В вашем браузере в данный момент отключен JavaScript. Некоторые функции этого веб-сайта не будут работать при отключенном JavaScript.
Зарегистрируйтесь, указав свои конкретные данные и интересующий вас препарат, и мы сопоставим предоставленную вами информацию со статьями в нашей обширной базе данных и оперативно вышлем вам PDF-копию по электронной почте.
作者 Стелла С., Витале С.Р., Марторана Ф., Массимино М., Павоне Г., Ланцафэйм К., Бьянка С., Бароне С., Горгоне С., Фичера М., Манцелла Л.
Стефания Стелла, 1,2 Сильвия Рита Витале, 1,2 Федерика Марторана, 1,2 Микеле Массимино, 1,2 Джулиана Павоне, 3 Катя Ланцафаме, 3 Себастьяно Бьянка, 4 Кьяра Бароне, 5 Кристина Горгоне, 6 Марко Фичера, 6, 7 Ливия Манцелла1,21 Кафедра клинической и экспериментальной медицины, Университет Катания, Катания, 95123, Италия;2 Центр экспериментальной онкологии и гематологии, АОУ Поликлиника «Г.Родолико – Сан-Марко», Катания, 95123, Италия; 3 Медицинская онкология, АОУ Поликлиника «Г. Родолико – Сан-Марко», Катания, 95123, Италия; 4 Медицинская генетика, АРНАС Гарибальди, Катания, 95123, Италия; 5. Медицинская генетика, ASP, Сиракьюз, 96100, Италия; 6. Кафедра биомедицинских и биотехнологических наук, Университет Катании, медицинская генетика, Катания, Италия, 95123; 7. Научно-исследовательский институт Oasi-IRCCS, Троина, 94018, Италия. Связь: Стефания Стелла, тел. +39 095 378 1946, электронная почта [email protected]; [email protected] Цель: Герминальные мутации в генах BRCA1 и BRCA2 и установленный рак молочной железы (РМЖ), рак яичников (РЯ) и другие заболевания связаны с пожизненным риском развития рака. Тестирование на наличие мутаций в гене BRCA имеет ключевое значение для оценки индивидуального риска, а также для поиска методов профилактики у здоровых носителей и подбора лечения для онкологических больных. Распространенность изменений в генах BRCA1 и BRCA2 значительно варьируется в зависимости от географического региона, и хотя существуют данные о патогенных вариантах BRCA в сицилийских семьях, исследования, специально посвященные популяциям восточной Сицилии, отсутствуют. Целью нашего исследования было изучение частоты и распределения патогенных герминальных изменений BRCA в когорте пациентов с РМЖ из восточной Сицилии и оценка их связи со специфическими признаками РМЖ с использованием секвенирования нового поколения. Наличие изменений коррелировало со степенью злокачественности опухоли и индексом пролиферации. РЕЗУЛЬТАТЫ: В целом, у 35 пациентов (9%) был обнаружен патогенный вариант BRCA, у 17 (49%) — в генах BRCA1 и BRCA2. 18 (51%) в BRCA2. Изменения BRCA1 распространены у пациентов с трижды негативным раком молочной железы, тогда как мутации BRCA2 чаще встречаются у пациентов с люминальным раком молочной железы. По сравнению с неносителями, у субъектов с вариантами BRCA1 наблюдалась значительно более высокая степень злокачественности опухоли и пролиферативный индекс. Выводы: Наши результаты дают представление о мутационном статусе BRCA у пациентов с раком молочной железы из восточной Сицилии и подтверждают роль анализа NGS в выявлении пациентов с наследственным раком молочной железы. В целом, эти данные согласуются с предыдущими доказательствами, подтверждающими целесообразность скрининга BRCA для надлежащей профилактики и лечения рака у носителей мутаций.
