W Twojej przeglądarce wyłączona jest obsługa JavaScript. Niektóre funkcje tej witryny nie będą działać, gdy obsługa JavaScript będzie wyłączona.
Zarejestruj się, podając szczegółowe dane i konkretny lek, który Cię interesuje, a my dopasujemy podane przez Ciebie informacje do artykułów w naszej obszernej bazie danych i niezwłocznie wyślemy Ci kopię w formacie PDF na adres e-mail.
作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Wydział Medycyny Klinicznej i Eksperymentalnej, Uniwersytet im. Catania, Catania, 95123, Włochy;2 Centrum Eksperymentalnej Onkologii i Hematologii, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Włochy; 3 Onkologia Medyczna, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco”, Katania, 95123, Włochy; 4 Genetyka medyczna, ARNAS Garibaldi, Katania, 95123, Włochy; 5 Medicine Genetics, ASP, Syrakuzy, 96100, Włochy; 6 Department of Biomedical and Biotechnology Sciences, University of Catania, Medical Genetics, Katania, Włochy, 95123; 7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Włochy Komunikacja: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, e-mail [email protected]; [email protected] Cel: Mutacje linii zarodkowej w genach BRCA1 i BRCA2 oraz ustalony rak piersi (BC), jajnika (OC) i inne nowotwory związane z ryzykiem zachorowania na raka w ciągu całego życia. Badanie genu BRCA jest kluczowe dla oceny indywidualnego ryzyka, a także dla znalezienia metod profilaktyki u zdrowych nosicieli i dostosowania leczenia u pacjentów onkologicznych. Częstość występowania zmian w genach BRCA1 i BRCA2 jest bardzo zróżnicowana w zależności od regionu geograficznego i chociaż istnieją dane na temat patogennych wariantów BRCA w rodzinach sycylijskich, brakuje badań ukierunkowanych konkretnie na populacje we wschodniej Sycylii. Celem naszego badania było zbadanie częstości występowania i rozmieszczenia patogennych zmian w linii zarodkowej w genach BRCA w kohorcie pacjentów z BC ze wschodniej Sycylii oraz ocena ich związku ze specyficznymi cechami BC przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Obecność zmian korelowała ze stopniem zaawansowania nowotworu i wskaźnikiem proliferacji. WYNIKI: Ogółem 35 pacjentów (9%) miało patogenny wariant BRCA, 17 (49%) w BRCA1 i 18 (51%) w przypadku BRCA2. Zmiany w genie BRCA1 są powszechne u pacjentek z rakiem piersi potrójnie ujemnym, podczas gdy mutacje w genie BRCA2 są powszechniejsze u pacjentek z rakiem piersi luminalnym. W porównaniu z osobami niebędącymi nosicielami, osoby z wariantami BRCA1 miały znacznie wyższy stopień zaawansowania nowotworu i indeks proliferacyjny. Wnioski: Nasze odkrycia dają przegląd statusu mutacji genu BRCA u pacjentek z rakiem piersi ze wschodniej Sycylii i potwierdzają rolę analizy NGS w identyfikacji pacjentek z dziedzicznym rakiem piersi. Ogólnie rzecz biorąc, dane te są zgodne z wcześniejszymi dowodami wspierającymi badania przesiewowe w kierunku BRCA w celu właściwej profilaktyki i leczenia raka u nosicielek mutacji.
Rak piersi (BC) jest najczęstszym nowotworem złośliwym na świecie i najbardziej śmiertelnym nowotworem u kobiet.1 Cechy biologiczne, które determinują rokowanie i zachowanie kliniczne BC, były szeroko badane i częściowo wyjaśnione na przestrzeni czasu. W rzeczywistości kilka markerów zastępczych jest obecnie używanych do klasyfikacji BC na różne podtypy molekularne. Są to receptor estrogenowy (ER) i/lub progesteronowy (PgR), amplifikacja receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2), indeks proliferacji Ki-67 i stopień guza (G).2 Połączenie tych zmiennych zidentyfikowało następujące kategorie BC: 1) Guzy luminalne, wykazujące ekspresję ER i/lub PgR, stanowiły 75% BC. Guzy te podzielono dalej na Luminal A, gdy Ki-67 było poniżej 20% i HER2-ujemne, i Luminal B, gdy Ki-67 było równe lub wyższe niż 20% i w obecności amplifikacji HER2, niezależnie od indeksu proliferacji; 2) Guzy HER2+, które są ER i PgR ujemne, ale wykazują amplifikację HER2. Grupa ta stanowi 10% wszystkich guzów piersi; 3) Potrójnie ujemny rak piersi (TNBC), który nie wykazuje ekspresji ER i PgR ani amplifikacji HER2, stanowi około 15% przypadków raka piersi.2-4
