W Twojej przeglądarce wyłączony jest obecnie JavaScript. Niektóre funkcje tej witryny nie będą działać, gdy JavaScript będzie wyłączony.
Zarejestruj się, podając szczegółowe dane i konkretny lek, który Cię interesuje, a my dopasujemy podane przez Ciebie informacje do artykułów w naszej obszernej bazie danych i niezwłocznie wyślemy Ci kopię w formacie PDF na adres e-mail.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Wydział Medycyny Klinicznej i Eksperymentalnej, Uniwersytet im. Catania, Catania, 95123, Włochy;2 Centrum Eksperymentalnej Onkologii i Hematologii, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Włochy; 3 Onkologia Medyczna, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco”, Katania, 95123, Włochy; 4 Genetyka medyczna, ARNAS Garibaldi, Katania, 95123, Włochy; 5. Genetyka medyczna, ASP, Syrakuzy, 96100, Włochy; 6. Wydział Nauk Biomedycznych i Biotechnologicznych, Uniwersytet w Katanii, Genetyka medyczna, Katania, Włochy, 95123; 7. Instytut Badawczy Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Włochy Komunikacja: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, e-mail [email protected]; [email protected] Cel: Mutacje linii zarodkowej w genach BRCA1 i BRCA2 oraz ustalony rak piersi (BC), jajnika (OC) i inne związane z ryzykiem zachorowania na raka w ciągu całego życia. Badanie genu BRCA jest kluczowe dla oceny indywidualnego ryzyka, a także dla znalezienia metod zapobiegania u zdrowych nosicieli i dostosowania leczenia u pacjentów onkologicznych. Częstość występowania zmian w genach BRCA1 i BRCA2 znacznie różni się w zależności od regionu geograficznego i chociaż istnieją dane na temat patogennych wariantów BRCA w rodzinach sycylijskich, brakuje badań ukierunkowanych konkretnie na populacje we wschodniej Sycylii. Celem naszego badania było zbadanie częstości występowania i rozmieszczenia patogennych zmian linii zarodkowej w genach BRCA w kohorcie pacjentów z BC ze wschodniej Sycylii oraz ocena ich związku ze specyficznymi cechami BC przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Obecność zmian korelowała ze stopniem zaawansowania guza i wskaźnikiem proliferacji. WYNIKI: Ogółem 35 pacjentów (9%) miało patogenny wariant BRCA, 17 (49%) BRCA1 i 18 (51%) w BRCA2. Zmiany w genie BRCA1 są powszechne u pacjentek z rakiem piersi potrójnie ujemnym, podczas gdy mutacje w genie BRCA2 są powszechniejsze u pacjentek z rakiem piersi luminalnym. W porównaniu z osobami niebędącymi nosicielami, osoby z wariantami BRCA1 miały znacznie wyższy stopień zaawansowania nowotworu i wskaźnik proliferacji. Wnioski: Nasze odkrycia dają przegląd statusu mutacji genu BRCA u pacjentek z rakiem piersi ze wschodniej Sycylii i potwierdzają rolę analizy NGS w identyfikacji pacjentek z dziedzicznym rakiem piersi. Ogólnie rzecz biorąc, dane te są zgodne z wcześniejszymi dowodami wspierającymi badania przesiewowe w kierunku BRCA w celu właściwej profilaktyki i leczenia raka u nosicieli mutacji.
