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작곡 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 University of Clinical and Experimental Medicine 카타니아, 카타니아, 95123, 이탈리아;2 실험 종양학 및 혈액학 센터, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, 카타니아, 95123, 이탈리아; 3 의학 종양학, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, 카타니아, 95123, 이탈리아; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, 카타니아, 95123, 이탈리아; 5 의학 유전학, ASP, 시라쿠사, 96100, 이탈리아; 6 생의학 및 생명공학 과학부, 카타니아 대학교, 의학 유전학, 카타니아, 이탈리아, 95123; 7 Oasi 연구소-IRCCS, 트로이나, 94018, 이탈리아. 연락처: Stefania Stella, 전화 +39 095 378 1946, 이메일 [email protected]; [email protected] 목적: BRCA1 및 BRCA2 유전자의 생식세포 돌연변이는 유방암(BC), 난소암(OC) 및 기타 암 발생 위험과 관련이 있습니다. BRCA 유전자 검사는 개인의 위험을 평가하고, 건강한 보인자의 예방 방법을 찾고, 암 환자의 치료법을 맞춤화하는 데 중요합니다. BRCA1 및 BRCA2 변이의 유병률은 지역에 따라 크게 다르며, 시칠리아 가족의 BRCA 병원성 변이에 대한 데이터는 존재하지만, 특히 시칠리아 동부 지역 인구를 대상으로 한 연구는 부족합니다. 본 연구의 목적은 시칠리아 동부 지역 유방암 환자 코호트에서 BRCA 병원성 생식세포 변이의 발생률과 분포를 조사하고, 차세대 염기서열 분석을 이용하여 특정 유방암 특성과의 연관성을 평가하는 것입니다. 변이의 존재는 종양 등급 및 증식 지수와 상관관계가 있었습니다. 결과: 전체 환자 중 35명(9%)에서 BRCA 병원성 변이가 발견되었으며, 이 중 17명(49%)은 BRCA1, 18명(51%)은 BRCA2 유전자에서 발견되었습니다. BRCA2 및 BRCA1 변이는 삼중 음성 유방암 환자에서 흔하게 나타나는 반면, BRCA2 돌연변이는 루미널 유방암 환자에서 더 흔하게 나타납니다. BRCA1 변이 보유자는 비보유자에 비해 종양 등급과 증식 지수가 유의하게 높았습니다. 결론: 본 연구 결과는 시칠리아 동부 지역 유방암 환자의 BRCA 돌연변이 현황을 개괄적으로 보여주고, 유전성 유방암 환자 식별에 있어 차세대 염기서열 분석(NGS)의 역할을 확인시켜 줍니다. 전반적으로 이러한 데이터는 돌연변이 보유자의 암 예방 및 치료를 위한 BRCA 스크리닝의 중요성을 뒷받침하는 기존 연구 결과와 일치합니다.
유방암(BC)은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양이며 여성에게 가장 치명적인 암입니다.¹ 유방암의 예후와 임상적 행동을 결정하는 생물학적 특징은 오랜 시간에 걸쳐 광범위하게 연구되고 부분적으로 규명되어 왔습니다. 실제로 현재 여러 대리 마커가 유방암을 다양한 분자 아형으로 분류하는 데 사용되고 있습니다. 이러한 마커에는 에스트로겐 수용체(ER) 및/또는 프로게스테론 수용체(PgR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 증폭, 증식 지수 Ki-67 및 종양 등급(G)이 있습니다.² 이러한 변수들의 조합을 통해 다음과 같은 유방암 범주가 확인되었습니다. 1) ER 및/또는 PgR 발현을 보이는 루미널 종양은 전체 유방암의 75%를 차지합니다. 이러한 종양은 Ki-67이 20% 미만이고 HER2 음성인 경우 루미널 A로, Ki-67이 20% 이상이고 HER2 증폭이 있는 경우 루미널 B로 세분화되며, 증식 지수는 고려하지 않습니다. 2) 에스트로겐 수용체(ER)와 프로게스테론 수용체(PgR)는 음성이지만 HER2 증폭을 보이는 HER2+ 종양. 이 그룹은 전체 유방암의 10%를 차지합니다. 3) 에스트로겐 수용체와 PgR 발현이 없고 HER2 증폭도 나타나지 않는 삼중 음성 유방암(TNBC)은 유방암의 약 15%를 차지합니다.2-4