Wśród tych podtypów raka piersi stopień zaawansowania nowotworu i wskaźnik proliferacji stanowią przekrojowe biomarkery, które są bezpośrednio i niezależnie związane z agresywnością nowotworu i rokowaniem.5,6
Oprócz wyżej wymienionych cech biologicznych, rola dziedzicznych zmian genetycznych prowadzących do rozwoju raka piersi stała się coraz ważniejsza w ciągu ostatnich kilku lat.7 Około 1 na 10 guzów piersi dziedziczy się z powodu zmian linii zarodkowej w określonych genach.8 Dwa duże badania epidemiologiczne z udziałem ponad 180 000 kobiet niedawno zidentyfikowały grupę ośmiu genów (tj. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C i RAD51D) odpowiedzialnych głównie za dziedziczny BC. Wśród tych genów BRCA1 i BRCA2 (zwane dalej BRCA1/2) wykazały najsilniejszą korelację z rozwojem guzów piersi.9-12 W rzeczywistości mutacje linii zarodkowej BRCA1/2 znacząco zwiększają ryzyko zachorowania na raka piersi w ciągu całego życia, a także inne nowotwory złośliwe, w tym jajnika, prostaty, trzustki, jelita grubego i czerniaka. Od 13. do W ciągu 80 lat skumulowana częstość występowania raka piersi wynosi 72% u kobiet z patogennym wariantem genu BRCA1 (PV) i 69% u kobiet z wariantem BRCA2 PV.14
Warto zauważyć, że niedawna publikacja sugeruje, że ryzyko zachorowania na raka piersi zależy od rodzaju PV. W rzeczywistości, w porównaniu z patogennymi wariantami skracającymi, wyraźne warianty typu missense, zwłaszcza w genie BRCA1, wiążą się ze zmniejszonym ryzykiem zachorowania na raka piersi, zwłaszcza u starszych kobiet.15
Obecność mutacji BRCA1 lub BRCA2 PV wiązała się z różnymi cechami biologicznymi i kliniczno-patologicznymi.16,17 Rak piersi związany z BRCA1 ma tendencję do agresywnego przebiegu klinicznego, słabego zróżnicowania i wysokiej proliferacji. Guzy te są zwykle potrójnie ujemne i pojawiają się wcześnie. Guzy występujące u pacjentów z mutacją BRCA2 zwykle wykazują umiarkowane do dobrze zróżnicowanych stopni oraz zmienne wskaźniki proliferacji. Guzy te częściej występują w świetle B i zwykle występują u osób starszych.16-18 Co godne uwagi, mutacje w BRCA1 i BRCA2 zwiększają wrażliwość na określone metody leczenia, w tym sole platyny i leki ukierunkowane, takie jak inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARPi).19,20
W ciągu ostatnich kilku lat wdrożenie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w praktyce klinicznej umożliwiło coraz większej liczbie pacjentów z rakiem piersi poddanie się badaniom molekularnym w kierunku zespołów podatności na raka, w tym BRCA1/2.21 Jednocześnie definicje oparte na precyzyjnych kryteriach dotyczących historii rodzinnej, cech demograficznych i kliniczno-patologicznych pozwalają lepiej identyfikować osoby godne badania BRCA1/2.22,23 W tym kontekście gromadzą się dowody na temat badań przesiewowych BRCA1/2 w określonych populacjach, podkreślając różnice w różnych regionach geograficznych.24–27 Chociaż istnieją raporty dotyczące kohorty BC w zachodniej Sycylii, dostępnych jest mniej danych na temat badań przesiewowych BRCA1/2 w populacji wschodniej Sycylii.28,29
Opisujemy tutaj wyniki badań przesiewowych w kierunku mutacji BRCA1/2 u pacjentek z rakiem piersi pochodzących ze wschodniej Sycylii, a także korelację pomiędzy obecnością mutacji BRCA1 lub BRCA2 a głównymi cechami kliniczno-patologicznymi tych nowotworów.
Retrospektywne badanie zostało przeprowadzone w „Centrum Onkologii Eksperymentalnej i Hematologii” w Szpitalu Policlinico Rodolico – San Marco w Katanii. W latach od stycznia 2017 r. do marca 2021 r. do naszego laboratorium diagnostyki molekularnej w celu wykonania badań genetycznych w kierunku BRCA/2 skierowano łącznie 455 pacjentów z rakiem piersi i jajników, czerniakiem, rakiem trzustki lub prostaty. Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w analizie molekularnej.
Histologiczne i biologiczne cechy (estrogenów, PgR, statusu HER2, Ki-67 i stopnia) raka piersi oceniano na podstawie biopsji rdzeniowej lub próbek chirurgicznych, biorąc pod uwagę jedynie agresywne składniki guza. Na podstawie tych cech rak piersi klasyfikowano następująco: luminalny A (ER+ i/lub PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminalny B (ER+ i/lub PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalny B-HER2+ (ER i/lub PgR+, HER2+), HER2+ (ER i PgR-, HER2+) lub potrójnie ujemny (ER i PgR-, HER2-).
