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作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Catania, Catania, 95123, Italia;2 Centro di Oncologia ed Ematologia Sperimentale, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 3 Oncologia Medica, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 4 Genetica Medica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italia; 5 Medicina Genetica, ASP, Siracusa, 96100, Italia; 6 Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologiche, Università di Catania, Genetica Medica, Catania, Italia, 95123; 7 Istituto di Ricerca Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Italia Comunicazioni: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, email [email protected]; [email protected] Scopo: Mutazioni germinali in BRCA1 e BRCA2 e cancro al seno (BC), ovaio (OC) e altri associati a un rischio di cancro nel corso della vita. Il test per il gene BRCA è fondamentale per valutare il rischio individuale, nonché per trovare metodi di prevenzione nei portatori sani e personalizzare i trattamenti nei pazienti oncologici. La prevalenza delle alterazioni BRCA1 e BRCA2 varia ampiamente nelle regioni geografiche e, sebbene esistano dati sulle varianti patogene BRCA nelle famiglie siciliane, mancano studi specificamente mirati alle popolazioni della Sicilia orientale. Lo scopo del nostro studio era di indagare l'incidenza e la distribuzione delle alterazioni germinali patogene BRCA in una coorte di pazienti con BC provenienti dalla Sicilia orientale e di valutarne l'associazione con tratti specifici del BC utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. La presenza di alterazioni era correlata al grado del tumore e all'indice di proliferazione. RISULTATI: Complessivamente, 35 pazienti (9%) presentavano una variante patogena BRCA, 17 (49%) in BRCA1 e 18 (51%) in BRCA2. Le alterazioni BRCA1 sono prevalenti in pazienti con carcinoma mammario triplo negativo, mentre le mutazioni BRCA2 sono più comuni nei pazienti con carcinoma mammario luminale. Rispetto ai non portatori, i soggetti con varianti BRCA1 presentavano un grado tumorale e un indice di proliferazione significativamente più elevati. Conclusioni: I nostri risultati forniscono una panoramica dello stato mutazionale BRCA nei pazienti con carcinoma mammario della Sicilia orientale e confermano il ruolo dell'analisi NGS nell'identificazione dei pazienti con carcinoma mammario ereditario. Nel complesso, questi dati sono coerenti con le precedenti evidenze a supporto dello screening BRCA per la corretta prevenzione e il trattamento del cancro nei portatori di mutazioni.
Il cancro al seno (BC) è la neoplasia più comune al mondo e il tumore più letale nelle donne.¹ Le caratteristiche biologiche che determinano la prognosi e il comportamento clinico del BC sono state ampiamente studiate e parzialmente chiarite nel tempo. Infatti, diversi marcatori surrogati sono attualmente utilizzati per classificare il BC in diversi sottotipi molecolari. Essi sono il recettore degli estrogeni (ER) e/o del progesterone (PgR), l'amplificazione del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2), l'indice di proliferazione Ki-67 e il grado del tumore (G).² La combinazione di queste variabili ha identificato le seguenti categorie di BC: 1) I tumori luminali, che mostrano espressione di ER e/o PgR, rappresentavano il 75% dei BC. Questi tumori sono stati ulteriormente suddivisi in Luminal A, quando Ki-67 era inferiore al 20% e HER2 negativo, e Luminal B, quando Ki-67 era uguale o superiore al 20% e in presenza di amplificazione di HER2, indipendentemente dall'indice di proliferazione; 2) Tumori HER2+ che sono negativi per ER e PgR ma mostrano amplificazione di HER2. Questo gruppo rappresenta il 10% di tutti i tumori al seno; 3) Il carcinoma mammario triplo negativo (TNBC), che non mostra espressione di ER e PgR e amplificazione di HER2, rappresenta circa il 15% dei tumori al seno.2-4
Tra questi sottotipi di carcinoma mammario, il grado del tumore e l'indice di proliferazione rappresentano biomarcatori trasversali che sono associati direttamente e indipendentemente all'aggressività del tumore e alla prognosi.5,6
