Javascript je trenutno onemogućen u vašem pregledniku. Neke značajke ove web stranice neće raditi kada je javascript onemogućen.
Registrirajte se sa svojim specifičnim podacima i specifičnim lijekom koji vas zanima, a mi ćemo podatke koje navedete uskladiti s člancima u našoj opsežnoj bazi podataka i odmah vam poslati PDF kopiju e-poštom.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Odjel za kliničke i Eksperimentalna medicina, Sveučilište Catania, Catania, 95123, Italija;2 Centar za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italija; 4 Medicinska genetika, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italija; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Italija; 6 Odjel za biomedicinske i biotehnološke znanosti, Sveučilište u Cataniji, Medicinska genetika, Catania, Italija, 95123; 7 Istraživački institut Oasi - IRCCS, Troina, 94018, Italija Komunikacije: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-pošta [email protected]; [email protected] Svrha: Mutacije zametne linije u BRCA1 i BRCA2 te utvrđeni rak dojke (BC), jajnika (OC) i drugi povezani s doživotnim rizikom od raka. Testiranje na gen BRCA ključno je za procjenu individualnog rizika, kao i za pronalaženje metoda prevencije kod zdravih nositelja i prilagođavanje liječenja kod pacijenata s rakom. Prevalencija promjena BRCA1 i BRCA2 uvelike varira ovisno o geografskim regijama i iako postoje podaci o patogenim varijantama BRCA u sicilijanskim obiteljima, nedostaju studije koje su posebno usmjerene na populacije u istočnoj Siciliji. Cilj naše studije bio je istražiti incidenciju i distribuciju patogenih promjena zametne linije BRCA u kohorti pacijenata s BC iz istočne Sicilije i procijeniti njihovu povezanost sa specifičnim osobinama BC-a korištenjem sekvenciranja sljedeće generacije. Prisutnost promjena korelirala je sa stupnjem tumora i indeksom proliferacije. REZULTATI: Sveukupno, 35 pacijenata (9%) imalo je patogenu varijantu BRCA, 17 (49%) u BRCA1 i 18 (51%) u BRCA2. Promjene BRCA1 prevladavaju kod pacijenata s trostruko negativnim BC-om, dok su mutacije BRCA2 češće kod pacijenata s luminalnim BC-om. U usporedbi s Ispitanici s BRCA1 varijantama koji nisu bili nositelji mutacije imali su značajno viši stupanj tumora i proliferativni indeks. Zaključci: Naši nalazi pružaju pregled mutacijskog statusa BRCA gena kod pacijenata s rakom dojke iz istočne Sicilije i potvrđuju ulogu NGS analize u identificiranju pacijenata s nasljednim rakom dojke. Sveukupno, ovi podaci su u skladu s prethodnim dokazima koji podupiru probir na BRCA gen za pravilnu prevenciju i liječenje raka kod nositelja mutacija.
Rak dojke (RKD) je najčešća maligna bolest u svijetu i najsmrtonosniji rak kod žena.1 Biološke značajke koje određuju prognozu RKD i kliničko ponašanje opsežno su proučavane i djelomično razjašnjene tijekom vremena. Zapravo, trenutno se koristi nekoliko surogatnih markera za klasifikaciju RKD u različite molekularne podtipove. To su estrogenski (ER) i/ili progesteronski receptor (PgR), amplifikacija receptora 2 humanog epidermalnog faktora rasta (HER2), indeks proliferacije Ki-67 i stupanj tumora (G).2 Kombinacija ovih varijabli identificirala je sljedeće kategorije RKD: 1) Luminalni tumori, koji pokazuju ekspresiju ER i/ili PgR, činili su 75% RKD. Ovi tumori su dalje podijeljeni na Luminalni A, kada je Ki-67 bio ispod 20% i HER2 negativan, te Luminalni B, kada je Ki-67 bio jednak ili veći od 20% i u prisutnosti HER2 amplifikacije, bez obzira na indeks proliferacije; 2) HER2+ tumori koji su ER i PgR negativni, ali pokazuju HER2 amplifikaciju. Ova skupina čini 10% svih tumora dojke; 3) Trostruko negativni rak dojke (TNBC), koji ne pokazuje ekspresiju ER i PgR te amplifikaciju HER2, čini oko 15% slučajeva raka dojke.2-4
Među ovim podtipovima raka dojke, stupanj tumora i indeks proliferacije predstavljaju presječne biomarkere koji su izravno i neovisno povezani s agresivnošću i prognozom tumora.5,6