Rak piersi (BC) jest najczęściej występującym nowotworem złośliwym na świecie i najbardziej śmiertelnym nowotworem u kobiet.1 Cechy biologiczne, które determinują rokowanie i zachowanie kliniczne BC, były szeroko badane i częściowo wyjaśnione na przestrzeni czasu. W rzeczywistości, kilka markerów zastępczych jest obecnie stosowanych do klasyfikacji BC na różne podtypy molekularne. Są to receptor estrogenowy (ER) i/lub progesteronowy (PgR), amplifikacja receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2), indeks proliferacji Ki-67 i stopień guza (G).2 Połączenie tych zmiennych zidentyfikowało następujące kategorie BC: 1) Guzy luminalne, wykazujące ekspresję ER i/lub PgR, stanowiły 75% BC. Guzy te podzielono dalej na Luminal A, gdy Ki-67 było poniżej 20% i HER2-ujemne, i Luminal B, gdy Ki-67 było równe lub wyższe niż 20% i w obecności amplifikacji HER2, niezależnie od indeksu proliferacji; 2) Guzy HER2+, które są ER i PgR ujemne, ale wykazują amplifikację HER2. Grupa ta stanowi 10% wszystkich nowotworów piersi; 3) Potrójnie ujemny rak piersi (TNBC), który nie wykazuje ekspresji ER i PgR oraz amplifikacji HER2, stanowi około 15% przypadków raka piersi.2-4
Wśród tych podtypów raka piersi stopień zaawansowania nowotworu i wskaźnik proliferacji stanowią przekrojowe biomarkery, które są bezpośrednio i niezależnie związane z agresywnością nowotworu i rokowaniem.5,6
Oprócz wyżej wymienionych cech biologicznych, rola dziedzicznych zmian genetycznych prowadzących do rozwoju raka piersi stała się coraz ważniejsza w ciągu ostatnich kilku lat.7 Około 1 na 10 guzów piersi jest dziedziczone z powodu zmian linii zarodkowej w określonych genach.8 Dwa duże badania epidemiologiczne z udziałem ponad 180 000 kobiet niedawno zidentyfikowały grupę ośmiu genów (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C i RAD51D) odpowiedzialnych głównie za dziedziczny BC. Wśród tych genów BRCA1 i BRCA2 (zwane dalej BRCA1/2) wykazały najsilniejszą korelację z rozwojem guzów piersi.9-12 W rzeczywistości mutacje linii zarodkowej BRCA1/2 znacząco zwiększają ryzyko zachorowania na raka piersi w ciągu całego życia, a także inne nowotwory złośliwe, w tym jajnika, prostaty, trzustki, jelita grubego i czerniaka. Od 13. roku życia do W wieku 80 lat skumulowana częstość występowania raka piersi wynosi 72% u kobiet z patogennym wariantem BRCA1 (PV) i 69% u kobiet z wariantem BRCA2 PV.14
Co ciekawe, niedawna publikacja sugeruje, że ryzyko zachorowania na raka piersi zależy od rodzaju PV. W rzeczywistości, w porównaniu z patogennymi wariantami skracającymi, wyraźne warianty zmiany sensu, zwłaszcza w genie BRCA1, wiążą się ze zmniejszonym ryzykiem zachorowania na raka piersi, zwłaszcza u starszych kobiet.15
Obecność mutacji BRCA1 lub BRCA2 PV wiązała się z różnymi cechami biologicznymi i kliniczno-patologicznymi.16,17 Rak piersi związany z BRCA1 ma tendencję do agresywnego przebiegu klinicznego, słabo zróżnicowanego i wysoce proliferacyjnego. Te guzy są zwykle potrójnie ujemne i pojawiają się wcześnie. Guzy występujące u pacjentów z mutacją BRCA2 zwykle wykazują umiarkowane do dobrze zróżnicowanych stopni i zmienne wskaźniki proliferacji. Guzy te występują częściej w świetle B i zwykle występują u osób starszych.16-18 Co godne uwagi, mutacje w BRCA1 i BRCA2 zwiększają wrażliwość na określone metody leczenia, w tym sole platyny i leki ukierunkowane, takie jak inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARPi).19,20
W ciągu ostatnich kilku lat wdrożenie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w praktyce klinicznej umożliwiło coraz większej liczbie pacjentów z rakiem piersi poddanie się badaniom molekularnym w kierunku zespołów podatności na raka, w tym BRCA1/2.21 Jednocześnie definicje oparte na precyzyjnych kryteriach dotyczących historii rodzinnej, cech demograficznych i kliniczno-patologicznych pozwalają lepiej identyfikować osoby godne badania BRCA1/2.22,23 W tym kontekście gromadzą się dowody na temat badań przesiewowych w kierunku BRCA1/2 w określonych populacjach, podkreślając różnice między regionami geograficznymi.24–27 Chociaż istnieją raporty dotyczące kohorty raka piersi w zachodniej Sycylii, dostępnych jest mniej danych na temat badań przesiewowych w kierunku BRCA1/2 w populacji wschodniej Sycylii.28,29
W niniejszym artykule opisujemy wyniki badań przesiewowych w kierunku mutacji genu BRCA1/2 u pacjentek z rakiem piersi pochodzących ze wschodniej Sycylii, a także korelujemy obecność mutacji BRCA1 lub BRCA2 z głównymi cechami kliniczno-patologicznymi tych nowotworów.
Przeprowadzono badanie retrospektywne w „Centrum Onkologii Eksperymentalnej i Hematologii” w Szpitalu Policlinico Rodolico – San Marco w Katanii. Od stycznia 2017 r. do marca 2021 r. w sumie 455 pacjentów z rakiem piersi i jajników, czerniakiem, rakiem trzustki lub prostaty zostało skierowanych do naszego laboratorium diagnostyki molekularnej w celu wykonania testów genetycznych BRCA/2. Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed analizą molekularną.
