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작곡 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 University of Clinical and Experimental Medicine 카타니아, 카타니아, 95123, 이탈리아;2 실험 종양학 및 혈액학 센터, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, 카타니아, 95123, 이탈리아; 3 의학 종양학, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, 카타니아, 95123, 이탈리아; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, 카타니아, 95123, 이탈리아; 5 의학유전학, ASP, 시러큐스, 96100, 이탈리아; 6 생물의학 및 생명공학과, 카타니아 대학교, 의학유전학, 카타니아, 이탈리아, 95123; 7Oasi Research Institute-IRCCS, 트로이나, 94018, 이탈리아 커뮤니케이션: Stefania Stella, 전화 +39 095 378 1946, 이메일 [email protected]; [email protected] 목적: BRCA1 및 BRCA2의 생식세포 돌연변이와 확립된 유방암(BC), 난소암(OC) 및 기타 평생 암 위험과 관련된 암.BRCA 유전자 검사는 개인 위험을 평가하는 데 중요하며 건강한 보균자의 예방 방법을 찾고 암 환자의 치료법을 맞춤화하는 데에도 중요합니다.BRCA1 및 BRCA2 변형의 유병률은 지리적 지역에 따라 크게 다르며 시칠리아 가족의 BRCA 병원성 변형에 대한 데이터가 있지만 동부 시칠리아 인구를 특별히 표적으로 삼은 연구는 부족합니다.이 연구의 목적은 동부 시칠리아의 BC 환자 코호트에서 BRCA 병원성 생식세포 변형의 발생률과 분포를 조사하고 차세대 시퀀싱을 사용하여 특정 BC 특성과의 연관성을 평가하는 것이었습니다.변형의 존재는 종양 등급 및 증식 지수와 상관 관계가 있었습니다.결과: 전체적으로 35명의 환자(9%)가 BRCA 병원성 변형을 가지고 있었고 17명(49%)은 BRCA1과 18 (51%) BRCA2에서.BRCA1 변형은 삼중 음성 BC 환자에게 널리 퍼져 있는 반면, BRCA2 돌연변이는 루미날 BC 환자에게 더 흔합니다.비보유자와 비교하여 BRCA1 변형을 가진 대상은 종양 등급과 증식 지수가 유의하게 높았습니다.결론: 우리의 연구 결과는 시칠리아 동부의 BC 환자의 BRCA 돌연변이 상태에 대한 개요를 제공하고 유전성 BC 환자를 식별하는 데 있어 NGS 분석의 역할을 확인합니다.전반적으로 이러한 데이터는 돌연변이 보유자의 암을 적절하게 예방하고 치료하기 위한 BRCA 스크리닝을 뒷받침하는 이전 증거와 일치합니다.
유방암(BC)은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양이며 여성에게 가장 치명적인 암입니다.1 BC 예후와 임상적 행동을 결정하는 생물학적 특징은 광범위하게 연구되었고 시간이 지남에 따라 부분적으로 밝혀졌습니다.사실, 현재 여러 대용 마커가 BC를 다른 분자적 하위 유형으로 분류하는 데 사용됩니다.이러한 하위 유형은 에스트로겐(ER) 및/또는 프로게스테론 수용체(PgR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2) 증폭, 증식 지수 Ki-67 및 종양 등급(G)입니다.2 이러한 변수의 조합은 다음과 같은 BC 범주를 식별했습니다.1) ER 및/또는 PgR 발현을 보이는 루미날 종양은 BC의 75%를 차지했습니다.이러한 종양은 Ki-67이 20% 미만이고 HER2가 음성인 루미날 A와 증식 지수에 관계없이 Ki-67이 20% 이상이고 HER2 증폭이 있는 루미날 B로 세분되었습니다. 2) ER 및 PgR 음성이지만 HER2 증폭을 보이는 HER2+ 종양. 이 그룹은 전체 유방 종양의 10%를 차지합니다. 3) ER 및 PgR 발현과 HER2 증폭을 보이지 않는 삼중 음성 유방암(TNBC)은 유방암의 약 15%를 차지합니다.2-4
이러한 BC 하위 유형 중 종양 등급 및 증식 지수는 종양 공격성 및 예후와 직접적이고 독립적으로 관련된 단면적 바이오마커를 나타냅니다.5,6
