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作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Catania, Catania, 95123, Italia;2 Centro di Oncologia ed Ematologia Sperimentale, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 3 Oncologia Medica, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 4 Genetica Medica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italia; 5 Medicina Genetica, ASP, Siracusa, 96100, Italia; 6 Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologiche, Università di Catania, Genetica Medica, Catania, Italia, 95123; 7Istituto di Ricerca Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Italia Comunicazioni: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, email [email protected]; [email protected] Scopo: Mutazioni germinali in BRCA1 e BRCA2 e carcinoma mammario (BC) conclamato, ovarico (OC) e altri associati a un rischio di cancro nel corso della vita. Il test per il gene BRCA è fondamentale per valutare il rischio individuale, nonché per trovare metodi di prevenzione nei portatori sani e personalizzare i trattamenti nei pazienti affetti da cancro. La prevalenza delle alterazioni di BRCA1 e BRCA2 varia ampiamente tra le regioni geografiche e, sebbene esistano dati sulle varianti patogene di BRCA nelle famiglie siciliane, mancano studi specificamente mirati alle popolazioni della Sicilia orientale. Lo scopo del nostro studio era quello di indagare l'incidenza e la distribuzione delle alterazioni germinali patogene di BRCA in una coorte di pazienti con BC della Sicilia orientale e di valutare la loro associazione con tratti specifici del BC utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. La presenza di alterazioni è correlata al grado del tumore e all'indice di proliferazione. RISULTATI: Nel complesso, 35 pazienti (9%) presentavano una variante patogena di BRCA, 17 (49%) in BRCA1 e 18 (51%) in BRCA2. Alterazioni di BRCA1 sono prevalenti nei pazienti con BC triplo negativo, mentre le mutazioni BRCA2 sono più comuni nei pazienti con BC luminale. Rispetto ai non portatori, i soggetti con varianti BRCA1 avevano un grado del tumore e un indice proliferativo significativamente più elevati. Conclusioni: i nostri risultati forniscono una panoramica dello stato mutazionale BRCA nei pazienti con BC della Sicilia orientale e confermano il ruolo dell'analisi NGS nell'identificazione dei pazienti con BC ereditario. Nel complesso, questi dati sono coerenti con le precedenti evidenze a supporto dello screening BRCA per una corretta prevenzione e trattamento del cancro nei portatori di mutazione.
Il cancro al seno (BC) è la neoplasia maligna più comune al mondo e il tumore più mortale nelle donne.1 Le caratteristiche biologiche che determinano la prognosi e il comportamento clinico del BC sono state ampiamente studiate e parzialmente chiarite nel tempo. Infatti, attualmente vengono utilizzati diversi marcatori surrogati per classificare il BC in diversi sottotipi molecolari. Sono il recettore degli estrogeni (ER) e/o del progesterone (PgR), l'amplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2), l'indice di proliferazione Ki-67 e il grado del tumore (G).2 La combinazione di queste variabili ha identificato le seguenti categorie di BC: 1) Tumori luminali, che mostrano espressione di ER e/o PgR, rappresentavano il 75% dei BC. Questi tumori sono stati ulteriormente suddivisi in Luminale A, quando Ki-67 era inferiore al 20% e HER2 negativo, e Luminale B, quando Ki-67 era uguale o superiore al 20% e in presenza di amplificazione HER2, indipendentemente dall'indice di proliferazione; 2) Tumori HER2+ che sono negativi per ER e PgR ma mostrano amplificazione di HER2. Questo gruppo rappresenta il 10% di tutti i tumori al seno; 3) Il cancro al seno triplo negativo (TNBC), che non mostra espressione di ER e PgR e amplificazione di HER2, rappresenta circa il 15% dei tumori al seno.2-4
Tra questi sottotipi di BC, il grado del tumore e l'indice di proliferazione rappresentano biomarcatori trasversali che sono direttamente e indipendentemente associati all'aggressività del tumore e alla prognosi.5,6