이러한 유방암 아형 중에서 종양 등급과 증식 지수는 종양의 공격성과 예후에 직접적이고 독립적으로 연관된 단면적 바이오마커를 나타냅니다.5,6
앞서 언급한 생물학적 특징 외에도, 유방암 발병으로 이어지는 유전적 변이의 역할이 최근 몇 년 동안 점점 더 중요해지고 있습니다.7 유방암의 약 10%는 특정 유전자의 생식세포 변이로 인해 유전됩니다.8 최근 18만 명 이상의 여성을 대상으로 한 두 건의 대규모 역학 연구에서 유전성 유방암의 주요 원인 유전자 8개(ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C, RAD51D)가 확인되었습니다. 이 유전자들 중 BRCA1과 BRCA2(이하 BRCA1/2)는 유방암 발병과 가장 강한 상관관계를 보였습니다.9-12 실제로 생식세포 BRCA1/2 돌연변이는 유방암뿐만 아니라 난소암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 흑색종을 포함한 다른 악성 종양의 평생 발병 위험을 크게 증가시킵니다. 13세부터 80세까지, BRCA1 병원성 변이(PV)를 가진 여성의 유방암 누적 발생률은 72%이고, BRCA2 PV를 가진 여성의 누적 발생률은 69%입니다.14
특히 최근 발표된 연구에 따르면 유방암 위험은 PV 유형에 따라 달라집니다. 실제로 병원성 절단 변이와 비교했을 때, 특히 BRCA1 유전자의 심각한 미스센스 변이는 유방암 위험 감소와 관련이 있으며, 특히 고령 여성에서 이러한 경향이 두드러집니다.15
BRCA1 또는 BRCA2 PV의 존재는 다양한 생물학적 및 임상병리학적 특징과 관련이 있습니다.16,17 BRCA1 관련 유방암은 임상적으로 공격적이고 분화도가 낮으며 증식성이 높은 경향이 있습니다. 이러한 종양은 일반적으로 삼중 음성이고 발병 연령이 빠릅니다. BRCA2 돌연변이 환자에서 발생하는 종양은 일반적으로 중등도에서 양호한 분화도를 보이며 증식 지수가 다양합니다. 이러한 종양은 루멘 B에서 더 흔하며 일반적으로 고령층에서 발생합니다.16-18 특히, BRCA1 및 BRCA2 돌연변이는 백금염 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소 억제제(PARPi)와 같은 표적 치료제를 포함한 특정 치료에 대한 민감도를 증가시킵니다.19,20
지난 몇 년간 차세대 염기서열 분석(NGS)이 임상에 도입되면서 유방암 환자들이 BRCA1/2를 포함한 암 유전적 소인 증후군에 대한 분자 검사를 받는 사례가 증가하고 있습니다.21 또한, 가족력, 인구통계학적 특성, 임상병리학적 특성에 대한 정확한 기준에 기반한 정의를 통해 BRCA1/2 검사가 필요한 환자를 더욱 정확하게 식별할 수 있게 되었습니다.22,23 이러한 맥락에서 특정 인구 집단에서의 BRCA1/2 스크리닝에 대한 연구 결과가 축적되고 있으며, 지역별 차이점도 밝혀지고 있습니다.24–27 서부 시칠리아의 유방암 환자 코호트에 대한 보고는 있지만, 동부 시칠리아 인구 집단의 BRCA1/2 스크리닝에 대한 자료는 상대적으로 부족합니다.28,29
본 연구에서는 시칠리아 동부 지역 유방암 환자를 대상으로 생식세포 BRCA1/2 유전자 검사 결과를 기술하고, BRCA1 또는 BRCA2 유전자 변이의 존재와 이러한 종양의 주요 임상병리학적 특징 간의 상관관계를 분석합니다.
본 연구는 카타니아의 로돌리코-산마르코 종합병원 내 "실험 종양학 및 혈액학 센터"에서 후향적 연구로 진행되었습니다. 2017년 1월부터 2021년 3월까지 유방암, 난소암, 흑색종, 췌장암 또는 전립선암 환자 총 455명이 BRCA/2 유전자 검사를 위해 본 분자 진단 연구실에 의뢰되었습니다. 본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 모든 참가자는 분자 분석 전에 서면 동의서를 제출했습니다.
유방암의 조직학적 및 생물학적 특성(ER, PgR, HER2 상태, Ki-67 및 등급)은 공격적인 종양 성분만을 고려하여 코어 생검 또는 수술 검체에서 평가되었습니다. 이러한 특성을 바탕으로 유방암은 다음과 같이 분류되었습니다: 루미널 A(ER+ 및/또는 PgR+, HER2-, Ki-67<20%), 루미널 B(ER+ 및/또는 PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), 루미널 B-HER2+(ER 및/또는 PgR+, HER2+), HER2+(ER 및 PgR-, HER2+) 또는 삼중 음성(ER 및 PgR-, HER2-).
BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 상태를 평가하기 전에 종양 전문의, 유전학자, 심리학자를 포함한 다학제 팀이 각 환자에 대해 종양 유전학 상담을 실시하여 BRCA1 및/또는 BRCA2 유전자의 PV 고위험군 여부를 확인했습니다. 환자 선정은 이탈리아 종양학회(AIOM) 지침 및 시칠리아 지역 권고 사항에 따라 수행되었습니다.30,31 이러한 기준에는 다음이 포함됩니다. (i) 감수성 유전자(예: BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN)의 알려진 병원성 변이의 가족력; (ii) 유방암 남성; (iii) 유방암 및 난소암 환자; (iv) 36세 미만 유방암, 60세 미만 삼중음성 유방암 또는 50세 미만 양측성 유방암 여성; (v) 50세 미만 유방암 병력 및 최소 한 명의 1촌 친척: (a) 50세 미만 유방암; (b) 모든 연령대의 비점액성 및 비경계성 난소암; (c) 양측성 유방암; (d) 남성 유방암; (e) 췌장암; (f) 전립선암; (vi) 50세 이상 유방암 병력이 두 개 이상이고, 직계 가족(본인과 직계 가족인 친척 포함) 중 유방암, 난소암 또는 췌장암 병력이 두 개 이상 있는 경우; (vii) 본인에게 난소암 병력이 있고 직계 가족 중 한 명 이상에게 난소암이 있는 경우: (a) 50세 미만 유방암; (b) 비점액성 난소암; (c) 양측성 유방암; (d) 남성 유방암; (vii) 고등급 장액성 난소암을 가진 여성.
각 환자로부터 20mL의 말초혈액을 채취하여 EDTA 튜브(BD Biosciences)에 담았습니다. 0.7mL의 전혈 샘플에서 QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit(QIAGEN, Hilden, Italy)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리하고, Qubit® 3.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 정량 분석을 수행했습니다. 표적 유전자 증폭 및 라이브러리 준비는 Oncomine™ BRCA Research Assay Chef를 사용하여 수행되며, 제조사 지침에 따라 자동 라이브러리 준비를 위해 Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit에 로드할 준비가 됩니다. 이 키트는 모든 BRCA1(NM_007300.3) 및 BRCA2(NM_000059.3) 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있는 두 개의 멀티플렉스 PCR 프라이머 풀로 구성됩니다. 간단히 설명하면, 희석된 각 샘플 DNA(10 ng) 15 µL를 라이브러리 준비를 위해 바코드 플레이트에 첨가하고 모든 시약과 소모품을 Ion Chef™ 기기에 로드했습니다. 그런 다음 Ion Chef™ 기기에서 자동 라이브러리 준비 및 바코드 샘플 라이브러리 풀링을 수행했습니다. 준비된 라이브러리 수는 제조사 지침에 따라 Qubit® 3.0 형광계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 측정했습니다. 마지막으로, 라이브러리는 Ion Chef™ 라이브러리 샘플 튜브에서 등몰비로 혼합됩니다. (바코드가 부착된 튜브에) 시료를 담아 Ion Chef™ 기기에 장착하였다. 시퀀싱은 Ion Torrent S5(Thermo Fisher Scientific) 기기와 Ion 510 칩(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은 Amplicon Suite(SmartSeq srl) 및 Ion Reporter 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
모든 변이 명명법은 온라인에서 확인할 수 있는 인간 게놈 변이 컨소시엄(HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen)의 최신 지침을 따랐습니다. BRCA1/2 변이의 임상적 중요성은 국제 컨소시엄 ENIGMA(Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/)의 분류 체계를 사용하고 ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD, UMD 등의 다양한 데이터베이스를 참고하여 정의했습니다. 이 분류 체계는 양성(범주 I), 양성 가능성 높음(범주 II), 임상적 중요성 불확실 변이(VUS, 범주 III), 병원성 가능성 높음(범주 IV), 병원성(범주 V)의 다섯 가지 위험 범주로 구성됩니다. VarSome은 또한 30개의 데이터베이스에 접근할 수 있는 유용한 도구로서 단백질 구조 및 기능에 대한 돌연변이의 영향을 분석했습니다.32
각 VUS에 잠재적인 임상적 중요성을 부여하기 위해 다음과 같은 단백질 예측 알고리즘을 사용했습니다: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT(http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2(http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) 및 Align-GVGD(http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). 1등급 및 2등급으로 분류된 변이는 야생형으로 간주했습니다.
Sanger 시퀀싱을 통해 각 병원성 변이체의 존재를 확인했습니다. 간단히 설명하면, BRCA1 및 BRCA2 유전자 참조 서열(각각 NG_005905.2, NM_007294.3 및 NG_012772.3, NM_000059.3)을 이용하여 검출된 각 변이체에 대한 특이적 프라이머 쌍을 설계했습니다. 따라서 표적 PCR을 수행한 후 Sanger 시퀀싱을 진행했습니다.
