בבדיקת 389 חולות סרטן שד, 9% נשאו סרטן שד BRCA1/2, כשהם מחולקים באופן שווה בין BRCA1 ו-BRCA2. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם אלו שדווחו בעבר באוכלוסייה האיטלקית.28 מעניין לציין, ש-3% (13/389) מהקבוצה שלנו היו גברים. שיעור זה גבוה מהצפוי לסרטן שד גברי (1% מכלל סרטני השד),40 המשקף את בחירת האוכלוסיות שלנו על סמך הסיכון למוטציה BRCA1/2. עם זאת, אף אחד מהגברים הללו לא פיתח סרטן שד BRCA1/2, ולכן הם היו מועמדים לניתוח מולקולרי נוסף כדי לשלול את נוכחותן של מוטציות פחות שכיחות כמו PALB2, RAD51C ו-D, בין היתר. וריאנטים בעלי משמעות לא ודאית נמצאו ב-7% מהנבדקים שבהם BRCA2 VUS היה ניכר. אפילו תוצאה זו עולה בקנה אחד עם ראיות קיימות.28,41,42
כאשר ניתחנו את התפלגות תת-הסוגים המולקולריים של BC בנשים עם מוטציה BRCA1/2, אישרנו קשרים ידועים בין TNBC ל-BRCA1 PV (58.8%) ובין BC לומינלי B ל-BRCA2 PV (55.6%).16,43 גידולי לומינלי A ו-HER2+ בנשאיות BRCA1 ו-BRCA2 PV עולים בקנה אחד עם נתוני הספרות הקיימים.16,43
לאחר מכן אנו מתמקדים בסוג ובמיקום של PV BRCA1/2. בקוהורט שלנו, PV BRCA1 הנפוץ ביותר היה c.5035_5039delCTAAT. למרות ש-Incorvaia et al. לא תיארו וריאנט זה בקבוצת המחקר הסיציליאנית שלהם, מחברים אחרים דיווחו עליו כ-BRCA1 PV מסוג נבט.34 מספר מוטציות BRCA1 PV נמצאו בקבוצת המחקר שלנו - למשל c.181T>G, c.514del, c.3253dupA ו-c.5266dupC - אשר נצפו בסיציליה.28 מבין אלה, שתי מוטציות מייסדות BRCA1 (c.181T>G ו-c.5266dupC) נמצאות בדרך כלל אצל יהודים אשכנזים ממזרח ומרכז אירופה (פולין, צ'כיה), סלובניה, אוסטריה, הונגריה, בלארוסית וגרמניה),44,45 ובארצות הברית ובארגנטינה הוגדר לאחרונה כ"וריאנט נבט חוזר" בחולות איטלקיות עם סרטן שד וסרטן שד אוראלי. הווריאנט 34c.514del זוהה בעבר ב-8 חולות סרטן שד מצפון סיציליה בפלרמו ובמסינה. מעניין לציין שאפילו אינקורביאה ואח'. מצאו את הווריאנט c.3253dupA בכמה משפחות בקטניה.28 וריאנטי ה-PV המייצגים ביותר של BRCA2 הם c.428dup, c.5851_5854delAGTT והוריאנט האינטרוני c.8487+1G>A, אשר דווחו ביתר פירוט28 בחולה בפלרמו עם c.428dup, c.5851_5854delAGTT. PV נצפה במשקי בית בצפון מערב סיציליה, בעיקר באזורי טראפאני ופלרמו, בעוד ש-c.5851_5854delAGTT PV נצפה במשקי בית בצפון מערב סיציליה. הווריאנט 8487+1G>A היה נפוץ יותר בקרב נבדקים ממסינה, פלרמו וקלטניסטה.28 Rebbeck et al. תיארנו בעבר את השינוי c.5851_5854delAGTT בקולומביה.37 BRCA2 PV נוסף, c.631+1G>A, נמצא בחולי BC ו-OC מסיציליה (אגריג'נטו, סירקוזה ורגוזה).28 ראוי לציין כי צפינו בקיום משותף של שני וריאנטים של BRCA2 (BRCA2 c.631G>A ו- c.7008-2A>T) באותו מטופל, אשר הנחנו שהם מופרדים במצב cis, כפי שדווח בעבר.34,46 מוטציות BRCA2 uble אלו אכן נצפות לעתים קרובות באזור איטליה ונמצא כי הן מכניסות קודוני עצירה מוקדמים, המשפיעים על שחבור RNA שליח וגורמים לכשל של חלבון BRCA2.47,48
מיפינו גם ערכי PV של BRCA1 ו-BRCA2 באזורים משוערים של OCCR ו-BCCR בתחומי חלבון וגנים. אזורים אלה תוארו על ידי רבק ועמיתיו כאזורי סיכון להתפתחות סרטן שחלות וסרטן השד, בהתאמה.49 עם זאת, הראיות בנוגע לקשר בין מיקום וריאנטים של קו הנבט לבין הסיכון לסרטן השד או השחלות נותרות שנויות במחלוקת.28,50-52 באוכלוסייה שלנו, ערכי PV של BRCA1 היו ממוקמים בעיקר באזור BCCR, בעוד ש-PV של BRCA2 היו ממוקמים בעיקר באזור OCCR. עם זאת, לא הצלחנו למצוא קשר כלשהו בין אזורי OCCR משוערים ו-BCCR לבין מאפייני BC. ייתכן שזה נובע ממספר המוגבל של חולים עם מוטציות BRCA1/2. מנקודת מבט של תחום חלבון, ערכי PV של BRCA1 מפוזרים לאורך כל החלבון, ושינויים ב-BRCA2 נמצאים באופן עדיף בתחום החזרה של BRC.