Oltre alle caratteristiche biologiche sopra menzionate, il ruolo delle alterazioni genetiche ereditarie che portano allo sviluppo del BC è diventato sempre più importante negli ultimi anni.7 Circa 1 tumore al seno su 10 è ereditato a causa di alterazioni della linea germinale in geni specifici.8 Due grandi studi epidemiologici che hanno coinvolto più di 180.000 donne hanno recentemente identificato un gruppo di otto geni (vale a dire, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C e RAD51D) principalmente responsabili del BC ereditario. Tra questi geni, BRCA1 e BRCA2 (di seguito denominati BRCA1/2) hanno mostrato la correlazione più forte con lo sviluppo di tumori al seno.9-12 Infatti, le mutazioni della linea germinale BRCA1/2 aumentano significativamente il rischio di BC nel corso della vita così come di altre neoplasie, tra cui ovariche, prostatiche, pancreatiche, colorettali e melanoma.Dai 13 agli 80 anni, l'incidenza cumulativa del cancro al seno è del 72% nelle donne con una variante patogena BRCA1 (PV) e del 69% nelle donne con una PV BRCA2.14
In particolare, una recente pubblicazione suggerisce che il rischio di BC dipende dal tipo di PV. Infatti, rispetto alle varianti troncanti patogene, le varianti missense evidenti, in particolare nel gene BRCA1, sono associate a un rischio ridotto di BC, soprattutto nelle donne anziane.15
La presenza di BRCA1 o BRCA2 PV è stata associata a diverse caratteristiche biologiche e clinico-patologiche.16,17 I tumori ovarici associati a BRCA1 tendono a essere clinicamente aggressivi, scarsamente differenziati e altamente proliferativi. Questi tumori sono solitamente tripli negativi e hanno un'età di insorgenza precoce. I tumori che si verificano nei pazienti con mutazione BRCA2 presentano in genere gradi da moderati a ben differenziati e indici proliferativi variabili. Questi tumori sono più comuni nel lume B e di solito si verificano negli adulti più anziani.16-18 In particolare, le mutazioni in BRCA1 e BRCA2 aumentano la sensibilità a trattamenti specifici, tra cui sali di platino e farmaci mirati come gli inibitori della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARPi).19,20
Negli ultimi anni, l'implementazione del sequenziamento di nuova generazione (NGS) nella pratica clinica ha consentito a un numero crescente di pazienti con BC di sottoporsi a test molecolari per le sindromi di suscettibilità al cancro, tra cui BRCA1/2.21 Contemporaneamente, definizioni basate su criteri precisi riguardanti la storia familiare, le caratteristiche demografiche e clinico-patologiche per identificare meglio gli individui meritevoli di test BRCA1/2.22,23 In questo contesto, si stanno accumulando prove sullo screening BRCA1/2 in popolazioni specifiche, evidenziando differenze tra le regioni geografiche.24–27 Sebbene vi siano rapporti sulla coorte di BC nella Sicilia occidentale, sono disponibili meno dati sullo screening BRCA1/2 nella popolazione della Sicilia orientale.28,29
Descriviamo in questo articolo i risultati dello screening germinale BRCA1/2 nei pazienti affetti da tumore al seno della Sicilia orientale, correlando ulteriormente la presenza di mutazioni BRCA1 o BRCA2 con le principali caratteristiche clinico-patologiche di questi tumori.
È stato condotto uno studio retrospettivo presso il “Centro di Oncologia ed Ematologia Sperimentale” dell’Ospedale Policlinico Rodolico – San Marco di Catania. Da gennaio 2017 a marzo 2021, un totale di 455 pazienti con tumore al seno e alle ovaie, melanoma, pancreas o prostata sono stati indirizzati al nostro laboratorio di diagnostica molecolare per il test genetico BRCA/2. Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato scritto prima dell’analisi molecolare.
Le caratteristiche istologiche e biologiche (ER, PgR, stato HER2, Ki-67 e grado) dei BC sono state valutate su biopsia del nucleo o campioni chirurgici, considerando solo i componenti tumorali aggressivi. In base a queste caratteristiche, i BC sono stati classificati come segue: luminale A (ER+ e/o PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminale B (ER+ e/o PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminale B-HER2+ (ER e/o PgR+, HER2+), HER2+ (ER e PgR-, HER2+) o triplo negativo (ER e PgR-, HER2-).