Charakterystykę histologiczną i biologiczną (estrogenów, PgR, status HER2, Ki-67 i stopień) raka piersi oceniano na podstawie biopsji rdzeniowej lub próbek chirurgicznych, biorąc pod uwagę jedynie agresywne składniki guza. Na podstawie tych cech raka piersi klasyfikowano w następujący sposób: luminalny A (ER+ i/lub PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminalny B (ER+ i/lub PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalny B-HER2+ (ER i/lub PgR+, HER2+), HER2+ (ER i PgR-, HER2+) lub potrójnie ujemny (ER i PgR-, HER2-).
Przed oceną statusu mutacji BRCA1 i BRCA2, wielodyscyplinarny zespół składający się z onkologa, genetyka i psychologa przeprowadził konsultację genetyki guza u każdego pacjenta w celu ustalenia obecności BRCA1 i/lub BRCA1. lub osób z wysokim ryzykiem PV w genie BRCA2. Dobór pacjentów przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Włoskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (AIOM) i lokalnymi zaleceniami sycylijskimi.30,31 Kryteria te obejmują: (i) historię rodzinną znanych wariantów patogennych w genach podatności (np. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) mężczyzn z rakiem piersi; (iii) osoby z rakiem piersi i rakiem jajnika; (iv) kobiety z rakiem piersi <36 lat, TNBC <60 lat lub obustronnym rakiem piersi <50 lat; (v) osobistą historię medyczną raka piersi <50 lat i co najmniej jednego krewnego pierwszego stopnia: (a) rak piersi <50 lat; (b) nieśluzowy i niegraniczny OC w każdym wieku; (c) obustronny BC; (d) męski BC; (e) rak trzustki; (f) rak prostaty; (vi) dwa lub więcej Wywiad osobisty BC > 50 lat i wywiad rodzinny BC, OC lub raka trzustki u krewnych, którzy są krewnymi pierwszego stopnia względem siebie (w tym krewnych, z którymi jest krewnymi pierwszego stopnia); (vii) Wywiad osobisty OC i co najmniej jeden krewny pierwszego stopnia: (a) BC <50 lat; (b) NOC; (c) obustronny BC; (d) męski BC; (vii) kobieta z surowiczym OC wysokiego stopnia.
Od każdego pacjenta pobrano 20 ml próbki krwi obwodowej i umieszczono ją w probówkach z EDTA (BD Biosciences). Genomowe DNA wyizolowano z 0,7 ml próbek krwi pełnej przy użyciu zestawu do izolacji QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Włochy) zgodnie z instrukcją producenta. Następnie przepuszczono przez fluorometr Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Przeprowadzono oznaczenie ilościowe. Wzbogacanie docelowe i przygotowywanie biblioteki są wykonywane przez Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, gotowe do załadowania do zestawu Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 w celu zautomatyzowanego przygotowania biblioteki zgodnie z instrukcją producenta. Zestaw składa się z dwóch pul starterów multipleksowych PCR, których można użyć do badania wszystkich genów BRCA1 (NM_007300.3) i BRCA2 (NM_000059.3). Krótko mówiąc, 15 µl każdego rozcieńczonego DNA próbki (10 ng) dodano do kodowanych kreskowo płytek w celu przygotowania biblioteki, a wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne załadowano do urządzenia Ion Chef™. Następnie zautomatyzowane przygotowanie biblioteki i łączenie kodowanych kreskowo bibliotek próbek przeprowadzono na urządzeniu Ion Chef™. Następnie liczbę przygotowanych bibliotek oceniono za pomocą fluorometru Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zgodnie z instrukcją producenta. instrukcje.Na koniec biblioteki są łączone w proporcjach ekwimolarnych w próbówkach biblioteki Ion Chef™ (probówki z kodem kreskowym) i ładowane do urządzenia Ion Chef™.Sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu urządzenia Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) przy użyciu układu Ion 510 (Thermo Fisher Scientific).Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Amplicon Suite (SmartSeq srl) i Ion Reporter Software.
Nomenklatura wszystkich wariantów była zgodna z aktualnymi wytycznymi Human Genome Variation Consortium, dostępnymi online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Znaczenie kliniczne wariantów BRCA1/2 zdefiniowano przy użyciu klasyfikacji Międzynarodowego Konsorcjum ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) i konsultacji z różnymi bazami danych, takimi jak ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD i UMD. Klasyfikacja obejmuje pięć odrębnych kategorii ryzyka: łagodny (kategoria I), prawdopodobnie łagodny (kategoria II), wariant o niepewnym znaczeniu (VUS, kategoria III), prawdopodobnie patogenny (kategoria IV) i patogenny (kategoria V). VarSome przeanalizował również wpływ mutacji na strukturę i funkcję białka, narzędzie informacyjne z dostępem do 30 baz danych.32
Aby przypisać potencjalne znaczenie kliniczne każdemu VUS, zastosowano następujące algorytmy obliczeniowe do przewidywania białek: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) i Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Warianty sklasyfikowane jako klasa 1 i 2 uznano za typ dziki.