Uz spomenute biološke značajke, uloga naslijeđenih genetskih promjena koje dovode do razvoja raka dojke postala je sve važnija posljednjih nekoliko godina.7 Otprilike 1 od 10 tumora dojke nasljeđuje se zbog promjena zametne linije u specifičnim genima.8 Dvije velike epidemiološke studije koje su obuhvatile više od 180 000 žena nedavno su identificirale skupinu od osam gena (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C i RAD51D) primarno odgovornih za nasljedni rak dojke. Među tim genima, BRCA1 i BRCA2 (u daljnjem tekstu BRCA1/2) pokazali su najjaču korelaciju s razvojem tumora dojke.9-12 Zapravo, mutacije zametne linije BRCA1/2 značajno povećavaju doživotni rizik od raka dojke, kao i drugih malignih bolesti, uključujući bolesti jajnika, prostate, gušterače, kolorektuma i melanoma. Od 13. do 80. godine života, kumulativna incidencija raka dojke iznosi 72% kod žena s patogenom varijantom (PV) BRCA1 i 69% kod žena s BRCA2. PV.14
Značajno je da nedavna publikacija sugerira da rizik od raka dojke ovisi o vrsti PV-a. Zapravo, u usporedbi s patogenim skraćenim varijantama, upadljive missense varijante, posebno u genu BRCA1, povezane su sa smanjenim rizikom od raka dojke, posebno kod starijih žena.15
Prisutnost BRCA1 ili BRCA2 PV bila je povezana s različitim biološkim i kliničkopatološkim značajkama.16,17 BRCA1-povezani karcinomi dojke obično su klinički agresivni, slabo diferencirani i visoko proliferativni. Ovi tumori su obično trostruko negativni i imaju ranu dob početka. Tumori koji se javljaju kod pacijenata s mutacijom BRCA2 obično pokazuju umjerene do dobro diferencirane stupnjeve i varijabilne proliferativne indekse. Ovi tumori su češći u lumenu B i obično se javljaju kod starijih osoba.16-18 Posebno je važno napomenuti da mutacije u BRCA1 i BRCA2 povećavaju osjetljivost na specifične tretmane, uključujući soli platine i ciljane lijekove poput inhibitora poli(ADP-riboze) polimeraze (PARPi).19,20
Tijekom proteklih nekoliko godina, primjena sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) u kliničkoj praksi omogućila je sve većem broju pacijenata s rakom dojke da se podvrgnu molekularnom testiranju sindroma predispozicije za rak, uključujući BRCA1/2.21 Istodobno, definicije temeljene na preciznim kriterijima u vezi s obiteljskom anamnezom, demografskim i kliničkopatološkim karakteristikama kako bi se bolje identificirale osobe vrijedne testiranja na BRCA1/2.22,23 U tom kontekstu, akumuliraju se dokazi o probiru na BRCA1/2 u specifičnim populacijama, ističući razlike među geografskim regijama.24–27 Iako postoje izvješća o kohorti raka dojke u zapadnoj Siciliji, dostupno je manje podataka o probiru na BRCA1/2 u populaciji istočne Sicilije.28,29
Ovdje opisujemo rezultate probira zametne linije BRCA1/2 kod pacijenata s rakom dojke iz istočne Sicilije, dodatno korelirajući prisutnost mutacija BRCA1 ili BRCA2 s glavnim kliničkopatološkim značajkama ovih tumora.
Retrospektivna studija provedena je u „Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju“ u bolnici Policlinico Rodolico – San Marco u Cataniji. Od siječnja 2017. do ožujka 2021. ukupno 455 pacijenata s rakom dojke i jajnika, melanomom, gušteračom ili prostatom upućeno je u naš molekularno-dijagnostički laboratorij na genetsko testiranje BRCA/2. Ova studija provedena je u skladu s Helsinškom deklaracijom, a svi sudionici dali su pisani informirani pristanak prije molekularne analize.
Histološke i biološke karakteristike (ER, PgR, HER2 status, Ki-67 i gradus) karcinoma dojke procijenjene su na uzorcima biopsije jezgre ili kirurških uzoraka, uzimajući u obzir samo agresivne komponente tumora. Na temelju tih karakteristika, karcinomi dojke klasificirani su na sljedeći način: luminalni A (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67 <20%), luminalni B (ER+ i/ili PgR+, HER2-, Ki-67 ≥20%), luminalni B-HER2+ (ER i/ili PgR+, HER2+), HER2+ (ER i PgR-, HER2+) ili trostruko negativni (ER i PgR-, HER2-).