Przed oceną statusu mutacji BRCA1 i BRCA2, wielodyscyplinarny zespół składający się z onkologa, genetyka i psychologa przeprowadził konsultację genetyki guza u każdego pacjenta w celu ustalenia obecności BRCA1 i/lub BRCA1. lub osób z wysokim ryzykiem PV w genie BRCA2. Dobór pacjentów przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Włoskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (AIOM) i lokalnymi zaleceniami sycylijskimi.30,31 Kryteria te obejmują: (i) historię rodzinną znanych wariantów patogennych w genach podatności (np. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) mężczyzn z rakiem piersi; (iii) osoby z rakiem piersi i rakiem jajnika; (iv) kobiety z rakiem piersi <36 lat, rakiem piersi TNBC <60 lat lub obustronnym rakiem piersi <50 lat; (v) osobistą historię medyczną raka piersi <50 lat i co najmniej jednego krewnego pierwszego stopnia: (a) rak piersi <50 lat; (b) nieśluzowy i niegraniczny rak jajnika w każdym wieku; (c) obustronny rak piersi; (d) rak piersi u mężczyzn; (e) rak trzustki; (f) rak prostaty; (vi) dwa lub więcej przypadków rak piersi > 50 lat w wywiadzie osobistym oraz historii rodzinnej rak piersi, rak piersi lub rak trzustki u krewnych, którzy są krewnymi pierwszego stopnia (w tym krewni, z którymi jest krewnymi pierwszego stopnia); (vii) przypadek rak piersi i co najmniej jeden krewny pierwszego stopnia: (a) rak piersi <50 lat; (b) rak piersi bez torbieli; (c) obustronny rak piersi; (d) rak piersi u mężczyzn; (vii) kobieta z surowiczym rak piersi wysokiego stopnia.
Od każdego pacjenta pobrano próbkę krwi obwodowej o objętości 20 ml i umieszczono ją w probówkach z EDTA (BD Biosciences). Genomowe DNA wyizolowano z 0,7 ml próbek krwi pełnej przy użyciu zestawu do izolacji QIAsymphony DSP DNA Midi kit (QIAGEN, Hilden, Włochy) zgodnie z instrukcją producenta. Następnie przepuszczono przez fluorometr Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Przeprowadzono kwantyfikację. Wzbogacanie docelowe i przygotowywanie biblioteki przeprowadzane są przez Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, gotowe do załadowania do zestawu Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 w celu zautomatyzowanego przygotowania biblioteki zgodnie z instrukcją producenta. Zestaw składa się z dwóch pul starterów multipleksowych PCR, które można wykorzystać do badania wszystkich genów BRCA1 (NM_007300.3) i BRCA2 (NM_000059.3). Krótko mówiąc, 15 µl każdego rozcieńczonego DNA próbki (10 ng) dodano do kodowanych kreskowo płytek w celu przygotowania biblioteki, a wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne załadowano do urządzenia Ion Chef™. Następnie zautomatyzowane przygotowanie biblioteki i łączenie kodowanych kreskowo bibliotek próbek przeprowadzono na urządzeniu Ion Chef™. Liczbę przygotowanych bibliotek oceniono następnie za pomocą fluorometru Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) zgodnie z instrukcją producenta. instrukcje.Na koniec biblioteki łączono w proporcjach ekwimolarnych w probówkach biblioteki Ion Chef™ (probówki z kodem kreskowym) i ładowano do urządzenia Ion Chef™. Sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu urządzenia Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) z wykorzystaniem układu Ion 510 Chip (Thermo Fisher Scientific). Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Amplicon Suite (SmartSeq srl) i Ion Reporter Software.
Nomenklatura wszystkich wariantów jest zgodna z aktualnymi wytycznymi Human Genome Variation Consortium, dostępnymi online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Znaczenie kliniczne wariantów BRCA1/2 zdefiniowano przy użyciu klasyfikacji Międzynarodowego Konsorcjum ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) i konsultacji z różnymi bazami danych, takimi jak ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD i UMD. Klasyfikacja obejmuje pięć odrębnych kategorii ryzyka: łagodny (kategoria I), prawdopodobnie łagodny (kategoria II), wariant o niepewnym znaczeniu (VUS, kategoria III), prawdopodobnie patogenny (kategoria IV) i patogenny (kategoria V). VarSome przeanalizował również wpływ mutacji na strukturę i funkcję białek, narzędzie informacyjne z dostępem do 30 baz danych.32
Aby przypisać potencjalne znaczenie kliniczne każdemu VUS, zastosowano następujące algorytmy obliczeniowe do przewidywania białek: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) i Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Warianty sklasyfikowane jako klasa 1 i 2 uznano za typ dziki.