Prima di valutare lo stato di mutazione di BRCA1 e BRCA2, un team multidisciplinare comprendente un oncologo, un genetista e uno psicologo ha condotto una consulenza di genetica tumorale per ogni paziente per determinare la presenza di BRCA1 e/o BRCA1. o individui con un alto rischio di PV nel gene BRCA2. La selezione dei pazienti è stata eseguita secondo le linee guida della Società Italiana di Oncologia Medica (AIOM) e le raccomandazioni locali siciliane.30,31 Questi criteri includono: (i) storia familiare di varianti patogene note nei geni di suscettibilità (ad esempio, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) uomini con BC; (iii) quelli con BC e OC; (iv) donne con BC <36 anni, TNBC <60 anni o BC bilaterale <50 anni; (v) storia medica personale di BC <50 anni e almeno un parente di primo grado: (a) BC <50 anni; (b) OC non mucinoso e non borderline di qualsiasi età; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (e) cancro al pancreas; (f) cancro alla prostata; (vi) due o più anamnesi personali di BC > 50 anni e anamnesi familiare di BC, OC o cancro al pancreas per i parenti che sono parenti di primo grado tra loro (inclusi i parenti con cui è parente di primo grado); (vii) anamnesi personale di OC e almeno un parente di primo grado: (a) BC <50 anni; (b) NOC; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (vii) donna con OC sieroso di alto grado.
Da ciascun paziente è stato prelevato un campione di sangue periferico di 20 mL, raccolto in provette EDTA (BD Biosciences). Il DNA genomico è stato isolato da campioni di sangue intero di 0,7 mL utilizzando il kit di isolamento QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Italia) secondo le istruzioni del produttore e passato attraverso un fluorimetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Eseguire la quantificazione. L'arricchimento del target e la preparazione della libreria vengono eseguiti dall'Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pronti per essere caricati nel kit Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 per la preparazione automatizzata della libreria secondo le istruzioni del produttore. Il kit è costituito da due pool di primer PCR multiplex che possono essere utilizzati per studiare tutti i geni BRCA1 (NM_007300.3) e BRCA2 (NM_000059.3). In breve, 15 µL di ciascun campione di DNA diluito (10 ng) sono stati aggiunti alle piastre con codice a barre per la preparazione della libreria e tutti i reagenti e i materiali di consumo sono stati caricati sullo strumento Ion Chef™. La preparazione automatizzata della libreria e il pooling della libreria del campione con codice a barre sono stati quindi eseguiti sullo strumento Ion Chef™. Il numero di librerie preparate è stato quindi valutato da un fluorimetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Infine, le librerie vengono combinate in rapporti equimolari in Ion Provette per campioni della libreria Chef™ (provette con codice a barre) caricate sullo strumento Ion Chef™. Il sequenziamento è stato eseguito utilizzando uno strumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) utilizzando un chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). L'analisi dei dati è stata eseguita da Amplicon Suite (SmartSeq srl) e dal software Ion Reporter.
La nomenclatura di tutte le varianti ha seguito le attuali linee guida dell'Human Genome Variation Consortium, disponibili online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Il significato clinico delle varianti BRCA1/2 è stato definito utilizzando la classificazione dell'International Consortium ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) e consultando diversi database come ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD e UMD. La classificazione include cinque distinte categorie di rischio: benigno (categoria I), probabilmente benigno (categoria II), variante di significato incerto (VUS, categoria III), probabilmente patogeno (categoria IV) e patogeno (categoria V). VarSome ha anche analizzato l'effetto delle mutazioni sulla struttura e sulla funzione delle proteine, uno strumento informativo con accesso a 30 database.32
Per assegnare un potenziale significato clinico a ciascuna VUS, sono stati utilizzati i seguenti algoritmi computazionali di predizione proteica: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Le varianti classificate come classe 1 e 2 sono state considerate di tipo selvatico.
Il sequenziamento di Sanger ha confermato la presenza di ciascuna variante patogena. In breve, è stata progettata una coppia di primer specifici per ciascuna variante rilevata utilizzando le sequenze di riferimento dei geni BRCA1 e BRCA2 (rispettivamente NG_005905.2, NM_007294.3 e NG_012772.3, NM_000059.3). Pertanto, è stata eseguita una PCR mirata seguita dal sequenziamento di Sanger.
I pazienti risultati negativi al gene BRCA1/2 sono stati testati mediante amplificazione multipla della sonda dipendente dalla ligazione (MLPA) secondo le istruzioni del produttore per valutare la presenza di grandi riarrangiamenti genomici (LGR). In breve, i campioni di DNA vengono denaturati e vengono utilizzate fino a 60 sonde specifiche per i geni BRCA1 e BRCA2, ciascuna delle quali rileva una sequenza di DNA specifica di circa 60 nucleotidi di lunghezza. I prodotti di amplificazione della sonda, costituiti da un set univoco di ampliconi PCR, sono stati quindi analizzati mediante elettroforesi capillare e dal software Cofalyser.Net insieme alle tabelle Cofalyser specifiche per lotto (www.mrcholland.com).