Sekwencjonowanie metodą Sangera potwierdziło obecność każdego wariantu patogennego. Krótko mówiąc, dla każdego wykrytego wariantu zaprojektowano parę specyficznych starterów, korzystając z sekwencji referencyjnych genów BRCA1 i BRCA2 (odpowiednio NG_005905.2, NM_007294.3 i NG_012772.3, NM_000059.3). Dlatego też przeprowadzono ukierunkowaną reakcję PCR, a następnie sekwencjonowanie metodą Sangera.
U pacjentów, u których wynik testu na obecność genu BRCA1/2 był ujemny, wykonano badanie metodą multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji (MLPA) zgodnie z instrukcją producenta, aby ocenić obecność dużych przegrupowań genomowych (LGR). W skrócie, próbki DNA poddano denaturacji i wykorzystano do 60 sond specyficznych dla genów BRCA1 i BRCA2, z których każda wykrywała określoną sekwencję DNA o długości około 60 nukleotydów. Produkty amplifikacji sondy, składające się z unikalnego zestawu amplikonów PCR, przeanalizowano następnie metodą elektroforezy kapilarnej i za pomocą oprogramowania Cofalyser.Net w połączeniu z odpowiednimi tabelami Cofalyser specyficznymi dla danej partii (www.mrcholland.com).
Wybrane zmienne kliniczno-patologiczne (stopień histologiczny i wskaźnik proliferacji Ki-67%) były związane z obecnością BRCA1/2 PV, obliczone przy użyciu oprogramowania Prism v. 8.4, przy użyciu dokładnego testu Fishera, przyjmując, że wartość p <0,05 jest istotna.
W okresie od stycznia 2017 r. do marca 2021 r. przebadano 455 pacjentów pod kątem mutacji linii zarodkowej BRCA1/2. Badania mutacji przeprowadzono w Centrum Onkologii Eksperymentalnej i Hematologii Szpitala Policlinico. Zgodnie z wytycznymi sycylijskimi (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), w Rodolico de Catania – San Marco” ogółem przebadano 389 pacjentów. Wystąpił rak piersi, 37 rak jajnika, 16 rak trzustki, 8 rak prostaty i 5 czerniak. Podział pacjentów według rodzaju nowotworu i wyników analizy pokazano na rysunku 1.
Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy obrazujący przegląd badania. U pacjentek z guzami piersi, czerniaka, trzustki, prostaty lub jajników wykonano badania w celu wykrycia mutacji w genach BRCA1 i BRCA2.
Skróty: PVs – wariant patogenny; VUS – wariant o niepewnym znaczeniu; WT – sekwencja BRCA1/2 typu dzikiego.
W naszych badaniach selektywnie skupiliśmy się na grupach pacjentów z rakiem piersi. Mediana wieku pacjentek wyniosła 49 lat (zakres 23–89), a przeważały wśród nich kobiety (n=376, czyli 97%).
Spośród tych osób 64 (17%) miało mutacje BRCA1/2 i wszystkie były płci żeńskiej. U trzydziestu pięciu (9%) występowała PV, a u 29 (7,5%) VUS. Siedemnaście (48,6%) z 35 wariantów patogennych wystąpiło w genie BRCA1, a 18 (51,4%) w genie BRCA2, podczas gdy 5 wariantów VUS wystąpiło w genie BRCA1 (17,2%), a 24 (82,8%) w genie BRCA2 (rysunki 1 i 2). LGR nie był obecny w analizie MLPA.
Rycina 2. Analiza mutacji BRCA1 i BRCA2 u 389 pacjentek z rakiem piersi. (A) Dystrybucja wariantów patogennych (PV) (czerwony), wariantów o niepewnym znaczeniu (VUS) (pomarańczowy) i WT (niebieski) u 389 pacjentek z rakiem piersi; (B) 389 pacjentek z rakiem piersi Trzydzieści pięć (9%) miało warianty patogenne BRCA1/2 (PV). Spośród nich 17 (48,6%) było nosicielami BRCA1 PV (ciemnoczerwony), a 18 (51,4%) było nosicielami BRCA2 (jasnoczerwony); (C) 29 (7,5%) z 389 pacjentek było nosicielami VUS, 5 (17,2%) genów BRCA1 (ciemnopomarańczowy) i 24 (82,8%) genów BRCA2 (jasnopomarańczowy).
Skróty: PVs – wariant patogenny; VUS – wariant o niepewnym znaczeniu; WT – sekwencja BRCA1/2 typu dzikiego.
