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स्टेला एस, विटाले एसआर, मार्टोराना एफ, मासिमिनो एम, पावोन जी, लैंज़ाफेम के, बियांका एस, बैरोन सी, गोर्गोन सी, फिचेरा एम, मंजेला एल
स्टेफ़ानिया स्टेला, 1,2 सिल्विया रीटा विटाले, 1,2 फेडेरिका मार्टोराना, 1,2 मिशेल मासिमिनो, 1,2 गिउलिआना पावोन, 3 कटिया लान्ज़ाफेम, 3 सेबेस्टियानो बियांका, 4 चियारा बैरोन, 5 क्रिस्टीना गोर्गोन, 6 मार्को फिचेरा, 6, 7 लिविया मंज़ेला1,21 क्लिनिकल और प्रायोगिक चिकित्सा विभाग, विश्वविद्यालय कैटेनिया, कैटेनिया, 95123, इटली; 2 सेंटर फॉर एक्सपेरिमेंटल ऑन्कोलॉजी एंड हेमेटोलॉजी, एओयू पोलिक्लिनिको "जी.रोडोलिको - सैन मार्को", कैटेनिया, 95123, इटली; 3 मेडिकल ऑन्कोलॉजी, एओयू पोलिक्लिनिको "जी. रोडोलिको - सैन मार्को", कैटेनिया, 95123, इटली; 4 मेडिकल जेनेटिक्स, अरनस गैरीबाल्डी, कैटेनिया, 95123, इटली; 5 मेडिसिन जेनेटिक्स, एएसपी, सिरैक्यूज़, 96100, इटली; 6 बायोमेडिकल और बायोटेक्नोलॉजी विज्ञान विभाग, कैटेनिया विश्वविद्यालय, मेडिकल जेनेटिक्स, कैटेनिया, इटली, 95123; 7ओएसी रिसर्च इंस्टीट्यूट-आईआरसीसीएस, ट्रोइना, 94018, इटली संचार: स्टेफनिया स्टेला, दूरभाष +39 095 378 1946, ईमेल [email protected]; [email protected] उद्देश्य: BRCA1 और BRCA2 में जर्मलाइन उत्परिवर्तन और स्तन कैंसर (BC), अंडाशय (OC) और अन्य कैंसर के आजीवन जोखिम से जुड़े स्थापित रोग। BRCA जीन के लिए परीक्षण व्यक्तिगत जोखिम का आकलन करने के साथ-साथ स्वस्थ वाहकों में रोकथाम के तरीके खोजने और कैंसर रोगियों में उपचार तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। BRCA1 और BRCA2 परिवर्तनों का प्रचलन भौगोलिक क्षेत्रों में व्यापक रूप से भिन्न होता है, और हालांकि सिसिली के परिवारों में BRCA रोगजनक रूपों पर डेटा मौजूद है, पूर्वी सिसिली में आबादी को लक्षित करने वाले अध्ययनों की कमी है। हमारे अध्ययन का उद्देश्य पूर्वी सिसिली के BC रोगियों के एक समूह में BRCA रोगजनक जर्मलाइन परिवर्तनों की घटनाओं और वितरण की जांच करना और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके विशिष्ट BC लक्षणों के साथ उनके जुड़ाव का आकलन करना था। ट्रिपल-नेगेटिव बीसी रोगियों में BRCA2.BRCA1 परिवर्तन प्रचलित हैं, जबकि ल्यूमिनल बीसी रोगियों में BRCA2 उत्परिवर्तन अधिक आम हैं। गैर-वाहकों की तुलना में, BRCA1 वेरिएंट वाले विषयों में ट्यूमर ग्रेड और प्रोलिफेरेटिव इंडेक्स काफी अधिक था। निष्कर्ष: हमारे निष्कर्ष पूर्वी सिसिली के बीसी रोगियों में BRCA उत्परिवर्तन स्थिति का अवलोकन प्रदान करते हैं और वंशानुगत बीसी वाले रोगियों की पहचान करने में NGS विश्लेषण की भूमिका की पुष्टि करते हैं। कुल मिलाकर, ये डेटा उत्परिवर्तन वाहकों में कैंसर की उचित रोकथाम और उपचार के लिए BRCA स्क्रीनिंग का समर्थन करने वाले पिछले साक्ष्य के अनुरूप हैं।
स्तन कैंसर (बीसी) दुनिया भर में सबसे आम दुर्दांत बीमारी है और महिलाओं में सबसे जानलेवा कैंसर है।1 बीसी के निदान और नैदानिक ​​व्यवहार को निर्धारित करने वाली जैविक विशेषताओं का समय के साथ बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और आंशिक रूप से स्पष्ट किया गया है। वास्तव में, बीसी को विभिन्न आणविक उपप्रकारों में वर्गीकृत करने के लिए वर्तमान में कई सरोगेट मार्करों का उपयोग किया जाता है। वे एस्ट्रोजन (ईआर) और/या प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीजीआर), मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (एचईआर 2) प्रवर्धन, प्रसार सूचकांक की-67 और ट्यूमर ग्रेड (जी) हैं।2 इन चरों के संयोजन ने निम्नलिखित बीसी श्रेणियों की पहचान की: 1) ईआर और/या पीजीआर अभिव्यक्ति दिखाने वाले ल्यूमिनल ट्यूमर, बीसी के 75% के लिए जिम्मेदार हैं। 2) HER2+ ट्यूमर जो ER और PgR नेगेटिव होते हैं, लेकिन HER2 प्रवर्धन दिखाते हैं। यह समूह सभी स्तन ट्यूमर का 10% होता है; 3) ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर (TNBC), जो ER और PgR अभिव्यक्ति और HER2 प्रवर्धन नहीं दिखाता है, स्तन कैंसर का लगभग 15% होता है।2-4