Alcune variabili clinico-patologiche (grado istologico e indice di proliferazione Ki-67%) sono state associate alla presenza di BRCA1/2 PV, calcolate utilizzando il software Prism versione 8.4 utilizzando il test esatto di Fisher, presupponendo che il valore p <0,05 fosse significativo.
Tra gennaio 2017 e marzo 2021, 455 pazienti sono stati sottoposti a screening per mutazioni germinali BRCA1/2. Il test di mutazione è stato eseguito presso il Centro di Oncologia ed Ematologia Sperimentale dell'Ospedale Policlinico. Secondo le linee guida siciliane (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), il Rodolico di Catania - San Marco" ha complessivamente 389 pazienti. Si trattava di tumore al seno, 37 tumore all'ovaio, 16 tumore al pancreas, 8 tumore alla prostata e 5 melanoma. La distribuzione dei pazienti in base al tipo di tumore e ai risultati dell'analisi è mostrata nella Figura 1.
La figura 1 mostra un diagramma di flusso che illustra una panoramica dello studio. I pazienti con tumori al seno, melanoma, pancreas, prostata o ovaie sono stati sottoposti a test per mutazioni nei geni BRCA1 e BRCA2.
Abbreviazioni: PV, variante patogena; VUS, variante di significato incerto; WT, sequenza BRCA1/2 di tipo selvatico.
Abbiamo concentrato selettivamente i nostri studi su coorti di pazienti con tumore al seno. I pazienti avevano un'età media di 49 anni (intervallo 23-89) ed erano prevalentemente di sesso femminile (n=376, ovvero il 97%).
Di questi soggetti, 64 (17%) presentavano mutazioni BRCA1/2 ed erano tutti di sesso femminile. Trentacinque (9%) presentavano PV e 29 (7,5%) VUS. Diciassette (48,6%) delle 35 varianti patogene si sono verificate in BRCA1 e 18 (51,4%) in BRCA2, mentre 5 VUS si sono verificate in BRCA1 (17,2%) e 24 (82,8%) in BRCA2 (Figure 1 e 2). LGR non era presente nell'analisi MLPA.
Figura 2. Analisi delle mutazioni BRCA1 e BRCA2 in 389 pazienti con tumore al seno. (A) Distribuzione delle varianti patogene (PV) (rosso), varianti di significato incerto (VUS) (arancione) e WT (blu) in 389 pazienti con tumore al seno; (B) 389 pazienti con tumore al seno Trentacinque (9%) presentavano varianti patogene (PV) di BRCA1/2. Tra queste, 17 (48,6%) erano portatrici di PV di BRCA1 (rosso scuro) e 18 (51,4%) erano portatrici di BRCA2 (rosso chiaro); (C) 29 (7,5%) di 389 soggetti presentavano VUS, 5 (17,2%) geni BRCA1 (arancione scuro) e 24 (82,8%) geni BRCA2 (arancione chiaro).
Abbreviazioni: PV, variante patogena; VUS, variante di significato incerto; WT, sequenza BRCA1/2 di tipo selvatico.
Successivamente abbiamo studiato la prevalenza dei sottotipi molecolari di BC in pazienti con BRCA1/2 PV. La distribuzione includeva 2 (5,7%) luminali A, 15 (42,9%) luminali B, 3 (8,6%) luminali B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ e 13 (37,1%) pazienti con TNBC. Tra i pazienti BRCA1-positivi, 5 (29,4%) avevano BC luminale B, 2 (11,8%) avevano malattia HER2+ e 10 (58,8%) avevano TNBC. I tumori senza mutazioni BRCA1 erano luminali A o luminali B-HER2+ (Figura 3). Nel sottogruppo BRCA2-positivo, 10 (55,6%) tumori erano luminali B, 3 (16,7%) erano luminali B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC e 2 (11,1%) erano luminali A (Figura 3). In questo gruppo non erano presenti tumori HER2+. Pertanto, le mutazioni BRCA1 sono prevalenti nei pazienti con TNBC, mentre le alterazioni BRCA2 sono predominanti negli individui con lume B.