앞서 언급한 생물학적 특징 외에도 BC의 발병으로 이어지는 유전적 변형의 역할은 지난 몇 년 동안 점점 더 중요해졌습니다.7 약 10개의 유방 종양 중 1개는 특정 유전자의 생식 세포 변형으로 인해 유전됩니다.8 180,000명 이상의 여성을 대상으로 한 두 건의 대규모 역학 연구에서 최근 유전성 BC에 주로 책임이 있는 8개의 유전자(예: ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C 및 RAD51D) 그룹을 확인했습니다. 이러한 유전자 중 BRCA1 및 BRCA2(이하 BRCA1/2)는 유방 종양 발병과 가장 강력한 상관 관계를 보였습니다.9-12 실제로 생식 세포 BRCA1/2 돌연변이는 난소, 전립선, 췌장, 대장 및 흑색종을 포함한 다른 악성 종양뿐만 아니라 BC의 평생 위험을 크게 증가시킵니다.13세에서 80세까지 BRCA1 병원성 변이(PV)가 있는 여성의 경우 BC 누적 발병률은 72%이고 BRCA2 PV가 있는 여성의 경우 69%입니다.14
주목할 만한 것은 최근 간행물에 따르면 BC 위험은 PV 유형에 따라 달라진다는 것입니다. 실제로 병원성 절단 변이와 비교했을 때, 특히 BRCA1 유전자의 눈에 띄는 미스센스 변이는 특히 노년 여성의 경우 BC 위험 감소와 관련이 있습니다.15
BRCA1 또는 BRCA2 PV의 존재는 다양한 생물학적 및 임상병리학적 특징과 관련이 있었습니다.16,17 BRCA1 관련 유방암은 임상적으로 공격적이고, 분화도가 낮으며, 증식성이 높은 경향이 있습니다. 이러한 종양은 일반적으로 삼중 음성이며 조기에 발생합니다. BRCA2 돌연변이 환자에서 발생하는 종양은 일반적으로 중등도에서 고분화도의 등급과 다양한 증식 지표를 보입니다. 이러한 종양은 루멘 B에서 더 흔하며 일반적으로 고령자에게 발생합니다.16-18 특히 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이는 백금염 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소 억제제(PARPi)와 같은 표적 약물을 포함한 특정 치료에 대한 민감도를 증가시킵니다.19,20
지난 몇 년 동안 임상 실무에서 차세대 시퀀싱(NGS)을 구현함으로써 점점 더 많은 BC 환자가 BRCA1/221를 포함한 암 감수성 증후군에 대한 분자 검사를 받을 수 있게 되었습니다. 동시에 가족력, 인구 통계학적 및 임상 병리학적 특성에 대한 정확한 기준에 기반한 정의를 통해 BRCA1/2 검사에 적합한 개인을 더 잘 식별할 수 있습니다. 이러한 맥락에서 특정 인구에서 BRCA1/2 스크리닝에 대한 증거가 축적되고 있으며, 이는 지역 간 차이점을 강조합니다. 서부 시칠리아의 BC 코호트에 대한 보고가 있지만 동부 시칠리아 인구에서 BRCA1/2 스크리닝에 대한 데이터는 적습니다.
여기서는 동부 시칠리아의 BC 환자를 대상으로 실시한 생식 세포 BRCA1/2 스크리닝 결과를 설명하고, 이러한 종양의 주요 임상병리학적 특징과 BRCA1 또는 BRCA2 돌연변이의 존재 여부를 더욱 연관시킵니다.
카타니아의 로돌리코-산 마르코에 있는 폴리클리니코 병원의 "실험 종양학 및 혈액학 센터"에서 후향적 연구가 수행되었습니다. 2017년 1월부터 2021년 3월까지 유방암, 난소암, 흑색종, 췌장암 또는 전립선암을 앓고 있는 총 455명의 환자가 BRCA/2 유전자 검사를 위해 분자 진단 실험실로 의뢰되었습니다. 이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 모든 참가자는 분자 분석 전에 서면으로 정보 제공에 대한 동의를 제공했습니다.
BC의 조직학적 및 생물학적 특성(ER, PgR, HER2 상태, Ki-67 및 등급)은 공격적인 종양 성분만을 고려하여 핵심 생검 또는 수술 샘플에서 평가되었습니다. 이러한 특성을 기반으로 BC는 다음과 같이 분류되었습니다. 루미날 A(ER+ 및/또는 PgR+, HER2-, Ki-67<20%), 루미날 B(ER+ 및/또는 PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), 루미날 B-HER2+(ER 및/또는 PgR+, HER2+), HER2+(ER 및 PgR-, HER2+) 또는 삼중 음성(ER 및 PgR-, HER2-).
BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 상태를 평가하기 전에 종양학자, 유전학자, 심리학자를 포함한 다학제 팀이 각 환자에 대해 종양 유전학 상담을 실시하여 BRCA1 및/또는 BRCA1의 존재 또는 BRCA2 유전자에 PV의 고위험이 있는 개인을 확인했습니다.환자 선택은 이탈리아 의학 종양학회(AIOM) 지침 및 현지 시칠리아 권장 사항에 따라 수행되었습니다.30,31 이러한 기준에는 다음이 포함됩니다.(i) 감수성 유전자의 알려진 병원성 변형(예: BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN)의 가족력;(ii) BC가 있는 남성;(iii) BC와 OC가 있는 여성;(iv) BC <36세, TNBC <60세 또는 양측 BC <50세인 여성;(v) BC <50세의 개인 병력 및 최소 한 명의 1촌 친척:(a) BC <50세; (b) 모든 연령대의 비점액성 및 비경계성 OC; (c) 양측성 유방암; (d) 남성 유방암; (e) 췌장암; (f) 전립선암; (vi) 서로 1급 친척인 친척 중 2명 이상이 50년 이상 유방암의 개인 병력이 있고, 서로 1급 친척인 친척의 경우 BC, OC 또는 췌장암의 가족력이 있는 경우(그녀와 1급 친척인 친척 포함); (vii) OC의 개인 병력과 최소 1명의 1급 친척: (a) 50년 미만의 BC; (b) NOC; (c) 양측성 유방암; (d) 남성 유방암; (vii) 고등급 漿液性 OC가 있는 여성.
각 환자로부터 20mL의 말초혈액 샘플을 채취하여 EDTA 튜브(BD Biosciences)에 모았습니다. 제조업체의 지침에 따라 QIAsymphony DSP DNA Midi 키트 분리 키트(QIAGEN, Hilden, Italy)를 사용하여 0.7mL의 전혈 샘플에서 게놈 DNA를 분리하고 Qubit® 3.0 형광계(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통과시켜 정량화를 수행했습니다. 타겟 농축 및 라이브러리 준비는 Oncomine™ BRCA Research Assay Chef를 통해 수행되며, 제조업체의 지침에 따라 자동 라이브러리 준비를 위해 Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit에 로드할 준비가 되었습니다. 이 키트는 모든 BRCA1(NM_007300.3) 및 BRCA2(NM_000059.3) 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있는 두 개의 멀티플렉스 PCR 프라이머 풀로 구성됩니다. 간단히 말해서, 각 희석된 샘플 DNA(10 ng) 15 µL를 라이브러리 준비를 위해 바코드가 찍힌 플레이트에 첨가했고 모든 시약과 소모품을 Ion Chef™ 기기에 로드했습니다. 그런 다음 자동 라이브러리 준비 및 바코드가 찍힌 샘플 라이브러리 풀링을 Ion Chef™ 기기에서 수행했습니다. 준비된 라이브러리의 수는 제조업체의 지침에 따라 Qubit® 3.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통해 평가했습니다. 마지막으로 라이브러리는 Ion Chef™ 라이브러리에서 등몰 비율로 결합되었습니다. 샘플 튜브(바코드 튜브)를 Ion Chef™ 기기에 장착했습니다. 시퀀싱은 Ion Torrent S5(Thermo Fisher Scientific) 기기(Thermo Fisher Scientific)와 Ion 510 칩(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행했습니다. 데이터 분석은 Amplicon Suite(SmartSeq srl)와 Ion Reporter 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다.
모든 변이체 명명법은 온라인에서 제공되는 인간 게놈 변이 컨소시엄(HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen)의 현재 가이드라인을 따랐습니다.BRCA1/2 변이체의 임상적 유의성은 국제 컨소시엄 ENIGMA(Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/)의 분류를 사용하고 ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD, UMD와 같은 다양한 데이터베이스를 참조하여 정의했습니다.분류에는 양성(범주 I), 양성일 가능성이 높음(범주 II), 유의성 불확실 변이체(VUS, 범주 III), 병원성일 가능성이 높음(범주 IV), 병원성(범주 V)의 다섯 가지 위험 범주가 포함됩니다.VarSome은 또한 30개의 데이터베이스에 액세스할 수 있는 유익한 도구인 단백질 구조와 기능에 대한 돌연변이의 영향을 분석했습니다.32
각 VUS에 잠재적인 임상적 중요성을 할당하기 위해 다음과 같은 계산 단백질 예측 알고리즘이 사용되었습니다: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT(http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2(http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) 및 Align-GVGD(http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). 클래스 1 및 2로 분류된 변이체는 야생형으로 간주되었습니다.
샌거 시퀀싱을 통해 각 병원성 변이체의 존재가 확인되었습니다. 간단히 말해, BRCA1 및 BRCA2 유전자 참조 서열(각각 NG_005905.2, NM_007294.3 및 NG_012772.3, NM_000059.3)을 사용하여 검출된 각 변이체에 대한 특정 프라이머 쌍을 설계했습니다. 따라서 샌거 시퀀싱에 이어 표적 PCR을 수행했습니다.