Sekwencjonowanie metodą Sangera potwierdziło obecność każdego wariantu patogennego. Krótko mówiąc, dla każdego wykrytego wariantu zaprojektowano parę specyficznych starterów, korzystając z sekwencji referencyjnych genów BRCA1 i BRCA2 (odpowiednio NG_005905.2, NM_007294.3 i NG_012772.3, NM_000059.3). Dlatego przeprowadzono ukierunkowaną reakcję PCR, a następnie sekwencjonowanie metodą Sangera.
U pacjentów, u których wynik testu na obecność genu BRCA1/2 był ujemny, wykonano badanie metodą multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji (MLPA) zgodnie z instrukcją producenta, aby ocenić obecność dużych przegrupowań genomowych (LGR). W skrócie, próbki DNA poddano denaturacji i wykorzystano do 60 sond specyficznych dla genów BRCA1 i BRCA2, z których każda wykrywała określoną sekwencję DNA o długości około 60 nukleotydów. Produkty amplifikacji sond, składające się z unikalnego zestawu amplikonów PCR, przeanalizowano następnie metodą elektroforezy kapilarnej i za pomocą oprogramowania Cofalyser.Net w połączeniu z odpowiednimi tabelami Cofalyser specyficznymi dla danej partii (www.mrcholland.com).
Wybrane zmienne kliniczno-patologiczne (stopień histologiczny i indeks proliferacji Ki-67%) były powiązane z obecnością BRCA1/2 PV, obliczoną przy użyciu oprogramowania Prism w wersji 8.4, przy użyciu dokładnego testu Fishera, przyjmując, że wartość p <0,05 jest istotna.
W latach od stycznia 2017 r. do marca 2021 r. przebadano 455 pacjentów w kierunku mutacji w genie BRCA1/2 w linii zarodkowej. Badania mutacji przeprowadzono w Centrum Onkologii Eksperymentalnej i Hematologii Szpitala Policlinico. Zgodnie z wytycznymi sycylijskimi (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, nr 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), w ośrodku Rodolico di Catania – San Marco, łącznie przebadano 389 pacjentów. Wśród nich znajdowały się: rak piersi (37), rak jajnika (37), rak trzustki (16), rak prostaty (8) i czerniak (5). Podział pacjentów według rodzaju nowotworu i wyników analizy przedstawiono na rysunku 1.
Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy obrazujący przegląd badania. U pacjentek z guzami piersi, czerniakiem, trzustki, prostaty lub jajników wykonano badania w celu wykrycia mutacji w genach BRCA1 i BRCA2.
Skróty: PVs – wariant patogenny; VUS – wariant o niepewnym znaczeniu; WT – sekwencja BRCA1/2 typu dzikiego.
W naszych badaniach selektywnie skupiliśmy się na kohortach chorych na raka piersi. Mediana wieku pacjentek wynosiła 49 lat (zakres 23–89), a przeważały wśród nich kobiety (n=376, czyli 97%).
Spośród tych osób 64 (17%) miało mutacje BRCA1/2 i wszystkie były płci żeńskiej. Trzydzieści pięć (9%) miało PV, a 29 (7,5%) miało VUS. Siedemnaście (48,6%) z 35 wariantów patogennych wystąpiło w BRCA1, a 18 (51,4%) w BRCA2, podczas gdy 5 wariantów VUS wystąpiło w BRCA1 (17,2%) i 24 (82,8%) w BRCA2 (rysunki 1 i 2). LGR nie było obecne w analizie MLPA.
Rycina 2. Analiza mutacji BRCA1 i BRCA2 u 389 pacjentek z rakiem piersi. (A) Dystrybucja wariantów patogennych (PV) (czerwony), wariantów o niepewnym znaczeniu (VUS) (pomarańczowy) i WT (niebieski) u 389 pacjentek z rakiem piersi; (B) 389 pacjentek z rakiem piersi Trzydzieści pięć (9%) miało warianty patogenne BRCA1/2 (PV). Wśród nich 17 (48,6%) było nosicielami BRCA1 PV (ciemnoczerwony), a 18 (51,4%) było nosicielami BRCA2 (jasnoczerwony); (C) 29 (7,5%) z 389 pacjentek było nosicielami VUS, 5 (17,2%) genów BRCA1 (ciemnopomarańczowy) i 24 (82,8%) genów BRCA2 (jasnopomarańczowy).
Skróty: PVs – wariant patogenny; VUS – wariant o niepewnym znaczeniu; WT – sekwencja BRCA1/2 typu dzikiego.
