Javascript je momentálne vo vašom prehliadači vypnutý. Niektoré funkcie tejto webovej stránky nebudú fungovať, keď je javascript vypnutý.
Zaregistrujte sa s vašimi konkrétnymi údajmi a konkrétnym liekom, o ktorý máte záujem, a my priradíme informácie, ktoré poskytnete, k článkom v našej rozsiahlej databáze a obratom vám e-mailom zašleme kópiu vo formáte PDF.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 17, Univerzitná klinika Catania, experimentálna klinika 21, Catania Manzella Catania, 95123, Taliansko;2 Centrum pre experimentálnu onkológiu a hematológiu, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania , 95123, Taliansko; 3 Lekárska onkológia, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Taliansko; 4 Lekárska genetika, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Taliansko; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Taliansko; 6 Katedra biomedicínskych a biotechnologických vied, Univerzita v Catanii, Lekárska genetika, Catania, Taliansko, 95123; 7 Výskumný inštitút Oasi - IRCCS, Troina, 94018, Taliansko Komunikácia: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-mail [email protected]; [email protected] Účel: Mutácie zárodočnej línie v génoch BRCA1 a BRCA2 a rozvinutý karcinóm prsníka (BC), vaječníkov (OC) a ďalšie spojené s celoživotným rizikom rakoviny. Testovanie génu BRCA je kľúčové pre posúdenie individuálneho rizika, ako aj pre nájdenie metód prevencie u zdravých nositeľov a prispôsobenie liečby pacientkam s rakovinou. Prevalencia zmien BRCA1 a BRCA2 sa v jednotlivých geografických oblastiach značne líši a hoci existujú údaje o patogénnych variantoch BRCA v sicílskych rodinách, chýbajú štúdie zamerané špecificky na populácie vo východnej Sicílii. Cieľom našej štúdie bolo preskúmať výskyt a distribúciu patogénnych zmien zárodočnej línie BRCA v kohorte pacientok s BC z východnej Sicílie a posúdiť ich súvislosť so špecifickými znakmi BC pomocou sekvenovania novej generácie. Prítomnosť zmien korelovala so stupňom nádoru a indexom proliferácie. VÝSLEDKY: Celkovo malo 35 pacientok (9 %) patogénny variant BRCA, 17 (49 %) v BRCA1 a 18 (51 %) v BRCA2. Zmeny BRCA1 sú rozšírené u pacientok s trojnásobne negatívnym BC, zatiaľ čo mutácie BRCA2 sú častejšie u pacientok s luminálnym BC. V porovnaní s U nenositeľov mutácií mali subjekty s variantmi BRCA1 významne vyšší stupeň nádoru a proliferačný index. Závery: Naše zistenia poskytujú prehľad o mutačnom stave BRCA u pacientok s rakovinou prsníka z východnej Sicílie a potvrdzujú úlohu NGS analýzy pri identifikácii pacientok s dedičnou rakovinou prsníka. Celkovo sú tieto údaje v súlade s predchádzajúcimi dôkazmi podporujúcimi skríning BRCA pre správnu prevenciu a liečbu rakoviny u nositeľov mutácií.
Rakovina prsníka (BC) je najčastejším zhubným nádorom na svete a najsmrteľnejším druhom rakoviny u žien.1 Biologické vlastnosti, ktoré určujú prognózu a klinické správanie BC, boli v priebehu času rozsiahlo študované a čiastočne objasnené. V skutočnosti sa v súčasnosti používa niekoľko náhradných markerov na klasifikáciu BC do rôznych molekulárnych podtypov. Sú to estrogénový (ER) a/alebo progesterónový receptor (PgR), amplifikácia receptora 2 ľudského epidermálneho rastového faktora (HER2), proliferačný index Ki-67 a stupeň nádoru (G).2 Kombinácia týchto premenných identifikovala nasledujúce kategórie BC: 1) Luminálne nádory, vykazujúce expresiu ER a/alebo PgR, predstavovali 75 % BC. Tieto nádory boli ďalej rozdelené na Luminálny A, keď Ki-67 bol pod 20 % a HER2 negatívny, a Luminálny B, keď Ki-67 bol rovný alebo vyšší ako 20 % a v prítomnosti amplifikácie HER2, bez ohľadu na proliferačný index; 2) HER2+ nádory, ktoré sú ER a PgR negatívne, ale vykazujú amplifikáciu HER2. Táto skupina predstavuje 10 % všetkých nádorov prsníka; 3) Trojito negatívny karcinóm prsníka (TNBC), ktorý nevykazuje expresiu ER a PgR a amplifikáciu HER2, predstavuje približne 15 % prípadov rakoviny prsníka.2-4
Spomedzi týchto podtypov rakoviny prsníka predstavujú stupeň nádoru a proliferačný index prierezové biomarkery, ktoré sú priamo a nezávisle spojené s agresivitou a prognózou nádoru.5,6