इन बीसी उपप्रकारों में, ट्यूमर ग्रेड और प्रसार सूचकांक क्रॉस-सेक्शनल बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व करते हैं जो सीधे और स्वतंत्र रूप से ट्यूमर की आक्रामकता और रोग का निदान से जुड़े होते हैं।5,6
उपर्युक्त जैविक विशेषताओं के अतिरिक्त, बीसी के विकास के लिए वंशानुगत आनुवंशिक परिवर्तनों की भूमिका पिछले कुछ वर्षों में तेजी से महत्वपूर्ण हो गई है।7 लगभग 10 में से 1 स्तन ट्यूमर विशिष्ट जीन में जर्मलाइन परिवर्तनों के कारण वंशानुगत होता है।8 180,000 से अधिक महिलाओं को शामिल करने वाले दो बड़े महामारी विज्ञान अध्ययनों ने हाल ही में आठ जीनों के एक समूह की पहचान की है (यानी, एटीएम, बीएआरडी1, बीआरसीए1, बीआरसीए2, सीएचके2, पीएएलबी2, आरएडी51सी और आरएडी51डी) जो मुख्य रूप से वंशानुगत बीसी के लिए जिम्मेदार हैं। इन जीनों में से, बीआरसीए1 और बीआरसीए2 (जिसे आगे बीआरसीए1/2 कहा जाएगा) ने स्तन ट्यूमर के विकास के साथ सबसे मजबूत सहसंबंध दिखाया।9-12 वास्तव में, जर्मलाइन बीआरसीए1/2 उत्परिवर्तन बीसी के साथ-साथ अन्य दुर्दांत बीमारियों, जैसे डिम्बग्रंथि, प्रोस्टेट, अग्नाशय, कोलोरेक्टल और मेलेनोमा के आजीवन जोखिम को काफी बढ़ा देते हैं। BRCA1 रोगजनक संस्करण (PV) वाली महिलाओं में 72% और BRCA2 PV वाली महिलाओं में 69%.14
उल्लेखनीय रूप से, एक हालिया प्रकाशन से पता चलता है कि बीसी जोखिम पीवी के प्रकार पर निर्भर करता है। वास्तव में, रोगजनक ट्रंकेशन वेरिएंट की तुलना में, स्पष्ट मिसेंस वेरिएंट, विशेष रूप से BRCA1 जीन में, बीसी के कम जोखिम से जुड़े हैं, विशेष रूप से वृद्ध महिलाओं में।15
BRCA1 या BRCA2 PV की उपस्थिति विभिन्न जैविक और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं से जुड़ी हुई थी।16,17 BRCA1-संबंधित BCs चिकित्सकीय रूप से आक्रामक, खराब रूप से विभेदित और अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव होते हैं। ये ट्यूमर आमतौर पर ट्रिपल नेगेटिव होते हैं और इनकी शुरुआत कम उम्र में होती है। BRCA2-उत्परिवर्तित रोगियों में होने वाले ट्यूमर आमतौर पर मध्यम से अच्छी तरह से विभेदित ग्रेड और परिवर्तनशील प्रोलिफेरेटिव इंडेक्स प्रदर्शित करते हैं। ये ट्यूमर लुमेन बी में अधिक आम हैं और आमतौर पर वृद्ध वयस्कों में होते हैं।16-18 उल्लेखनीय रूप से, BRCA1 और BRCA2 में उत्परिवर्तन प्लैटिनम लवण और लक्षित दवाओं जैसे पॉली (ADP-राइबोज) पॉलीमरेज़ अवरोधक (PARPi) सहित विशिष्ट उपचारों के प्रति संवेदनशीलता बढ़ाते हैं।19,20
पिछले कुछ वर्षों में, नैदानिक ​​अभ्यास में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के कार्यान्वयन ने बीआरसीए 1/2 सहित कैंसर संवेदनशीलता सिंड्रोम के लिए आणविक परीक्षण से गुजरने वाले बीसी रोगियों की बढ़ती संख्या को सक्षम किया है। 21 इसके साथ ही, बीआरसीए 1/2 परीक्षण के योग्य व्यक्तियों की बेहतर पहचान करने के लिए पारिवारिक इतिहास, जनसांख्यिकीय और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के बारे में सटीक मानदंडों के आधार पर परिभाषाएं। 22,23 इस संदर्भ में, विशिष्ट आबादी में बीआरसीए 1/2 स्क्रीनिंग पर साक्ष्य जमा हो रहे हैं, जो भौगोलिक क्षेत्रों में अंतर को उजागर करते हैं। 24–27 हालांकि पश्चिमी सिसिली में बीसी कोहोर्ट पर रिपोर्टें हैं, पूर्वी सिसिली की आबादी में बीआरसीए 1/2 स्क्रीनिंग पर कम डेटा उपलब्ध हैं।
हम यहां पूर्वी सिसिली के बीसी रोगियों में जर्मलाइन BRCA1/2 स्क्रीनिंग के परिणामों का वर्णन करते हैं, तथा इन ट्यूमर की मुख्य क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के साथ BRCA1 या BRCA2 उत्परिवर्तन की उपस्थिति का सहसंबंध स्थापित करते हैं।
कैटेनिया में रोडोलिको - सैन मार्को के पोलीक्लिनिको अस्पताल में "प्रायोगिक ऑन्कोलॉजी और हेमेटोलॉजी केंद्र" में एक पूर्वव्यापी अध्ययन किया गया था। जनवरी 2017 से मार्च 2021 तक, स्तन और डिम्बग्रंथि, मेलेनोमा, अग्नाशय या प्रोस्टेट कैंसर वाले कुल 455 रोगियों को BRCA/2 आनुवंशिक परीक्षण के लिए हमारी आणविक नैदानिक ​​​​प्रयोगशाला में भेजा गया था। यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार आयोजित किया गया था, और सभी प्रतिभागियों ने आणविक विश्लेषण से पहले लिखित सूचित सहमति प्रदान की थी।