Następnie zbadaliśmy częstość występowania podtypów molekularnych raka piersi u pacjentów z mutacją genu BRCA1/2 PV. Dystrybucja obejmowała 2 (5,7%) luminalnych A, 15 (42,9%) luminalnych B, 3 (8,6%) luminalnych B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ i 13 (37,1%) pacjentów z TNBC. Wśród pacjentów BRCA1-dodatnich 5 (29,4%) miało luminalnych B BC, 2 (11,8%) miało chorobę HER2+, a 10 (58,8%) miało TNBC. Guzy bez mutacji BRCA1 były albo luminalne A, albo luminalne B-HER2+ (Rysunek 3). W podgrupie BRCA2-dodatnich 10 (55,6%) guzów było luminalnych B, 3 (16,7%) luminalnych B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC a 2 (11,1%) były typu luminalnego A (ryc. 3). W tej grupie nie stwierdzono guzów HER2+. Zatem mutacje BRCA1 są powszechne u pacjentów z TNBC, podczas gdy zmiany BRCA2 dominują u osób z typem luminalnym B.
Rycina 3. Częstość występowania podtypów raka piersi u pacjentek z patogennymi wariantami genów BRCA1 i BRCA2. Histogramy przedstawiające rozkład genów PV BRCA1 (ciemnoczerwony) i BRCA2 (jasnoczerwony) wśród podtypów molekularnych pacjentek z rakiem piersi. Liczby podane w każdym polu oznaczają odsetek pacjentek z genami PV BRCA1 i BRCA2 dla każdego podtypu raka piersi.
Skróty: PVs – wariant patogenny; HER2+ – dodatni receptor naskórkowego czynnika wzrostu 2; TNBC – potrójnie ujemny rak piersi.
Następnie oceniliśmy typ i lokalizację genu BRCA1 i BRCA2 PV. W BRCA1 PV zaobserwowaliśmy 7 wariantów pojedynczego nukleotydu (SNV), 6 delecji, 3 duplikacje i 1 insercję. Tylko jedna mutacja (c.5522delG) stanowi nowe odkrycie. Najczęściej wykrywanym BRCA1 PV u obu pacjentów był c.5035_5039delCTAAT. Ta zmiana obejmuje delecję pięciu nukleotydów (CTAAT) w eksonie 15 BRCA1, co skutkuje podstawieniem aminokwasu leucyny tyrozyną w kodonie 1679 i ze względu na przesunięcie ramki translacji z przewidywanym alternatywnym kodonem stop prowadzi do przedwczesnego skrócenia białka. Wszystkie inne zmiany wykryto tylko w jednym przypadku. Warto zauważyć, że jeden ze zgłoszonych PV znajdował się w regionie konsensusu miejsca splicingowego (c.4357+1G>T) (Tabela 1).
W odniesieniu do BRCA2 PV zaobserwowaliśmy 6 delecji, 6 SNV i 2 duplikacje. Żadna ze znalezionych zmian nie jest nowa. W naszej populacji powtórzyły się trzy mutacje, c.428dup i c.8487+1G>A zaobserwowane u 3 osób, a następnie c.5851_5854delAGTT odzyskane w dwóch przypadkach. Zmiana c.428dup obejmuje powtórzenie C w eksonie 5 BRCA2, który prawdopodobnie koduje skrócone, niefunkcjonalne białko. Mutacja c.8487+1G>A występuje w regionie intronowym intronu 19 BRCA2 (± 1,2) i wpływa na sekwencję konsensusu splicingowego, powodując zmianę splicingu skutkującą nieprawidłowym lub nieobecnym białkiem. Patogenny wariant c.5851_5854delAGTT jest spowodowany delecją 4 nukleotydów od pozycji nukleotydowych 5851 do 5854 w eksonie kodującym 10 genu BRCA2 i powoduje przesunięcie ramki translacji z przewidywanym alternatywnym kodonem stopu (p.S1951WfsTer). Co godne uwagi, jak wcześniej zgłaszano, obie zmiany c.631G>A i c.7008-2A>T wykryto u tego samego pacjenta.34 Pierwsza mutacja obejmuje zastąpienie adenozyny (A) w eksonie 7 genu BRCA2 nukleotydem zawierającym guaninę (G), co powoduje zmianę waliny na izoleucynę w kodonie 211. Aminokwas izoleucyny to aminokwas o bardzo podobnych właściwościach. Ta zmiana wpływa na normalny splicing mRNA. Drugi wariant znajduje się w regionie intronowym i powoduje podwójną substytucję A na tyminę (T) przed eksonem 13 genu kodującego BRCA2. Zmiana c.7008-2A>T może generować wiele transkryptów o różnej długości. Ponadto w grupie W przypadku mutacji BRCA2 PV 4 z 18 zmian (22,2%) miały charakter intronowy.