Рак молочной железы (РМЖ) — наиболее распространенное злокачественное новообразование в мире и самый смертоносный вид рака у женщин.¹ Биологические особенности, определяющие прогноз и клиническое поведение РМЖ, были extensively изучены и частично выяснены с течением времени. Фактически, в настоящее время для классификации РМЖ на различные молекулярные подтипы используются несколько суррогатных маркеров. К ним относятся рецепторы эстрогена (ER) и/или прогестерона (PgR), амплификация рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), индекс пролиферации Ki-67 и степень злокачественности опухоли (G).² Комбинация этих переменных позволила выделить следующие категории РМЖ: 1) Люминальные опухоли, демонстрирующие экспрессию ER и/или PgR, составляли 75% всех случаев РМЖ. Эти опухоли были далее разделены на Люминальный А, когда Ki-67 был ниже 20% и HER2-отрицателен, и Люминальный В, когда Ki-67 был равен или выше 20% и при наличии амплификации HER2, независимо от индекса пролиферации; 2) HER2+ опухоли, которые являются ER- и PgR-отрицательными, но демонстрируют амплификацию HER2. На эту группу приходится 10% всех опухолей молочной железы; 3) Тройно-негативный рак молочной железы (ТНБК), который не демонстрирует экспрессию ER и PgR и амплификацию HER2, составляет около 15% случаев рака молочной железы.2-4
Среди этих подтипов рака молочной железы степень злокачественности опухоли и индекс пролиферации представляют собой поперечные биомаркеры, которые напрямую и независимо связаны с агрессивностью опухоли и прогнозом.5,6
В дополнение к вышеупомянутым биологическим особенностям, роль наследственных генетических изменений, приводящих к развитию рака молочной железы, в последние несколько лет приобретает все большее значение.7 Примерно 1 из 10 опухолей молочной железы наследуется из-за герминальных изменений в определенных генах.8 Два крупных эпидемиологических исследования с участием более 180 000 женщин недавно выявили группу из восьми генов (а именно, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C и RAD51D), которые в первую очередь ответственны за наследственный рак молочной железы. Среди этих генов BRCA1 и BRCA2 (далее именуемые BRCA1/2) показали наиболее сильную корреляцию с развитием опухолей молочной железы.9-12 Фактически, герминальные мутации BRCA1/2 значительно увеличивают пожизненный риск развития рака молочной железы, а также других злокачественных новообразований, включая рак яичников, предстательной железы, поджелудочной железы, толстой кишки и меланома. В возрасте от 13 до 80 лет кумулятивная частота возникновения рака молочной железы составляет 72% у женщин с патогенным вариантом гена BRCA1 и 69% у женщин с патогенным вариантом гена BRCA2.14
Примечательно, что в недавней публикации предполагается, что риск рака молочной железы зависит от типа патогенного варианта. В самом деле, по сравнению с патогенными усекающими вариантами, явные миссенс-варианты, особенно в гене BRCA1, связаны со сниженным риском рака молочной железы, особенно у женщин старшего возраста.¹⁵
Наличие полиморфизма BRCA1 или BRCA2 ассоциировалось с различными биологическими и клинико-патологическими характеристиками.16,17 Рак молочной железы, ассоциированный с BRCA1, как правило, клинически агрессивен, плохо дифференцирован и обладает высокой пролиферативной активностью. Эти опухоли обычно тройно-негативные и имеют ранний возраст начала заболевания. Опухоли, возникающие у пациентов с мутациями BRCA2, обычно имеют умеренную или хорошую степень дифференцировки и вариабельные индексы пролиферации. Эти опухоли чаще встречаются в просвете B и обычно возникают у пожилых людей.16-18 Следует отметить, что мутации в BRCA1 и BRCA2 повышают чувствительность к определенным методам лечения, включая соли платины и таргетные препараты, такие как ингибиторы поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARPi).19,20
За последние несколько лет внедрение секвенирования нового поколения (NGS) в клиническую практику позволило все большему числу пациенток с раком молочной железы пройти молекулярное тестирование на наличие синдромов предрасположенности к раку, включая гены BRCA1/2.21 Одновременно с этим, были разработаны определения, основанные на точных критериях, касающихся семейного анамнеза, демографических и клинико-патологических характеристик, для более точной идентификации лиц, нуждающихся в тестировании на гены BRCA1/2.22,23 В этом контексте накапливаются данные о скрининге на гены BRCA1/2 в конкретных популяциях, что подчеркивает различия между географическими регионами.24–27 Хотя существуют отчеты о когорте пациенток с раком молочной железы в западной Сицилии, данных о скрининге на гены BRCA1/2 в популяции восточной Сицилии меньше.28,29
В данной работе мы описываем результаты скрининга герминальных мутаций генов BRCA1/2 у пациенток с раком молочной железы из восточной Сицилии, а также сопоставляем наличие мутаций BRCA1 или BRCA2 с основными клинико-патологическими характеристиками этих опухолей.