Oltre alle suddette caratteristiche biologiche, il ruolo delle alterazioni genetiche ereditarie che portano allo sviluppo del cancro al seno è diventato sempre più importante negli ultimi anni.7 Circa 1 tumore al seno su 10 è ereditario a causa di alterazioni della linea germinale in geni specifici.8 Due ampi studi epidemiologici che hanno coinvolto più di 180.000 donne hanno recentemente identificato un gruppo di otto geni (ovvero ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C e RAD51D) principalmente responsabili del cancro al seno ereditario. Tra questi geni, BRCA1 e BRCA2 (di seguito indicati come BRCA1/2) hanno mostrato la correlazione più forte con lo sviluppo di tumori al seno.9-12 Infatti, le mutazioni germinali BRCA1/2 aumentano significativamente il rischio a vita di cancro al seno, così come di altre neoplasie, tra cui ovariche, prostatiche, pancreatiche, colorettali e melanoma. Dall'età di 13 a 80 anni, l'incidenza cumulativa di Il rischio di cancro al seno è del 72% nelle donne con una variante patogena (PV) del gene BRCA1 e del 69% nelle donne con una PV del gene BRCA2.14
In particolare, una recente pubblicazione suggerisce che il rischio di cancro al seno dipende dal tipo di variante patogena. Infatti, rispetto alle varianti troncanti patogene, le varianti missenso evidenti, soprattutto nel gene BRCA1, sono associate a un rischio ridotto di cancro al seno, in particolare nelle donne anziane.¹⁵
La presenza di mutazioni parziali di BRCA1 o BRCA2 è stata associata a diverse caratteristiche biologiche e clinico-patologiche.16,17 I tumori della vescica associati a BRCA1 tendono ad essere clinicamente aggressivi, scarsamente differenziati e altamente proliferativi. Questi tumori sono solitamente triplo negativi e hanno un'età di insorgenza precoce. I tumori che si verificano in pazienti con mutazioni di BRCA2 mostrano tipicamente gradi di differenziazione da moderati a ben differenziati e indici di proliferazione variabili. Questi tumori sono più comuni nel lume B e di solito si verificano negli adulti più anziani.16-18 In particolare, le mutazioni in BRCA1 e BRCA2 aumentano la sensibilità a trattamenti specifici, inclusi i sali di platino e farmaci mirati come gli inibitori della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARPi).19,20
Negli ultimi anni, l'implementazione del sequenziamento di nuova generazione (NGS) nella pratica clinica ha permesso a un numero crescente di pazienti con tumore al seno di sottoporsi a test molecolari per le sindromi di predisposizione al cancro, tra cui BRCA1/2.21 Contemporaneamente, si stanno definendo criteri precisi riguardanti l'anamnesi familiare, le caratteristiche demografiche e clinico-patologiche per identificare meglio gli individui meritevoli del test BRCA1/2.22,23 In questo contesto, si stanno accumulando evidenze sullo screening BRCA1/2 in popolazioni specifiche, evidenziando differenze tra le regioni geografiche.24–27 Sebbene esistano studi sulla coorte di pazienti con tumore al seno nella Sicilia occidentale, sono disponibili meno dati sullo screening BRCA1/2 nella popolazione della Sicilia orientale.28,29
In questo studio descriviamo i risultati dello screening germinale dei geni BRCA1/2 in pazienti con tumore al seno provenienti dalla Sicilia orientale, correlando inoltre la presenza di mutazioni BRCA1 o BRCA2 con le principali caratteristiche clinico-patologiche di questi tumori.
Presso il "Centro di Oncologia e Ematologia Sperimentale" del Policlinico Rodolico - San Marco di Catania è stato condotto uno studio retrospettivo. Da gennaio 2017 a marzo 2021, un totale di 455 pazienti affetti da tumore al seno e alle ovaie, melanoma, tumore al pancreas o alla prostata sono stati indirizzati al nostro laboratorio di diagnostica molecolare per il test genetico BRCA/2. Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto prima dell'analisi molecolare.
Le caratteristiche istologiche e biologiche (stato di ER, PgR, HER2, Ki-67 e grado) del carcinoma mammario sono state valutate su campioni bioptici o chirurgici, considerando solo le componenti tumorali aggressive. Sulla base di queste caratteristiche, i carcinomi mammari sono stati classificati come segue: luminale A (ER+ e/o PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminale B (ER+ e/o PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminale B-HER2+ (ER e/o PgR+, HER2+), HER2+ (ER e PgR-, HER2+) o triplo negativo (ER e PgR-, HER2-).