बीसी के ऊतकीय और जैविक विशेषताओं (ईआर, पीजीआर, एचईआर2 स्थिति, की-67, और ग्रेड) का मूल्यांकन कोर बायोप्सी या सर्जिकल नमूनों पर किया गया, जिसमें केवल आक्रामक ट्यूमर घटकों पर विचार किया गया। इन विशेषताओं के आधार पर, बीसी को निम्नानुसार वर्गीकृत किया गया: ल्यूमिनल ए (ईआर+ और/या पीजीआर+, एचईआर2-, की-67<20%), ल्यूमिनल बी (ईआर+ और/या पीजीआर+, एचईआर2-, की-67≥20%), ल्यूमिनल बी-एचईआर2+ (ईआर और/या पीजीआर+, एचईआर2+), एचईआर2+ (ईआर और पीजीआर-, एचईआर2+) या ट्रिपल नेगेटिव (ईआर और पीजीआर-, एचईआर2-)।
BRCA1 और BRCA2 उत्परिवर्तन स्थिति का आकलन करने से पहले, एक ओंकोलॉजिस्ट, एक आनुवंशिकीविद् और एक मनोवैज्ञानिक सहित बहु-विषयक टीम ने BRCA1 और/या BRCA1 की मौजूदगी निर्धारित करने के लिए प्रत्येक रोगी के लिए एक ट्यूमर आनुवंशिकी परामर्श आयोजित किया। या BRCA2 जीन में PV के उच्च जोखिम वाले व्यक्ति। रोगी का चयन इतालवी सोसाइटी ऑफ मेडिकल ऑन्कोलॉजी (AIOM) के दिशानिर्देशों और स्थानीय सिसिली सिफारिशों के अनुसार किया गया था।30,31 इन मानदंडों में शामिल हैं: (i) संवेदनशीलता जीन में ज्ञात रोगजनक वेरिएंट का पारिवारिक इतिहास (उदाहरण के लिए, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) BC वाले पुरुष; (iii) BC और OC वाले; (iv) BC <36 वर्ष, TNBC <60 वर्ष, या द्विपक्षीय BC <50 वर्ष वाली महिलाएं; (सी) द्विपक्षीय बीसी; (डी) पुरुष बीसी; (ई) अग्नाशय कैंसर; (एफ) प्रोस्टेट कैंसर; (vi) दो या अधिक बीसी का व्यक्तिगत इतिहास > 50 वर्ष और बीसी, ओसी, या अग्नाशय कैंसर का पारिवारिक इतिहास उन रिश्तेदारों के लिए जो एक-दूसरे के प्रथम-डिग्री रिश्तेदार हैं (उन रिश्तेदारों सहित जिनके साथ वह प्रथम-डिग्री रिश्तेदार है); (vii) ओसी और कम से कम एक प्रथम-डिग्री रिश्तेदार का व्यक्तिगत इतिहास: (ए) बीसी <50 वर्ष; (बी) एनओसी; (सी) द्विपक्षीय बीसी; (डी) पुरुष बीसी; (vii) उच्च ग्रेड सीरस ओसी वाली महिला।
प्रत्येक रोगी से 20 एमएल परिधीय रक्त का नमूना लिया गया और EDTA ट्यूबों (BD बायोसाइंसेज) में एकत्र किया गया। जीनोमिक डीएनए को निर्माता के निर्देशों के अनुसार QIAsymphony DSP DNA मिडी किट आइसोलेशन किट (QIAGEN, हिल्डेन, इटली) का उपयोग करके 0.7 एमएल पूरे रक्त के नमूनों से अलग किया गया और एक Qubit® 3.0 फ्लोरोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, MA, USA) के माध्यम से पारित किया गया। मात्रा का ठहराव करें। लक्ष्य संवर्धन और लाइब्रेरी की तैयारी ऑनकोमाइन™ BRCA रिसर्च परख शेफ द्वारा की जाती है, जो निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्वचालित लाइब्रेरी तैयारी के लिए आयन एम्पलीसेक™ शेफ अभिकर्मकों DL8 किट में लोड होने के लिए तैयार है। किट में दो मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्राइमर पूल शामिल हैं जिनका उपयोग सभी BRCA1 (NM_007300.3) और BRCA2 (NM_000059.3) जीन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, लाइब्रेरी की तैयारी के लिए बारकोड वाली प्लेटों में प्रत्येक पतला नमूना डीएनए (10 एनजी) के 15 µL को जोड़ा गया और सभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों को आयन शेफ™ उपकरण पर लोड किया गया। निर्देश। अंत में, पुस्तकालयों को आयन शेफ™ लाइब्रेरी नमूना ट्यूबों (बारकोडेड ट्यूब) में सममोलर अनुपात में संयोजित किया जाता है और आयन शेफ™ उपकरण पर लोड किया जाता है। अनुक्रमण एक आयन 510 चिप (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके आयन टोरेंट एस5 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) उपकरण (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करके किया गया था। डेटा विश्लेषण एम्प्लीकॉन सूट (स्मार्टसेक एसआरएल) और आयन रिपोर्टर सॉफ्टवेयर द्वारा किया गया था।
सभी वेरिएंट नामकरण में ह्यूमन जीनोम वेरिएशन कंसोर्टियम के वर्तमान दिशानिर्देशों का पालन किया गया है, जो ऑनलाइन उपलब्ध हैं (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen)। BRCA1/2 वेरिएंट के नैदानिक ​​महत्व को इंटरनेशनल कंसोर्टियम ENIGMA (जर्मलाइन म्यूटेंट एलील्स की व्याख्या करने के लिए साक्ष्य-आधारित नेटवर्क, https://enigmaconsortium.org/) के वर्गीकरण का उपयोग करके और ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD और UMD जैसे विभिन्न डेटाबेस से परामर्श करके परिभाषित किया गया था। वर्गीकरण में पांच अलग-अलग जोखिम श्रेणियां शामिल हैं: सौम्य (श्रेणी I), संभावित सौम्य (श्रेणी II), अनिश्चित महत्व का वेरिएंट (VUS, श्रेणी III), संभावित रोगजनक (श्रेणी IV) और रोगजनक (श्रेणी V)।