Figura 3 Prevalenza dei sottotipi di cancro al seno in pazienti con varianti patogene in BRCA1 e BRCA2. Istogrammi che mostrano la distribuzione dei PV BRCA1- (rosso scuro) e BRCA2- (rosso chiaro) tra i sottotipi molecolari di pazienti con cancro al seno. I numeri riportati in ogni riquadro rappresentano la percentuale di pazienti con PV BRCA1 e BRCA2 per ciascun sottotipo di cancro al seno.
Abbreviazioni: PV, variante patogena; HER2+, recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 positivo; TNBC, tumore al seno triplo negativo.
Successivamente, abbiamo valutato il tipo e la localizzazione genica delle PV di BRCA1 e BRCA2. Nelle PV di BRCA1, abbiamo osservato 7 varianti a singolo nucleotide (SNV), 6 delezioni, 3 duplicazioni e 1 inserzione. Solo una mutazione (c.5522delG) rappresenta una nuova scoperta. La PV di BRCA1 più comune rilevata in entrambi i soggetti era c.5035_5039delCTAAT. Questa alterazione comporta una delezione di cinque nucleotidi (CTAAT) nell'esone 15 di BRCA1, che determina la sostituzione dell'amminoacido leucina con la tirosina al codone 1679 e, a causa di uno spostamento del frame di traduzione con un codone di stop alternativo previsto, porta al troncamento prematuro della proteina. Tutte le altre modifiche sono state rilevate in un solo caso. In particolare, una delle PV segnalate era localizzata nella regione consenso del sito di splicing (c.4357+1G>T) (Tabella 1).
Per quanto riguarda BRCA2 PV, abbiamo osservato 6 delezioni, 6 SNV e 2 duplicazioni. Nessuna delle modifiche trovate è nuova. Tre mutazioni si sono ripresentate nella nostra popolazione, c.428dup e c.8487+1G>A osservate in 3 soggetti, seguite da c.5851_5854delAGTT recuperata in due casi. L'alterazione c.428dup comporta una ripetizione di C nell'esone 5 di BRCA2, prevista per codificare una proteina troncata e non funzionale. La mutazione c.8487+1G>A si verifica nella regione intronica dell'introne 19 di BRCA2 (± 1,2) e colpisce la sequenza di consenso dello splicing, risultando in uno splicing alterato che risulta in una proteina anomala o assente. La variante patogena c.5851_5854delAGTT è dovuta a una delezione di 4 nucleotidi dalle posizioni nucleotidiche 5851 a 5854 nell'esone codificante 10 del gene BRCA2 e determina uno spostamento del frame traduzionale con un codone di stop alternativo previsto (p.S1951WfsTer). In particolare, come precedentemente riportato, entrambe le alterazioni c.631G>A e c.7008-2A>T sono state rilevate nello stesso paziente.34 La prima mutazione comporta la sostituzione dell'adenosina (A) nell'esone 7 di BRCA2 con un nucleotide contenente guanina (G) che determina un cambiamento della valina in isoleucina al codone 211, l'amminoacido isoleucina è un amminoacido con proprietà molto simili. Questo cambiamento influenza il normale splicing dell'mRNA. La seconda variante si trova in una regione intronica e determina una doppia sostituzione da A a timina (T) prima dell'esone 13 del gene che codifica per BRCA2. Il cambiamento c.7008-2A>T può generare trascrizioni multiple di lunghezze diverse. Inoltre, nel gruppo di BRCA2 PV, 4 su 18 cambiamenti (22,2%) erano intronici.
Abbiamo quindi mappato le mutazioni deleterie di BRCA1/2 nei domini funzionali e nelle regioni di legame alle proteine ​​(Fig. 4). Nel gene BRCA1, il 50% delle PV era localizzato nella regione del cluster del cancro al seno (BCCR), mentre il 22% delle mutazioni era localizzato nella regione del cluster del cancro ovarico (OCCR) (Fig. 4A). Nelle PV di BRCA2, il 35,7% delle varianti era localizzato nella regione BCCR e il 42,8% delle mutazioni era localizzato nell'OCCR (Fig. 4B). Successivamente, abbiamo valutato la posizione delle PV all'interno dei domini proteici di BRCA1 e BRCA2. Per la proteina BRCA1, abbiamo trovato tre PV nei domini loop e coiled coil e due mutazioni nel dominio BRCT (Fig. 4A). Per la proteina BRCA2, 4 PV mappavano nel dominio di ripetizione BRC, mentre 3 cambiamenti intronici e 3 esonici sono stati rilevati nel dominio di legame degli oligo/oligosaccaridi (OB) e nella torre. (T) domini (Figura 4B).