Prije procjene statusa mutacija BRCA1 i BRCA2, multidisciplinarni tim koji je uključivao onkologa, genetičara i psihologa proveo je konzultacije o tumorskoj genetici za svakog pacijenta kako bi se utvrdila prisutnost BRCA1 i/ili BRCA1 ili osoba s visokim rizikom od PV u genu BRCA2. Odabir pacijenata proveden je prema smjernicama Talijanskog društva za medicinsku onkologiju (AIOM) i lokalnim sicilijanskim preporukama.30,31 Ovi kriteriji uključuju: (i) obiteljsku anamnezu poznatih patogenih varijanti u genima predispozicije (npr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) muškarce s karcinomom dojke; (iii) one s karcinomom dojke i karcinomom raka dojke; (iv) žene s karcinomom dojke <36 godina, trigliceridom dojke <60 godina ili bilateralnim karcinomom dojke <50 godina; (v) osobnu medicinsku anamnezu karcinoma dojke <50 godina i barem jednog rođaka prvog stupnja: (a) karcinom dojke < 50 godina; (b) nemucinozni i negranični karcinom dojke bilo koje dobi; (c) bilateralni karcinom dojke; (d) muški karcinom dojke; (e) rak gušterače; (f) rak prostate; (vi) dvije ili više osobnih anamneza raka dojke > 50 godina i obiteljska anamneza raka dojke, raka prostate ili raka gušterače za rođake koji su međusobno u srodstvu prvog stupnja (uključujući rođake s kojima je u srodstvu prvog stupnja); (vii) Osobna anamneza raka dojke i barem jedan rođak prvog stupnja: (a) rak dojke < 50 godina; (b) neonatalni rak dojke; (c) bilateralni rak dojke; (d) muški rak dojke; (vii) žena s visokostupanjskim seroznim rakom dojke.
Od svakog pacijenta uzet je uzorak periferne krvi od 20 mL i sakupljen u EDTA epruvete (BD Biosciences). Genomska DNA izolirana je iz 0,7 mL uzoraka pune krvi pomoću QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italija) prema uputama proizvođača i propuštena kroz Qubit® 3.0 fluorometar (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Provedena je kvantifikacija. Obogaćivanje ciljeva i priprema biblioteke provode se pomoću Oncomine™ BRCA Research Assay Chefa, spremnog za učitavanje u Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit za automatiziranu pripremu biblioteke prema uputama proizvođača. Kit se sastoji od dva multipleks PCR poola primera koji se mogu koristiti za proučavanje svih gena BRCA1 (NM_007300.3) i BRCA2 (NM_000059.3). Ukratko, 15 µL svakog razrijeđenog uzorka DNA (10 ng) dodano je na ploče s barkodom za pripremu biblioteke, a svi reagensi i potrošni materijal uneseni su u Ion Chef™ instrument. Automatizirana priprema biblioteke i objedinjavanje biblioteke uzoraka s barkodom zatim su provedeni na Ion Chef™ instrumentu. Broj pripremljenih biblioteka zatim je procijenjen Qubit® 3.0 fluorometrom (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) prema uputama proizvođača. Konačno, biblioteke se kombiniraju u ekvimolarnim omjerima u epruvetama za uzorke biblioteke Ion Chef™ (epruvete s barkodom) i unesene na instrumentom Ion Chef™. Sekvenciranje je provedeno pomoću instrumenta Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) s čipom Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Analiza podataka provedena je pomoću programa Amplicon Suite (SmartSeq srl) i softvera Ion Reporter.
Sva nomenklatura varijanti slijedila je trenutne smjernice Konzorcija za varijacije ljudskog genoma, dostupne na mreži (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinički značaj BRCA1/2 varijanti definiran je korištenjem klasifikacije Međunarodnog konzorcija ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) i konzultiranjem različitih baza podataka kao što su ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD i UMD. Klasifikacija uključuje pet različitih kategorija rizika: benigna (kategorija I), vjerojatno benigna (kategorija II), varijanta neizvjesnog značaja (VUS, kategorija III), vjerojatno patogena (kategorija IV) i patogena (kategorija V). VarSome je također analizirao učinak mutacija na strukturu i funkciju proteina, informativni alat s pristupom 30 baza podataka.32
Za dodjeljivanje potencijalne kliničke važnosti svakom VUS-u korišteni su sljedeći računalni algoritmi za predviđanje proteina: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) i Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varijante klasificirane kao klasa 1 i 2 smatrane su divljim tipom.