Następnie zbadaliśmy częstość występowania podtypów molekularnych raka piersi u pacjentów z mutacją genu BRCA1/2 PV. Dystrybucja obejmowała 2 (5,7%) luminalne A, 15 (42,9%) luminalne B, 3 (8,6%) luminalne B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ i 13 (37,1%) pacjentów z TNBC. Wśród pacjentów BRCA1-dodatnich 5 (29,4%) miało luminalne B BC, 2 (11,8%) miało chorobę HER2+, a 10 (58,8%) miało TNBC. Guzy bez mutacji BRCA1 były albo luminalne A, albo luminalne B-HER2+ (Rysunek 3). W podgrupie BRCA2-dodatniej 10 (55,6%) guzów było luminalnych B, 3 (16,7%) luminalnych B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC a 2 (11,1%) były typu luminalnego A (ryc. 3). W tej grupie nie stwierdzono guzów HER2+. Zatem mutacje BRCA1 są powszechne u pacjentów z TNBC, podczas gdy zmiany BRCA2 są dominujące u osób z typem luminalnym B.
Rycina 3. Częstość występowania podtypów raka piersi u pacjentek z patogennymi wariantami genów BRCA1 i BRCA2. Histogramy przedstawiające rozkład genów PV BRCA1 (ciemnoczerwony) i BRCA2 (jasnoczerwony) wśród podtypów molekularnych pacjentek z rakiem piersi. Liczby podane w każdym polu oznaczają odsetek pacjentek z genami PV BRCA1 i BRCA2 dla każdego podtypu raka piersi.
Skróty: PVs – wariant patogenny; HER2+ – dodatni receptor naskórkowego czynnika wzrostu 2; TNBC – potrójnie ujemny rak piersi.
Następnie oceniliśmy typ i lokalizację genu BRCA1 i BRCA2 PV. W BRCA1 PV zaobserwowaliśmy 7 wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), 6 delecji, 3 duplikacje i 1 insercję. Tylko jedna mutacja (c.5522delG) stanowi nowe odkrycie. Najczęściej wykrywanym BRCA1 PV u obu pacjentów był c.5035_5039delCTAAT. Ta zmiana obejmuje delecję pięciu nukleotydów (CTAAT) w eksonie 15 BRCA1, co skutkuje podstawieniem aminokwasu leucyny tyrozyną w kodonie 1679, a ze względu na przesunięcie ramki translacji z przewidywanym alternatywnym kodonem stop prowadzi do przedwczesnego skrócenia białka. Wszystkie inne zmiany wykryto tylko w jednym przypadku. Warto zauważyć, że jeden ze zgłoszonych PV znajdował się w regionie konsensusu miejsca splicingowego (c.4357+1G>T) (Tabela 1).
W odniesieniu do BRCA2 PV zaobserwowaliśmy 6 delecji, 6 SNV i 2 duplikacje. Żadna ze znalezionych zmian nie jest nowa. Trzy mutacje powtórzyły się w naszej populacji, c.428dup i c.8487+1G>A zaobserwowane u 3 osób, a następnie c.5851_5854delAGTT odzyskane w dwóch przypadkach. Zmiana c.428dup obejmuje powtórzenie C w eksonie 5 BRCA2, który prawdopodobnie koduje skrócone, niefunkcjonalne białko. Mutacja c.8487+1G>A występuje w regionie intronowym intronu 19 BRCA2 (± 1,2) i wpływa na sekwencję konsensusu splicingowego, powodując zmienione splicing, co skutkuje nieprawidłowym lub nieobecnym białkiem. Patogenna odmiana c.5851_5854delAGTT jest spowodowana 4-nukleotydową delecją z pozycji nukleotydowych 5851 do 5854 w kodującym eksonie 10 genu BRCA2 i skutkuje przesunięciem ramki translacji z przewidywanym alternatywnym kodonem stopu (p.S1951WfsTer). Co ciekawe, jak wcześniej donoszono, obie zmiany c.631G>A i c.7008-2A>T wykryto u tego samego pacjenta.34 Pierwsza mutacja obejmuje zastąpienie adenozyny (A) w eksonie 7 genu BRCA2 nukleotydem zawierającym guaninę (G), co skutkuje zmianą waliny na izoleucynę w kodonie 211, izoleucyna Aminokwas to aminokwas o bardzo podobnych właściwościach. Ta zmiana wpływa na normalne składanie mRNA. Druga odmiana znajduje się w regionie intronowym i skutkuje podwójną substytucją A na tyminę (T) przed eksonem 13 genu kodującego BRCA2. Zmiana c.7008-2A>T może generować wiele transkryptów o różnej długości. Ponadto w grupie Spośród 18 zmian w genie BRCA2 PV 4 (22,2%) miały charakter intronowy.