BRCA1/2 유전자에 대한 음성 반응이 나온 환자는 제조업체의 지침에 따라 멀티플렉스 결찰 의존성 프로브 증폭(MLPA) 검사를 통해 대규모 게놈 재배열(LGR)의 존재 여부를 평가했습니다. 간략히 설명하면, DNA 샘플을 변성시키고 최대 60개의 BRCA1 및 BRCA2 유전자 특이적 프로브를 사용하는데, 각각은 약 60개 뉴클레오티드 길이의 특정 DNA 서열을 검출합니다. 고유한 PCR 앰플리콘 세트로 구성된 프로브 증폭 산물은 모세관 전기영동과 Cofalyser.Net 소프트웨어와 적절한 배치별 Cofalyser 표(www.mrcholland.com)를 함께 사용하여 분석했습니다.
선택된 임상병리학적 변수(조직학적 등급 및 Ki-67% 증식 지수)는 BRCA1/2 PV의 존재와 관련이 있었으며, 이는 p값 <0.05를 유의미하다고 가정하고 Fisher의 정확 검정을 사용하여 Prism 소프트웨어 v. 8.4를 사용하여 계산되었습니다.
2017년 1월부터 2021년 3월까지 455명의 환자를 대상으로 생식세포 BRCA1/2 돌연변이 검사를 시행했습니다. 돌연변이 검사는 폴리클리니코 병원 실험종양학 및 혈액학 센터에서 시행했습니다. 시칠리아 가이드라인(http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020)에 따라, 카타니아-산마르코 호돌리코 병원(Rodolico of Catania-San Marco)에서는 총 389명의 환자를 대상으로 유방암, 난소암 37명, 췌장암 16명, 전립선암 8명, 흑색종 5명을 대상으로 검사를 시행했습니다. 암 유형별 환자 분포 및 분석 결과는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1은 연구 개요를 보여주는 흐름도를 보여줍니다. 유방암, 흑색종, 췌장암, 전립선암 또는 난소암이 있는 환자들을 대상으로 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이 검사를 실시했습니다.
약어: PV, 병원성 변이체; VUS, 중요성이 불확실한 변이체; WT, 야생형 BRCA1/2 서열.
우리는 유방암 코호트에 선택적으로 연구를 집중했습니다. 환자의 중앙 연령은 49세(범위 23-89세)였고, 주로 여성이었습니다(n=376, 또는 97%).
이들 대상자 중 64명(17%)은 BRCA1/2 돌연변이를 가지고 있었고 모두 여성이었습니다.35명(9%)은 PV를 가지고 있었고 29명(7.5%)은 VUS를 가지고 있었습니다.35개 병원성 변이체 중 17개(48.6%)는 BRCA1에서 발생했고 18개(51.4%)는 BRCA2에서 발생했으며, VUS는 5개(17.2%)는 BRCA1에서 발생했고 24개(82.8%)는 BRCA2에서 발생했습니다(그림 1 및 2).MLPA 분석에는 LGR이 존재하지 않았습니다.
그림 2. 389명의 유방암 환자를 대상으로 한 BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 분석.(A) 389명의 유방암 환자를 대상으로 한 병원성 변이체(PV)(빨간색), 유의성 불확실 변이체(VUS)(주황색), WT(파란색)의 분포.(B) 389명의 유방암 환자 35명(9%)이 BRCA1/2 병원성 변이체(PV)를 가지고 있었습니다.그 중 17명(48.6%)은 BRCA1 PV 보유자(짙은 빨간색)였고 18명(51.4%)은 BRCA2 보유자(연한 빨간색)였습니다.(C) 389명의 대상 중 29명(7.5%)은 VUS를 가지고 있었고, 5명(17.2%)은 BRCA1 유전자(짙은 주황색)를 가지고 있었고, 24명(82.8%)은 BRCA2 유전자(연한 주황색)를 가지고 있었습니다.
약어: PV, 병원성 변이체; VUS, 중요성이 불확실한 변이체; WT, 야생형 BRCA1/2 서열.
다음으로 우리는 BRCA1/2 PV가 있는 환자에서 BC 분자 하위 유형의 유병률을 조사했습니다. 분포에는 2명(5.7%)의 루미날 A, 15명(42.9%)의 루미날 B, 3명(8.6%)의 루미날 B-HER2+, 2명(5.7%)의 HER2+ 및 13명(37.1%)의 TNBC 환자가 포함되었습니다. BRCA1 양성 환자 중 5명(29.4%)은 루미날 B BC, 2명(11.8%)은 HER2+ 질환, 10명(58.8%)은 TNBC였습니다. BRCA1 돌연변이가 없는 종양은 루미날 A 또는 루미날 B-HER2+였습니다(그림 3). BRCA2 양성 하위 그룹에서 10명(55.6%)의 종양은 루미날 B, 3명(16.7%)은 루미날 B-HER2+, 3명(16.7%)은 TNBC 및 2명이었습니다. (11.1%)은 루멘 A였습니다(그림 3). 이 그룹에는 HER2+ 종양이 존재하지 않았습니다. 따라서 BRCA1 돌연변이는 TNBC 환자에게 널리 퍼져 있는 반면 BRCA2 변형은 루멘 B 개인에게 우세합니다.