Prima di valutare lo stato di mutazione di BRCA1 e BRCA2, un team multidisciplinare composto da un oncologo, un genetista e uno psicologo ha condotto una consulenza genetica tumorale per ciascun paziente per determinare la presenza di BRCA1 e/o BRCA1. o individui con un alto rischio di PV nel gene BRCA2. La selezione dei pazienti è stata effettuata secondo le linee guida della Società Italiana di Oncologia Medica (AIOM) e le raccomandazioni locali siciliane.30,31 Questi criteri includono: (i) storia familiare di varianti patogene note in geni di suscettibilità (ad es. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) maschi con BC; (iii) quelli con BC e OC; (iv) donne con BC <36 anni, TNBC <60 anni o BC bilaterale <50 anni; (v) storia medica personale di BC <50 anni e almeno un parente di primo grado: (a) BC < 50 anni; (b) OC non mucinoso e non borderline di qualsiasi età; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (e) cancro al pancreas; (f) cancro alla prostata; (vi) due o più Anamnesi personale di BC > 50 anni e anamnesi familiare di BC, OC o cancro al pancreas per parenti che sono parenti di primo grado tra loro (compresi i parenti con cui è parente di primo grado); (vii) Anamnesi personale di OC e almeno un parente di primo grado: (a) BC <50 anni; (b) NOC; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (vii) donna con OC sieroso di alto grado.
Da ciascun paziente è stato prelevato un campione di sangue periferico di 20 mL, raccolto in provette con EDTA (BD Biosciences). Il DNA genomico è stato isolato da campioni di sangue intero di 0,7 mL utilizzando il kit di isolamento QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Italia) secondo le istruzioni del produttore e analizzato mediante un fluorimetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per la quantificazione. L'arricchimento del target e la preparazione della libreria vengono eseguiti dall'Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pronto per essere caricato nell'Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit per la preparazione automatizzata della libreria secondo le istruzioni del produttore. Il kit è composto da due pool di primer PCR multiplex che possono essere utilizzati per studiare tutti i geni BRCA1 (NM_007300.3) e BRCA2 (NM_000059.3). In breve, 15 µL di DNA di ciascun campione diluito (10 ng) sono stati aggiunti alle piastre con codice a barre per la preparazione della libreria e tutti i reagenti e i materiali di consumo sono stati caricati sullo strumento Ion Chef™. La preparazione automatizzata della libreria e il pooling delle librerie di campioni con codice a barre sono stati quindi eseguiti sullo strumento Ion Chef™. Il numero di librerie preparate è stato quindi valutato da un fluorimetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Infine, le librerie vengono combinate in rapporti equimolari nel campione di libreria Ion Chef™ Le provette (provette con codice a barre) sono state caricate sullo strumento Ion Chef™. Il sequenziamento è stato eseguito utilizzando uno strumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) con un chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). L'analisi dei dati è stata effettuata con Amplicon Suite (SmartSeq srl) e il software Ion Reporter.
Tutta la nomenclatura delle varianti ha seguito le linee guida attuali dell'Human Genome Variation Consortium, disponibili online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Il significato clinico delle varianti BRCA1/2 è stato definito utilizzando la classificazione dell'International Consortium ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) e consultando diversi database come ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD e UMD. La classificazione include cinque distinte categorie di rischio: benigna (categoria I), probabilmente benigna (categoria II), variante di significato incerto (VUS, categoria III), probabilmente patogena (categoria IV) e patogena (categoria V). VarSome ha anche analizzato l'effetto delle mutazioni sulla struttura e sulla funzione proteica, uno strumento informativo con accesso a 30 database.32
Per assegnare un potenziale significato clinico a ciascuna VUS, sono stati utilizzati i seguenti algoritmi computazionali di predizione proteica: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Le varianti classificate come classe 1 e 2 sono state considerate di tipo selvatico.
Il sequenziamento Sanger ha confermato la presenza di ciascuna variante patogena. In breve, è stata progettata una coppia di primer specifici per ciascuna variante rilevata utilizzando le sequenze di riferimento dei geni BRCA1 e BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 e NG_012772.3, NM_000059.3, rispettivamente). Pertanto, è stata eseguita una PCR mirata seguita dal sequenziamento Sanger.
I pazienti risultati negativi al test per il gene BRCA1/2 sono stati sottoposti ad amplificazione di sonde dipendente dalla ligazione multiplex (MLPA) secondo le istruzioni del produttore per valutare la presenza di grandi riarrangiamenti genomici (LGR). In breve, i campioni di DNA vengono denaturati e vengono utilizzate fino a 60 sonde specifiche per i geni BRCA1 e BRCA2, ciascuna in grado di rilevare una specifica sequenza di DNA di circa 60 nucleotidi di lunghezza. I prodotti di amplificazione delle sonde, costituiti da un set unico di ampliconi PCR, sono stati quindi analizzati mediante elettroforesi capillare e con il software Cofalyser.Net in combinazione con le tabelle Cofalyser specifiche per il lotto (www.mrcholland.com).