Sangerovo sekvenciranje potvrdilo je prisutnost svake patogene varijante. Ukratko, za svaku detektiranu varijantu dizajniran je par specifičnih primera korištenjem referentnih sekvenci gena BRCA1 i BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 i NG_012772.3, NM_000059.3). Stoga je provedena ciljana PCR, a zatim Sangerovo sekvenciranje.
Pacijenti koji su bili negativni na gen BRCA1/2 testirani su multipleks ligacijom ovisnom amplifikacijom sonde (MLPA) prema uputama proizvođača kako bi se procijenila prisutnost velikih genomskih preuređenja (LGR). Ukratko, uzorci DNA se denaturiraju i koristi se do 60 sondi specifičnih za gene BRCA1 i BRCA2, od kojih svaka detektira specifičan slijed DNA duljine približno 60 nukleotida. Produkti amplifikacije sonde, koji se sastoje od jedinstvenog skupa PCR amplikona, zatim su analizirani kapilarnom elektroforezom i Cofalyser.Net softverom u kombinaciji s odgovarajućim Cofalyser tablicama specifičnim za seriju (www.mrcholland.com).
Odabrane kliničkopatološke varijable (histološki stupanj i Ki-67% indeks proliferacije) bile su povezane s prisutnošću BRCA1/2 PV, izračunato korištenjem Prism softvera v. 8.4 korištenjem Fisherovog egzaktnog testa uz pretpostavku da je p-vrijednost <0,05 značajna.
Između siječnja 2017. i ožujka 2021., 455 pacijenata je pregledano na mutacije germinativne linije BRCA1/2. Testiranje mutacija provedeno je u Centru za eksperimentalnu onkologiju i hematologiju bolnice Policlinico. Prema sicilijanskim smjernicama (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), Rodolico of Catania – San Marco” ukupno je 389 pacijenata imalo rak dojke, 37 rak jajnika, 16 rak gušterače, 8 rak prostate i 5 melanom. Raspodjela pacijenata prema vrsti raka i rezultatima analize prikazana je na slici 1.
Slika 1 prikazuje dijagram toka koji prikazuje pregled studije. Pacijenti s tumorima dojke, melanoma, gušterače, prostate ili jajnika testirani su na mutacije u genima BRCA1 i BRCA2.
Kratice: PV, patogena varijanta; VUS, varijanta neizvjesnog značaja; WT, divlji tip BRCA1/2 sekvence.
Selektivno smo usmjerili naša istraživanja na kohorte s rakom dojke. Pacijenti su imali srednju dob od 49 godina (raspon 23-89) i bili su pretežno ženskog spola (n=376 ili 97%).
Od tih ispitanika, 64 (17%) imalo je mutacije BRCA1/2 i sve su bile ženskog spola. Trideset pet (9%) imalo je PV, a 29 (7,5%) VUS. Sedamnaest (48,6%) od 35 patogenih varijanti pojavilo se u BRCA1 i 18 (51,4%) u BRCA2, dok se 5 VUS pojavilo u BRCA1 (17,2%) i 24 (82,8%) u BRCA2 (slike 1 i 2). LGR nije bio prisutan u MLPA analizi.
Slika 2. Analiza mutacija BRCA1 i BRCA2 u 389 pacijentica s rakom dojke. (A) Raspodjela patogenih varijanti (PV) (crvena), varijanti neizvjesnog značaja (VUS) (narančasta) i WT (plava) u 389 pacijentica s rakom dojke; (B) 389 pacijentica s rakom dojke Trideset pet (9%) imalo je patogene varijante (PV) BRCA1/2. Među njima, 17 (48,6%) bili su nositelji BRCA1 PV (tamnocrvena), a 18 (51,4%) bili su nositelji BRCA2 (svijetlocrvena); (C) 29 (7,5%) od 389 ispitanica nosilo je VUS, 5 (17,2%) gene BRCA1 (tamnonarančasta) i 24 (82,8%) gene BRCA2 (svijetlonarančasta).
Kratice: PV, patogena varijanta; VUS, varijanta neizvjesnog značaja; WT, divlji tip BRCA1/2 sekvence.