Figura 4 Rappresentazione schematica delle proteine ​​BRCA1 e BRCA2 e localizzazione delle varianti patogene. Questa figura mostra la distribuzione delle varianti patogene BRCA1 (A) e BRCA2 (B) nelle pazienti con cancro al seno. Le mutazioni esoniche sono mostrate in blu, mentre le varianti introniche sono mostrate in arancione. L'altezza della barra rappresenta il numero di casi. Vengono riportate le proteine ​​BRCA1 e BRCA2 e i loro domini funzionali. (A) La proteina BRCA1 contiene un dominio loop (RING) e una sequenza di localizzazione nucleare (NLS), un dominio coiled-coil, un dominio cluster SQ/TQ (SCD) e un dominio C-terminale BRCA1 (BRCT). (B) La proteina BRCA2 contiene otto ripetizioni BRC, un dominio di legame al DNA con un dominio elicoidale (Helical), tre pieghe di legame agli oligonucleotidi/oligosaccaridi (OB), un dominio tower (T) e una NLS sul lato C. Aree chiamate Breast Cancer Cluster Region (BCCR) e In basso è mostrata la regione del cluster del cancro ovarico (OCCR).*Rappresenta le mutazioni che determinano i codoni di stop.
Abbiamo poi studiato le caratteristiche clinico-patologiche del carcinoma mammario che potrebbero essere correlate alla presenza di BRCA1/2 PV. Erano disponibili cartelle cliniche complete di 181 pazienti BRCA1/2-negativi (non portatori) e di tutti i portatori (n = 35). È stata riscontrata una correlazione tra il tasso di proliferazione del tumore e il grado.
Abbiamo calcolato la distribuzione di Ki-67 in base alla mediana della nostra coorte (25%, range <10-90%). I soggetti con Ki-67 < 25% sono stati definiti come "Ki-67 basso", mentre gli individui con valori ≥ 25% sono stati considerati "Ki-67 alto". Sono state riscontrate differenze significative di Ki-67 (p <0,01) tra non portatori e portatori di BRCA1 PV (Fig. 5A).
Figura 5 Correlazione di Ki-67 con la distribuzione del grado nelle donne con tumore al seno con e senza PV BRCA1 e BRCA2. (A) Boxplot che mostra i valori mediani di Ki-67 in 181 pazienti con BC non portatrici rispetto a pazienti con PV BRCA1 (18) o BRCA2 (17). I valori di P inferiori a 0,5 sono stati considerati statisticamente significativi. (B) Istogramma che rappresenta l'assegnazione delle pazienti con tumore al seno in gruppi di grado istologico (G2 e G3) in base allo stato di mutazione BRCA1 e BRCA2 (soggetti WT, portatori di PV BRCA1 e BRCA2).
Allo stesso modo, abbiamo esaminato se il grado del tumore fosse correlato alla presenza di BRCA1/2 PV. Poiché il carcinoma mammario G1 era assente nella nostra popolazione, abbiamo diviso i pazienti in due gruppi (G2 o G3). In linea con i risultati del Ki-67, l'analisi ha rivelato una correlazione statisticamente significativa tra il grado del tumore e la mutazione BRCA1, con una percentuale maggiore di tumori G3 nei portatori di BRCA1 rispetto ai non portatori (p<0,005) (Figura 5B).
I progressi nella tecnologia di sequenziamento del DNA hanno consentito progressi senza precedenti nei test genetici BRCA1/2, con implicazioni cruciali per i pazienti con una storia familiare di cancro. Ad oggi, circa 20.000 varianti BRCA1/2 sono state identificate e classificate secondo l'American Society of Medical Genetics 35 e il sistema ENIGMA.35,36 È noto che lo spettro mutazionale BRCA1/2 varia ampiamente tra le regioni geografiche.37 In Italia, il tasso di PV BRCA1/2 variava dall'8% al 37%, mostrando un'ampia variabilità intra-nazionale.38,39 Con una popolazione di quasi 5 milioni, la Sicilia è la quinta regione più grande d'Italia in termini di numero di abitanti. Sebbene esistano dati sulla distribuzione di BRCA1/2 nella Sicilia occidentale, non vi sono prove esaurienti nella parte orientale dell'isola.