Okrem vyššie uvedených biologických vlastností sa v posledných rokoch stala čoraz dôležitejšou úloha dedičných genetických zmien vedúcich k rozvoju rakoviny prsníka (BC).7 Približne 1 z 10 nádorov prsníka je zdedených v dôsledku zmien zárodočnej línie v špecifických génoch.8 Dve rozsiahle epidemiologické štúdie zahŕňajúce viac ako 180 000 žien nedávno identifikovali skupinu ôsmich génov (t. j. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C a RAD51D) primárne zodpovedných za dedičnú rakovinu prsníka. Spomedzi týchto génov BRCA1 a BRCA2 (ďalej len BRCA1/2) preukázali najsilnejšiu koreláciu s rozvojom nádorov prsníka.9-12 V skutočnosti mutácie zárodočnej línie BRCA1/2 významne zvyšujú celoživotné riziko rakoviny prsníka, ako aj iných malignít vrátane ovariálnych, prostatických, pankreatických, kolorektálnych a melanómových ochorení. Od 13 do 80 rokov je kumulatívny výskyt rakoviny prsníka 72 % u žien s patogénnym variantom (PV) BRCA1 a 69 % u žien s BRCA2. PV.14
Je pozoruhodné, že nedávna publikácia naznačuje, že riziko vzniku rakoviny prsníka závisí od typu fotosenzitívnej pankreatitídy. V skutočnosti, v porovnaní s patogénnymi skrátenými variantmi, výrazné missense varianty, najmä v géne BRCA1, sú spojené so zníženým rizikom rakoviny prsníka, najmä u starších žien.15
Prítomnosť BRCA1 alebo BRCA2 PV bola spojená s rôznymi biologickými a klinicko-patologickými znakmi.16,17 BRCA1-asociované karcinomy prsníka bývajú klinicky agresívne, slabo diferencované a vysoko proliferatívne. Tieto nádory sú zvyčajne trojito negatívne a majú skorý nástup. Nádory, ktoré sa vyskytujú u pacientov s mutáciou BRCA2, zvyčajne vykazujú stredne až dobre diferencované stupne a variabilné proliferačné indexy. Tieto nádory sú častejšie v lúmene B a zvyčajne sa vyskytujú u starších dospelých.16-18 Je pozoruhodné, že mutácie v BRCA1 a BRCA2 zvyšujú citlivosť na špecifickú liečbu vrátane platinových solí a cielených liekov, ako sú inhibítory poly(ADP-ribóza)polymerázy (PARPi).19,20
V posledných rokoch umožnilo zavedenie sekvenovania novej generácie (NGS) do klinickej praxe rastúcemu počtu pacientov s rakovinou prsníka podstúpiť molekulárne testovanie na syndrómy náchylnosti na rakovinu vrátane BRCA1/2.21 Súčasne sa definície založené na presných kritériách týkajúcich sa rodinnej anamnézy, demografických a klinicko-patologických charakteristík používajú na lepšiu identifikáciu jedincov hodných testovania na BRCA1/2.22,23 V tejto súvislosti sa hromadia dôkazy o skríningu BRCA1/2 v špecifických populáciách, čo zdôrazňuje rozdiely medzi geografickými regiónmi.24–27 Hoci existujú správy o kohorte pacientov s rakovinou prsníka v západnej Sicílii, o skríningu BRCA1/2 v populácii východnej Sicílie je k dispozícii menej údajov.28,29
V tejto práci popisujeme výsledky skríningu zárodočnej línie BRCA1/2 u pacientok s rakovinou prsníka z východnej Sicílie, pričom ďalej korelujeme prítomnosť mutácií BRCA1 alebo BRCA2 s hlavnými klinicko-patologickými znakmi týchto nádorov.
V „Centre pre experimentálnu onkológiu a hematológiu“ v nemocnici Policlinico v Rodolicu – San Marco v Catanii sa uskutočnila retrospektívna štúdia. Od januára 2017 do marca 2021 bolo do nášho molekulárno-diagnostického laboratória odoslaných celkovo 455 pacientok s rakovinou prsníka a vaječníkov, melanómom, pankreasom alebo prostatou na genetické testovanie BRCA/2. Táto štúdia sa uskutočnila v súlade s Helsinskou deklaráciou a všetci účastníci poskytli písomný informovaný súhlas pred molekulárnou analýzou.
Histologické a biologické charakteristiky (ER, PgR, HER2 status, Ki-67 a stupeň) karcinomu prsníka (BC) boli hodnotené na základe biopsie jadra alebo chirurgických vzoriek, pričom sa brali do úvahy iba agresívne nádorové zložky. Na základe týchto charakteristík boli karcinomy prsníka klasifikované nasledovne: luminálny A (ER+ a/alebo PgR+, HER2-, Ki-67 < 20 %), luminálny B (ER+ a/alebo PgR+, HER2-, Ki-67 ≥ 20 %), luminálny B-HER2+ (ER a/alebo PgR+, HER2+), HER2+ (ER a PgR-, HER2+) alebo trojito negatívny (ER a PgR-, HER2-).