Zatim smo istražili prevalenciju molekularnih podtipova karcinoma dojke u pacijentica s BRCA1/2 paracetamolom. Raspodjela je uključivala 2 (5,7%) luminalni A, 15 (42,9%) luminalni B, 3 (8,6%) luminalni B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ i 13 (37,1%) pacijentica s TNBC-om. Među BRCA1-pozitivnim pacijenticama, 5 (29,4%) imalo je luminalni B karcinom dojke, 2 (11,8%) HER2+ bolest, a 10 (58,8%) TNBC. Tumori bez BRCA1 mutacija bili su ili luminalni A ili luminalni B-HER2+ (Slika 3). U BRCA2-pozitivnoj podskupini, 10 (55,6%) tumora bili su luminalni B, 3 (16,7%) luminalni B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC i 2 (11,1%) luminalni A (Slika 3). Nije bilo HER2+ tumora. bile su prisutne u ovoj skupini. Dakle, mutacije BRCA1 su prevladavajuće kod pacijenata s TNBC-om, dok su promjene BRCA2 predominantne kod osoba s lumenom B.
Slika 3. Prevalencija podtipova raka dojke u pacijentica s patogenim varijantama u BRCA1 i BRCA2. Histogrami koji prikazuju distribuciju BRCA1- (tamnocrveno) i BRCA2- (svijetlocrveno) PV među molekularnim podtipovima pacijentica s rakom dojke. Brojevi prikazani unutar svakog okvira predstavljaju postotak pacijentica s BRCA1 i BRCA2 PV za svaku podtipu raka dojke.
Kratice: PV, patogena varijanta; HER2+, pozitivan na receptor 2 humanog epidermalnog faktora rasta; TNBC, trostruko negativni rak dojke.
Nakon toga, procijenili smo vrstu i lokalizaciju gena BRCA1 i BRCA2 PV-ova. U BRCA1 PV-u uočili smo 7 jednonukleotidnih varijanti (SNV-ova), 6 delecija, 3 duplikacije i 1 inserciju. Samo jedna mutacija (c.5522delG) predstavlja novo otkriće. Najčešći BRCA1 PV otkriven kod oba ispitanika bio je c.5035_5039delCTAAT. Ova promjena uključuje deleciju pet nukleotida (CTAAT) u BRCA1 eksonu 15, što rezultira zamjenom aminokiseline leucina tirozinom na kodonu 1679, a zbog pomaka okvira čitanja translacije s predviđenim alternativnim stop kodonom dolazi do preranog skraćivanja proteina. Sve ostale promjene otkrivene su samo u jednom slučaju. Značajno je da je jedan od prijavljenih PV-ova bio smješten u konsenzus regiji mjesta spajanja (c.4357+1G>T) (Tablica 1).
Što se tiče BRCA2 PV, uočili smo 6 delecija, 6 SNV-ova i 2 duplikacije. Nijedna od pronađenih promjena nije nova. Tri mutacije su se ponovile u našoj populaciji, c.428dup i c.8487+1G>A uočene su kod 3 ispitanika, a zatim c.5851_5854delAGTT pronađen u dva slučaja. Promjena c.428dup uključuje ponavljanje C u eksonu 5 BRCA2, za koji se predviđa da kodira skraćeni, nefunkcionalni protein. Mutacija c.8487+1G>A javlja se u introničkoj regiji introna 19 BRCA2 (± 1,2) i utječe na konsenzus sekvencu prerade, što rezultira promijenjenim preradom što rezultira abnormalnim ili odsutnim proteinom. Patogena varijanta c.5851_5854delAGTT posljedica je delecije od 4 nukleotida s nukleotidnih pozicija 5851 do 5854 u kodirajućem eksonu 10 gena BRCA2 i rezultira translacijskom... pomak okvira čitanja s predviđenim alternativnim stop kodonom (p.S1951WfsTer). Značajno je da su, kako je prethodno objavljeno, obje promjene c.631G>A i c.7008-2A>T otkrivene kod istog pacijenta.34 Prva mutacija uključuje zamjenu adenozina (A) u BRCA2 eksonu 7 nukleotidom koji sadrži gvanin (G), što rezultira promjenom valina u izoleucin na kodonu 211, izoleucin. Aminokiselina je aminokiselina s vrlo sličnim svojstvima. Ova promjena utječe na normalno spajanje mRNA. Druga varijanta nalazi se u introničkoj regiji i rezultira dvostrukom zamjenom A timinom (T) prije eksona 13 gena koji kodira BRCA2. Promjena c.7008-2A>T može generirati više transkripata različitih duljina. Nadalje, u skupini BRCA2 PV-ova, 4 od 18 promjena (22,2%) bile su intronične.