BRCA1/2 유전자 검사에서 음성으로 나온 환자들은 제조사의 지침에 따라 다중 연결 의존형 프로브 증폭(MLPA) 검사를 받아 대규모 유전체 재배열(LGR)의 존재 여부를 평가했습니다. 간단히 설명하면, DNA 샘플을 변성시킨 후 최대 60개의 BRCA1 및 BRCA2 유전자 특이적 프로브를 사용하는데, 각 프로브는 약 60개 뉴클레오티드 길이의 특정 DNA 서열을 검출합니다. 고유한 PCR 증폭산물 세트로 구성된 프로브 증폭 산물은 모세관 전기영동과 Cofalyser.Net 소프트웨어(www.mrcholland.com)를 사용하여 해당 배치별 Cofalyser 표와 함께 분석했습니다.
선택된 임상병리학적 변수(조직학적 등급 및 Ki-67% 증식 지수)는 BRCA1/2 PV의 존재와 연관성을 보였으며, 이는 Prism 소프트웨어 v. 8.4를 사용하여 Fisher의 정확 검정으로 계산되었고, p값 <0.05를 유의미한 것으로 가정했습니다.
2017년 1월부터 2021년 3월까지 455명의 환자를 대상으로 생식세포 BRCA1/2 유전자 변이 검사를 시행했습니다. 변이 검사는 카타니아-산마르코 종합병원 실험 종양학 및 혈액학 센터에서 진행되었습니다. 시칠리아 지침(http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, 2020년 1월 10일 금요일자 02호)에 따라, 카타니아-산마르코 종합병원에서는 총 389명의 환자 중 유방암, 37명의 환자에서 난소암, 16명의 환자에서 췌장암, 8명의 환자에서 전립선암, 5명의 환자에서 흑색종이 확인되었습니다. 암 종류별 환자 분포 및 분석 결과는 그림 1에 제시되어 있습니다.
그림 1은 연구 개요를 보여주는 흐름도입니다. 유방암, 흑색종, 췌장암, 전립선암 또는 난소암 환자를 대상으로 BRCA1 및 BRCA2 유전자 변이 검사를 실시했습니다.
약어: PVs, 병원성 변이; VUS, 임상적 중요성이 불확실한 변이; WT, 야생형 BRCA1/2 서열.
본 연구에서는 유방암 환자 코호트를 선별적으로 선정하여 연구를 진행했습니다. 환자들의 평균 연령은 49세(범위 23~89세)였으며, 대부분 여성(n=376, 97%)이었습니다.
이 연구 대상자 중 64명(17%)은 BRCA1/2 유전자 변이를 가지고 있었고 모두 여성이었습니다. 35명(9%)은 PV(진행성 질환)를, 29명(7.5%)은 VUS(임상적 중요성이 불확실한 변이)를 가지고 있었습니다. 35개의 병원성 변이 중 17개(48.6%)는 BRCA1에서, 18개(51.4%)는 BRCA2에서 발생했으며, VUS는 5개(17.2%)가 BRCA1에서, 24개(82.8%)가 BRCA2에서 발생했습니다(그림 1 및 2). LGR은 MLPA 분석에서 나타나지 않았습니다.
그림 2. 유방암 환자 389명에서 BRCA1 및 BRCA2 유전자 변이 분석. (A) 유방암 환자 389명에서 병원성 변이(PV)(빨간색), 임상적 중요성이 불확실한 변이(VUS)(주황색), 야생형(WT)(파란색)의 분포; (B) 유방암 환자 389명 중 35명(9%)에서 BRCA1/2 병원성 변이(PV)가 발견되었다. 이 중 17명(48.6%)은 BRCA1 PV 보유자(진한 빨간색)였고, 18명(51.4%)은 BRCA2 보유자(옅은 빨간색)였다. (C) 389명 중 29명(7.5%)에서 VUS가 발견되었으며, 이 중 5명(17.2%)은 BRCA1 유전자(진한 주황색)를, 24명(82.8%)은 BRCA2 유전자(옅은 주황색)를 보유했다.
약어: PVs, 병원성 변이; VUS, 임상적 중요성이 불확실한 변이; WT, 야생형 BRCA1/2 서열.
다음으로 BRCA1/2 PV 환자에서 유방암 분자 아형의 유병률을 조사했습니다. 분포는 루미널 A 2명(5.7%), 루미널 B 15명(42.9%), 루미널 B-HER2+ 3명(8.6%), HER2+ 2명(5.7%), 삼중 음성 유방암(TNBC) 13명(37.1%)이었습니다. BRCA1 양성 환자 중 5명(29.4%)은 루미널 B 유방암, 2명(11.8%)은 HER2+ 유방암, 10명(58.8%)은 TNBC였습니다. BRCA1 변이가 없는 종양은 루미널 A 또는 루미널 B-HER2+였습니다(그림 3). BRCA2 양성 하위 그룹에서는 10명(55.6%)의 종양이 루미널 B, 3명(16.7%)이 루미널 B-HER2+, 3명(16.7%)이 TNBC, 2명이 HER2+였습니다. (11.1%)는 루멘 A였습니다(그림 3). 이 그룹에는 HER2+ 종양이 없었습니다. 따라서 BRCA1 돌연변이는 TNBC 환자에서 흔하고, BRCA2 변이는 루멘 B 환자에서 우세합니다.