그림 3 BRCA1 및 BRCA2에 병원성 변이가 있는 환자의 유방암 하위 유형의 유병률. 유방암 환자의 분자 하위 유형 중 BRCA1-(짙은 빨간색) 및 BRCA2-(연한 빨간색) PV의 분포를 보여주는 히스토그램. 각 상자 내에 보고된 숫자는 각 유방암 하위 유형에 대한 BRCA1 및 BRCA2 PV가 있는 환자의 백분율을 나타냅니다.
약어: PV, 병원성 변이형; HER2+, 인간 상피 성장 인자 수용체 2 양성; TNBC, 삼중 음성 유방암.
그 후, 우리는 BRCA1과 BRCA2 PV의 유형과 유전자 국소화를 평가했습니다.BRCA1 PV에서 우리는 7개의 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 6개의 결손, 3개의 중복 및 1개의 삽입을 관찰했습니다.단 하나의 돌연변이(c.5522delG)만이 새로운 발견을 나타냅니다.두 대상 모두에서 감지된 가장 흔한 BRCA1 PV는 c.5035_5039delCTAAT였습니다.이 변형은 BRCA1 엑손 15에서 5개의 뉴클레오티드(CTAAT)가 결손되어 코돈 1679에서 아미노산 류신이 티로신으로 대체되고 예측된 대체 종료 코돈으로 인한 번역 프레임시프트로 인해 조기 단백질 절단이 발생했습니다.다른 모든 변화는 단 하나의 사례에서만 감지되었습니다.주목할 만한 점은 보고된 PV 중 하나가 스플라이스 부위 합의 영역(c.4357+1G>T)에 위치해 있다는 것입니다(표 1).
BRCA2 PV와 관련하여 6개의 삭제, 6개의 SNV 및 2개의 중복을 관찰했습니다. 발견된 변화 중 새로운 것은 없습니다. 우리 집단에서 3개의 돌연변이가 재발했으며, 3명의 피험자에서 c.428dup 및 c.8487+1G>A가 관찰되었고, 그 후 2건에서 c.5851_5854delAGTT가 검색되었습니다. c.428dup 변형은 BRCA2의 엑손 5에서 C의 반복을 포함하며, 잘린 비기능성 단백질을 인코딩하는 것으로 예측됩니다. c.8487+1G>A 돌연변이는 BRCA2 인트론 19(± 1,2)의 인트론 영역에서 발생하고 스플라이싱 합의 시퀀스에 영향을 미쳐 변형된 스플라이싱을 초래하여 비정상적이거나 결여된 단백질을 생성합니다. c.5851_5854delAGTT 병원성 변이는 5851에서 5854까지의 뉴클레오티드 위치에서 4개의 뉴클레오티드가 삭제되어 발생합니다. BRCA2 유전자의 엑손 10을 코딩하고 예측된 대체 종료 코돈(p.S1951WfsTer)을 갖는 번역 프레임시프트를 초래합니다. 주목할 점은 이전에 보고된 바와 같이 c.631G>A 및 c.7008-2A>T 두 가지 변형이 동일한 환자에서 검출되었습니다.34 첫 번째 돌연변이는 BRCA2 엑손 7의 아데노신(A)이 구아닌(G)을 포함하는 뉴클레오티드로 대체되어 코돈 211에서 발린이 이소류신으로 변화하는 것을 포함합니다. 이소류신 아미노산은 매우 유사한 특성을 가진 아미노산입니다. 이 변화는 정상적인 mRNA 스플라이싱에 영향을 미칩니다. 두 번째 변형은 인트론 영역에 위치하며 BRCA2를 코딩하는 유전자의 엑손 13 앞에서 이중 A가 티민(T)으로 치환됩니다. c.7008-2A>T 변화는 길이가 다른 여러 전사체를 생성할 수 있습니다. 또한 BRCA2 PV 그룹에서 18개의 변화(22.2%)가 인트론적이었습니다.