प्रत्येक VUS को संभावित नैदानिक ​​महत्व प्रदान करने के लिए, निम्नलिखित कम्प्यूटेशनल प्रोटीन भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग किया गया: म्यूटेशन टैस्टर, 33 प्रोवियन-सिफ्ट (http://provean.jcvi.org/index.php), पॉलीफेन-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) और एलाइन-जीवीजीडी (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php)। वर्ग 1 और 2 के रूप में वर्गीकृत वेरिएंट को वाइल्ड टाइप माना गया।
सैंगर अनुक्रमण ने प्रत्येक रोगजनक संस्करण की उपस्थिति की पुष्टि की। संक्षेप में, BRCA1 और BRCA2 जीन संदर्भ अनुक्रमों (क्रमशः NG_005905.2, NM_007294.3 और NG_012772.3, NM_000059.3) का उपयोग करके प्रत्येक पता लगाए गए संस्करण के लिए विशिष्ट प्राइमरों की एक जोड़ी तैयार की गई थी। इसलिए, लक्षित पीसीआर का प्रदर्शन किया गया, जिसके बाद सैंगर अनुक्रमण किया गया।
जिन रोगियों के BRCA1/2 जीन के लिए नकारात्मक परीक्षण किए गए थे, उनका परीक्षण बड़े जीनोमिक पुनर्व्यवस्था (LGR) की उपस्थिति का आकलन करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार मल्टीप्लेक्स लिगेशन-आश्रित जांच प्रवर्धन (MLPA) द्वारा किया गया था। संक्षेप में, DNA नमूनों को विकृत किया जाता है और 60 BRCA1 और BRCA2 जीन-विशिष्ट जांचों का उपयोग किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक लगभग 60 न्यूक्लियोटाइड की लंबाई के एक विशिष्ट DNA अनुक्रम का पता लगाता है। जांच प्रवर्धन उत्पादों, जिसमें PCR एम्प्लीकॉन्स का एक अनूठा सेट शामिल होता है, का विश्लेषण केशिका वैद्युतकणसंचलन और Cofalyser.Net सॉफ्टवेयर द्वारा उपयुक्त बैच-विशिष्ट Cofalyser तालिकाओं (www.mrcholland.com) के संयोजन में किया गया।
चयनित क्लिनिकोपैथोलॉजिकल चर (हिस्टोलॉजिकल ग्रेड और Ki-67% प्रसार सूचकांक) BRCA1/2 PV की उपस्थिति से जुड़े थे, जिसकी गणना प्रिज्म सॉफ्टवेयर v. 8.4 का उपयोग करके फिशर के सटीक परीक्षण का उपयोग करके की गई थी, जिसमें p-मान <0.05 को महत्वपूर्ण माना गया था।
जनवरी 2017 और मार्च 2021 के बीच, 455 रोगियों की जर्मलाइन BRCA1/2 म्यूटेशन के लिए जांच की गई। म्यूटेशन परीक्षण पोलीक्लिनिको अस्पताल के प्रायोगिक ऑन्कोलॉजी और हेमटोलॉजी केंद्र में किया गया। सिसिलियन गाइडलाइन (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020) के अनुसार, कैटेनिया के रोडोलिको - सैन मार्को में कुल मिलाकर, 389 मरीज़ स्तन कैंसर, 37 डिम्बग्रंथि के कैंसर, 16 अग्नाशय के कैंसर, 8 प्रोस्टेट कैंसर और 5 मेलेनोमा के थे। कैंसर के प्रकार और विश्लेषण परिणामों के अनुसार रोगियों का वितरण चित्र 1 में दिखाया गया है।
चित्र 1 में अध्ययन का अवलोकन दर्शाने वाला प्रवाह चार्ट दिखाया गया है। स्तन, मेलेनोमा, अग्नाशय, प्रोस्टेट या डिम्बग्रंथि ट्यूमर वाले मरीजों का BRCA1 और BRCA2 जीन में उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण किया गया।
संक्षिप्त रूप: पी.वी.एस., रोगजनक प्रकार; वी.यू.एस., अनिश्चित महत्व का प्रकार; डब्ल्यू.टी., जंगली प्रकार का BRCA1/2 अनुक्रम।
हमने अपने अध्ययनों को स्तन कैंसर के समूहों पर चुनिंदा रूप से केंद्रित किया। रोगियों की औसत आयु 49 वर्ष (सीमा 23-89) थी और वे मुख्य रूप से महिलाएं थीं (n=376, या 97%)।
इन विषयों में से, 64 (17%) में BRCA1/2 उत्परिवर्तन थे और वे सभी महिलाएं थीं। पैंतीस (9%) में PV था और 29 (7.5%) में VUS था। 35 रोगजनक रूपों में से सत्रह (48.6%) BRCA1 में और 18 (51.4%) BRCA2 में पाए गए, जबकि 5 VUS BRCA1 (17.2%) में और 24 (82.8%) BRCA2 में पाए गए (आंकड़े 1 और 2)। एमएलपीए विश्लेषण में एलजीआर मौजूद नहीं था।