Następnie zmapowaliśmy szkodliwe mutacje BRCA1/2 w domenach funkcjonalnych i regionach wiążących białka (ryc. 4). W genie BRCA1 50% PV znajdowało się w regionie klastra raka piersi (BCCR), podczas gdy 22% mutacji znajdowało się w regionie klastra raka jajnika (OCCR) (ryc. 4A). W BRCA2 PV 35,7% wariantów znajdowało się w regionie BCCR, a 42,8% mutacji znajdowało się w regionie OCCR (ryc. 4B). Następnie oceniliśmy lokalizację PV w domenach białek BRCA1 i BRCA2. W przypadku białka BRCA1 znaleźliśmy trzy PV w domenach pętli i zwoju oraz dwie mutacje w domenie BRCT (ryc. 4A). W przypadku białka BRCA2 4 PV zmapowano na domenę powtórzeń BRC, podczas gdy 3 zmiany intronowe i 3 egzonowe wykryto w domeny wiążące oligosacharydy/oligosacharydy (OB) i domeny wieżowe (T) (ryc. 4B).
Rysunek 4 Schematyczne przedstawienie białek BRCA1 i BRCA2 oraz lokalizacja wariantów patogennych. Rysunek przedstawia dystrybucję wariantów patogennych BRCA1 (A) i BRCA2 (B) u pacjentek z rakiem piersi. Mutacje egzonowe są oznaczone na niebiesko, a warianty intronowe na pomarańczowo. Wysokość słupka przedstawia liczbę przypadków. Przedstawiono białka BRCA1 i BRCA2 oraz ich domeny funkcjonalne. (A) Białko BRCA1 zawiera domenę pętlową (RING) i sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS), domenę typu coiled-coil, domenę klastra SQ/TQ (SCD) i domenę C-końcową BRCA1 (BRCT). (B) Białko BRCA2 zawiera osiem powtórzeń BRC, domenę wiążącą DNA z domeną helisy (Helical), trzy fałdy wiążące oligonukleotydy/oligosacharydy (OB), domenę wieżową (T) i An NLS po stronie C. Obszary zwane regionem klastra raka piersi (BCCR) i region klastra raka jajnika (OCCR) pokazano na dole.*Oznacza mutacje, które determinują kodony stopu.
Następnie zbadaliśmy cechy kliniczno-patologiczne raka piersi, które mogą korelować z obecnością BRCA1/2 PV. Pełna dokumentacja kliniczna była dostępna dla 181 pacjentów BRCA1/2-ujemnych (niebędących nosicielami) i wszystkich nosicieli (n = 35). Zaobserwowano korelację między szybkością proliferacji guza a stopniem.
Obliczyliśmy rozkład Ki-67 na podstawie mediany naszej kohorty (25%, zakres <10-90%). Osoby z Ki-67 < 25% zdefiniowano jako „niskie Ki-67”, natomiast osoby z wartościami ≥ 25% uznano za „wysokie Ki-67”. Istotne różnice Ki-67 (p<0,01) stwierdzono między osobami niebędącymi nosicielami a nosicielami genu BRCA1 PV (ryc. 5A).
Rysunek 5. Korelacja Ki-67 z rozkładem stopnia zaawansowania u kobiet z rakiem piersi z mutacjami BRCA1 i BRCA2 PV i bez nich.(A) Wykres pudełkowy przedstawiający medianę wartości Ki-67 u 181 pacjentek z rakiem piersi niebędących nosicielkami mutacji w porównaniu z pacjentkami z mutacją BRCA1 (18) lub BRCA2 (17). Wartości p poniżej 0,5 uznano za statystycznie istotne.(B) Histogram przedstawiający przydział pacjentek z rakiem piersi do grup stopnia histologicznego (G2 i G3) w zależności od statusu mutacji BRCA1 i BRCA2 (osoby z dzikim typem choroby, nosicielki mutacji BRCA1 i BRCA2 PV).
Podobnie, sprawdziliśmy, czy stopień zaawansowania nowotworu koreluje z obecnością mutacji BRCA1/2 PV. Ponieważ w naszej populacji nie było raka piersi w stadium G1, podzieliliśmy pacjentów na dwie grupy (G2 lub G3). Zgodnie z wynikami Ki-67, analiza wykazała statystycznie istotną korelację między stopniem zaawansowania nowotworu a mutacją BRCA1, przy czym wyższy odsetek nowotworów w stadium G3 odnotowano u nosicieli mutacji BRCA1 w porównaniu do osób niebędących nosicielami (p<0,005) (Rysunek 5B).
Postęp w technologii sekwencjonowania DNA pozwolił na bezprecedensowe postępy w badaniach genetycznych BRCA1/2, co ma kluczowe znaczenie dla pacjentów z historią rodzinną raka. Do tej pory zidentyfikowano i sklasyfikowano około 20 000 wariantów BRCA1/2 zgodnie z systemem American Society of Medical Genetics35 i ENIGMA.35,36 Wiadomo, że spektrum mutacji BRCA1/2 znacznie różni się w zależności od regionu geograficznego.37 We Włoszech wskaźnik mutacji BRCA1/2 PV wahał się od 8% do 37%, co wskazuje na dużą zmienność wewnątrz kraju.38,39 Sycylia, licząca prawie 5 milionów mieszkańców, jest piątym co do wielkości regionem we Włoszech pod względem liczby mieszkańców. Chociaż istnieją dane na temat rozmieszczenia BRCA1/2 w zachodniej Sycylii, nie ma na to obszernych dowodów we wschodniej części wyspy.