그림 3. BRCA1 및 BRCA2 병원성 변이를 가진 환자에서 유방암 아형의 유병률. 유방암 환자의 분자 아형별 BRCA1(진한 빨간색) 및 BRCA2(옅은 빨간색) 병원성 변이의 분포를 보여주는 히스토그램. 각 상자 안의 숫자는 각 유방암 아형에서 BRCA1 및 BRCA2 병원성 변이를 가진 환자의 비율을 나타냅니다.
약어: PVs, 병원성 변이; HER2+, 인간 상피 성장 인자 수용체 2 양성; TNBC, 삼중 음성 유방암.
이후, BRCA1 및 BRCA2 PV의 유형과 유전자 위치를 평가했습니다. BRCA1 PV에서는 7개의 단일 염기 변이(SNV), 6개의 결실, 3개의 중복 및 1개의 삽입이 관찰되었습니다. 단 하나의 돌연변이(c.5522delG)만이 새롭게 발견된 것입니다. 두 대상 모두에서 가장 흔하게 검출된 BRCA1 PV는 c.5035_5039delCTAAT였습니다. 이 변이는 BRCA1 엑손 15에서 5개의 염기(CTAAT)가 결실되어 1679번 코돈에서 아미노산 류신이 티로신으로 치환되고, 예측되는 대체 종결 코돈을 가진 번역 프레임 시프트로 인해 단백질이 조기에 절단됩니다. 다른 모든 변이는 각각 한 사례에서만 검출되었습니다. 특히, 보고된 PV 중 하나는 스플라이스 부위 컨센서스 영역(c.4357+1G>T)에 위치했습니다(표 1).
BRCA2 PV와 관련하여 6개의 결실, 6개의 단일 염기 변이(SNV) 및 2개의 중복을 관찰했습니다. 발견된 변이 중 새로운 것은 없었습니다. 세 가지 돌연변이가 우리 연구 대상 집단에서 반복적으로 나타났는데, c.428dup와 c.8487+1G>A는 3명의 대상자에서, c.5851_5854delAGTT는 2명의 대상자에서 관찰되었습니다. c.428dup 변이는 BRCA2 엑손 5에서 C 염기가 반복되는 것으로, 단축되고 기능이 없는 단백질을 암호화하는 것으로 예측됩니다. c.8487+1G>A 돌연변이는 BRCA2 인트론 19(± 1,2)의 인트론 영역에서 발생하며 스플라이싱 컨센서스 서열에 영향을 미쳐 스플라이싱 변화를 초래하고 비정상적이거나 단백질이 생성되지 않게 합니다. c.5851_5854delAGTT 병원성 변이는 코딩 엑손의 5851~5854번째 염기 위치에서 4개의 염기가 결실된 것입니다. BRCA2 유전자의 엑손 10에 위치하며, 예측되는 대체 종결 코돈(p.S1951WfsTer)을 갖는 번역 프레임 시프트를 유발합니다. 특히, 이전에 보고된 바와 같이, c.631G>A와 c.7008-2A>T 변이가 동일한 환자에서 모두 발견되었습니다.34 첫 번째 변이는 BRCA2 엑손 7의 아데노신(A)이 구아닌(G)을 포함하는 뉴클레오티드로 치환되어 211번 코돈에서 발린이 이소류신으로 바뀌는 것입니다. 이소류신은 매우 유사한 특성을 가진 아미노산입니다. 이 변화는 정상적인 mRNA 스플라이싱에 영향을 미칩니다. 두 번째 변이는 인트론 영역에 위치하며, BRCA2를 코딩하는 유전자의 엑손 13 이전에 이중 아데노신(A)이 티민(T)으로 치환되는 것을 유발합니다. c.7008-2A>T 변이는 길이가 다른 여러 전사체를 생성할 수 있습니다. 또한, BRCA2 PV 그룹에서 18개 변이 중 4개가 발견되었습니다. (22.2%)는 인트론이었다.