Zatim smo mapirali štetne mutacije BRCA1/2 u funkcionalnim domenama i regijama koje vežu proteine ​​(slika 4). U genu BRCA1, 50% PV-a nalazilo se u regiji klastera raka dojke (BCCR), dok se 22% mutacija nalazilo u regiji klastera raka jajnika (OCCR) (slika 4A). U BRCA2 PV-u, 35,7% varijanti nalazilo se u regiji BCCR, a 42,8% mutacija nalazilo se u OCCR-u (slika 4B). Zatim smo procijenili lokaciju PV-a unutar domena proteina BRCA1 i BRCA2. Za protein BRCA1 pronašli smo tri PV-a u domenama petlje i spiralne zavojnice te dvije mutacije u domeni BRCT (slika 4A). Za protein BRCA2, 4 PV-a mapirana su na domenu ponavljanja BRC-a, dok su 3 intronske i 3 egzonske promjene otkrivene u domenama koje vežu oligo/oligosaharid (OB) i toranj (T) (slika 4B).
Slika 4. Shematski prikaz proteina BRCA1 i BRCA2 i lokalizacija patogenih varijanti. Ova slika prikazuje distribuciju patogenih varijanti BRCA1 (A) i BRCA2 (B) u pacijenticama s rakom dojke. Egzonske mutacije prikazane su plavom bojom, dok su intronske varijante prikazane narančastom bojom. Visina stupca predstavlja broj slučajeva. Prikazani su proteini BRCA1 i BRCA2 i njihove funkcionalne domene. (A) Protein BRCA1 sadrži domenu petlje (RING) i sekvencu nuklearne lokalizacije (NLS), domenu spiralne zavojnice, SQ/TQ domenu klastera (SCD) i C-terminalnu domenu BRCA1 (BRCT). (B) Protein BRCA2 sadrži osam BRC ponavljanja, domenu koja veže DNA sa spiralnom domenom (Helikalna), tri nabora koji vežu oligonukleotide/oligosaharide (OB), domenu tornja (T) i NLS na C strani. Područja nazvana Regija klastera raka dojke (BCCR) i Regija klastera raka jajnika (OCCR) prikazana su na dnu. *Predstavlja mutacije koje određuju zaustavljanje kodoni.
Zatim smo istražili kliničko-patološke značajke karcinoma dojke koje bi mogle biti povezane s prisutnošću BRCA1/2 paracetamola. Potpuni klinički zapisi bili su dostupni za 181 BRCA1/2-negativnog pacijenta (ne-nositelja) i sve nositelje (n = 35). Postojala je korelacija između stope proliferacije tumora i stupnja.
Distribuciju Ki-67 izračunali smo na temelju medijana naše kohorte (25%, raspon <10-90%). Ispitanici s Ki-67 < 25% definirani su kao „niski Ki-67“, dok su osobe s vrijednostima ≥ 25% smatrane „visokim Ki-67“. Značajne razlike u Ki-67 (p <0,01) pronađene su između osoba koje nisu nositelji i nositelja BRCA1 PV gena (slika 5A).
Slika 5. Korelacija Ki-67 s distribucijom gradusa kod žena s rakom dojke s i bez BRCA1 i BRCA2 PV. (A) Boxplot koji prikazuje srednje vrijednosti Ki-67 kod 181 pacijentice s rakom dojke koja nije nositeljica u odnosu na pacijentice s BRCA1 (18) ili BRCA2 (17) PV. P vrijednosti ispod 0,5 smatrane su statistički značajnima. (B) Histogram koji predstavlja raspodjelu pacijentica s rakom dojke u histološke skupine gradusa (G2 i G3) prema statusu mutacije BRCA1 i BRCA2 (ispitanice WT, nositelji BRCA1 i BRCA2 PV).
Isto tako, ispitali smo korelira li stupanj tumora s prisutnošću BRCA1/2 PV. Budući da G1 karcinom dojke nije bio prisutan u našoj populaciji, podijelili smo pacijente u dvije skupine (G2 ili G3). U skladu s rezultatima Ki-67, analiza je otkrila statistički značajnu korelaciju između stupnja tumora i mutacije BRCA1, s većim udjelom G3 tumora kod nositelja BRCA1 u usporedbi s nenositeljima (p<0,005) (Slika 5B).