Nasze badanie jest jednym z pierwszych raportów na temat częstości występowania BRCA1/2 PV u pacjentek z rakiem piersi we wschodniej Sycylii.28 W naszej analizie skupiliśmy się na raku piersi, ponieważ jest to zdecydowanie najczęstsza choroba w naszej grupie.
Podczas badania 389 pacjentów z rakiem piersi, 9% było nosicielami mutacji BRCA1/2 PV, równomiernie rozłożonych między BRCA1 i BRCA2. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniej raportowanymi dla populacji włoskiej.28 Co ciekawe, 3% (13/389) naszej kohorty stanowili mężczyźni. Ten wskaźnik jest wyższy niż oczekiwano w przypadku raka piersi u mężczyzn (1% wszystkich pacjentów z rakiem piersi),40 co odzwierciedla nasz wybór populacji na podstawie ryzyka mutacji BRCA1/2. Jednak żaden z tych mężczyzn nie rozwinął mutacji BRCA1/2 PV, więc byli oni kandydatami do dalszej analizy molekularnej w celu wykluczenia obecności mniej powszechnych mutacji, takich jak PALB2, RAD51C i D, między innymi. Warianty o niepewnym znaczeniu pobrano u 7% osób, u których widoczny był BRCA2 VUS. Nawet ten wynik jest zgodny z wcześniejszymi dowodami.28,41,42
Analizując rozkład podtypów molekularnych raka piersi u kobiet z mutacją genu BRCA1/2, potwierdziliśmy znane powiązania między rakiem piersi w stadium TNBC a rakiem piersi w stadium BRCA1 (58,8%) oraz między rakiem piersi w stadium luminalnym B a rakiem piersi w stadium BRCA2 (55,6%).16,43 Guzy w stadium luminalnym A i HER2+ u nosicielek genu BRCA1 i BRCA2 PV są zgodne z istniejącymi danymi z literatury.16,43
Następnie skupiamy się na typie i lokalizacji BRCA1/2 PV. W naszej kohorcie najczęstszym BRCA1 PV było c.5035_5039delCTAAT. Chociaż Incorvaia i in. nie opisali tego wariantu w swojej sycylijskiej kohorcie, inni autorzy zgłosili go jako wariant linii zarodkowej BRCA1 PV.34 W naszej kohorcie znaleziono kilka wariantów BRCA1 PV – np. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA i c.5266dupC – które zaobserwowano na Sycylii.28 Z nich dwie mutacje założycielskie BRCA1 (c.181T>G i c.5266dupC) są powszechnie spotykane u Żydów aszkenazyjskich z Europy Wschodniej i Środkowej (Polska, Czechy), Słowenia, Austria, Węgry, Białoruś i Niemcy),44,45 a w Stanach Zjednoczonych i Argentynie zostały niedawno zdefiniowane jako „nawracający wariant linii zarodkowej” u włoskich pacjentów z rakiem piersi i rakiem jajnika. Wariant 34c.514del został wcześniej zidentyfikowany u 8 pacjentek z rakiem piersi z północnej Sycylii w Palermo i Mesynie. Co ciekawe, nawet Incorvaia i in. znaleziono wariant c.3253dupA u niektórych rodzin w Katanii.28 Najbardziej reprezentatywne warianty BRCA2 PV to c.428dup, c.5851_5854delAGTT i wariant intronowy c.8487+1G>A, które opisano bardziej szczegółowo28 u pacjenta w Palermo z wariantem c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV obserwowano w gospodarstwach domowych w północno-zachodniej Sycylii, głównie w regionach Trapani i Palermo, podczas gdy wariant c.5851_5854delAGTT PV obserwowano w gospodarstwach domowych w północno-zachodniej Sycylii. Wariant 8487+1G>A był bardziej powszechny u osób z Mesyny, Palermo i Caltanissetty.28 Rebbeck i in. opisał wcześniej zmianę c.5851_5854delAGTT w Kolumbii.37 Inną mutację BRCA2 PV, c.631+1G>A, stwierdzono u pacjentów z rakiem piersi i rakiem jajnika z Sycylii (Agrigento, Syrakuzy i Ragusa).28 Co godne uwagi, zaobserwowaliśmy współistnienie dwóch wariantów BRCA2 (BRCA2 c.631G>A i c.7008-2A>T) u tego samego pacjenta, co do którego założyliśmy, że jest rozdzielony w trybie cis, jak wcześniej zgłoszono.34,46 Te mutacje BRCA2 są rzeczywiście często obserwowane w regionie włoskim i stwierdzono, że wprowadzają przedwczesne kodony stop, wpływając na splicing mRNA i powodując niewydolność białka BRCA2.47,48