다음으로, BRCA1/2 유해 돌연변이를 기능 도메인과 단백질 결합 영역에 매핑했습니다(그림 4). BRCA1 유전자에서는 PV의 50%가 유방암 클러스터 영역(BCCR)에 위치했고, 22%는 난소암 클러스터 영역(OCCR)에 위치했습니다(그림 4A). BRCA2 PV에서는 변이의 35.7%가 BCCR 영역에, 42.8%가 OCCR에 위치했습니다(그림 4B). 다음으로, BRCA1 및 BRCA2 단백질 도메인 내에서 PV의 위치를 ​​평가했습니다. BRCA1 단백질의 경우, 루프 및 코일형 도메인에서 3개의 PV를, BRCT 도메인에서 2개의 돌연변이를 발견했습니다(그림 4A). BRCA2 단백질의 경우, 4개의 PV가 BRC 반복 도메인에 매핑되었고, 3개의 인트론 변이와 3개의 엑손 변이가 검출되었습니다. 올리고/올리고당 결합(OB) 및 타워(T) 도메인(그림 4B).
그림 4. BRCA1 및 BRCA2 단백질의 개략도 및 병원성 변이의 위치. 이 그림은 유방암 환자에서 BRCA1(A) 및 BRCA2(B) 병원성 변이의 분포를 보여줍니다. 엑손 돌연변이는 파란색으로, 인트론 변이는 주황색으로 표시되어 있습니다. 막대 높이는 환자 수를 나타냅니다. BRCA1 및 BRCA2 단백질과 그 기능적 도메인이 보고되었습니다. (A) BRCA1 단백질은 루프 도메인(RING)과 핵 위치 결정 서열(NLS), 코일형 도메인, SQ/TQ 클러스터 도메인(SCD), 그리고 BRCA1 C-말단 도메인(BRCT)을 포함합니다. (B) BRCA2 단백질은 8개의 BRC 반복 서열, 나선형 도메인(Helical)을 포함하는 DNA 결합 도메인, 3개의 올리고뉴클레오티드/올리고당 결합(OB) 폴드, 타워 도메인(T), 그리고 C 말단에 NLS를 포함합니다. 이 영역은 유방암 클러스터 영역(Breast Cancer Cluster Region)이라고 불립니다. (BCCR) 및 난소암 클러스터 영역(OCCR)이 하단에 표시되어 있습니다.*정지 코돈을 결정하는 돌연변이를 나타냅니다.
우리는 BRCA1/2 PV의 존재와 관련될 수 있는 유방암의 임상병리학적 특징을 조사했습니다. BRCA1/2 음성 환자 181명(비보유자)과 모든 보유자(n=35)에 대한 완전한 임상 기록을 확보했습니다. 종양 증식 속도와 등급 사이에 상관관계가 있었습니다.
우리는 코호트의 중앙값(25%, 범위 <10-90%)을 기준으로 Ki-67 분포를 계산했습니다. Ki-67이 25% 미만인 대상자를 "낮은 Ki-67"로, 25% 이상인 대상자를 "높은 Ki-67"로 정의했습니다. BRCA1 PV 보인자와 비보인자 간에 유의미한 Ki-67 차이(p<0.01)가 발견되었습니다(그림 5A).
그림 5. BRCA1 및 BRCA2 PV 유무에 따른 유방암 여성 환자의 Ki-67과 등급 분포의 상관관계. (A) 181명의 비보유 유방암 환자와 BRCA1(18) 또는 BRCA2(17) PV 보유 환자의 Ki-67 중앙값을 나타내는 상자 그림. P값이 0.5 미만인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. (B) BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 상태(WT 대상, BRCA1 및 BRCA2 PV 보유자)에 따라 유방암 환자를 조직학적 등급 그룹(G2 및 G3)으로 분류한 것을 나타내는 히스토그램.
마찬가지로, 우리는 종양 등급이 BRCA1/2 PV의 존재와 상관관계가 있는지 조사했습니다. 우리 연구 대상에는 G1 BC가 없었으므로 환자를 두 그룹(G2 또는 G3)으로 나누었습니다. Ki-67 결과와 일관되게, 분석 결과 종양 등급과 BRCA1 돌연변이 사이에 통계적으로 유의미한 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, BRCA1 보유자에서 비보유자에 비해 G3 종양의 비율이 더 높았습니다(p<0.005) (그림 5B).
DNA 염기서열 분석 기술의 발전으로 BRCA1/2 유전자 검사가 전례 없는 발전을 이루었으며, 이는 암 가족력이 있는 환자들에게 매우 중요한 의미를 갖습니다. 현재까지 약 20,000개의 BRCA1/2 변이가 확인되었으며, 미국 유전학회(American Society of Medical Genetics)35 및 ENIGMA 시스템35,36에 따라 분류되었습니다. BRCA1/2 돌연변이 스펙트럼은 지역에 따라 크게 다르다는 것이 잘 알려져 있습니다.37 이탈리아 내에서도 BRCA1/2 PV(Primary Percentage) 발생률은 8%에서 37%까지 다양하게 나타나며, 국가 내에서도 큰 차이를 보입니다.38,39 인구 약 500만 명의 시칠리아는 이탈리아에서 다섯 번째로 인구가 많은 지역입니다. 시칠리아 서부 지역의 BRCA1/2 분포에 대한 자료는 존재하지만, 섬 동부 지역에 대한 광범위한 연구는 부족합니다.