Ретроспективное исследование было проведено в «Центре экспериментальной онкологии и гематологии» при больнице Поликлинико Родолито – Сан-Марко в Катании. С января 2017 года по март 2021 года в нашу молекулярно-диагностическую лабораторию для генетического тестирования на мутации генов BRCA/2 были направлены 455 пациентов с раком молочной железы и яичников, меланомой, раком поджелудочной железы или предстательной железы. Данное исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией, и все участники предоставили письменное информированное согласие до проведения молекулярного анализа.
Гистологические и биологические характеристики (статус ER, PgR, HER2, Ki-67 и степень злокачественности) рака молочной железы оценивались по образцам, полученным при пункционной биопсии или хирургическом вмешательстве, с учетом только агрессивных компонентов опухоли. На основании этих характеристик рак молочной железы классифицировался следующим образом: люминальный А (ER+ и/или PgR+, HER2-, Ki-67<20%), люминальный В (ER+ и/или PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), люминальный В-HER2+ (ER и/или PgR+, HER2+), HER2+ (ER и PgR-, HER2+) или тройной негативный (ER и PgR-, HER2-).
Перед оценкой статуса мутаций BRCA1 и BRCA2 многопрофильная команда, включающая онколога, генетика и психолога, проводила консультацию по генетике опухоли для каждого пациента, чтобы определить наличие мутаций BRCA1 и/или BRCA2 или лиц с высоким риском развития вариабельности рака предстательной железы в гене BRCA2. Отбор пациентов проводился в соответствии с рекомендациями Итальянского общества медицинской онкологии (AIOM) и местными рекомендациями Сицилии.30,31 Эти критерии включают: (i) семейный анамнез известных патогенных вариантов в генах предрасположенности (например, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) мужчины с раком молочной железы; (iii) мужчины с раком молочной железы и раком яичников; (iv) женщины с раком молочной железы в возрасте до 36 лет, трижды негативным раком молочной железы в возрасте до 60 лет или двусторонним раком молочной железы в возрасте до 50 лет; (v) личный медицинский анамнез рака молочной железы в возрасте до 50 лет и наличие как минимум одного родственника первой степени родства: (a) рак молочной железы в возрасте до 50 лет; (b) неслизистый и не пограничный рак яичников любого возраста; (c) двусторонний рак молочной железы; (d) рак молочной железы у мужчин; (e) рак поджелудочной железы; (f) рак предстательной железы; (vi) два или более случая рака молочной железы в возрасте старше 50 лет и семейный анамнез рака молочной железы, рака яичников или рака поджелудочной железы у родственников первой степени родства (включая родственников, с которыми она является родственником первой степени родства); (vii) личный анамнез рака яичников и наличие хотя бы одного родственника первой степени родства: (a) рак молочной железы в возрасте до 50 лет; (b) неслизистый рак яичников; (c) двусторонний рак молочной железы; (d) рак молочной железы у мужчин; (vii) женщина с высокозлокачественным серозным раком яичников.
У каждого пациента брали 20 мл образца периферической крови и собирали его в пробирки с ЭДТА (BD Biosciences). Геномную ДНК выделяли из 0,7 мл образцов цельной крови с использованием набора для выделения ДНК QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Хильден, Италия) в соответствии с инструкциями производителя и пропускали через флуориметр Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Для количественного определения проводили анализ. Обогащение целевых последовательностей и подготовка библиотек выполняются с помощью набора Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, который готов к загрузке в набор Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit для автоматической подготовки библиотек в соответствии с инструкциями производителя. Набор состоит из двух мультиплексных пулов ПЦР-праймеров, которые можно использовать для изучения всех генов BRCA1 (NM_007300.3) и BRCA2 (NM_000059.3). Вкратце, 15 мкл каждого разбавленного образца ДНК (10 нг) добавляли на планшеты с баркодами для подготовки библиотек, и все реагенты и расходные материалы загружали в прибор Ion Chef™. Затем на приборе Ion Chef™ выполняли автоматическую подготовку библиотек и объединение образцов с баркодами. Количество подготовленных библиотек затем оценивали с помощью флуориметра Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя. Инструкции производителя. Наконец, библиотеки объединяются в эквимолярных соотношениях в пробирках для образцов библиотек Ion Chef™ (пробирки со штрихкодом) и загружаются в прибор Ion Chef™. Секвенирование проводилось с использованием прибора Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) с чипом Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения Amplicon Suite (SmartSeq srl) и Ion Reporter.