Pred posúdením stavu mutácií BRCA1 a BRCA2 vykonal multidisciplinárny tím zahŕňajúci onkológa, genetika a psychológa konzultáciu zameranú na genetické ochorenia nádorov u každého pacienta, aby sa určila prítomnosť BRCA1 a/alebo BRCA1, alebo u jedincov s vysokým rizikom perforácie nádorov v géne BRCA2. Výber pacientov sa uskutočnil podľa smerníc Talianskej spoločnosti pre lekársku onkológiu (AIOM) a miestnych sicílskych odporúčaní.30,31 Tieto kritériá zahŕňajú: (i) rodinnú anamnézu známych patogénnych variantov v génoch náchylnosti (napr. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) muži s rakovinou prsníka (BC); (iii) pacienti s rakovinou prsníka a ovariálnym karcinómom (OC); (iv) ženy s rakovinou prsníka <36 rokov, nehnojeným ovariálnym karcinómom prsníka <60 rokov alebo obojstranným OC <50 rokov; (v) osobnú anamnézu rakoviny prsníka <50 rokov a aspoň jedného príbuzného prvého stupňa: (a) rakovina prsníka < 50 rokov; (b) nehnoječný a nehraničný OC akéhokoľvek veku; (c) obojstranný BC; (d) mužský BC; (e) rakovina pankreasu; (f) rakovina prostaty; (vi) dva alebo viac prípadov rakoviny pankreasu v osobnej anamnéze > 50 rokov a rodinná anamnéza rakoviny pankreasu, rakoviny pankreasu alebo rakoviny pankreasu u príbuzných, ktorí sú si navzájom príbuzní prvého stupňa (vrátane príbuzných, s ktorými je príbuzná prvého stupňa); (vii) Osobná anamnéza rakoviny pankreasu a aspoň jeden príbuzný prvého stupňa: (a) rakovina pankreasu < 50 rokov; (b) rakovina bez rakoviny; (c) bilaterálna rakovina pankreasu; (d) rakovina pankreasu u mužov; (vii) žena s vysokostupňovým seróznym rakovinou pankreasu.
Od každého pacienta sa odobrala 20 ml vzorka periférnej krvi a zhromaždila sa do skúmaviek s EDTA (BD Biosciences). Genomická DNA sa izolovala z 0,7 ml vzoriek plnej krvi pomocou izolačnej súpravy QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Hilden, Taliansko) podľa pokynov výrobcu a nechala sa prejsť cez fluorometer Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Vykonajte kvantifikáciu. Obohatenie cieľa a príprava knižnice sa vykonávajú pomocou prístroja Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, ktorý je pripravený na vloženie do súpravy Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit pre automatickú prípravu knižnice podľa pokynov výrobcu. Súprava pozostáva z dvoch multiplexných PCR primerových poolov, ktoré možno použiť na štúdium všetkých génov BRCA1 (NM_007300.3) a BRCA2 (NM_000059.3). Stručne povedané, 15 µL každej zriedenej vzorky DNA (10 ng) sa pridalo do platní s čiarovým kódom na prípravu knižnice a všetky činidlá a spotrebný materiál sa vložili do prístroja Ion Chef™. Automatizovaná príprava knižnice a zlúčenie vzoriek knižnice s čiarovým kódom sa potom vykonali na prístroji Ion Chef™. Počet pripravených knižníc sa potom vyhodnotil pomocou fluorometra Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Nakoniec sa knižnice skombinujú v ekvimolárnych pomeroch v skúmavkách so vzorkami knižnice Ion Chef™ (s čiarovým kódom) a vložia sa na... prístroj Ion Chef™. Sekvenovanie sa vykonalo pomocou prístroja Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) s použitím čipu Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Analýza dát sa vykonala pomocou softvéru Amplicon Suite (SmartSeq srl) a softvéru Ion Reporter.
Všetka nomenklatúra variantov sa riadila aktuálnymi smernicami Konzorcia pre variácie ľudského genómu, ktoré sú dostupné online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Klinický význam variantov BRCA1/2 bol definovaný pomocou klasifikácie Medzinárodného konzorcia ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) a konzultáciou rôznych databáz, ako sú ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD a UMD. Klasifikácia zahŕňa päť odlišných rizikových kategórií: benígny (kategória I), pravdepodobne benígny (kategória II), variant s neistým významom (VUS, kategória III), pravdepodobne patogénny (kategória IV) a patogénny (kategória V). VarSome tiež analyzoval vplyv mutácií na štruktúru a funkciu proteínov, čo je informatívny nástroj s prístupom k 30 databázam.32
Na priradenie potenciálneho klinického významu každému VUS boli použité nasledujúce výpočtové algoritmy predikcie proteínov: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) a Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianty klasifikované ako trieda 1 a 2 boli považované za divoký typ.