Następnie zmapowaliśmy szkodliwe mutacje BRCA1/2 w domenach funkcjonalnych i regionach wiążących białka (rys. 4). W genie BRCA1 50% PV znajdowało się w regionie klastra raka piersi (BCCR), podczas gdy 22% mutacji znajdowało się w regionie klastra raka jajnika (OCCR) (rys. 4A). W BRCA2 PV 35,7% wariantów znajdowało się w regionie BCCR, a 42,8% mutacji znajdowało się w OCCR (rys. 4B). Następnie oceniliśmy lokalizację PV w domenach białek BRCA1 i BRCA2. W przypadku białka BRCA1 znaleźliśmy trzy PV w domenach pętli i zwoju oraz dwie mutacje w domenie BRCT (rys. 4A). W przypadku białka BRCA2 4 PV zostały zmapowane na domenie powtórzeń BRC, podczas gdy wykryto 3 zmiany intronowe i 3 zmiany eksonowe w domeny wiążące oligosacharydy (OB) i domeny wieżowe (T) (ryc. 4B).
Rycina 4. Schematyczna reprezentacja białek BRCA1 i BRCA2 oraz lokalizacja wariantów patogennych. Rycina przedstawia rozkład wariantów patogennych BRCA1 (A) i BRCA2 (B) u pacjentek z rakiem piersi. Mutacje eksonowe oznaczono kolorem niebieskim, a warianty intronowe kolorem pomarańczowym. Wysokość słupka oznacza liczbę przypadków. Przedstawiono białka BRCA1 i BRCA2 oraz ich domeny funkcjonalne. (A) Białko BRCA1 zawiera domenę pętlową (RING) i sekwencję lokalizacji jądrowej (NLS), domenę typu coiled-coil, domenę klastra SQ/TQ (SCD) i domenę C-końcową BRCA1 (BRCT). (B) Białko BRCA2 zawiera osiem powtórzeń BRC, domenę wiążącą DNA z domeną helisy (Helical), trzy fałdy wiążące oligonukleotydy/oligosacharydy (OB), domenę wieżową (T) i NLS po stronie C. Obszary zwane regionem klastra raka piersi (BCCR) a region klastra raka jajnika (OCCR) pokazano na dole.*Oznacza mutacje, które determinują kodony stopu.
Następnie zbadaliśmy cechy kliniczno-patologiczne raka piersi, które mogą korelować z obecnością mutacji genu BRCA1/2 PV. Pełna dokumentacja kliniczna była dostępna dla 181 pacjentów BRCA1/2-ujemnych (niebędących nosicielami) i wszystkich nosicieli (n = 35). Zaobserwowano korelację między szybkością proliferacji guza a stopniem zaawansowania.
Obliczyliśmy rozkład Ki-67 na podstawie mediany naszej kohorty (25%, zakres <10-90%). Osoby z Ki-67 < 25% zdefiniowano jako „niskie Ki-67”, natomiast osoby z wartościami ≥ 25% uznano za „wysokie Ki-67”. Istotne różnice Ki-67 (p<0,01) stwierdzono między osobami niebędącymi nosicielami genu BRCA1 PV a nosicielami tego genu (ryc. 5A).
Rycina 5. Korelacja Ki-67 z rozkładem stopnia zaawansowania u kobiet z rakiem piersi z mutacjami BRCA1 i BRCA2 PV i bez nich.(A) Wykres pudełkowy przedstawiający medianę wartości Ki-67 u 181 pacjentek z rakiem piersi niebędących nosicielkami mutacji w porównaniu z pacjentkami z mutacjami BRCA1 (18) lub BRCA2 (17). Wartości p poniżej 0,5 uznano za statystycznie istotne.(B) Histogram przedstawiający przydział pacjentek z rakiem piersi do grup stopnia histologicznego (G2 i G3) na podstawie statusu mutacji BRCA1 i BRCA2 (osoby dzikiego typu, nosicielki mutacji BRCA1 i BRCA2 PV).
Podobnie, sprawdziliśmy, czy stopień zaawansowania nowotworu koreluje z obecnością mutacji BRCA1/2 PV. Ponieważ w naszej populacji nie było raka piersi w stadium G1, podzieliliśmy pacjentów na dwie grupy (G2 lub G3). Zgodnie z wynikami Ki-67, analiza wykazała statystycznie istotną korelację między stopniem zaawansowania nowotworu a mutacją BRCA1, przy czym wyższy odsetek nowotworów w stadium G3 odnotowano u nosicieli BRCA1 w porównaniu do osób niebędących nosicielami (p<0,005) (Rysunek 5B).
Postęp w technologii sekwencjonowania DNA umożliwił bezprecedensowe postępy w badaniach genetycznych BRCA1/2, co ma kluczowe znaczenie dla pacjentów z historią rodzinną raka. Do tej pory zidentyfikowano i sklasyfikowano około 20 000 wariantów BRCA1/2 zgodnie z systemem American Society of Medical Genetics35 i ENIGMA.35,36 Wiadomo, że spektrum mutacji BRCA1/2 znacznie różni się w zależności od regionu geograficznego.37 We Włoszech wskaźnik mutacji BRCA1/2 wahał się od 8% do 37%, co pokazuje dużą zmienność wewnątrz kraju.38,39 Sycylia, z populacją liczącą prawie 5 milionów mieszkańców, jest piątym co do wielkości regionem we Włoszech pod względem liczby mieszkańców. Chociaż istnieją dane na temat rozmieszczenia BRCA1/2 w zachodniej Sycylii, nie ma obszernych dowodów na to we wschodniej części wyspy.