Вся номенклатура вариантов соответствовала действующим рекомендациям Консорциума по изучению вариаций генома человека, доступным онлайн (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Клиническая значимость вариантов BRCA1/2 определялась с использованием классификации Международного консорциума ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) и путем обращения к различным базам данных, таким как ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD и UMD. Классификация включает пять различных категорий риска: доброкачественные (категория I), вероятно доброкачественные (категория II), варианты неопределенного значения (VUS, категория III), вероятно патогенные (категория IV) и патогенные (категория V). VarSome также анализировал влияние мутаций на структуру и функцию белка, используя информативный инструмент с доступом к 30 базам данных.32
Для определения потенциальной клинической значимости каждого варианта неопределенного клинического значения (VUS) использовались следующие алгоритмы компьютерного прогнозирования белков: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) и Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Варианты, классифицированные как классы 1 и 2, считались диким типом.
Секвенирование по Сэнгеру подтвердило наличие каждого патогенного варианта. Вкратце, для каждого обнаруженного варианта была разработана пара специфических праймеров с использованием референсных последовательностей генов BRCA1 и BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 и NG_012772.3, NM_000059.3 соответственно). Затем была проведена таргетная ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру.
Пациенты, у которых тест на ген BRCA1/2 дал отрицательный результат, были обследованы методом мультиплексной лигационно-зависимой амплификации зондов (MLPA) в соответствии с инструкциями производителя для оценки наличия крупных геномных перестроек (LGR). Вкратце, образцы ДНК денатурируются, и используется до 60 зондов, специфичных для генов BRCA1 и BRCA2, каждый из которых детектирует специфическую последовательность ДНК длиной приблизительно 60 нуклеотидов. Продукты амплификации зондов, состоящие из уникального набора ПЦР-ампликонов, затем анализируются методом капиллярного электрофореза и с помощью программного обеспечения Cofalyser.Net в сочетании с соответствующими таблицами Cofalyser для каждой партии образцов (www.mrcholland.com).
Выбранные клинико-патологические переменные (гистологическая степень и индекс пролиферации Ki-67%) были связаны с наличием полицитемии BRCA1/2, что было рассчитано с помощью программного обеспечения Prism версии 8.4 с использованием точного теста Фишера, при этом значение p < 0,05 считалось статистически значимым.
В период с января 2017 года по март 2021 года 455 пациентов были обследованы на наличие герминальных мутаций генов BRCA1/2. Тестирование на мутации проводилось в Центре экспериментальной онкологии и гематологии больницы Поликлинико. Согласно сицилийским рекомендациям (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, № 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), в общей сложности 389 пациентов были обследованы на предмет рака молочной железы, 37 — на рак яичников, 16 — на рак поджелудочной железы, 8 — на рак предстательной железы и 5 — на меланому. Распределение пациентов по типу рака и результатам анализа показано на рисунке 1.
На рисунке 1 представлена ​​блок-схема, иллюстрирующая общий ход исследования. Пациенты с опухолями молочной железы, меланомой, поджелудочной железы, предстательной железы или яичников были обследованы на наличие мутаций в генах BRCA1 и BRCA2.
Сокращения: PVs — патогенный вариант; VUS — вариант неопределенного значения; WT — последовательность BRCA1/2 дикого типа.
В своих исследованиях мы целенаправленно изучали когорты пациентов с раком молочной железы. Средний возраст пациенток составлял 49 лет (диапазон 23-89 лет), и большинство из них были женщинами (n=376, или 97%).
Из этих субъектов у 64 (17%) были мутации BRCA1/2, и все они были женщинами. У 35 (9%) был ПВ, а у 29 (7,5%) — ВУС. Семнадцать (48,6%) из 35 патогенных вариантов встречались в BRCA1 и 18 (51,4%) в BRCA2, в то время как 5 ВУС встречались в BRCA1 (17,2%) и 24 (82,8%) в BRCA2 (рисунки 1 и 2). LGR не был обнаружен в анализе MLPA.
Рисунок 2. Анализ мутаций BRCA1 и BRCA2 у 389 пациенток с раком молочной железы. (A) Распределение патогенных вариантов (PV) (красный), вариантов неопределенного значения (VUS) (оранжевый) и дикого типа (WT) (синий) у 389 пациенток с раком молочной железы; (B) У 389 пациенток с раком молочной железы были обнаружены патогенные варианты BRCA1/2 (PV). Среди них 17 (48,6%) были носителями PV BRCA1 (темно-красный) и 18 (51,4%) — носителями BRCA2 (светло-красный); (C) 29 (7,5%) из 389 пациенток имели VUS, 5 (17,2%) — гены BRCA1 (темно-оранжевый) и 24 (82,8%) — гены BRCA2 (светло-оранжевый).