Sangerovo sekvenovanie potvrdilo prítomnosť každého patogénneho variantu. Stručne povedané, pre každý detegovaný variant bol navrhnutý pár špecifických primerov s použitím referenčných sekvencií génov BRCA1 a BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 a NG_012772.3, NM_000059.3). Preto bola vykonaná cielená PCR a následne Sangerovo sekvenovanie.
Pacienti s negatívnym testom na gén BRCA1/2 boli testovaní multiplexnou ligáciou závislou amplifikáciou sondy (MLPA) podľa pokynov výrobcu na posúdenie prítomnosti veľkých genomických preskupení (LGR). Stručne povedané, vzorky DNA sú denaturované a používa sa až 60 sond špecifických pre gény BRCA1 a BRCA2, pričom každá deteguje špecifickú sekvenciu DNA s dĺžkou približne 60 nukleotidov. Produkty amplifikácie sondy, pozostávajúce z jedinečnej sady PCR amplikónov, boli potom analyzované kapilárnou elektroforézou a softvérom Cofalyser.Net v spojení s príslušnými tabuľkami Cofalyser špecifickými pre danú šaržu (www.mrcholland.com).
Vybrané klinicko-patologické premenné (histologický stupeň a proliferačný index Ki-67%) boli spojené s prítomnosťou BRCA1/2 PV, vypočítané pomocou softvéru Prism v. 8.4 s použitím Fisherovho exaktného testu za predpokladu, že p-hodnota < 0,05 je významná.
Medzi januárom 2017 a marcom 2021 bolo 455 pacientov vyšetrených na mutácie zárodočnej línie BRCA1/2. Testovanie mutácií sa vykonalo v Centre pre experimentálnu onkológiu a hematológiu nemocnice Policlinico. Podľa sicílskych smerníc (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Jannaio 2020), nemocnica Rodolico de Catania – San Marco” mala celkovo 389 pacientov s rakovinou prsníka, 37 s rakovinou vaječníkov, 16 s rakovinou pankreasu, 8 s rakovinou prostaty a 5 s melanómom. Rozdelenie pacientov podľa typu rakoviny a výsledkov analýzy je znázornené na obrázku 1.
Obrázok 1 zobrazuje vývojový diagram zobrazujúci prehľad štúdie. Pacientky s nádormi prsníka, melanómu, pankreasu, prostaty alebo vaječníkov boli testované na mutácie v génoch BRCA1 a BRCA2.
Skratky: PV, patogénny variant; VUS, variant s neistým významom; WT, sekvencia divokého typu BRCA1/2.
Naše štúdie sme selektívne zamerali na kohorty s rakovinou prsníka. Pacientky mali medián veku 49 rokov (rozsah 23 – 89) a boli prevažne ženy (n = 376 alebo 97 %).
Z týchto subjektov malo 64 (17 %) mutácie BRCA1/2 a všetky boli ženy. Tridsaťpäť (9 %) malo PV a 29 (7,5 %) malo VUS. Sedemnásť (48,6 %) z 35 patogénnych variantov sa vyskytlo v BRCA1 a 18 (51,4 %) v BRCA2, zatiaľ čo 5 VUS sa vyskytlo v BRCA1 (17,2 %) a 24 (82,8 %) v BRCA2 (obrázky 1 a 2). LGR nebol prítomný v analýze MLPA.
Obrázok 2. Analýza mutácií BRCA1 a BRCA2 u 389 pacientok s rakovinou prsníka. (A) Distribúcia patogénnych variantov (PV) (červená), variantov s neistým významom (VUS) (oranžová) a WT (modrá) u 389 pacientok s rakovinou prsníka; (B) 389 pacientok s rakovinou prsníka Tridsaťpäť (9 %) malo patogénne varianty (PV) BRCA1/2. Z nich bolo 17 (48,6 %) nositeľov PV BRCA1 (tmavočervená) a 18 (51,4 %) nositeľov BRCA2 (svetločervená); (C) 29 (7,5 %) z 389 subjektov malo VUS, 5 (17,2 %) génov BRCA1 (tmavooranžová) a 24 (82,8 %) génov BRCA2 (svetlooranžová).
Skratky: PV, patogénny variant; VUS, variant s neistým významom; WT, sekvencia divokého typu BRCA1/2.