Alcune variabili clinico-patologiche selezionate (grado istologico e indice di proliferazione Ki-67%) sono state associate alla presenza di BRCA1/2 PV, calcolate utilizzando il software Prism v. 8.4 con il test esatto di Fisher, assumendo un valore di p <0,05 come significativo.
Tra gennaio 2017 e marzo 2021, 455 pazienti sono stati sottoposti a screening per mutazioni germinali BRCA1/2. Il test delle mutazioni è stato eseguito presso il Centro di Oncologia Sperimentale ed Ematologia dell'Ospedale Policlinico. Secondo le linee guida siciliane (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), il Rodolico di Catania – San Marco ha complessivamente 389 pazienti affetti da tumore al seno, 37 da tumore alle ovaie, 16 da tumore al pancreas, 8 da tumore alla prostata e 5 da melanoma. La distribuzione dei pazienti in base al tipo di tumore e ai risultati dell'analisi è mostrata nella Figura 1.
La Figura 1 mostra un diagramma di flusso che offre una panoramica dello studio. I pazienti affetti da tumori al seno, melanoma, pancreas, prostata o ovaio sono stati sottoposti a test per la ricerca di mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2.
Abbreviazioni: PVs, variante patogena; VUS, variante di significato incerto; WT, sequenza BRCA1/2 di tipo selvatico.
Abbiamo focalizzato i nostri studi in modo selettivo su coorti di pazienti affette da tumore al seno. Le pazienti avevano un'età mediana di 49 anni (range 23-89) ed erano prevalentemente di sesso femminile (n=376, ovvero il 97%).
Di questi soggetti, 64 (17%) presentavano mutazioni BRCA1/2 ed erano tutti di sesso femminile. Trentacinque (9%) presentavano PV e 29 (7,5%) presentavano VUS. Diciassette (48,6%) delle 35 varianti patogene si sono verificate in BRCA1 e 18 (51,4%) in BRCA2, mentre 5 VUS si sono verificate in BRCA1 (17,2%) e 24 (82,8%) in BRCA2 (Figure 1 e 2). LGR non era presente nell'analisi MLPA.
Figura 2. Analisi delle mutazioni BRCA1 e BRCA2 in 389 pazienti con cancro al seno. (A) Distribuzione delle varianti patogene (PV) (rosso), delle varianti di significato incerto (VUS) (arancione) e del tipo selvatico (WT) (blu) in 389 pazienti con cancro al seno; (B) 389 pazienti con cancro al seno. Trentacinque (9%) presentavano varianti patogene (PV) BRCA1/2. Tra queste, 17 (48,6%) erano portatrici di PV BRCA1 (rosso scuro) e 18 (51,4%) erano portatrici di PV BRCA2 (rosso chiaro); (C) 29 (7,5%) dei 389 soggetti presentavano VUS, 5 (17,2%) geni BRCA1 (arancione scuro) e 24 (82,8%) geni BRCA2 (arancione chiaro).
Abbreviazioni: PVs, variante patogena; VUS, variante di significato incerto; WT, sequenza BRCA1/2 di tipo selvatico.
Abbiamo quindi studiato la prevalenza dei sottotipi molecolari di BC nei pazienti con PV BRCA1/2. La distribuzione includeva 2 (5,7%) pazienti luminali A, 15 (42,9%) luminali B, 3 (8,6%) luminali B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ e 13 (37,1%) pazienti TNBC. Tra i pazienti BRCA1-positivi, 5 (29,4%) avevano BC luminale B, 2 (11,8%) avevano malattia HER2+ e 10 (58,8%) avevano TNBC. I tumori senza mutazioni BRCA1 erano luminali A o luminali B-HER2+ (Figura 3). Nel sottogruppo BRCA2-positivo, 10 (55,6%) tumori erano luminali B, 3 (16,7%) erano luminali B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC e 2 (11,1%) erano luminale A (Figura 3). In questo gruppo non erano presenti tumori HER2+. Pertanto, le mutazioni BRCA1 sono prevalenti nei pazienti con TNBC, mentre le alterazioni BRCA2 sono predominanti negli individui con lume B.