לבסוף, קישרנו בין מאפיינים קליניים-פתולוגיים של BC לבין PV של BRCA1/2. עקב מספר החולים המוגבל שנכללו, מצאנו מתאם משמעותי רק בין Ki-67 לדרגת הגידול. למרות שההערכה והפרשנות של Ki-67 נותרות שנויות במחלוקת במידה מסוימת, אין ספק ששיעורי התרבות גבוהים קשורים לסיכון מוגבר להישנות המחלה ולירידה בהישרדות. נכון להיום, סף הגבול להבחנה בין Ki-67 "גבוה" ל"נמוך" הוא 20%. עם זאת, סף זה אינו חל על אוכלוסיית החולים שלנו עם מוטציית BRCA1/2, אשר ערך Ki-67 חציוני הוא 25%. מגמה זו בשיעורי Ki-67 גבוהים ניתנת להסבר על ידי השכיחות בקבוצות ה-luminal B וה-TNBC שלנו, מתוכן נכחו מעט גידולי luminal A. עם זאת, נראה כי מספר ראיות מצביעות על כך שסף Ki-67 גבוה יותר (25-30%) עשוי לסדר טוב יותר את החולים לפי הפרוגנוזה שלהם.53,54 מתוצאות הניתוח שלנו, מתאם משמעותי אינו מפתיע. מתרחש בין דרגות Ki-67 גבוהות לבין נוכחות BRCA1. PV. למעשה, גידולים הקשורים ל-BRCA1 אופייניים ל-TNBC ומציגים מאפיינים אגרסיביים יותר.16,17
לסיכום, מחקר זה מספק דוח על המצב המוטציוני של BRCA1/2 בקבוצת חולים עם סרטן ראש ממזרח סיציליה. בסך הכל, הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם ראיות קיימות, הן מבחינת שכיחות המוטציות והן מבחינת מאפיינים קליניים-פתולוגיים בסרטן ראש. יש צורך במחקרים נוספים באוכלוסיות גדולות יותר של חולי סרטן ראש עם מוטציה BRCA1/2, כגון שימוש בניתוח מוטציות מורחב רב-גנומי, כדי להעריך את נוכחותם של אירועי סרטן PV שונים ופחות שכיחים מ-BRCA1/2. זה יאפשר זיהוי וניהול נכון של המספר ההולך וגדל של נבדקים בסיכון מוגבר לסרטן עקב מוטציות גנטיות.
אישרנו כי המטופלים חתמו על הסכמה מדעת לשחרור דגימות הגידול שלהם באופן אנונימי למטרות מחקר. כל המטופלים חתמו על הסכמה מדעת בכתב בהתאם להצהרת הלסינקי. בהתאם למדיניות של AOU Policlinico "G.Rodolico - S.Marco", מחקר זה פטור מבדיקה אתית מכיוון שניתוח BRCA1/2 בוצע בהתאם לפרקטיקה הקלינית וכל המטופלים נתנו הסכמה מדעת בכתב. המטופלים מסכימים גם לשימוש בנתונים שלהם למטרות מחקר.
אנו מודים לפרופסור פאולו ויגנרי על עזרתו בטיפול בחולות סרטן השד כפי שביקשה ועדת האתיקה.
פדריקה מרטורנה מדווחת על שכר לימוד מ-Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. המחברים האחרים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים בעבודה זו.
1. סונג ה', פרליי ג', סיגל ר.ל. ואחרים. סטטיסטיקות סרטן עולמיות 2020: GLOBOCAN מעריך את שכיחותם ותמותתם של 36 סוגי סרטן ב-185 מדינות ברחבי העולם. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660