Ďalej sme skúmali prevalenciu molekulárnych podtypov BC u pacientok s BRCA1/2 PV. Distribúcia zahŕňala 2 (5,7 %) pacientky s luminálnym A, 15 (42,9 %) pacientky s luminálnym B, 3 (8,6 %) pacientky s luminálnym B-HER2+, 2 (5,7 %) pacientky s HER2+ a 13 (37,1 %) pacientky s TNBC. Spomedzi pacientok s BRCA1 pozitívnym génom malo 5 (29,4 %) pacientku s luminálnym B BC, 2 (11,8 %) pacientky s HER2+ ochorením a 10 (58,8 %) pacientky s TNBC. Nádory bez mutácií BRCA1 boli buď luminálne A, alebo luminálne B-HER2+ (obrázok 3). V podskupine s BRCA2 pozitívnym génom malo 10 (55,6 %) nádorov luminálne B, 3 (16,7 %) pacientky s luminálnym B-HER2+, 3 (16,7 %) pacientky s TNBC a 2 (11,1 %) pacientky s luminálnym A (obrázok 3). Žiadne HER2+ nádory. boli prítomné v tejto skupine. Mutácie BRCA1 sú teda rozšírené u pacientov s TNBC, zatiaľ čo zmeny BRCA2 sú prevládajúce u jedincov s lumenom B.
Obrázok 3 Prevalencia podtypov rakoviny prsníka u pacientok s patogénnymi variantmi v BRCA1 a BRCA2. Histogramy znázorňujúce distribúciu paralytických vírusov BRCA1- (tmavočervená) a BRCA2- (svetločervená) medzi molekulárnymi podtypmi pacientok s rakovinou prsníka. Čísla uvedené v každom políčku predstavujú percento pacientok s paralytickými vírusmi BRCA1 a BRCA2 pre každý podtyp rakoviny prsníka.
Skratky: PV, patogénny variant; HER2+, pozitívny na receptor 2 ľudského epidermálneho rastového faktora; TNBC, trojito negatívny karcinóm prsníka.
Následne sme zhodnotili typ a lokalizáciu génov BRCA1 a BRCA2 PV. V BRCA1 PV sme pozorovali 7 jednonukleotidových variantov (SNV), 6 delécií, 3 duplikácie a 1 inzerciu. Iba jedna mutácia (c.5522delG) predstavuje nový objav. Najčastejším BRCA1 PV zisteným u oboch subjektov bol c.5035_5039delCTAAT. Táto zmena zahŕňa deléciu piatich nukleotidov (CTAAT) v exóne BRCA1 15, čo vedie k substitúcii aminokyseliny leucínu tyrozínom v kodóne 1679 a v dôsledku posunu translačného rámca s predpokladaným alternatívnym stop kodónom vedie k predčasnému skráteniu proteínu. Všetky ostatné zmeny sú zistené iba v jednom prípade. Je pozoruhodné, že jeden z hlásených PV sa nachádzal v konsenzuálnej oblasti miesta zostrihu (c.4357+1G>T) (Tabuľka 1).
Pokiaľ ide o BRCA2 PV, pozorovali sme 6 delécií, 6 jednonukleotidových variantov (SNV) a 2 duplikácie. Žiadna zo zistených zmien nie je nová. V našej populácii sa opakovali tri mutácie, c.428dup a c.8487+1G>A pozorované u 3 subjektov, nasledované c.5851_5854delAGTT získanou v dvoch prípadoch. Zmena c.428dup zahŕňa opakovanie C v exóne 5 génu BRCA2, o ktorom sa predpokladá, že kóduje skrátený, nefunkčný proteín. Mutácia c.8487+1G>A sa vyskytuje v intrónovej oblasti intrónu 19 génu BRCA2 (± 1,2) a ovplyvňuje konsenzuálnu sekvenciu zostrihu, čo vedie k zmenenému zostrihu, čoho výsledkom je abnormálny alebo chýbajúci proteín. Patogénny variant c.5851_5854delAGTT je spôsobený 4-nukleotidovou deléciou z nukleotidových pozícií 5851 až 5854 v kódujúcom exóne 10 génu BRCA2 a vedie k translačnej zmene. posun čítacieho rámca s predpokladaným alternatívnym stop kodónom (p.S1951WfsTer). Je pozoruhodné, že ako už bolo uvedené, obe zmeny c.631G>A a c.7008-2A>T boli detegované u toho istého pacienta.34 Prvá mutácia zahŕňa nahradenie adenozínu (A) v exóne 7 génu BRCA2 nukleotidom obsahujúcim guanín (G), čo vedie k zmene valínu na izoleucín v kodóne 211, izoleucín. Aminokyselina je aminokyselina s veľmi podobnými vlastnosťami. Táto zmena ovplyvňuje normálny zostrih mRNA. Druhý variant sa nachádza v intrónovej oblasti a vedie k dvojitej substitúcii A za tymín (T) pred exónom 13 génu kódujúceho BRCA2. Zmena c.7008-2A>T môže generovať viacero transkriptov rôznych dĺžok. Okrem toho, v skupine PV BRCA2 boli 4 z 18 zmien (22,2 %) intrónové.