우리의 연구는 동부 시칠리아의 유방암 환자에서 BRCA1/2 PV의 발생률에 대한 최초의 보고서 중 하나입니다.28 우리는 유방암에 대한 분석에 집중했는데, 이는 우리 코호트에서 가장 흔한 질병이기 때문입니다.
389명의 유방암 환자를 대상으로 검사한 결과, 9%에서 BRCA1/2 유전자 변이(PV)가 발견되었으며, BRCA1과 BRCA2 유전자 변이가 고르게 분포되어 있었습니다. 이러한 결과는 이전에 이탈리아 인구 집단에서 보고된 결과와 일치합니다.28 흥미롭게도, 연구 대상자의 3%(13/389)가 남성이었습니다. 이 비율은 남성 유방암(전체 유방암의 1%)에서 예상되는 비율보다 높은데,40 이는 BRCA1/2 유전자 변이 위험을 기준으로 연구 대상자를 선정했기 때문입니다. 그러나 이 남성 환자들 중 누구도 BRCA1/2 유전자 변이를 발견하지 못했으므로, PALB2, RAD51C 및 D 등과 같은 드문 유전자 변이의 존재 여부를 확인하기 위한 추가 분자 분석 대상이었습니다. BRCA2 유전자 변이가 확인된 대상자의 7%에서 임상적 중요성이 불확실한 변이(VUS)가 발견되었습니다. 이 결과 또한 기존 연구 결과와 일치합니다.28,41,42
BRCA1/2 변이 여성에서 유방암 분자 아형의 분포를 분석한 결과, 삼중 음성 유방암(TNBC)과 BRCA1 PV(58.8%), 그리고 루미널 B 유방암과 BRCA2 PV(55.6%) 사이의 기존 연관성을 확인했습니다.16,43 BRCA1 및 BRCA2 PV 보유자에서 루미널 A 및 HER2+ 종양이 나타나는 것은 기존 문헌 자료와 일치합니다.16,43
다음으로 BRCA1/2 PV의 유형과 위치에 초점을 맞추었습니다. 우리 코호트에서 가장 흔한 BRCA1 PV는 c.5035_5039delCTAAT였습니다. Incorvaia et al. 본 연구에서는 시칠리아 코호트에서 이 변이를 기술하지 않았지만, 다른 연구자들은 이를 생식세포 BRCA1 PV로 보고했습니다.34 저희 코호트에서도 여러 BRCA1 PV(예: c.181T>G, c.514del, c.3253dupA, c.5266dupC)가 발견되었는데, 이는 시칠리아에서 관찰된 바 있습니다.28 이 중 두 가지 BRCA1 창시자 돌연변이(c.181T>G 및 c.5266dupC)는 동유럽 및 중앙유럽(폴란드, 체코), 슬로베니아, 오스트리아, 헝가리, 벨라루스, 독일의 아슈케나지 유대인에게서 흔히 발견되며,44,45 미국과 아르헨티나에서는 최근 이탈리아 유방암 및 난소암 환자에서 "재발성 생식세포 변이"로 정의되었습니다. 34c.514del 변이는 이전에 시칠리아 북부 팔레르모와 메시나의 유방암 환자 8명에서 확인되었습니다. 흥미롭게도, Incorvaia et al.은 Catania의 일부 가족에서 c.3253dupA 변이를 발견했습니다.28 가장 대표적인 BRCA2 PV는 c.428dup, c.5851_5854delAGTT 및 인트론 변이인 c.8487+1G>A이며, 이는 c.428dup를 가진 Palermo의 환자에서 더 자세히 보고되었습니다.28 c.5851_5854delAGTT PV는 주로 Trapani 및 Palermo 지역을 포함한 시칠리아 북서부의 가구에서 관찰되었으며, c.5851_5854delAGTT PV는 시칠리아 북서부의 가구에서 관찰되었습니다. 8487+1G>A 변이는 Messina, Palermo 및 Caltanissetta 출신 대상자에서 더 흔했습니다.28 Rebbeck et al. 이전에 콜롬비아에서 c.5851_5854delAGTT 변이가 보고된 바 있다.37 또 다른 BRCA2 PV인 c.631+1G>A는 시칠리아(아그리젠토, 시라쿠사, 라구사)의 유방암 및 난소암 환자에서 발견되었다.28 특히, 우리는 동일 환자에서 두 가지 BRCA2 변이(BRCA2 c.631G>A 및 c.7008-2A>T)가 공존하는 것을 관찰했으며, 이는 이전에 보고된 바와 같이 시스(cis) 방식으로 분리되는 것으로 추정된다.34,46 이러한 BRCA2 이중 돌연변이는 실제로 이탈리아 지역에서 빈번하게 관찰되며, 조기 종결 코돈을 도입하여 메신저 RNA 스플라이싱에 영향을 미치고 BRCA2 단백질의 기능 부전을 초래하는 것으로 밝혀졌다.47,48