그런 다음 기능적 도메인과 단백질 결합 영역에서 BRCA1/2 유해 돌연변이를 매핑했습니다(그림 4).BRCA1 유전자에서 PV의 50%가 유방암 클러스터 영역(BCCR)에 위치했고 돌연변이의 22%가 난소암 클러스터 영역(OCCR)에 위치했습니다(그림 4A).BRCA2 PV에서 변형의 35.7%가 BCCR 영역에 위치했고 돌연변이의 42.8%가 OCCR에 위치했습니다(그림 4B).다음으로 BRCA1 및 BRCA2 단백질 도메인 내에서 PV의 위치를 ​​평가했습니다.BRCA1 단백질의 경우 루프 및 코일형 코일 도메인에서 3개의 PV를 발견했고 BRCT 도메인에서 2개의 돌연변이를 발견했습니다(그림 4A).BRCA2 단백질의 경우 4개의 PV가 BRC 반복 도메인에 매핑되었고 3개의 인트론 및 3개의 엑손 변화가 감지되었습니다. 올리고/올리고당 결합(OB) 및 타워(T) 도메인(그림 4B).
그림 4 BRCA1 및 BRCA2 단백질과 병원성 변이체의 국소화에 대한 개략적 표현. 이 그림은 유방암 환자에서 BRCA1(A) 및 BRCA2(B) 병원성 변이체의 분포를 보여줍니다. 엑손 돌연변이는 파란색으로, 인트론 변이는 주황색으로 표시했습니다. 막대 높이는 사례 수를 나타냅니다. BRCA1 및 BRCA2 단백질과 그 기능적 도메인이 보고되었습니다. (A) BRCA1 단백질은 루프 도메인(RING)과 핵 국소화 서열(NLS), 코일형 코일 도메인, SQ/TQ 클러스터 도메인(SCD) 및 BRCA1 C 말단 도메인(BRCT)을 포함합니다. (B) BRCA2 단백질은 8개의 BRC 반복, 나선형 도메인(Helical)을 가진 DNA 결합 도메인, 3개의 올리고뉴클레오타이드/올리고당 결합(OB) 폴드, 타워 도메인(T) 및 C 측의 NLS를 포함합니다. 유방암 클러스터 영역이라고 하는 영역 (BCCR)과 난소암 클러스터 영역(OCCR)이 하단에 표시됩니다.*종료 코돈을 결정하는 돌연변이를 나타냅니다.
그런 다음 BRCA1/2 PV의 존재와 관련이 있을 수 있는 BC 임상병리학적 특징을 조사했습니다. 181명의 BRCA1/2 음성 환자(비보유자)와 모든 보유자(n = 35)에 대한 완전한 임상 기록이 제공되었습니다. 종양 증식 속도와 등급 사이에 상관 관계가 있었습니다.
우리는 코호트의 중앙값(25%, 범위 <10-90%)을 기반으로 Ki-67의 분포를 계산했습니다. Ki-67이 25% 미만인 대상은 "낮은 Ki-67"로 정의되었고, 값이 25% 이상인 개인은 "높은 Ki-67"로 간주되었습니다. 비보유자와 BRCA1 PV 보유자 간에 유의미한 Ki-67 차이(p<0.01)가 발견되었습니다(그림 5A).
그림 5 BRCA1 및 BRCA2 PV가 있는 유방암 여성과 없는 유방암 여성의 Ki-67과 등급 분포의 상관 관계.(A) 181명의 비보균자 BC 환자와 BRCA1(18) 또는 BRCA2(17) PV 환자의 중앙값 Ki-67 값을 보여주는 상자 그림. 0.5 미만의 P값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.(B) BRCA1 및 BRCA2 돌연변이 상태(WT 대상, BRCA1 및 BRCA2 PV 보균자)에 따라 BC 암 환자를 조직학적 등급 그룹(G2 및 G3)으로 분류한 것을 나타내는 히스토그램입니다.
마찬가지로, 우리는 종양 등급이 BRCA1/2 PV의 존재와 상관관계가 있는지 조사했습니다. 우리 집단에는 G1 BC가 없었기 때문에 환자를 두 그룹(G2 또는 G3)으로 나누었습니다. Ki-67 결과와 일치하게, 분석 결과 종양 등급과 BRCA1 돌연변이 사이에 통계적으로 유의미한 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, BRCA1 보유자에서 비보유자에 비해 G3 종양의 비율이 더 높았습니다(p<0.005)(그림 5B).
DNA 시퀀싱 기술의 발전으로 BRCA1/2 유전자 검사가 전례 없는 진전을 이루었으며, 이는 가족력에 암이 있는 환자에게 중요한 의미를 갖습니다. 현재까지 약 20,000개의 BRCA1/2 변이가 미국 의학 유전학회35와 ENIGMA 시스템35,36에 따라 식별 및 분류되었습니다. BRCA1/2 돌연변이 스펙트럼은 지리적 지역에 따라 크게 다르다는 것은 잘 알려진 사실입니다. 이탈리아 내에서 BRCA1/2 PV 비율은 8%에서 37%까지 이르러 국가 내에서 큰 변동성을 보였습니다. 인구가 약 500만 명인 시칠리아는 주민 수 면에서 이탈리아에서 다섯 번째로 큰 지역입니다. 시칠리아 서부의 BRCA1/2 분포에 대한 데이터는 있지만 섬의 동부 지역에서는 광범위한 증거가 없습니다.