Сокращения: PVs — патогенный вариант; VUS — вариант неопределенного значения; WT — последовательность BRCA1/2 дикого типа.
Далее мы исследовали распространенность молекулярных подтипов рака молочной железы у пациентов с полицитемией вера (BRCA1/2). Распределение включало 2 (5,7%) пациента с люминальным А, 15 (42,9%) — с люминальным В, 3 (8,6%) — с люминальным В-HER2+, 2 (5,7%) — с HER2+ и 13 (37,1%) — с трижды негативным раком молочной железы (ТНБК). Среди пациентов с мутацией BRCA1 у 5 (29,4%) был люминальный В-РМЖ, у 2 (11,8%) — с HER2+, и у 10 (58,8%) — с ТНБК. Опухоли без мутаций BRCA1 были либо люминального А, либо люминального В-HER2+ (Рисунок 3). В подгруппе с мутацией BRCA2 у 10 (55,6%) опухолей был люминальный В, у 3 (16,7%) — люминальный В-HER2+, у 3 (16,7%) — ТНБК и у 2 (16,7%) — ТНБК. (11,1%) относились к люминальному типу А (рисунок 3). В этой группе не было HER2+ опухолей. Таким образом, мутации BRCA1 распространены среди пациентов с трижды негативным раком молочной железы, тогда как изменения BRCA2 преобладают у лиц с люминальным типом В.
Рисунок 3. Распространенность подтипов рака молочной железы у пациентов с патогенными вариантами генов BRCA1 и BRCA2. Гистограммы, показывающие распределение патогенных вариантов BRCA1 (темно-красный) и BRCA2 (светло-красный) среди молекулярных подтипов рака молочной железы. Числа в каждом прямоугольнике представляют процент пациентов с патогенными вариантами генов BRCA1 и BRCA2 для каждого подтипа рака молочной железы.
Сокращения: PVs — патогенный вариант; HER2+ — положительный по рецептору эпидермального фактора роста человека 2; TNBC — тройно-негативный рак молочной железы.
Впоследствии мы оценили тип и локализацию генов патогенных вариантов BRCA1 и BRCA2. В патогенном варианте BRCA1 мы обнаружили 7 однонуклеотидных вариантов (SNV), 6 делеций, 3 дупликации и 1 вставку. Только одна мутация (c.5522delG) представляет собой новое открытие. Наиболее распространенным патогенным вариантом BRCA1, обнаруженным у обоих субъектов, был c.5035_5039delCTAAT. Это изменение включает делецию пяти нуклеотидов (CTAAT) в 15-м экзоне BRCA1, что приводит к замене аминокислоты лейцина на тирозин в кодоне 1679 и, вследствие сдвига рамки трансляции с предсказанным альтернативным стоп-кодоном, приводит к преждевременной укорочению белка. Все остальные изменения обнаружены только в одном случае. Примечательно, что один из описанных патогенных вариантов располагался в консенсусной области сайта сплайсинга (c.4357+1G>T) (таблица 1).
Что касается патогенного варианта BRCA2, мы обнаружили 6 делеций, 6 однонуклеотидных вариантов и 2 дупликации. Ни одно из обнаруженных изменений не является новым. В нашей популяции были повторно выявлены три мутации: c.428dup и c.8487+1G>A, обнаруженные у 3 субъектов, а также c.5851_5854delAGTT, выявленная в двух случаях. Изменение c.428dup затрагивает повтор C в экзоне 5 гена BRCA2, который, как предполагается, кодирует укороченный, нефункциональный белок. Мутация c.8487+1G>A происходит в интронной области интрона 19 гена BRCA2 (± 1,2) и влияет на консенсусную последовательность сплайсинга, что приводит к изменению сплайсинга и, как следствие, к образованию аномального или отсутствующего белка. Патогенный вариант c.5851_5854delAGTT обусловлен делецией 4 нуклеотидов от нуклеотидных позиций 5851 до Мутация 5854 в кодирующем экзоне 10 гена BRCA2 приводит к сдвигу рамки считывания с предсказанным альтернативным стоп-кодоном (p.S1951WfsTer). Примечательно, что, как сообщалось ранее, обе мутации c.631G>A и c.7008-2A>T были обнаружены у одного и того же пациента.34 Первая мутация включает замену аденозина (A) в экзоне 7 гена BRCA2 на нуклеотид, содержащий гуанин (G), что приводит к замене валина на изолейцин в кодоне 211. Аминокислота изолейцин – это аминокислота с очень похожими свойствами. Это изменение влияет на нормальный сплайсинг мРНК. Второй вариант расположен в интронной области и приводит к двойной замене A на тимин (T) перед экзоном 13 гена, кодирующего BRCA2. Изменение c.7008-2A>T может генерировать множественные транскрипты различной длины. Кроме того, в группе В мутациях гена BRCA2 4 из 18 изменений (22,2%) были интронными.