Následne sme zmapovali škodlivé mutácie BRCA1/2 vo funkčných doménach a oblastiach viažucich proteíny (obr. 4). V géne BRCA1 sa 50 % PV nachádzalo v oblasti klastra rakoviny prsníka (BCCR), zatiaľ čo 22 % mutácií sa nachádzalo v oblasti klastra rakoviny vaječníkov (OCCR) (obr. 4A). V PV BRCA2 sa 35,7 % variantov nachádzalo v oblasti BCCR a 42,8 % mutácií sa nachádzalo v OCCR (obr. 4B). Ďalej sme posúdili umiestnenie PV v rámci domén proteínov BRCA1 a BRCA2. V prípade proteínu BRCA1 sme našli tri PV v doménach slučky a špirálovej špirály a dve mutácie v doméne BRCT (obr. 4A). V prípade proteínu BRCA2 sa 4 PV mapovali na doménu opakovania BRC, zatiaľ čo 3 intronické a 3 exonické zmeny sa zistili v doménach viažucich oligo/oligosacharidy (OB) a vežovej (T) doméne (obrázok 4B).
Obrázok 4 Schematické znázornenie proteínov BRCA1 a BRCA2 a lokalizácia patogénnych variantov. Tento obrázok zobrazuje distribúciu patogénnych variantov BRCA1 (A) a BRCA2 (B) u pacientok s rakovinou prsníka. Exónové mutácie sú zobrazené modrou farbou, zatiaľ čo intronické varianty sú zobrazené oranžovou farbou. Výška stĺpca predstavuje počet prípadov. Sú uvedené proteíny BRCA1 a BRCA2 a ich funkčné domény. (A) Proteín BRCA1 obsahuje slučkovú doménu (RING) a sekvenciu nukleárnej lokalizácie (NLS), doménu so špirálovou špirálou, klastrovú doménu SQ/TQ (SCD) a C-terminálnu doménu BRCA1 (BRCT). (B) Proteín BRCA2 obsahuje osem opakovaní BRC, doménu viažucu DNA so helikálnou doménou (Helikálna), tri záhyby viažuce oligonukleotidy/oligosacharidy (OB), vežovú doménu (T) a NLS na C strane. Oblasti nazývané oblasť klastra rakoviny prsníka (BCCR) a oblasť klastra rakoviny vaječníkov (OCCR) sú zobrazené v dolnej časti. *Predstavuje mutácie, ktoré určujú zastavenie kodóny.
Následne sme skúmali klinicko-patologické znaky rakoviny prsníka, ktoré by mohli korelovať s prítomnosťou BRCA1/2 paracetamolu. Kompletné klinické záznamy boli k dispozícii pre 181 pacientov s negatívnym génom BRCA1/2 (neprenášačov) a všetkých prenášačov (n = 35). Medzi mierou proliferácie nádoru a jeho stupňom bola zistená korelácia.
Distribúciu Ki-67 sme vypočítali na základe mediánu našej kohorty (25 %, rozsah <10 – 90 %). Subjekty s Ki-67 < 25 % boli definované ako „nízke Ki-67“, zatiaľ čo jedinci s hodnotami ≥ 25 % boli považovaní za „vysoké Ki-67“. Medzi nenositeľmi a nositeľmi BRCA1 PV boli zistené významné rozdiely v Ki-67 (p < 0,01) (Obr. 5A).
Obrázok 5 Korelácia Ki-67 s distribúciou stupňa u žien s rakovinou prsníka s mutáciami BRCA1 a BRCA2 a bez nich. (A) Boxplot znázorňujúci medián hodnôt Ki-67 u 181 pacientok s rakovinou prsníka bez mutácie oproti pacientkam s mutáciou BRCA1 (18) alebo BRCA2 (17). Hodnoty P pod 0,5 boli považované za štatisticky významné. (B) Histogram znázorňujúci zaradenie pacientok s rakovinou prsníka do skupín histologického stupňa (G2 a G3) podľa stavu mutácie BRCA1 a BRCA2 (subjekty s WT, nositeľky mutácií BRCA1 a BRCA2).
Podobne sme skúmali, či stupeň nádoru koreloval s prítomnosťou BRCA1/2 PV. Keďže v našej populácii chýbala mutácia G1, rozdelili sme pacientky do dvoch skupín (G2 alebo G3). V súlade s výsledkami Ki-67 analýza odhalila štatisticky významnú koreláciu medzi stupňom nádoru a mutáciou BRCA1 s vyšším podielom nádorov G3 u nositeľov BRCA1 v porovnaní s nenositeľmi (p < 0,005) (Obrázok 5B).