Figura 3 Prevalenza dei sottotipi di cancro al seno in pazienti con varianti patogene in BRCA1 e BRCA2. Istogrammi che mostrano la distribuzione delle varianti patogene BRCA1 (rosso scuro) e BRCA2 (rosso chiaro) tra i sottotipi molecolari di pazienti con cancro al seno. I numeri riportati all'interno di ciascun riquadro rappresentano la percentuale di pazienti con varianti patogene BRCA1 e BRCA2 per ciascun sottotipo di cancro al seno.
Abbreviazioni: PVs, variante patogena; HER2+, recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano positivo; TNBC, carcinoma mammario triplo negativo.
Successivamente, abbiamo valutato il tipo e la localizzazione genica delle varianti patogene (PV) di BRCA1 e BRCA2. Nelle PV di BRCA1, abbiamo osservato 7 varianti a singolo nucleotide (SNV), 6 delezioni, 3 duplicazioni e 1 inserzione. Solo una mutazione (c.5522delG) rappresenta una nuova scoperta. La PV di BRCA1 più comune rilevata in entrambi i soggetti è stata c.5035_5039delCTAAT. Questa alterazione comporta una delezione di cinque nucleotidi (CTAAT) nell'esone 15 di BRCA1, con conseguente sostituzione dell'amminoacido leucina con tirosina al codone 1679 e, a causa di uno slittamento del frame di traduzione con un codone di stop alternativo previsto, porta a una troncatura prematura della proteina. Tutte le altre modifiche sono state rilevate in un solo caso. In particolare, una delle PV riportate era localizzata nella regione consenso del sito di splicing (c.4357+1G>T) (Tabella 1).
Per quanto riguarda le varianti patogene BRCA2, abbiamo osservato 6 delezioni, 6 SNV e 2 duplicazioni. Nessuna delle modifiche riscontrate è nuova. Tre mutazioni si sono ripresentate nella nostra popolazione: c.428dup e c.8487+1G>A, osservate in 3 soggetti, seguite da c.5851_5854delAGTT, riscontrata in due casi. L'alterazione c.428dup coinvolge una ripetizione di C nell'esone 5 di BRCA2, che si prevede codifichi una proteina troncata e non funzionale. La mutazione c.8487+1G>A si verifica nella regione intronica dell'introne 19 (± 1,2) di BRCA2 e influenza la sequenza consenso di splicing, determinando uno splicing alterato che porta alla produzione di una proteina anomala o assente. La variante patogena c.5851_5854delAGTT è dovuta a una delezione di 4 nucleotidi dalle posizioni nucleotidiche 5851 a 5854. nell'esone codificante 10 del gene BRCA2 e determina uno spostamento del frame di traduzione con un codone di stop alternativo previsto (p.S1951WfsTer). In particolare, come precedentemente riportato, entrambe le alterazioni c.631G>A e c.7008-2A>T sono state rilevate nello stesso paziente.34 La prima mutazione comporta la sostituzione dell'adenosina (A) nell'esone 7 di BRCA2 con un nucleotide contenente guanina (G) che determina un cambiamento della valina in isoleucina al codone 211, l'isoleucina. L'amminoacido è un amminoacido con proprietà molto simili. Questo cambiamento influenza il normale splicing dell'mRNA. La seconda variante si trova in una regione intronica e determina una doppia sostituzione da A a timina (T) prima dell'esone 13 del gene che codifica per BRCA2. Il cambiamento c.7008-2A>T può generare più trascritti di lunghezze diverse. Inoltre, nel gruppo di PV BRCA2, 4 Su 18 modifiche (22,2%), la percentuale era intronica.
Abbiamo quindi mappato le mutazioni deleterie di BRCA1/2 nei domini funzionali e nelle regioni di legame proteico (Fig. 4). Nel gene BRCA1, il 50% delle varianti patogene (PV) era localizzato nella regione del cluster del cancro al seno (BCCR), mentre il 22% delle mutazioni era localizzato nella regione del cluster del cancro ovarico (OCCR) (Fig. 4A). Nelle PV di BRCA2, il 35,7% delle varianti era localizzato nella regione BCCR e il 42,8% delle mutazioni era localizzato nell'OCCR (Fig. 4B). Successivamente, abbiamo valutato la posizione delle PV all'interno dei domini proteici di BRCA1 e BRCA2. Per la proteina BRCA1, abbiamo trovato tre PV nei domini loop e coiled coil e due mutazioni nel dominio BRCT (Fig. 4A). Per la proteina BRCA2, 4 PV sono state mappate nel dominio di ripetizione BRC, mentre 3 cambiamenti intronici e 3 esonici sono stati rilevati nel dominio di legame oligo/oligosaccaridi (OB) e nel dominio tower (T). domini ( Figura 4B ).