Затем мы картировали вредные мутации BRCA1/2 в функциональных доменах и областях связывания белков (рис. 4). В гене BRCA1 50% патогенных вариантов (ПВ) располагались в кластерной области рака молочной железы (BCCR), а 22% мутаций — в кластерной области рака яичников (OCCR) (рис. 4A). В ПВ гена BRCA2 35,7% вариантов располагались в области BCCR, а 42,8% мутаций — в области OCCR (рис. 4B). Далее мы оценили локализацию ПВ в доменах белков BRCA1 и BRCA2. Для белка BRCA1 мы обнаружили три ПВ в петлевом и спиральном доменах и две мутации в домене BRCT (рис. 4A). Для белка BRCA2 4 ПВ картировались в домене повторов BRC, а 3 интронных и 3 экзонных изменения были обнаружены в Домен, связывающий олиго/олигосахариды (OB) и домен башни (T) (рис. 4B).
Рисунок 4. Схематическое представление белков BRCA1 и BRCA2 и локализация патогенных вариантов. На этом рисунке показано распределение патогенных вариантов BRCA1 (A) и BRCA2 (B) у пациенток с раком молочной железы. Экзонные мутации показаны синим цветом, а интронные варианты — оранжевым. Высота столбика соответствует количеству случаев. Представлены белки BRCA1 и BRCA2 и их функциональные домены. (A) Белок BRCA1 содержит петлевой домен (RING) и последовательность ядерной локализации (NLS), домен спиральной структуры, кластерный домен SQ/TQ (SCD) и С-концевой домен BRCA1 (BRCT). (B) Белок BRCA2 содержит восемь BRC-повторов, домен связывания ДНК со спиральным доменом (Helical), три олигонуклеотид/олигосахарид-связывающих (OB) складки, башенный домен (T) и NLS на стороне C. Области называются кластерными областями рака молочной железы. Внизу показаны (BCCR) и кластерный регион рака яичников (OCCR).*Обозначает мутации, определяющие стоп-кодоны.
Затем мы исследовали клинико-патологические особенности рака молочной железы, которые могли бы коррелировать с наличием мутаций BRCA1/2. Полные клинические данные были доступны для 181 пациента с отрицательным результатом на мутации BRCA1/2 (неносителей) и всех носителей (n = 35). Была обнаружена корреляция между скоростью пролиферации опухоли и степенью злокачественности.
Мы рассчитали распределение Ki-67 на основе медианы нашей когорты (25%, диапазон <10-90%). Субъекты с Ki-67 < 25% были определены как «низкий Ki-67», в то время как лица со значениями ≥ 25% считались «высоким Ki-67». Были обнаружены значительные различия в Ki-67 (p<0,01) между неносителями и носителями BRCA1 PV (рис. 5A).
Рисунок 5. Корреляция Ki-67 с распределением степеней злокачественности у женщин с раком молочной железы с наличием и отсутствием мутаций BRCA1 и BRCA2. (A) Диаграмма размаха, показывающая медианные значения Ki-67 у 181 пациентки с раком молочной железы без мутаций по сравнению с пациентками с мутациями BRCA1 (18) или BRCA2 (17). Значения P менее 0,5 считались статистически значимыми. (B) Гистограмма, представляющая распределение пациенток с раком молочной железы по группам гистологической степени злокачественности (G2 и G3) в зависимости от статуса мутаций BRCA1 и BRCA2 (субъекты дикого типа, носители мутаций BRCA1 и BRCA2).
Аналогичным образом мы исследовали, коррелирует ли степень злокачественности опухоли с наличием мутаций BRCA1/2. Поскольку рак молочной железы стадии G1 отсутствовал в нашей популяции, мы разделили пациентов на две группы (G2 или G3). В соответствии с результатами Ki-67, анализ выявил статистически значимую корреляцию между степенью злокачественности опухоли и мутацией BRCA1, при этом доля опухолей стадии G3 была выше у носителей мутации BRCA1 по сравнению с неносителями (p<0,005) (Рисунок 5B).