Napredak u tehnologiji sekvenciranja DNK omogućio je neviđen napredak u genetskom testiranju BRCA1/2, s ključnim implikacijama za pacijente s obiteljskom anamnezom raka. Do danas je identificirano i klasificirano približno 20 000 varijanti BRCA1/2 prema Američkom društvu za medicinsku genetiku 35 i ENIGMA sustavu. 35,36 Dobro je poznato da se mutacijski spektar BRCA1/2 uvelike razlikuje ovisno o geografskim regijama. 37 Unutar Italije, stopa BRCA1/2 PV kretala se od 8% do 37%, što pokazuje veliku varijabilnost unutar zemlje. 38,39 S populacijom od gotovo 5 milijuna, Sicilija je peta najveća regija u Italiji po broju stanovnika. Iako postoje podaci o distribuciji BRCA1/2 u zapadnoj Siciliji, nema opsežnih dokaza u istočnom dijelu otoka.
Naša studija je jedno od prvih izvješća o incidenciji BRCA1/2 PV kod pacijenata s rakom dojke u istočnoj Siciliji.28 Usredotočili smo se na rak dojke, budući da je to daleko najčešća bolest u našoj kohorti.
Prilikom testiranja 389 pacijenata s rakom dojke, 9% ih je imalo BRCA1/2 PV, ravnomjerno raspoređene između BRCA1 i BRCA2. Ovi rezultati su u skladu s onima prethodno zabilježenima u talijanskoj populaciji.28 Zanimljivo je da je 3% (13/389) naše kohorte bilo muškaraca. Ova stopa je viša od očekivane za rak dojke kod muškaraca (1% svih karcinoma dojke),40 što odražava naš odabir populacija na temelju rizika od mutacije BRCA1/2. Međutim, niti jedan od ovih muškaraca nije razvio BRCA1/2 PV, pa su bili kandidati za daljnju molekularnu analizu kako bi se isključila prisutnost manje uobičajenih mutacija poput PALB2, RAD51C i D, između ostalih. Varijacije neizvjesne značajnosti pronađene su u 7% ispitanika kod kojih je bio evidentan BRCA2 VUS. Čak je i ovaj rezultat u skladu s postojećim dokazima.28,41,42
Kada smo analizirali distribuciju molekularnih podtipova BC-a kod žena s mutantima BRCA1/2, potvrdili smo poznate povezanosti između TNBC-a i BRCA1 PV (58,8%) te između luminalnog B BC-a i BRCA2 PV-a (55,6%).16,43 Luminalni A i HER2+ tumori kod nositeljica BRCA1 i BRCA2 PV u skladu su s postojećim podacima iz literature.16,43
Zatim se usredotočujemo na vrstu i lokaciju BRCA1/2 PV. U našoj kohorti, najčešći BRCA1 PV bio je c.5035_5039delCTAAT. Iako su Incorvaia i sur. nisu opisali ovu varijantu u svojoj sicilijanskoj kohorti, drugi autori su je izvijestili kao germinativni BRCA1 PV.34 U našoj kohorti pronađeno je nekoliko BRCA1 PV-ova – npr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA i c.5266dupC – koji su uočeni na Siciliji.28 Od njih, dvije osnivačke mutacije BRCA1 (c.181T>G i c.5266dupC) često se nalaze kod aškenaskih Židova istočne i srednje Europe (Poljska, Češka), Slovenska, Austrijska, Mađarska, Bjelorusija i Njemačka),44,45 a u Sjedinjenim Državama i Argentini nedavno je definirana kao „rekurentna germinativna varijanta“ kod talijanskih pacijenata s rakom dojke i rakom dojke. Varijanta 34c.514del prethodno je identificirana kod 8 pacijenata s rakom dojke iz sjeverne Sicilije u Palermu i Messini. Zanimljivo je da su čak i Incorvaia i sur. pronašli su varijantu c.3253dupA u nekim obiteljima u Cataniji.28 Najreprezentativniji BRCA2 PV su c.428dup, c.5851_5854delAGTT i intronička varijanta c.8487+1G>A, koje su detaljnije opisane28 kod pacijenta u Palermu s c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV uočen je u kućanstvima na sjeverozapadnoj Siciliji, uglavnom u regijama Trapani i Palermo, dok je c.5851_5854delAGTT PV uočen u kućanstvima na sjeverozapadnoj Siciliji. Varijanta 8487+1G>A bila je češća kod ispitanika iz Messine, Palerma i Caltanissette.28 Rebbeck i sur. prethodno je opisana promjena c.5851_5854delAGTT u Kolumbiji.37 Drugi BRCA2 PV, c.631+1G>A, pronađen je kod pacijenata s BC i OC iz Sicilije (Agrigento, Siracusa i Ragusa).28 Značajno je da smo uočili koegzistenciju dviju BRCA2 varijanti (BRCA2 c.631G>A i c.7008-2A>T) kod istog pacijenta, za koje smo pretpostavili da su odvojene u cis načinu rada, kao što je prethodno objavljeno.34,46 Ove BRCA2 podne mutacije doista se često opažaju u talijanskoj regiji i utvrđeno je da uvode preuranjene stop kodone, utječući na spajanje informacijske RNA i uzrokujući neuspjeh BRCA2 proteina.47,48