Pokroky v technológii sekvenovania DNA umožnili bezprecedentný pokrok v genetickom testovaní BRCA1/2, čo má kľúčové dôsledky pre pacientov s rodinnou anamnézou rakoviny. Doteraz bolo identifikovaných a klasifikovaných približne 20 000 variantov BRCA1/2 podľa Americkej spoločnosti pre lekársku genetiku35 a systému ENIGMA.35,36 Je dobre známe, že mutačné spektrum BRCA1/2 sa v jednotlivých geografických oblastiach značne líši.37 V Taliansku sa miera výskytu BRCA1/2 PV pohybovala od 8 % do 37 %, čo vykazuje širokú variabilitu v rámci krajiny.38,39 S populáciou takmer 5 miliónov je Sicília piatym najväčším regiónom v Taliansku z hľadiska počtu obyvateľov. Hoci existujú údaje o rozšírení BRCA1/2 v západnej Sicílii, vo východnej časti ostrova neexistujú rozsiahle dôkazy.
Naša štúdia je jednou z prvých správ o výskyte BRCA1/2 paracetamolu u pacientok s karcinómom prsníka (BC) vo východnej Sicílii.28 Našu analýzu sme zamerali na BC, pretože ide o zďaleka najčastejšie ochorenie v našej kohorte.
Pri testovaní 389 pacientov s rakovinou prsníka (BC) malo 9 % pacientov BRCA1/2 paralytické varixy (PV), rovnomerne rozdelené medzi BRCA1 a BRCA2. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami, ktoré boli predtým hlásené v talianskej populácii.28 Je zaujímavé, že 3 % (13/389) z našej kohorty boli muži. Táto miera je vyššia, ako sa očakávalo pri rakovine prsníka u mužov (1 % všetkých BC),40 čo odráža náš výber populácií na základe rizika mutácie BRCA1/2. U žiadneho z týchto mužov sa však nevyvinuli PV BRCA1/2, takže boli kandidátmi na ďalšiu molekulárnu analýzu, aby sa vylúčila prítomnosť menej bežných mutácií, ako sú okrem iných PALB2, RAD51C a D. Varianty s neistým významom boli získané u 7 % subjektov, u ktorých bola evidentná VUS BRCA2. Aj tento výsledok je v súlade s už existujúcimi dôkazmi.28,41,42
Keď sme analyzovali distribúciu molekulárnych podtypov BC u žien s mutáciou BRCA1/2, potvrdili sme známe súvislosti medzi TNBC a BRCA1 PV (58,8 %) a medzi luminálnou B BC a BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Luminálne A a HER2+ nádory u nositeľov BRCA1 a BRCA2 PV sú v súlade s existujúcimi údajmi z literatúry.16,43
Potom sa zameriavame na typ a lokalizáciu BRCA1/2 PV. V našej kohorte bol najčastejším BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT. Hoci Incorvaia a kol. tento variant vo svojej sicílskej kohorte neopísali, iní autori ho uviedli ako zárodočný variant BRCA1 PV.34 V našej kohorte sa našlo niekoľko BRCA1 PV – napr. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA a c.5266dupC – ktoré boli pozorované na Sicílii.28 Z nich sa dve zakladajúce mutácie BRCA1 (c.181T>G a c.5266dupC) bežne vyskytujú u aškenázskych Židov vo východnej a strednej Európe (Poľsko, Česko), Slovinsko, Rakúsko, Maďarsko, Bielorusko a Nemecko),44,45 a v Spojených štátoch a Argentíne bol nedávno definovaný ako „rekurentný zárodočný variant“ u talianskych pacientok s rakovinou prsníka a rakovinou prsníka. Variant 34c.514del bol predtým identifikovaný u 8 pacientok s rakovinou prsníka zo severnej Sicílie v Palerme a Messine. Je zaujímavé, že aj Incorvaia a kol. zistili variant c.3253dupA v niektorých rodinách v Catanii.28 Najreprezentatívnejšie BRCA2 PV sú c.428dup, c.5851_5854delAGTT a intrónový variant c.8487+1G>A, ktoré boli podrobnejšie hlásené28 u pacienta v Palerme s c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV bol pozorovaný v domácnostiach v severozápadnej Sicílii, najmä v regiónoch Trapani a Palermo, zatiaľ čo c.5851_5854delAGTT PV bol pozorovaný v domácnostiach v severozápadnej Sicílii. Variant 8487+1G>A bol častejší u subjektov z Messiny, Palerma a Caltanissetty.28 Rebbeck a kol. predtým opísali alteráciu c.5851_5854delAGTT v Kolumbii.37 Ďalší BRCA2 PV, c.631+1G>A, bol nájdený u pacientok s BC a OC zo Sicílie (Agrigento, Siracusa a Ragusa).28 Je pozoruhodné, že sme pozorovali koexistenciu dvoch variantov BRCA2 (BRCA2 c.631G>A a c.7008-2A>T) u tej istej pacientky, o ktorých sme predpokladali, že sú segregované v cis móde, ako bolo predtým hlásené.34,46 Tieto mutácie BRCA2 sa skutočne často pozorujú v talianskom regióne a zistilo sa, že zavádzajú predčasné stop kodóny, ktoré ovplyvňujú zostrih mediátorovej RNA a spôsobujú zlyhanie proteínu BRCA2.47,48
Taktiež sme zmapovali PV BRCA1 a BRCA2 v predpokladaných oblastiach OCCR a BCCR proteínových domén a génov. Tieto oblasti Rebbeck a kol. opísali ako rizikové oblasti pre rozvoj rakoviny vaječníkov a prsníka.49 Dôkazy týkajúce sa súvislosti medzi umiestnením variantov zárodočnej línie a rizikom rakoviny prsníka alebo vaječníkov však zostávajú kontroverzné.28,50-52 V našej populácii sa PV BRCA1 nachádzali prevažne v oblasti BCCR, zatiaľ čo PV BRCA2 sa nachádzali prevažne v oblasti OCCR. Nepodarilo sa nám však nájsť žiadnu súvislosť medzi predpokladanými oblasťami OCCR a BCCR a znakmi BC. Môže to byť spôsobené obmedzeným počtom pacientov s mutáciami BRCA1/2. Z hľadiska proteínovej domény sú PV BRCA1 rozmiestnené pozdĺž celého proteínu a zmeny BRCA2 sa prednostne nachádzajú v opakujúcej sa doméne BRC.