Nasze badanie jest jednym z pierwszych raportów na temat częstości występowania raka piersi z mutacją genu BRCA1/2 u pacjentów z rakiem piersi we wschodniej Sycylii.28 W naszej analizie skupiliśmy się na raku piersi, ponieważ jest to zdecydowanie najczęstsza choroba w naszej kohorcie.
Podczas badania 389 pacjentów z rakiem piersi, 9% było nosicielami mutacji BRCA1/2 PV, równomiernie rozłożonych między BRCA1 i BRCA2. Wyniki te są zgodne z wynikami wcześniej raportowanymi dla populacji włoskiej.28 Co ciekawe, 3% (13/389) naszej kohorty stanowili mężczyźni. Jest to wskaźnik wyższy od oczekiwanego w przypadku raka piersi u mężczyzn (1% wszystkich pacjentów z rakiem piersi),40 co odzwierciedla nasz wybór populacji na podstawie ryzyka mutacji BRCA1/2. Jednak żaden z tych mężczyzn nie rozwinął mutacji PV BRCA1/2, więc byli oni kandydatami do dalszej analizy molekularnej w celu wykluczenia obecności mniej powszechnych mutacji, takich jak PALB2, RAD51C i D, między innymi. Warianty o niepewnym znaczeniu pobrano u 7% pacjentów, u których widoczny był BRCA2 VUS. Nawet ten wynik jest zgodny z wcześniej istniejącymi dowodami.28,41,42
Analizując rozkład podtypów molekularnych raka piersi u kobiet z mutacją genu BRCA1/2, potwierdziliśmy znane powiązania między rakiem piersi typu TNBC a rakiem piersi typu BRCA1 (58,8%) oraz między rakiem piersi typu B typu luminalnego a rakiem piersi typu BRCA2 (55,6%).16,43 Guzy typu luminalnego A i HER2+ u nosicielek genu BRCA1 i BRCA2 PV są zgodne z istniejącymi danymi z literatury.16,43
Następnie skupiamy się na typie i lokalizacji genu BRCA1/2 PV. W naszej kohorcie najczęstszym genem genu BRCA1 PV był c.5035_5039delCTAAT. Chociaż Incorvaia i in. nie opisali tego wariantu w swojej sycylijskiej kohorcie, inni autorzy zgłosili go jako wariant linii zarodkowej BRCA1 PV.34 W naszej kohorcie znaleziono kilka wariantów BRCA1 PV – np. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA i c.5266dupC – które zaobserwowano na Sycylii.28 Z nich dwie mutacje założycielskie BRCA1 (c.181T>G i c.5266dupC) są powszechnie spotykane u Żydów aszkenazyjskich z Europy Wschodniej i Środkowej (Polska, Czechy), Słowenia, Austria, Węgry, Białoruś i Niemcy), 44,45 a w Stanach Zjednoczonych i Argentynie zostały niedawno zdefiniowane jako „nawracający wariant linii zarodkowej” u włoskich pacjentów z rakiem piersi i rakiem jajnika. Wariant 34c.514del został wcześniej zidentyfikowany u 8 pacjentów z rakiem piersi z północnej Sycylii w Palermo i Mesynie. Co ciekawe, nawet Incorvaia i in. stwierdzono wariant c.3253dupA u niektórych rodzin w Katanii.28 Najbardziej reprezentatywne warianty BRCA2 PV to c.428dup, c.5851_5854delAGTT i wariant intronowy c.8487+1G>A, które opisano bardziej szczegółowo28 u pacjenta z Palermo z wariantem c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV obserwowano w gospodarstwach domowych w północno-zachodniej Sycylii, głównie w regionach Trapani i Palermo, podczas gdy wariant c.5851_5854delAGTT PV obserwowano w gospodarstwach domowych w północno-zachodniej Sycylii. Wariant 8487+1G>A był bardziej powszechny u osób z Mesyny, Palermo i Caltanissetty.28 Rebbeck i in. wcześniej opisano zmianę c.5851_5854delAGTT w Kolumbii.37 Inną mutację BRCA2 PV, c.631+1G>A, wykryto u pacjentów z rakiem piersi i rakiem jajnika z Sycylii (Agrigento, Syrakuzy i Ragusa).28 Co godne uwagi, zaobserwowaliśmy współistnienie dwóch wariantów BRCA2 (BRCA2 c.631G>A i c.7008-2A>T) u tego samego pacjenta, co do którego założyliśmy, że jest segregowany w trybie cis, jak wcześniej zgłoszono.34,46 Te mutacje BRCA2 są rzeczywiście często obserwowane w regionie włoskim i stwierdzono, że wprowadzają przedwczesne kodony stop, wpływając na splicing mRNA i powodując niewydolność białka BRCA2.47,48