Figura 4 Rappresentazione schematica delle proteine ​​BRCA1 e BRCA2 e localizzazione delle varianti patogene. Questa figura mostra la distribuzione delle varianti patogene di BRCA1 (A) e BRCA2 (B) in pazienti con cancro al seno. Le mutazioni esoniche sono mostrate in blu, mentre le varianti introniche sono mostrate in arancione. L'altezza della barra rappresenta il numero di casi. Sono riportate le proteine ​​BRCA1 e BRCA2 e i loro domini funzionali. (A) La proteina BRCA1 contiene un dominio ad anello (RING) e una sequenza di localizzazione nucleare (NLS), un dominio coiled-coil, un dominio cluster SQ/TQ (SCD) e un dominio C-terminale BRCA1 (BRCT). (B) La proteina BRCA2 contiene otto ripetizioni BRC, un dominio di legame al DNA con un dominio elicoidale (Helical), tre ripiegamenti di legame a oligonucleotidi/oligosaccaridi (OB), un dominio a torre (T) e una NLS sul lato C. Aree chiamate Regione Cluster del Cancro al Seno (BCCR) e Cluster del Cancro Ovarico. Le regioni (OCCR) sono mostrate in basso.*Rappresentano le mutazioni che determinano i codoni di stop.
Abbiamo quindi esaminato le caratteristiche clinico-patologiche del carcinoma mammario che potrebbero correlarsi con la presenza di mutazioni parziali di BRCA1/2. Erano disponibili cartelle cliniche complete per 181 pazienti BRCA1/2-negative (non portatrici) e per tutte le portatrici (n = 35). È stata riscontrata una correlazione tra il tasso di proliferazione tumorale e il grado.
Abbiamo calcolato la distribuzione del Ki-67 basandoci sulla mediana della nostra coorte (25%, intervallo <10-90%). I soggetti con Ki-67 < 25% sono stati definiti "Ki-67 basso", mentre gli individui con valori ≥ 25% sono stati considerati "Ki-67 alto". Sono state riscontrate differenze significative nel Ki-67 (p<0,01) tra i non portatori e i portatori di BRCA1 PV (Fig. 5A).
Figura 5 Correlazione di Ki-67 con la distribuzione del grado in donne con cancro al seno con e senza PV BRCA1 e BRCA2. (A) Boxplot che mostra i valori mediani di Ki-67 in 181 pazienti con cancro al seno non portatrici rispetto a pazienti con PV BRCA1 (18) o BRCA2 (17). I valori di P inferiori a 0,5 sono stati considerati statisticamente significativi. (B) Istogramma che rappresenta l'assegnazione di pazienti con cancro al seno in gruppi di grado istologico (G2 e G3) in base allo stato di mutazione BRCA1 e BRCA2 (soggetti WT, portatori di PV BRCA1 e BRCA2).
Allo stesso modo, abbiamo esaminato se il grado del tumore fosse correlato alla presenza di BRCA1/2 PV. Poiché il BC G1 era assente nella nostra popolazione, abbiamo diviso i pazienti in due gruppi (G2 o G3). In linea con i risultati del Ki-67, l'analisi ha rivelato una correlazione statisticamente significativa tra il grado del tumore e la mutazione BRCA1, con una proporzione maggiore di tumori G3 nei portatori di BRCA1 rispetto ai non portatori (p<0,005) (Figura 5B).
I progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA hanno permesso progressi senza precedenti nei test genetici BRCA1/2, con implicazioni cruciali per i pazienti con una storia familiare di cancro. Ad oggi, sono state identificate e classificate circa 20.000 varianti BRCA1/2 secondo l'American Society of Medical Genetics 35 e il sistema ENIGMA.35,36 È noto che lo spettro mutazionale BRCA1/2 varia ampiamente nelle diverse regioni geografiche.37 In Italia, il tasso di varianti patogene BRCA1/2 variava dall'8% al 37%, mostrando un'ampia variabilità intra-nazionale.38,39 Con una popolazione di quasi 5 milioni di abitanti, la Sicilia è la quinta regione più grande d'Italia in termini di numero di abitanti. Sebbene esistano dati sulla distribuzione di BRCA1/2 nella Sicilia occidentale, non vi sono prove estese nella parte orientale dell'isola.