Il nostro studio è uno dei primi resoconti sull'incidenza di BRCA1/2 PV nei pazienti affetti da BC nella Sicilia orientale.28 Abbiamo concentrato la nostra analisi sul BC, poiché questa è di gran lunga la malattia più comune nella nostra coorte.
Nel test su 389 pazienti con carcinoma mammario maschile, il 9% presentava mutazioni polimorfiche di BRCA1/2, equamente distribuite tra BRCA1 e BRCA2. Questi risultati sono coerenti con quelli precedentemente riportati nella popolazione italiana.28 È interessante notare che il 3% (13/389) della nostra coorte era di sesso maschile. Questo tasso è superiore a quello previsto per il carcinoma mammario maschile (1% di tutti i tumori mammari maschili),40 riflettendo la nostra selezione di popolazioni in base al rischio di mutazione di BRCA1/2. Tuttavia, nessuno di questi uomini ha sviluppato una mutazione polimorfica di BRCA1/2, quindi erano candidati per ulteriori analisi molecolari per escludere la presenza di mutazioni meno comuni come PALB2, RAD51C e D, tra le altre. Varianti di significato incerto sono state recuperate nel 7% dei soggetti in cui era evidente la VUS di BRCA2. Anche questo risultato è coerente con le prove preesistenti.28,41,42
Quando abbiamo analizzato la distribuzione dei sottotipi molecolari di BC nelle donne con mutazione BRCA1/2, abbiamo confermato le associazioni note tra TNBC e BRCA1 PV (58,8%) e tra luminal B BC e BRCA2 PV (55,6%).16,43 I tumori luminal A e HER2+ nelle portatrici di BRCA1 e BRCA2 PV sono coerenti con i dati della letteratura esistente.16,43
Ci concentriamo quindi sul tipo e sulla posizione del PV BRCA1/2. Nella nostra coorte, il PV BRCA1 più comune era c.5035_5039delCTAAT. Sebbene Incorvaia et al. non hanno descritto questa variante nella loro coorte siciliana, altri autori l'hanno riportata come una PV germinale BRCA1.34 Nella nostra coorte sono state trovate diverse PV BRCA1, ad esempio c.181T>G, c.514del, c.3253dupA e c.5266dupC, che sono state osservate in Sicilia.28 Di queste, due mutazioni fondatrici BRCA1 (c.181T>G e c.5266dupC) si trovano comunemente negli ebrei ashkenaziti dell'Europa orientale e centrale (Polonia, Repubblica ceca), sloveni, austriaci, ungheresi, bielorussi e tedeschi), 44,45 e, negli Stati Uniti e in Argentina, è stata recentemente definita come una "variante germinale ricorrente" nei pazienti italiani con BC e OC. La variante 34c.514del è stata precedentemente identificata in 8 pazienti con cancro al seno della Sicilia settentrionale a Palermo e Messina. È interessante notare che anche Incorvaia et al. hanno trovato la variante c.3253dupA in alcune famiglie di Catania.28 Le varianti genetiche BRCA2 più rappresentative sono c.428dup, c.5851_5854delAGTT e la variante intronica c.8487+1G>A, che sono state riportate più dettagliatamente 28 in un paziente di Palermo con c.428dup, c.5851_5854delAGTT. La variante genetica è stata osservata in famiglie della Sicilia nord-occidentale, principalmente nelle province di Trapani e Palermo, mentre la variante genetica c.5851_5854delAGTT è stata osservata in famiglie della Sicilia nord-occidentale. La variante 8487+1G>A era più comune nei soggetti di Messina, Palermo e Caltanissetta.28 Rebbeck et al. precedentemente descritta l'alterazione c.5851_5854delAGTT in Colombia.37 Un'altra variante BRCA2, c.631+1G>A, è stata trovata in pazienti con BC e OC provenienti dalla Sicilia (Agrigento, Siracusa e Ragusa).28 In particolare, abbiamo osservato la coesistenza di due varianti BRCA2 (BRCA2 c.631G>A e c.7008-2A>T) nello stesso paziente, che abbiamo assunto essere segregate in modalità cis, come precedentemente riportato.34,46 Queste mutazioni BRCA2 sono infatti frequentemente osservate nella regione italiana e si è scoperto che introducono codoni di stop prematuri, influenzando lo splicing dell'RNA messaggero e causando il fallimento della proteina BRCA2.47,48
Abbiamo anche mappato i PV di BRCA1 e BRCA2 nelle presunte regioni OCCR e BCCR dei domini proteici e dei geni. Queste regioni sono state descritte da Rebbeck et al. come aree di rischio per lo sviluppo rispettivamente di cancro alle ovaie e al seno.49 Tuttavia, le prove riguardanti l'associazione tra la posizione delle varianti della linea germinale e il rischio di cancro al seno o alle ovaie rimangono controverse.28,50-52 Nella nostra popolazione, i PV di BRCA1 erano prevalentemente localizzati nella regione BCCR, mentre i PV di BRCA2 erano prevalentemente localizzati nella regione OCCR. Tuttavia, non siamo stati in grado di trovare alcuna associazione tra le presunte regioni OCCR e BCCR e le caratteristiche del BC. Ciò potrebbe essere dovuto al numero limitato di pazienti con mutazioni BRCA1/2. Dal punto di vista del dominio proteico, i PV di BRCA1 sono distribuiti lungo l'intera proteina e le alterazioni di BRCA2 si trovano preferibilmente nel dominio ripetuto di BRC.