Nakoniec sme korelovali klinicko-patologické znaky rakoviny prsníka s BRCA1/2 parafrázou. Vzhľadom na obmedzený počet zahrnutých pacientok sme zistili významnú koreláciu iba medzi Ki-67 a stupňom nádoru. Hoci hodnotenie a interpretácia Ki-67 zostáva do istej miery kontroverzná, je isté, že vysoká miera proliferácie je spojená so zvýšeným rizikom recidívy ochorenia a zníženým prežitím. Doteraz je hraničná hodnota pre rozlíšenie medzi „vysokou“ a „nízkou“ Ki-67 20 %. Táto hranica sa však nevzťahuje na našu populáciu pacientok s mutáciou BRCA1/2, ktorá má medián hodnoty Ki-67 25 %. Tento trend vysokých mier Ki-67 možno vysvetliť prevalenciou v našich kohortách luminálneho B a TNBC, z ktorých bolo prítomných len málo nádorov luminálneho A. Niektoré dôkazy však naznačujú, že vyššia hraničná hodnota Ki-67 (25 – 30 %) môže lepšie stratifikovať pacientok podľa ich prognózy.53,54 Z výsledkov našej analýzy nevyplýva, že významná korelácia je prekvapujúca. Vyskytuje sa medzi vysokou Ki-67 a stupňami a prítomnosťou BRCA1. PV. V skutočnosti sú nádory súvisiace s BRCA1 typické pre TNBC a vykazujú agresívnejšie znaky.16,17
Záverom možno povedať, že táto štúdia poskytuje správu o mutačnom stave BRCA1/2 v kohorte pacientov s rakovinou prsníka z východnej Sicílie. Celkovo sú naše zistenia v súlade s existujúcimi dôkazmi, a to ako z hľadiska prevalencie mutácií, tak aj klinicko-patologických znakov rakoviny prsníka. Na posúdenie prítomnosti paracetamolových mutácií (PV), ktoré sú odlišné a menej časté ako BRCA1/2, je potrebné vykonať ďalšie štúdie na väčších populáciách pacientov s rakovinou prsníka s mutáciou BRCA1/2, ako napríklad s použitím multigenómovej rozšírenej mutačnej analýzy. To umožní identifikáciu a správnu liečbu rastúceho počtu subjektov so zvýšeným rizikom rakoviny v dôsledku genetických mutácií.
Potvrdili sme, že pacienti podpísali informovaný súhlas s anonymným sprístupnením vzoriek svojich nádorov na výskumné účely. Všetci pacienti podpísali písomný informovaný súhlas v súlade s Helsinskou deklaráciou. Podľa politiky AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“ bola táto štúdia oslobodená od etického posudzovania, pretože analýza BRCA1/2 bola vykonaná v súlade s klinickou praxou a všetci pacienti poskytli písomný informovaný súhlas. Pacienti tiež súhlasia s použitím svojich údajov na výskumné účely.
Ďakujeme profesorovi Paolovi Vignerimu za jeho pomoc pri starostlivosti o pacientky s rakovinou prsníka, ako o to požiadala Etická komisia.
Federica Martorana uvádza honoráre od spoločností Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis a Pfizer. Ostatní autori vyhlasujú, že v tejto práci nemajú žiadny konflikt záujmov.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL a kol. Globálna štatistika rakoviny 2020: GLOBOCAN odhaduje incidenciu a úmrtnosť 36 druhov rakoviny v 185 krajinách sveta. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660