Il nostro studio è uno dei primi report sull'incidenza della poliposi adenomatosa BRCA1/2 nelle pazienti con tumore al seno nella Sicilia orientale.28 Abbiamo focalizzato la nostra analisi sul tumore al seno, poiché questa è di gran lunga la malattia più comune nella nostra coorte.
Quando sono stati testati 389 pazienti con carcinoma mammario, il 9% presentava varianti patogene BRCA1/2, distribuite uniformemente tra BRCA1 e BRCA2. Questi risultati sono coerenti con quelli precedentemente riportati nella popolazione italiana.28 È interessante notare che il 3% (13/389) della nostra coorte era di sesso maschile. Questa percentuale è superiore a quella attesa per il carcinoma mammario maschile (1% di tutti i carcinomi mammari),40 riflettendo la nostra selezione di popolazioni basata sul rischio di mutazione BRCA1/2. Tuttavia, nessuno di questi uomini ha sviluppato una variante patogena BRCA1/2, quindi erano candidati per ulteriori analisi molecolari per escludere la presenza di mutazioni meno comuni come PALB2, RAD51C e D, tra le altre. Varianti di significato incerto sono state recuperate nel 7% dei soggetti in cui era evidente una variante di significato incerto BRCA2. Anche questo risultato è coerente con le evidenze preesistenti.28,41,42
Quando abbiamo analizzato la distribuzione dei sottotipi molecolari di BC nelle donne con mutazioni BRCA1/2, abbiamo confermato le associazioni note tra TNBC e BRCA1 PV (58,8%) e tra BC luminale B e BRCA2 PV (55,6%).16,43 I tumori luminali A e HER2+ nelle portatrici di BRCA1 e BRCA2 PV sono coerenti con i dati della letteratura esistente.16,43
Ci concentriamo quindi sul tipo e sulla posizione della variante patogena BRCA1/2. Nella nostra coorte, la variante patogena BRCA1 più comune era c.5035_5039delCTAAT. Sebbene Incorvaia et al. non hanno descritto questa variante nella loro coorte siciliana, altri autori l'hanno segnalata come una PV germinale BRCA1.34 Diverse PV BRCA1 sono state trovate nella nostra coorte – ad esempio c.181T>G, c.514del, c.3253dupA e c.5266dupC – che sono state osservate in Sicilia.28 Di queste, due mutazioni fondatrici BRCA1 (c.181T>G e c.5266dupC) sono comunemente trovate negli ebrei ashkenaziti dell'Europa orientale e centrale (Polonia, Repubblica Ceca), sloveni, austriaci, ungheresi, bielorussi e tedeschi),44,45 e, negli Stati Uniti e in Argentina, è stata recentemente definita come una "variante germinale ricorrente" in pazienti italiani con BC e OC. La variante 34c.514del è stata precedentemente identificata in 8 pazienti con cancro al seno della Sicilia settentrionale a Palermo e Messina. È interessante notare che anche Incorvaia et al. è stata trovata la variante c.3253dupA in alcune famiglie a Catania.28 Le varianti polimorfiche BRCA2 più rappresentative sono c.428dup, c.5851_5854delAGTT e la variante intronica c.8487+1G>A, che sono state riportate in modo più dettagliato 28 in un paziente a Palermo con c.428dup, c.5851_5854delAGTT La variante polimorfica è stata osservata nelle famiglie della Sicilia nord-occidentale, principalmente nelle regioni di Trapani e Palermo, mentre c.5851_5854delAGTT La variante polimorfica è stata osservata nelle famiglie della Sicilia nord-occidentale. La variante 8487+1G>A era più comune nei soggetti di Messina, Palermo e Caltanissetta.28 Rebbeck et al. Precedentemente è stata descritta l'alterazione c.5851_5854delAGTT in Colombia.37 Un'altra variante polimorfa BRCA2, c.631+1G>A, è stata riscontrata in pazienti con carcinoma mammario e ovarico provenienti dalla Sicilia (Agrigento, Siracusa e Ragusa).28 In particolare, abbiamo osservato la coesistenza di due varianti BRCA2 (BRCA2 c.631G>A e c.7008-2A>T) nello stesso paziente, che abbiamo ipotizzato segregassero in modalità cis, come precedentemente riportato.34,46 Queste mutazioni duali BRCA2 sono infatti frequentemente osservate nella regione italiana e si è scoperto che introducono codoni di stop prematuri, influenzando lo splicing dell'RNA messaggero e causando il fallimento della proteina BRCA2.47,48
Abbiamo anche mappato le varianti patogene (PV) di BRCA1 e BRCA2 nelle putative regioni OCCR e BCCR dei domini proteici e dei geni. Queste regioni sono state descritte da Rebbeck et al. come aree di rischio per lo sviluppo del cancro ovarico e mammario, rispettivamente.49 Tuttavia, le prove relative all'associazione tra la posizione delle varianti germinali e il rischio di cancro al seno o alle ovaie rimangono controverse.28,50-52 Nella nostra popolazione, le PV di BRCA1 erano prevalentemente localizzate nella regione BCCR, mentre le PV di BRCA2 erano prevalentemente localizzate nella regione OCCR. Tuttavia, non siamo stati in grado di trovare alcuna associazione tra le putative regioni OCCR e BCCR e le caratteristiche del cancro al seno. Ciò potrebbe essere dovuto al numero limitato di pazienti con mutazioni BRCA1/2. Dal punto di vista del dominio proteico, le PV di BRCA1 sono distribuite lungo l'intera proteina e le alterazioni di BRCA2 si trovano preferenzialmente nel dominio di ripetizione BRC.