चित्र 2. 389 स्तन कैंसर रोगियों में BRCA1 और BRCA2 उत्परिवर्तनों का विश्लेषण। (A) 389 स्तन कैंसर रोगियों में रोगजनक वेरिएंट (PV) (लाल), अनिश्चित महत्व के वेरिएंट (VUS) (नारंगी), और WT (नीला) का वितरण; (B) 389 स्तन कैंसर रोगी 35 (9%) में BRCA1/2 रोगजनक वेरिएंट (PVs) थे। उनमें से, 17 (48.6%) BRCA1 PV वाहक (गहरा लाल) और 18 (51.4%) BRCA2 वाहक (हल्का लाल) थे; (C) 389 विषयों में से 29 (7.5%) में VUS, 5 (17.2%) BRCA1 जीन (गहरा नारंगी) और 24 (82.8%) BRCA2 जीन (हल्का नारंगी) थे।
संक्षिप्त रूप: पी.वी.एस., रोगजनक प्रकार; वी.यू.एस., अनिश्चित महत्व का प्रकार; डब्ल्यू.टी., जंगली प्रकार का BRCA1/2 अनुक्रम।
हमने आगे BRCA1/2 PV वाले रोगियों में BC आणविक उपप्रकारों की व्यापकता की जांच की। वितरण में 2 (5.7%) ल्यूमिनल A, 15 (42.9%) ल्यूमिनल B, 3 (8.6%) ल्यूमिनल B-HER2+, 2 (5.7%) HER2+ और 13 (37.1%) TNBC रोगी शामिल थे। BRCA1 पॉजिटिव रोगियों में, 5 (29.4%) में ल्यूमिनल B BC, 2 (11.8%) में HER2+ रोग और 10 (58.8%) में TNBC था। BRCA1 उत्परिवर्तन के बिना ट्यूमर या तो ल्यूमिनल A या ल्यूमिनल B-HER2+ थे (चित्र 3)। BRCA2 पॉजिटिव उपसमूह में, 10 (55.6%) ट्यूमर ल्यूमिनल B, 3 (16.7%) ल्यूमिनल B-HER2+, 3 (16.7%) TNBC और 2 (11.1%) ल्यूमिनल ए थे (चित्र 3)। इस समूह में कोई HER2+ ट्यूमर मौजूद नहीं था। इस प्रकार, BRCA1 उत्परिवर्तन TNBC रोगियों में प्रचलित हैं, जबकि BRCA2 परिवर्तन लुमेन बी व्यक्तियों में प्रमुख हैं।
चित्र 3 BRCA1 और BRCA2 में रोगजनक वेरिएंट वाले रोगियों में स्तन कैंसर उपप्रकारों की व्यापकता। स्तन कैंसर रोगियों के आणविक उपप्रकारों के बीच BRCA1- (गहरा लाल) और BRCA2- (हल्का लाल) PV के वितरण को दर्शाने वाला हिस्टोग्राम। प्रत्येक बॉक्स में बताई गई संख्याएं प्रत्येक स्तन कैंसर उपप्रकार के लिए BRCA1 और BRCA2 PV वाले रोगियों के प्रतिशत को दर्शाती हैं।
संक्षिप्त रूप: पी.वी.एस., रोगजनक संस्करण; एच.ई.आर.2+, मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 पॉजिटिव; टी.एन.बी.सी., ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर।
इसके बाद, हमने BRCA1 और BRCA2 PV के प्रकार और जीन स्थानीयकरण का आकलन किया। BRCA1 PV में, हमने 7 एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (SNV), 6 विलोपन, 3 दोहराव और 1 सम्मिलन देखा। केवल एक उत्परिवर्तन (c.5522delG) एक नई खोज का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों विषयों में पता चला सबसे आम BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT था। इस परिवर्तन में BRCA1 एक्सॉन 15 में पांच न्यूक्लियोटाइड (CTAAT) का विलोपन शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप कोडन 1679 पर टाइरोसिन द्वारा अमीनो एसिड ल्यूसीन का प्रतिस्थापन होता है, और एक अनुमानित वैकल्पिक स्टॉप कोडन के साथ अनुवाद फ्रेमशिफ्ट के कारण समय से पहले प्रोटीन ट्रंकेशन होता है।
BRCA2 PV के संबंध में, हमने 6 विलोपन, 6 SNV और 2 दोहराव देखे। पाए गए परिवर्तनों में से कोई भी नया नहीं है। हमारी आबादी में तीन उत्परिवर्तन दोहराए गए, c.428dup और c.8487+1G>A 3 विषयों में देखे गए, इसके बाद c.5851_5854delAGTT दो मामलों में प्राप्त हुआ। c.428dup परिवर्तन में BRCA2 के एक्सॉन 5 में C की पुनरावृत्ति शामिल है, जो एक काटे गए, गैर-कार्यात्मक प्रोटीन को एनकोड करने का अनुमान है। c.8487+1G>A उत्परिवर्तन BRCA2 इंट्रॉन 19 (± 1,2) के इंट्रॉनिक क्षेत्र में होता है और स्प्लिसिंग सहमति अनुक्रम को प्रभावित करता है, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तित स्प्लिसिंग होता है जिसके परिणामस्वरूप असामान्य या अनुपस्थित प्रोटीन होता है 5854 को BRCA2 जीन के कोडिंग एक्सॉन 10 में परिवर्तित करता है और इसके परिणामस्वरूप एक पूर्वानुमानित वैकल्पिक स्टॉप कोडॉन (p.S1951WfsTer) के साथ ट्रांसलेशनल फ्रेमशिफ्ट होता है। उल्लेखनीय रूप से, जैसा कि पहले बताया गया है, दोनों परिवर्तन c.631G>A और c.7008-2A>T एक ही रोगी में पाए गए थे।34 पहले उत्परिवर्तन में BRCA2 एक्सॉन 7 में एडेनोसिन (A) को ग्वानिन (G) युक्त न्यूक्लियोटाइड से प्रतिस्थापित करना शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप कोडॉन 211 पर वैलीन का आइसोल्यूसिन में परिवर्तन होता है, आइसोल्यूसिन एमिनो एसिड एक एमिनो एसिड है जिसके गुण बहुत समान होते हैं। यह परिवर्तन सामान्य mRNA स्प्लिसिंग को प्रभावित करता है। दूसरा प्रकार एक इंट्रोनिक क्षेत्र में स्थित होता है और इसके परिणामस्वरूप BRCA2 को कोड करने वाले जीन के एक्सॉन 13 से पहले A से थाइमिन (T) का दोहरा प्रतिस्थापन होता है BRCA2 PVs, 18 में से 4 परिवर्तन (22.2%) इंट्रॉनिक थे।