Također smo mapirali BRCA1 i BRCA2 PV u pretpostavljenim OCCR i BCCR regijama proteinskih domena i gena. Rebbeck i suradnici su opisali ove regije kao područja rizika za razvoj raka jajnika i dojke.49 Međutim, dokazi o povezanosti između lokacije varijanti zametne linije i rizika od raka dojke ili jajnika ostaju kontroverzni.28,50-52 U našoj populaciji, BRCA1 PV su se pretežno nalazili u BCCR regiji, dok su BRCA2 PV pretežno bili smješteni u OCCR regiji. Međutim, nismo uspjeli pronaći nikakvu povezanost između pretpostavljenih OCCR i BCCR regija i BC značajki. To može biti zbog ograničenog broja pacijenata s mutacijama BRCA1/2. Iz perspektive proteinske domene, BRCA1 PV su raspoređeni duž cijelog proteina, a promjene BRCA2 se preferencijalno nalaze u BRC ponavljajućoj domeni.
Konačno, korelirali smo kliničko-patološke značajke karcinoma dojke s BRCA1/2 prevalencijom (PV). Zbog ograničenog broja uključenih pacijenata, pronašli smo značajnu korelaciju samo između Ki-67 i gradusa tumora. Iako procjena i interpretacija Ki-67 ostaje donekle kontroverzna, sigurno je da su visoke stope proliferacije povezane s povećanim rizikom od recidiva bolesti i smanjenim preživljavanjem. Do danas je granična vrijednost za razlikovanje „visokog“ i „niskog“ Ki-67 20%. Međutim, ovaj prag se ne odnosi na našu populaciju pacijenata s mutacijom BRCA1/2, koja ima medijan Ki-67 od 25%. Ovaj trend visokih stopa Ki-67 može se objasniti prevalencijom u našim kohortama luminalnog B i TNBC-a, od kojih je bilo prisutno malo tumora luminalnog A. Međutim, neki dokazi sugeriraju da viša granična vrijednost Ki-67 (25–30%) može bolje stratificirati pacijente prema njihovoj prognozi.53,54 Iz rezultata naše analize, značajna korelacija nije iznenađujuća. Javlja se između visokog Ki-67 i gradusa te prisutnosti BRCA1. PV. Zapravo, tumori povezani s BRCA1 tipični su za TNBC i pokazuju agresivnije značajke.16,17
Zaključno, ova studija pruža izvješće o mutacijskom statusu BRCA1/2 u kohorti BC-a iz istočne Sicilije. Sveukupno, naši nalazi su u skladu s postojećim dokazima, kako u pogledu prevalencije mutacija tako i kliničko-patoloških značajki BC-a. Potrebna su daljnja istraživanja na većim populacijama pacijenata s BC-om s mutacijom BRCA1/2, poput korištenja multigenomske proširene mutacijske analize, kako bi se procijenila prisutnost PV-a koji su različiti i rjeđi od BRCA1/2. To će omogućiti identifikaciju i pravilno liječenje sve većeg broja ispitanika s povećanim rizikom od raka zbog genetskih mutacija.
Potvrdili smo da su pacijenti potpisali informirani pristanak za anonimno izdavanje uzoraka svojih tumora u istraživačke svrhe. Svi pacijenti potpisali su pisani informirani pristanak u skladu s Helsinškom deklaracijom. Prema politici AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“, ova studija je izuzeta od etičkog pregleda jer je analiza BRCA1/2 provedena u skladu s kliničkom praksom i svi pacijenti su dali pisani informirani pristanak. Pacijenti također pristaju na korištenje svojih podataka u istraživačke svrhe.
Zahvaljujemo prof. Paolu Vigneriju na pomoći u skrbi za pacijentice oboljele od raka dojke, kako je zatražio Etički odbor.
Federica Martorana izvještava o honorarima od Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Ostali autori izjavljuju da nemaju sukob interesa u ovom radu.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL i dr. Globalna statistika raka 2020.: GLOBOCAN procjenjuje incidenciju i smrtnost od 36 vrsta raka u 185 zemalja diljem svijeta. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660