Infine, abbiamo correlato le caratteristiche clinico-patologiche del BC con il PV di BRCA1/2. A causa del numero limitato di pazienti inclusi, abbiamo trovato solo una correlazione significativa tra Ki-67 e grado del tumore. Sebbene la valutazione e l'interpretazione del Ki-67 rimangano in qualche modo controverse, è certo che alti tassi di proliferazione sono associati a un aumento del rischio di recidiva della malattia e a una diminuzione della sopravvivenza. Ad oggi, il cutoff per distinguere tra Ki-67 "alto" e "basso" è del 20%. Tuttavia, questa soglia non si applica alla nostra popolazione di pazienti con mutazione BRCA1/2, che ha un valore mediano di Ki-67 del 25%. Questa tendenza in alti tassi di Ki-67 può essere spiegata dalla prevalenza nelle nostre coorti luminali B e TNBC, in cui erano presenti pochi tumori luminali A. Tuttavia, alcune prove sembrano suggerire che un cutoff di Ki-67 più alto (25-30%) potrebbe stratificare meglio i pazienti in base alla loro prognosi.53,54 Dai risultati della nostra analisi, non si evince una correlazione significativa sorprendente. Si verifica tra alti livelli di Ki-67 e gradi e la presenza di BRCA1 PV. Infatti, i tumori correlati a BRCA1 sono tipici del TNBC e mostrano caratteristiche più aggressive.16,17
In conclusione, questo studio fornisce un resoconto sullo stato mutazionale di BRCA1/2 in una coorte di pazienti con carcinoma mammario provenienti dalla Sicilia orientale. Nel complesso, i nostri risultati sono coerenti con le evidenze preesistenti, sia in termini di prevalenza delle mutazioni che di caratteristiche clinico-patologiche nel carcinoma mammario. Sono necessari ulteriori studi su popolazioni più ampie di pazienti con carcinoma mammario portatrici di mutazioni BRCA1/2, ad esempio utilizzando l'analisi mutazionale multigenomica estesa, per valutare la presenza di varianti patogenetiche distinte e meno frequenti di BRCA1/2. Ciò consentirà l'identificazione e la corretta gestione del numero crescente di soggetti a maggior rischio di cancro a causa di mutazioni genetiche.
Abbiamo confermato che i pazienti hanno firmato il consenso informato per la divulgazione anonima dei loro campioni tumorali a fini di ricerca. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato scritto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Secondo la politica dell'AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, questo studio è stato esentato dalla revisione etica poiché l'analisi BRCA1/2 è stata eseguita secondo la pratica clinica e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto. I pazienti hanno inoltre acconsentito all'utilizzo dei loro dati a fini di ricerca.
Ringraziamo il Prof. Paolo Vigneri per la sua assistenza nella cura delle pazienti affette da tumore al seno, come richiesto dal Comitato Etico.
Federica Martorana dichiara di aver ricevuto compensi da Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis e Pfizer. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in relazione a questo lavoro.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Statistiche globali sul cancro 2020: GLOBOCAN stima l'incidenza e la mortalità di 36 tumori in 185 paesi in tutto il mondo. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660