Достижения в технологии секвенирования ДНК позволили добиться беспрецедентных успехов в генетическом тестировании генов BRCA1/2, что имеет решающее значение для пациентов с семейным анамнезом рака. На сегодняшний день выявлено и классифицировано около 20 000 вариантов генов BRCA1/2 в соответствии с классификацией Американского общества медицинской генетики 35 и системой ENIGMA.35,36 Хорошо известно, что спектр мутаций генов BRCA1/2 значительно варьируется в зависимости от географического региона.37 В Италии частота встречаемости вариантов генов BRCA1/2 составляла от 8% до 37%, демонстрируя значительную внутристрановую вариабельность.38,39 Сицилия с населением почти 5 миллионов человек является пятым по величине регионом Италии по численности населения. Хотя существуют данные о распространении генов BRCA1/2 в западной Сицилии, обширных данных о восточной части острова нет.
Наше исследование является одним из первых отчетов о распространенности полицитемии BRCA1/2 у пациенток с раком молочной железы в восточной Сицилии.²⁸ Мы сосредоточили наш анализ на раке молочной железы, поскольку это наиболее распространенное заболевание в нашей когорте.
При обследовании 389 пациентов с раком молочной железы у 9% были обнаружены варианты мутаций BRCA1/2, равномерно распределенные между BRCA1 и BRCA2. Эти результаты согласуются с ранее опубликованными данными по итальянской популяции.28 Интересно, что 3% (13/389) нашей когорты составляли мужчины. Этот показатель выше, чем ожидалось для рака молочной железы у мужчин (1% от всех случаев рака молочной железы),40 что отражает наш выбор популяций на основе риска мутаций BRCA1/2. Однако ни у одного из этих мужчин не развился вариант мутации BRCA1/2, поэтому они были кандидатами на дальнейший молекулярный анализ для исключения наличия менее распространенных мутаций, таких как PALB2, RAD51C и D, среди прочих. Варианты неопределенного значения были обнаружены у 7% субъектов, у которых был выявлен вариант неопределенного значения BRCA2. Даже этот результат согласуется с ранее полученными данными.28,41,42
При анализе распределения молекулярных подтипов рака молочной железы у женщин с мутациями BRCA1/2 мы подтвердили известные ассоциации между трижды негативным раком молочной железы (ТНБК) и полиморфизмом BRCA1 (58,8%) и между люминальным В-РМЖ и полиморфизмом BRCA2 (55,6%).16,43 Наличие люминальных А- и HER2+ опухолей у носительниц полиморфизмов BRCA1 и BRCA2 согласуется с имеющимися литературными данными.16,43
Затем мы сосредоточимся на типе и локализации полиморфизма BRCA1/2. В нашей когорте наиболее распространенным полиморфизмом BRCA1 был c.5035_5039delCTAAT. Хотя Incorvaia et al. В своей сицилийской когорте авторы не описали этот вариант, другие авторы сообщали о нем как о герминальном варианте мутации BRCA1.34 В нашей когорте было обнаружено несколько вариантов мутации BRCA1, например, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA и c.5266dupC, которые наблюдались на Сицилии.28 Из них две мутации-основателя BRCA1 (c.181T>G и c.5266dupC) часто встречаются у евреев-ашкенази из Восточной и Центральной Европы (Польша, Чехия), Словении, Австрии, Венгрии, Беларуси и Германии),44,45 а в Соединенных Штатах и ​​Аргентине недавно был определен как «рекуррентный герминальный вариант» у итальянских пациентов с раком молочной железы и раком яичников. Вариант 34c.514del ранее был выявлен у 8 пациентов с раком молочной железы из северной Сицилии, в Палермо и Мессине. Интересно, что даже Инкорвайя и др. Реббек и др. обнаружили вариант c.3253dupA в некоторых семьях в Катании.28 Наиболее распространенными вариантами патогенов BRCA2 являются c.428dup, c.5851_5854delAGTT и интронный вариант c.8487+1G>A, которые были более подробно описаны 28 у пациента в Палермо с вариантом c.428dup, c.5851_5854delAGTT. Вариант c.5851_5854delAGTT наблюдался в домохозяйствах на северо-западе Сицилии, главным образом в регионах Трапани и Палермо, тогда как вариант c.5851_5854delAGTT наблюдался в домохозяйствах на северо-западе Сицилии. Вариант 8487+1G>A был более распространен среди лиц из Мессины, Палермо и Кальтаниссетты.28 Реббек и др. Ранее в Колумбии была описана мутация c.5851_5854delAGTT.37 Другая мутация BRCA2, c.631+1G>A, была обнаружена у пациентов с раком молочной железы и раком яичников из Сицилии (Агридженто, Сиракуза и Рагуза).28 Примечательно, что мы наблюдали сосуществование двух вариантов BRCA2 (BRCA2 c.631G>A и c.7008-2A>T) у одного и того же пациента, которые, как мы предположили, были разделены в цис-режиме, как и сообщалось ранее.34,46 Эти двойные мутации BRCA2 действительно часто наблюдаются в итальянском регионе и, как было установлено, приводят к появлению преждевременных стоп-кодонов, влияя на сплайсинг матричной РНК и вызывая сбой в работе белка BRCA2.47,48