저희 연구는 시칠리아 동부의 BC 환자에서 BRCA1/2 PV 발생률을 조사한 최초의 보고서 중 하나입니다. 저희는 저희 코호트에서 가장 흔한 질병인 BC에 대한 분석에 집중했습니다.
389명의 유방암 환자를 검사했을 때, 9%가 BRCA1/2 PV를 가지고 있었으며, 이는 BRCA1과 BRCA2에 고르게 분포되어 있었습니다. 이러한 결과는 이전에 이탈리아 인구에서 보고된 결과와 일치합니다.28 흥미롭게도, 우리 코호트의 3%(13/389)가 남성이었습니다. 이 비율은 남성 유방암(전체 BC의 1%)에서 예상되는 것보다 높으며,40 이는 BRCA1/2 돌연변이 위험을 기반으로 한 인구 선택을 반영합니다. 그러나 이 남성 중 누구도 BRCA1/2 PV를 발병하지 않았으므로 PALB2, RAD51C, D 등과 같은 덜 흔한 돌연변이의 존재를 배제하기 위한 추가 분자 분석의 후보였습니다. BRCA2 VUS가 명백했던 대상의 7%에서 유의성이 불확실한 변이가 발견되었습니다. 이 결과도 기존 증거와 일치합니다.28,41,42
BRCA1/2 돌연변이 여성의 BC 분자 하위 유형 분포를 분석했을 때 TNBC와 BRCA1 PV(58.8%) 및 루미날 B BC와 BRCA2 PV(55.6%) 간의 알려진 연관성을 확인했습니다.16,43 BRCA1 및 BRCA2 PV 보유자의 루미날 A 및 HER2+ 종양은 기존 문헌 데이터와 일치합니다.16,43
그런 다음 BRCA1/2 PV의 유형과 위치에 초점을 맞춥니다. 우리 코호트에서 가장 흔한 BRCA1 PV는 c.5035_5039delCTAAT였습니다. Incorvaia et al. 영어: 그들의 시칠리아 코호트에서 이 변이를 설명하지 않았지만 다른 저자는 그것을 생식 세포 BRCA1 PV로 보고했습니다.34 우리 코호트에서 여러 BRCA1 PV가 발견되었습니다(예: c.181T>G, c.514del, c.3253dupA 및 c.5266dupC)는 시칠리아에서 관찰되었습니다.28 이 중 두 개의 BRCA1 창시자 돌연변이(c.181T>G 및 c.5266dupC)는 동유럽과 중부 유럽(폴란드, 체코), 슬로베니아, 오스트리아, 헝가리, 벨로루시 및 독일의 아슈케나지 유대인에서 흔히 발견되며,44,45 미국과 아르헨티나에서는 최근 BC 및 OC가 있는 이탈리아 환자에서 "재발성 생식 세포 변이"로 정의되었습니다.34c.514del 변이는 이전에 팔레르모와 메시나의 북부 시칠리아 출신 유방암 환자 8명에서 확인되었습니다.흥미롭게도 Incorvaia 등은 카타니아의 일부 가족에서 c.3253dupA 변이체를 발견했습니다.28 가장 대표적인 BRCA2 PV는 c.428dup, c.5851_5854delAGTT 및 인트론 변이체 c.8487+1G>A로, 이는 팔레르모의 c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV 환자에 대해 더 자세히 보고되었습니다.28 이 변이체는 주로 트라파니와 팔레르모 지역의 시칠리아 북서부 가정에서 관찰되었지만, c.5851_5854delAGTT PV는 시칠리아 북서부 가정에서 관찰되었습니다. 8487+1G>A 변이체는 메시나, 팔레르모 및 칼타니세타 출신 대상자에게 더 흔했습니다.28 Rebbeck 등 이전에 콜롬비아에서 c.5851_5854delAGTT 변형이 설명되었습니다.37 또 다른 BRCA2 PV인 c.631+1G>A는 시칠리아(아그리젠토, 시라쿠사 및 라구사)의 BC 및 OC 환자에서 발견되었습니다.28 주목할 점은 동일한 환자에서 두 가지 BRCA2 변이체(BRCA2 c.631G>A 및 c.7008-2A>T)가 공존하는 것을 관찰했으며, 이전에 보고된 바와 같이 cis 모드로 분리된 것으로 추정했습니다.34,46 이러한 BRCA2 uble 돌연변이는 실제로 이탈리아 지역에서 자주 관찰되며 조기 종료 코돈을 도입하여 메신저 RNA 스플라이싱에 영향을 미치고 BRCA2 단백질이 실패하게 만드는 것으로 밝혀졌습니다.47,48
우리는 또한 단백질 도메인과 유전자의 추정 OCCR 및 BCCR 영역에서 BRCA1 및 BRCA2 PV를 매핑했습니다.이러한 영역은 Rebbeck 등에 의해 각각 난소암과 유방암이 발생할 위험 영역으로 설명되었습니다.49 그러나 생식 세포 변이의 위치와 유방암 또는 난소암 위험 간의 연관성에 대한 증거는 여전히 논란의 여지가 있습니다.28,50-52 우리 집단에서 BRCA1 PV는 주로 BCCR 영역에 위치한 반면 BRCA2 PV는 주로 OCCR 영역에 위치했습니다.그러나 추정 OCCR 및 BCCR 영역과 BC 특성 간의 연관성을 찾을 수 없었습니다.이는 BRCA1/2 돌연변이가 있는 환자 수가 제한적이기 때문일 수 있습니다.단백질 도메인 관점에서 BRCA1 PV는 전체 단백질에 분포되어 있으며 BRCA2 변형은 BRC 반복 도메인에서 우선적으로 발견됩니다.