또한, 우리는 단백질 도메인과 유전자의 추정되는 OCCR 및 BCCR 영역에서 BRCA1 및 BRCA2 PV를 매핑했습니다. 이 영역들은 Rebbeck 등이 각각 난소암과 유방암 발병 위험 영역으로 설명한 바 있습니다.49 그러나 생식세포 변이의 위치와 유방암 또는 난소암 위험 사이의 연관성에 대한 증거는 여전히 논란의 여지가 있습니다.28,50-52 우리 연구 대상 집단에서 BRCA1 PV는 주로 BCCR 영역에 위치했고, BRCA2 PV는 주로 OCCR 영역에 위치했습니다. 하지만 추정되는 OCCR 및 BCCR 영역과 유방암 특징 사이의 연관성은 찾을 수 없었습니다. 이는 BRCA1/2 돌연변이를 가진 환자 수가 제한적이었기 때문일 수 있습니다. 단백질 도메인 관점에서 볼 때, BRCA1 PV는 단백질 전체에 분포되어 있으며, BRCA2 변이는 BRC 반복 도메인에서 우선적으로 발견됩니다.
마지막으로, 우리는 유방암의 임상병리학적 특징과 BRCA1/2 PV 사이의 상관관계를 분석했습니다. 포함된 환자 수가 제한적이었기 때문에 Ki-67과 종양 등급 사이에서만 유의미한 상관관계를 발견했습니다. Ki-67의 평가 및 해석은 여전히 ​​다소 논란의 여지가 있지만, 높은 증식률은 질병 재발 위험 증가 및 생존율 감소와 관련이 있다는 것은 분명합니다. 현재까지 "높음"과 "낮음" Ki-67을 구분하는 기준은 20%입니다. 그러나 이 기준은 Ki-67 중앙값이 25%인 BRCA1/2 변이 환자 집단에는 적용되지 않습니다. 이러한 높은 Ki-67 비율 경향은 루미널 B 및 삼중 음성 유방암(TNBC) 코호트에서 루미널 A 종양이 거의 없었기 때문으로 설명할 수 있습니다. 그러나 일부 연구에서는 더 높은 Ki-67 기준값(25~30%)이 환자의 예후에 따라 더 잘 분류할 수 있음을 시사합니다.53,54 본 분석 결과에서는 유의미한 상관관계가 발견되지 않았습니다. 놀랍게도, 높은 Ki-67 발현과 등급, 그리고 BRCA1 PV의 존재 사이에 발생합니다. 실제로 BRCA1 관련 종양은 TNBC의 전형적인 특징이며 더욱 공격적인 특성을 나타냅니다.16,17
결론적으로, 본 연구는 시칠리아 동부 지역 유방암 환자 코호트에서 BRCA1/2 유전자 변이 현황을 보고합니다. 전반적으로, 본 연구 결과는 유방암에서 변이 유병률 및 임상병리학적 특징 측면에서 기존 연구 결과와 일치합니다. BRCA1/2 변이 유방암 환자를 대상으로 다중 유전체 확장 변이 분석과 같은 더 많은 연구를 통해 BRCA1/2 변이와는 구별되고 빈도가 낮은 다른 유전자 변이(PV)의 존재를 평가할 필요가 있습니다. 이러한 연구를 통해 유전적 변이로 인해 암 발생 위험이 증가한 환자들을 조기에 식별하고 적절하게 관리할 수 있을 것입니다.
환자들이 연구 목적으로 종양 샘플을 익명으로 제공하는 데 대한 사전 동의서에 서명했음을 확인했습니다. 모든 환자는 헬싱키 선언에 따라 서면 동의서를 작성했습니다. AOU 폴리클리니코 "G.Rodolico – S.Marco"의 정책에 따라, BRCA1/2 분석은 임상 진료에 따라 수행되었고 모든 환자가 서면 동의서를 제출했으므로 본 연구는 윤리 심사에서 면제되었습니다. 환자들은 또한 연구 목적으로 자신의 데이터를 사용하는 데 동의했습니다.
윤리위원회의 요청에 따라 유방암 환자 치료에 도움을 주신 파올로 비녜리 교수님께 감사드립니다.
페데리카 마르토라나는 Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer로부터 강연료를 받았다고 밝혔습니다. 다른 저자들은 본 연구에서 이해 충돌이 없음을 선언합니다.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates the incidence and mortality of 36 cancers in 185 countries around the world. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660