Zmapowaliśmy również regiony PV BRCA1 i BRCA2 w domniemanych regionach OCCR i BCCR domen białkowych i genów. Regiony te zostały opisane przez Rebbeck i in. jako obszary ryzyka rozwoju odpowiednio raka jajnika i piersi.49 Jednak dowody dotyczące związku między lokalizacją wariantów linii zarodkowej a ryzykiem raka piersi lub jajnika pozostają kontrowersyjne.28,50-52 W naszej populacji regiony PV BRCA1 były zlokalizowane głównie w regionie BCCR, podczas gdy regiony PV BRCA2 były zlokalizowane głównie w regionie OCCR. Nie udało nam się jednak znaleźć żadnego związku między domniemanymi regionami OCCR i BCCR a cechami BC. Może to wynikać z ograniczonej liczby pacjentów z mutacjami BRCA1/2. Z perspektywy domeny białkowej regiony PV BRCA1 są rozmieszczone wzdłuż całego białka, a zmiany w BRCA2 są preferencyjnie znajdowane w domenie powtórzeń BRC.
Na koniec skorelowaliśmy cechy kliniczno-patologiczne raka piersi z BRCA1/2 PV. Ze względu na ograniczoną liczbę uwzględnionych pacjentów, znaleźliśmy jedynie istotną korelację między Ki-67 a stopniem guza. Chociaż ocena i interpretacja Ki-67 pozostają nieco kontrowersyjne, pewne jest, że wysokie wskaźniki proliferacji są związane ze zwiększonym ryzykiem nawrotu choroby i zmniejszonym przeżyciem. Do tej pory próg rozróżniania między „wysokim” i „niskim” Ki-67 wynosi 20%. Jednak próg ten nie ma zastosowania do naszej populacji pacjentów z mutacją BRCA1/2, która ma medianę wartości Ki-67 wynoszącą 25%. Tę tendencję w wysokich wskaźnikach Ki-67 można wyjaśnić rozpowszechnieniem w naszych kohortach luminalnego B i TNBC, w których było niewiele guzów luminalnych A. Jednak niektóre dowody wydają się sugerować, że wyższy próg Ki-67 (25–30%) może lepiej stratyfikować pacjentów w zależności od ich rokowania.53,54 Na podstawie wyników naszej analizy nie można stwierdzić istotnej korelacji zaskakujące. Występuje między wysokimi stopniami Ki-67 i obecnością BRCA1 PV. W rzeczywistości guzy związane z BRCA1 są typowe dla TNBC i wykazują bardziej agresywne cechy.16,17
Podsumowując, badanie to przedstawia raport na temat statusu mutacji BRCA1/2 w kohorcie pacjentów z rakiem piersi ze wschodniej Sycylii. Ogólnie rzecz biorąc, nasze ustalenia są zgodne z istniejącymi wcześniej dowodami, zarówno pod względem częstości występowania mutacji, jak i cech kliniczno-patologicznych w raku piersi. Uzasadnione jest przeprowadzenie większej liczby badań na większych populacjach pacjentów z rakiem piersi z mutacją BRCA1/2, takich jak analiza mutacji rozszerzonych o wiele genomów, w celu oceny obecności PV, które są odrębne i rzadsze niż BRCA1/2. Umożliwi to identyfikację i właściwe leczenie rosnącej liczby osób o zwiększonym ryzyku zachorowania na raka z powodu mutacji genetycznych.
Potwierdziliśmy, że pacjenci podpisali świadomą zgodę na anonimowe udostępnienie próbek swoich guzów do celów badawczych. Wszyscy pacjenci podpisali pisemną świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zgodnie z polityką AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco” badanie to zostało zwolnione z przeglądu etycznego, ponieważ analiza BRCA1/2 została przeprowadzona zgodnie z praktyką kliniczną, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę. Pacjenci wyrażają również zgodę na wykorzystanie ich danych do celów badawczych.
Dziękujemy prof. Paolo Vigneriemu za pomoc w opiece nad pacjentkami z rakiem piersi, zgodnie z prośbą Komisji Etycznej.
Federica Martorana otrzymuje honoraria od Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis i Pfizer. Pozostali autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów w związku z tą pracą.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL i in. Globalne statystyki dotyczące raka 2020: GLOBOCAN szacuje częstość występowania i śmiertelność z powodu 36 nowotworów w 185 krajach na całym świecie. CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660