फिर हमने कार्यात्मक डोमेन और प्रोटीन-बाइंडिंग क्षेत्रों में BRCA1/2 हानिकारक उत्परिवर्तनों का मानचित्रण किया (चित्र 4)। BRCA1 जीन में, 50% PV स्तन कैंसर क्लस्टर क्षेत्र (BCCR) में स्थित थे, जबकि 22% उत्परिवर्तन डिम्बग्रंथि के कैंसर क्लस्टर क्षेत्र (OCCR) में स्थित थे (चित्र 4A)। BRCA2 PV में, 35.7% वेरिएंट BCCR क्षेत्र में स्थित थे और 42.8% उत्परिवर्तन OCCR में स्थित थे (चित्र 4B)। इसके बाद, हमने BRCA1 और BRCA2 प्रोटीन डोमेन के भीतर PV के स्थान का आकलन किया। BRCA1 प्रोटीन के लिए, हमने लूप और कॉइल्ड कॉइल डोमेन में तीन PV और BRCT डोमेन में दो उत्परिवर्तन पाए (चित्र 4A)। BRCA2 प्रोटीन के लिए, BRC रिपीट डोमेन में 4 PV मैप किए गए ओलिगो/ओलिगोसेकेराइड-बाइंडिंग (ओबी) और टावर (टी) डोमेन (चित्र 4बी)।
आकृति 4 BRCA1 और BRCA2 प्रोटीनों का योजनाबद्ध निरूपण तथा रोगजनक रूपों का स्थानीयकरण। यह आकृति स्तन कैंसर रोगियों में BRCA1 (A) और BRCA2 (B) रोगजनक रूपों का वितरण दर्शाती है। एक्सोनिक उत्परिवर्तन नीले रंग में दिखाए गए हैं, जबकि इंट्रोनिक रूप नारंगी रंग में दिखाए गए हैं। बार की ऊंचाई मामलों की संख्या दर्शाती है। BRCA1 और BRCA2 प्रोटीन तथा उनके कार्यात्मक डोमेन रिपोर्ट किए गए हैं। (A) BRCA1 प्रोटीन में एक लूप डोमेन (RING) तथा एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम (NLS), एक कुंडलित-कुंडलित डोमेन, एक SQ/TQ क्लस्टर डोमेन (SCD), तथा एक BRCA1 C-टर्मिनल डोमेन (BRCT) होता है। (B) BRCA2 प्रोटीन में आठ BRC दोहराव, एक हेलिकल डोमेन वाला DNA-बाइंडिंग डोमेन (Helical), डिम्बग्रंथि कैंसर क्लस्टर क्षेत्र (OCCR) नीचे दिखाया गया है। *स्टॉप कोडॉन निर्धारित करने वाले उत्परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है।
इसके बाद हमने बीसी क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं की जांच की जो बीआरसीए 1/2 पीवी की उपस्थिति के साथ सहसंबंधित हो सकती हैं। 181 बीआरसीए 1/2-नकारात्मक रोगियों (गैर-वाहक) और सभी वाहकों (एन = 35) के लिए पूर्ण नैदानिक ​​​​रिकॉर्ड उपलब्ध थे। ट्यूमर प्रसार दर और ग्रेड के बीच एक सहसंबंध था।
हमने अपने समूह (25%, रेंज <10-90%) के मध्यमान के आधार पर Ki-67 के वितरण की गणना की। Ki-67 < 25% वाले विषयों को "कम Ki-67" के रूप में परिभाषित किया गया था, जबकि मूल्य ≥ 25% वाले व्यक्तियों को "उच्च Ki-67" माना जाता था। गैर-वाहकों और BRCA1 PV वाहकों के बीच महत्वपूर्ण Ki-67 अंतर (p<0.01) पाए गए (चित्र 5A)।
चित्र 5 BRCA1 और BRCA2 PVs के साथ और बिना स्तन कैंसर महिलाओं में ग्रेड वितरण के साथ Ki-67 का सहसंबंध। (ए) 181 गैर-वाहक BC रोगियों बनाम BRCA1 (18) या BRCA2 (17) PV रोगियों में औसत Ki-67 मान दिखाने वाला बॉक्सप्लॉट। 0.5 से नीचे के P मानों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। (बी) BRCA1 और BRCA2 उत्परिवर्तन स्थिति (WT विषय, BRCA1 और BRCA2 PVs वाहक) के अनुसार BC कैंसर रोगियों को हिस्टोलॉजिकल ग्रेड समूहों (G2 और G3) में असाइनमेंट का प्रतिनिधित्व करने वाला हिस्टोग्राम।
इसी तरह, हमने जांच की कि क्या ट्यूमर ग्रेड BRCA1/2 पीवी की उपस्थिति के साथ सहसंबंधित है। चूंकि G1 BC हमारी आबादी में अनुपस्थित था, इसलिए हमने मरीजों को दो समूहों (G2 या G3) में विभाजित किया। Ki-67 परिणामों के अनुरूप, विश्लेषण ने ट्यूमर ग्रेड और BRCA1 उत्परिवर्तन के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण सहसंबंध का खुलासा किया, जिसमें गैर-वाहकों की तुलना में BRCA1 वाहकों में G3 ट्यूमर का अनुपात अधिक था (p<0.005) (चित्र 5B)।
डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में प्रगति ने BRCA1/2 आनुवंशिक परीक्षण में अभूतपूर्व प्रगति को सक्षम किया है, जो कैंसर के पारिवारिक इतिहास वाले रोगियों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है। आज तक, लगभग 20,000 BRCA1/2 वेरिएंट की पहचान की गई है और अमेरिकन सोसाइटी ऑफ मेडिकल जेनेटिक्स 35 और ENIGMA सिस्टम के अनुसार वर्गीकृत किया गया है।35,36 यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि BRCA1/2 उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम भौगोलिक क्षेत्रों में व्यापक रूप से भिन्न होता है।37 इटली के भीतर, BRCA1/2 पीवी की दर 8% से 37% तक थी, जो देश के भीतर व्यापक परिवर्तनशीलता दिखाती है।38,39 लगभग 5 मिलियन की आबादी के साथ, सिसिली निवासियों की संख्या के मामले में इटली का पांचवां सबसे बड़ा क्षेत्र है।
हमारा अध्ययन पूर्वी सिसिली में बीसी रोगियों में बीआरसीए 1/2 पीवी की घटना पर पहली रिपोर्टों में से एक है।28 हमने अपना विश्लेषण बीसी पर केंद्रित किया, क्योंकि यह हमारे समूह में अब तक की सबसे आम बीमारी है।
389 बीसी रोगियों का परीक्षण करने पर, 9% में BRCA1/2 PV थे, जो BRCA1 और BRCA2 के बीच समान रूप से वितरित थे। ये परिणाम इतालवी आबादी में पहले बताए गए परिणामों के अनुरूप हैं।28 दिलचस्प बात यह है कि हमारे समूह के 3% (13/389) पुरुष थे। यह दर पुरुष स्तन कैंसर (सभी बीसी का 1%) के लिए अपेक्षित से अधिक है,40 जो BRCA1/2 उत्परिवर्तन जोखिम के आधार पर आबादी के हमारे चयन को दर्शाता है। हालाँकि, इनमें से किसी भी पुरुष में BRCA1/2 PV विकसित नहीं हुआ, इसलिए वे PALB2, RAD51C और D जैसे कम आम उत्परिवर्तनों की उपस्थिति को खारिज करने के लिए आगे के आणविक विश्लेषण के लिए उम्मीदवार थे। 7% विषयों में अनिश्चित महत्व के वेरिएंट प्राप्त किए गए जिनमें BRCA2 VUS स्पष्ट था। यहाँ तक कि यह परिणाम पहले से मौजूद साक्ष्य के अनुरूप है।28,41,42
जब हमने BRCA1/2 उत्परिवर्ती महिलाओं में BC आणविक उपप्रकारों के वितरण का विश्लेषण किया, तो हमने TNBC और BRCA1 PV (58.8%) के बीच और ल्यूमिनल B BC और BRCA2 PV (55.6%) के बीच ज्ञात संबंधों की पुष्टि की।16,43 BRCA1 और BRCA2 PV वाहकों में ल्यूमिनल A और HER2+ ट्यूमर मौजूदा साहित्य डेटा के अनुरूप हैं।16,43
फिर हम BRCA1/2 PV के प्रकार और स्थान पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हमारे समूह में, सबसे आम BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT था। हालाँकि इनकोर्वेया एट अल। अपने सिसिली समूह में इस प्रकार का वर्णन नहीं किया, अन्य लेखकों ने इसे जर्मलाइन BRCA1 PV के रूप में रिपोर्ट किया है।34 हमारे समूह में कई BRCA1 PV पाए गए – उदाहरण के लिए c.181T>G, c.514del, c.3253dupA और c.5266dupC – जो सिसिली में देखे गए हैं।28 इनमें से, दो BRCA1 संस्थापक उत्परिवर्तन (c.181T>G और c.5266dupC) आमतौर पर पूर्वी और मध्य यूरोप (पोलैंड, चेक), स्लोवेनियाई, ऑस्ट्रियाई, हंगेरियन, बेलारूसी और जर्मन ), 44,45 और, संयुक्त राज्य अमेरिका और अर्जेंटीना के अश्केनाज़ी यहूदियों में पाए जाते हैं, हाल ही में BC और OC वाले इतालवी रोगियों में इसे “पुनरावर्ती जर्मलाइन प्रकार” के रूप में परिभाषित किया गया था। कैटेनिया में कुछ परिवारों में c.3253dupA वैरिएंट पाया गया।28 सबसे अधिक प्रतिनिधि BRCA2 PVs c.428dup, c.5851_5854delAGTT और इंट्रोनिक वैरिएंट c.8487+1G>A हैं, जो कि पालेर्मो में एक रोगी में c.428dup, c.5851_5854delAGTT के साथ अधिक विस्तार से रिपोर्ट किए गए हैं। PV उत्तरपश्चिमी सिसिली के घरों में देखा गया था, मुख्यतः ट्रैपानी और पालेर्मो क्षेत्रों में, जबकि c.5851_5854delAGTT PV उत्तरपश्चिमी सिसिली के घरों में देखा गया था। 8487+1G>A वैरिएंट मेसिना, पालेर्मो और कैल्टानिसेटा के विषयों में अधिक आम था।28 कोलम्बिया में c.5851_5854delAGTT परिवर्तन का पहले वर्णन किया गया था।37 एक अन्य BRCA2 PV, c.631+1G>A, सिसिली (एग्रीजेंटो, सिरैक्यूज़ा और रागुसा) के BC और OC रोगियों में पाया गया है।28 उल्लेखनीय रूप से, हमने एक ही रोगी में दो BRCA2 वेरिएंट (BRCA2 c.631G>A और c.7008-2A>T) का सह-अस्तित्व देखा, जिसे हमने सीआईएस मोड में अलग-अलग माना था, जैसा कि पहले बताया गया था।34,46 ये BRCA2 दोहरे उत्परिवर्तन वास्तव में इतालवी क्षेत्र में अक्सर देखे जाते हैं और समय से पहले स्टॉप कोडॉन को पेश करते हुए पाए गए हैं, जो मैसेंजर RNA स्प्लिसिंग को प्रभावित करते हैं और BRCA2 प्रोटीन को विफल कर देते हैं।47,48