Infine, abbiamo correlato le caratteristiche clinico-patologiche del BC con il PV BRCA1/2. A causa del numero limitato di pazienti inclusi, abbiamo trovato una correlazione significativa solo tra Ki-67 e grado del tumore. Sebbene la valutazione e l'interpretazione del Ki-67 rimangano in qualche modo controverse, è certo che alti tassi proliferativi sono associati a un aumento del rischio di recidiva della malattia e a una riduzione della sopravvivenza. Ad oggi, il limite per distinguere tra Ki-67 "alto" e "basso" è del 20%. Tuttavia, questa soglia non si applica alla nostra popolazione di pazienti con mutazione BRCA1/2, che ha un valore mediano di Ki-67 del 25%. Questa tendenza negli alti tassi di Ki-67 può essere spiegata dalla prevalenza nelle nostre coorti luminali B e TNBC, di cui erano presenti pochi tumori luminali A. Tuttavia, alcune prove sembrano suggerire che un limite di Ki-67 più alto (25-30%) possa stratificare meglio i pazienti in base alla loro prognosi.53,54 Dai risultati della nostra analisi, non è stata riscontrata una correlazione significativa. sorprendente. Si verifica tra alti gradi Ki-67 e la presenza di BRCA1 PV. Infatti, i tumori correlati a BRCA1 sono tipici del TNBC e presentano caratteristiche più aggressive.16,17
In conclusione, questo studio fornisce un rapporto sullo stato mutazionale di BRCA1/2 in una coorte di pazienti con BC della Sicilia orientale. Nel complesso, i nostri risultati sono coerenti con le prove preesistenti, sia in termini di prevalenza delle mutazioni che di caratteristiche clinico-patologiche nel BC. Sono necessari ulteriori studi su popolazioni più ampie di pazienti con BC con mutazione BRCA1/2, come l'utilizzo dell'analisi mutazionale espansa multigenomica, per valutare la presenza di PV distinti e meno frequenti di BRCA1/2. Ciò consentirà l'identificazione e la corretta gestione del numero crescente di soggetti ad aumentato rischio di cancro a causa di mutazioni genetiche.
Abbiamo confermato che i pazienti hanno firmato il consenso informato per rilasciare i loro campioni tumorali in forma anonima per scopi di ricerca. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato scritto secondo la Dichiarazione di Helsinki. Secondo la politica dell'AOU Policlinico "G.Rodolico - S.Marco", questo studio è stato esentato dalla revisione etica perché l'analisi BRCA1/2 è stata eseguita secondo la pratica clinica e tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto. I pazienti acconsentono inoltre all'uso dei loro dati per scopi di ricerca.
Ringraziamo il Prof. Paolo Vigneri per l’assistenza prestata nella cura delle pazienti affette da tumore al seno, come richiesto dal Comitato Etico.
Federica Martorana dichiara di aver percepito compensi da Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Gli altri autori dichiarano di non avere conflitti di interesse nel presente lavoro.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN stima l'incidenza e la mortalità di 36 tumori in 185 paesi in tutto il mondo. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-249. doi: 10.3322/caac.21660