Мы также картировали варианты мутаций BRCA1 и BRCA2 в предполагаемых областях OCCR и BCCR белковых доменов и генов. Эти области были описаны Реббеком и др. как зоны риска развития рака яичников и молочной железы соответственно.49 Однако данные о связи между локализацией герминальных вариантов и риском рака молочной железы или яичников остаются противоречивыми.28,50-52 В нашей популяции варианты мутаций BRCA1 преимущественно располагались в области BCCR, тогда как варианты мутаций BRCA2 преимущественно располагались в области OCCR. Тем не менее, нам не удалось обнаружить какой-либо связи между предполагаемыми областями OCCR и BCCR и характеристиками рака молочной железы. Это может быть связано с ограниченным числом пациентов с мутациями BRCA1/2. С точки зрения белковых доменов, варианты мутаций BRCA1 распределены по всему белку, а изменения BRCA2 преимущественно обнаруживаются в домене повторов BRC.
Наконец, мы сопоставили клинико-патологические характеристики рака молочной железы с наличием мутаций BRCA1/2. Из-за ограниченного числа включенных пациентов мы обнаружили значимую корреляцию только между Ki-67 и степенью злокачественности опухоли. Хотя оценка и интерпретация Ki-67 остаются несколько спорными, несомненно, что высокие темпы пролиферации связаны с повышенным риском рецидива заболевания и снижением выживаемости. На сегодняшний день пороговое значение для различения «высокого» и «низкого» Ki-67 составляет 20%. Однако этот порог не применим к нашей популяции пациентов с мутациями BRCA1/2, у которых медианное значение Ki-67 составляет 25%. Эта тенденция к высоким показателям Ki-67 может быть объяснена распространенностью в наших когортах люминального B и трижды негативного рака молочной железы, среди которых было мало опухолей люминального A типа. Тем не менее, некоторые данные свидетельствуют о том, что более высокое пороговое значение Ki-67 (25–30%) может лучше стратифицировать пациентов в соответствии с их прогнозом.53,54 Из результатов нашего анализа значимой корреляции не выявлено. Удивительно. Наблюдается связь между высоким уровнем Ki-67 и степенью злокачественности, а также наличием BRCA1 PV. Фактически, опухоли, связанные с BRCA1, типичны для TNBC и демонстрируют более агрессивные характеристики.16,17
В заключение, данное исследование представляет собой отчет о мутационном статусе генов BRCA1/2 в когорте пациентов с раком молочной железы из восточной Сицилии. В целом, наши результаты согласуются с ранее полученными данными как в отношении распространенности мутаций, так и клинико-патологических особенностей рака молочной железы. Необходимы дальнейшие исследования на более крупных популяциях пациентов с раком молочной железы с мутациями BRCA1/2, например, с использованием расширенного мультигеномного мутационного анализа, для оценки наличия патогенных вариантов, которые отличаются и встречаются реже, чем мутации BRCA1/2. Это позволит выявлять и надлежащим образом лечить растущее число пациентов с повышенным риском развития рака из-за генетических мутаций.
Мы подтвердили, что пациенты подписали информированное согласие на анонимную передачу образцов своих опухолей для исследовательских целей. Все пациенты подписали письменное информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. В соответствии с политикой AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, данное исследование было освобождено от этической экспертизы, поскольку анализ BRCA1/2 проводился в соответствии с клинической практикой, и все пациенты дали письменное информированное согласие. Пациенты также дали согласие на использование своих данных в исследовательских целях.
Мы благодарим профессора Паоло Виньери за помощь в лечении пациенток с раком молочной железы по просьбе этического комитета.
Федерика Марторана сообщает о получении гонораров от Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis и Pfizer. Остальные авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов в данной работе.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates the incidence and mortality of 36 cancers in 185 countries around the world. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660