हमने प्रोटीन डोमेन और जीन के संभावित OCCR और BCCR क्षेत्रों में BRCA1 और BRCA2 PVs का मानचित्रण भी किया। इन क्षेत्रों को रेबेक एट अल द्वारा क्रमशः डिम्बग्रंथि और स्तन कैंसर के विकास के लिए जोखिम वाले क्षेत्रों के रूप में वर्णित किया गया था।49 हालांकि, जर्मलाइन वेरिएंट के स्थान और स्तन या डिम्बग्रंथि के कैंसर के जोखिम के बीच संबंध के प्रमाण विवादास्पद बने हुए हैं।28,50-52 हमारी आबादी में, BRCA1 PVs प्रमुख रूप से BCCR क्षेत्र में स्थित थे, जबकि BRCA2 PVs प्रमुख रूप से OCCR क्षेत्र में स्थित थे।हालांकि, हम संभावित OCCR और BCCR क्षेत्रों और BC विशेषताओं के बीच कोई संबंध नहीं खोज पाए।यह BRCA1/2 उत्परिवर्तन वाले रोगियों की सीमित संख्या के कारण हो सकता है।
अंत में, हमने BC क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं को BRCA1/2 PV के साथ सहसंबंधित किया। शामिल रोगियों की सीमित संख्या के कारण, हमें केवल Ki-67 और ट्यूमर ग्रेड के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध मिला। हालांकि Ki-67 का मूल्यांकन और व्याख्या कुछ हद तक विवादास्पद बनी हुई है, यह निश्चित है कि उच्च प्रसार दर रोग की पुनरावृत्ति के बढ़ते जोखिम और जीवित रहने की संभावना में कमी से जुड़ी है। आज तक, "उच्च" और "निम्न" Ki-67 के बीच अंतर करने के लिए कटऑफ 20% है। हालांकि, यह सीमा हमारे BRCA1/2 उत्परिवर्तन रोगी आबादी पर लागू नहीं होती है, जिसका औसत Ki-67 मूल्य 25% है। उच्च Ki-67 दरों में यह प्रवृत्ति हमारे ल्यूमिनल B और TNBC समूहों में व्यापकता से समझाई जा सकती है, जिनमें से कुछ ल्यूमिनल A ट्यूमर मौजूद थे। हालांकि, कुछ सबूत यह सुझाव देते हैं आश्चर्य की बात नहीं है। उच्च Ki-67 और ग्रेड और BRCA1 PV की उपस्थिति के बीच होता है। वास्तव में, BRCA1-संबंधित ट्यूमर TNBC के विशिष्ट हैं और अधिक आक्रामक विशेषताएं प्रदर्शित करते हैं।16,17
निष्कर्ष में, यह अध्ययन पूर्वी सिसिली के एक बीसी समूह में BRCA1/2 की उत्परिवर्तन स्थिति पर एक रिपोर्ट प्रदान करता है। कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्ष बीसी में उत्परिवर्तन व्यापकता और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल विशेषताओं दोनों के संदर्भ में पहले से मौजूद साक्ष्य के अनुरूप हैं। BRCA1/2-उत्परिवर्तित बीसी रोगियों की बड़ी आबादी में अधिक अध्ययन, जैसे कि मल्टीजीनोम विस्तारित उत्परिवर्तन विश्लेषण का उपयोग करना, उन पीवी की उपस्थिति का आकलन करने के लिए आवश्यक है जो BRCA1/2 से अलग और कम लगातार हैं। यह आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण कैंसर के बढ़ते जोखिम वाले विषयों की बढ़ती संख्या की पहचान और उचित प्रबंधन की अनुमति देगा।
हमने पुष्टि की है कि रोगियों ने अनुसंधान उद्देश्यों के लिए अपने ट्यूमर के नमूनों को गुमनाम रूप से जारी करने के लिए सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए हैं। सभी रोगियों ने हेलसिंकी घोषणा के अनुसार लिखित सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए हैं। एओयू पोलीक्लिनिको "जी. रोडोलिको - एस. मार्को" की नीति के अनुसार, इस अध्ययन को नैतिक समीक्षा से छूट दी गई थी क्योंकि BRCA1/2 विश्लेषण नैदानिक ​​अभ्यास के अनुसार किया गया था और सभी रोगियों ने लिखित सूचित सहमति दी थी। मरीज अनुसंधान उद्देश्यों के लिए अपने डेटा के उपयोग के लिए भी सहमति देते हैं।
हम प्रोफेसर पाओलो विग्नेरी को आचार समिति के अनुरोध पर स्तन कैंसर रोगियों की देखभाल में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।
फेडेरिका मार्टोराना ने इस्टीटूटो जेंटिली, एली लिली, नोवार्टिस, फाइजर से प्राप्त मानदेय की रिपोर्ट दी है। अन्य लेखकों ने इस कार्य में किसी भी प्रकार के हितों के टकराव की बात नहीं कही है।
1. सुंग एच, फेरले जे, सीगल आरएल, एट अल. ग्लोबल कैंसर सांख्यिकी 2020: ग्लोबोकैन ने दुनिया भर के 185 देशों में 36 कैंसर की घटनाओं और मृत्यु दर का अनुमान लगाया है। सीए कैंसर जे क्लिन.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660