마지막으로, 우리는 BC 임상병리학적 특징을 BRCA1/2 PV와 연관시켰습니다. 포함된 환자 수가 제한적이기 때문에 Ki-67과 종양 등급 간에 유의한 상관관계만 발견했습니다. Ki-67의 평가 및 해석은 여전히 ​​다소 논란의 여지가 있지만, 높은 증식률은 질병 재발 위험 증가 및 생존율 감소와 관련이 있다는 것은 확실합니다. 현재까지 "높음"과 "낮음" Ki-67을 구별하기 위한 임계값은 20%입니다. 그러나 이 임계값은 중간 Ki-67 값이 25%인 BRCA1/2 돌연변이 환자 집단에는 적용되지 않습니다. 높은 Ki-67 비율의 이러한 추세는 루미날 A 종양이 거의 없는 루미날 B 및 TNBC 코호트의 유병률로 설명할 수 있습니다. 그러나 일부 증거는 더 높은 Ki-67 임계값(25-30%)이 환자를 예후에 따라 더 잘 분류할 수 있음을 시사하는 것 같습니다.53,54 분석 결과에서 유의한 상관관계가 있습니다. 놀랍지 않습니다. 높은 Ki-67 및 등급과 BRCA1 PV의 존재 사이에서 발생합니다. 실제로 BRCA1 관련 종양은 TNBC의 전형이며 더 공격적인 특징을 보입니다.16,17
결론적으로, 이 연구는 시칠리아 동부의 BC 코호트에서 BRCA1/2 돌연변이 상태에 대한 보고서를 제공합니다. 전반적으로, 우리의 연구 결과는 BC의 돌연변이 유병률과 임상병리학적 특징 측면에서 모두 기존 증거와 일치합니다. BRCA1/2 돌연변이 BC 환자의 더 큰 집단에 대한 추가 연구, 예를 들어 다중 유전체 확장 돌연변이 분석을 사용하여 BRCA1/2보다 독특하고 덜 빈번한 PV의 존재를 평가하는 것이 필요합니다. 이를 통해 유전자 돌연변이로 인해 암 위험이 증가한 대상의 수가 증가하고 있음을 식별하고 적절하게 관리할 수 있을 것입니다.
환자가 연구 목적으로 자신의 종양 샘플을 익명으로 공개하는 데 대한 정보 제공 동의서에 서명했음을 확인했습니다. 모든 환자는 헬싱키 선언에 따라 서면 정보 제공 동의서에 서명했습니다. AOU Policlinico "G.Rodolico-S.Marco"의 정책에 따라 이 연구는 BRCA1/2 분석이 임상 실무에 따라 수행되었고 모든 환자가 서면 정보 제공 동의서를 제출했기 때문에 윤리적 검토에서 면제되었습니다. 환자는 또한 연구 목적으로 자신의 데이터를 사용하는 데 동의했습니다.
윤리위원회의 요청에 따라 유방암 환자 치료에 도움을 주신 파올로 비네리 교수께 감사드립니다.
페데리카 마르토라나는 이스티투토 젠틸리, 엘리 릴리, 노바티스, 화이자로부터 명예금을 받았습니다. 다른 저자들은 이 연구에서 이해 상충이 없다고 선언합니다.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL 외. 2020년 세계 암 통계: GLOBOCAN은 전 세계 185개국에서 36가지 암의 발생률과 사망률을 추정합니다. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660