Zmapowaliśmy również regiony PV BRCA1 i BRCA2 w domniemanych regionach OCCR i BCCR domen białkowych i genów. Regiony te zostały opisane przez Rebbeck i in. jako obszary ryzyka rozwoju odpowiednio raka jajnika i piersi.49 Jednakże dowody dotyczące związku między lokalizacją wariantów linii zarodkowej a ryzykiem raka piersi lub jajnika pozostają kontrowersyjne.28,50-52 W naszej populacji regiony PV BRCA1 były zlokalizowane głównie w regionie BCCR, podczas gdy regiony PV BRCA2 były zlokalizowane głównie w regionie OCCR. Nie byliśmy jednak w stanie znaleźć żadnego związku między domniemanymi regionami OCCR i BCCR a cechami BC. Może to być spowodowane ograniczoną liczbą pacjentów z mutacjami BRCA1/2. Z perspektywy domeny białkowej regiony PV BRCA1 są rozmieszczone wzdłuż całego białka, a zmiany w BRCA2 są preferencyjnie znajdowane w domenie powtórzeń BRC.
Na koniec skorelowaliśmy cechy kliniczno-patologiczne raka piersi z BRCA1/2 PV. Ze względu na ograniczoną liczbę uwzględnionych pacjentów, znaleźliśmy jedynie istotną korelację między Ki-67 a stopniem nowotworu. Chociaż ocena i interpretacja Ki-67 pozostaje nieco kontrowersyjna, pewne jest, że wysokie wskaźniki proliferacji są związane ze zwiększonym ryzykiem nawrotu choroby i zmniejszonym przeżyciem. Do tej pory punktem odcięcia dla rozróżnienia „wysokiego” i „niskiego” Ki-67 jest 20%. Jednakże próg ten nie ma zastosowania do naszej populacji pacjentów z mutacją BRCA1/2, która ma medianę wartości Ki-67 wynoszącą 25%. Tę tendencję w wysokich wskaźnikach Ki-67 można wyjaśnić rozpowszechnieniem w naszych kohortach luminalnego B i TNBC, w których było niewiele guzów luminalnych A. Jednakże niektóre dowody wydają się sugerować, że wyższy punkt odcięcia Ki-67 (25–30%) może lepiej stratyfikować pacjentów według ich rokowania.53,54 Na podstawie wyników naszej analizy nie ma istotnej korelacji zaskakujące. Występuje między wysokim poziomem Ki-67 i stopniami oraz obecnością BRCA1 PV. W rzeczywistości guzy związane z BRCA1 są typowe dla TNBC i wykazują bardziej agresywne cechy.16,17
Podsumowując, badanie to przedstawia raport na temat statusu mutacji BRCA1/2 w kohorcie pacjentów z rakiem piersi ze wschodniej Sycylii. Ogólnie rzecz biorąc, nasze ustalenia są zgodne z istniejącymi wcześniej dowodami, zarówno w odniesieniu do częstości występowania mutacji, jak i cech kliniczno-patologicznych w raku piersi. Konieczne jest przeprowadzenie większej liczby badań na większych populacjach pacjentów z rakiem piersi z mutacją BRCA1/2, takich jak analiza mutacji z wykorzystaniem rozszerzonego wielogenomu, w celu oceny obecności wariantów PV, które są odrębne i rzadsze niż BRCA1/2. Umożliwi to identyfikację i właściwe leczenie rosnącej liczby osób o zwiększonym ryzyku zachorowania na raka z powodu mutacji genetycznych.
Potwierdziliśmy, że pacjenci podpisali świadomą zgodę na anonimowe udostępnienie próbek guza do celów badawczych. Wszyscy pacjenci podpisali pisemną świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zgodnie z polityką AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco” badanie to zostało zwolnione z oceny etycznej, ponieważ analiza BRCA1/2 została przeprowadzona zgodnie z praktyką kliniczną, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę. Pacjenci wyrażają również zgodę na wykorzystanie ich danych do celów badawczych.
Dziękujemy prof. Paolo Vigneriemu za pomoc w opiece nad pacjentkami z rakiem piersi, zgodnie z prośbą Komisji Etycznej.
Federica Martorana otrzymuje honoraria od Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis i Pfizer. Pozostali autorzy nie deklarują żadnego konfliktu interesów w związku z tą pracą.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL i in. Globalne statystyki dotyczące nowotworów 2020: GLOBOCAN szacuje zapadalność na 36 nowotworów i śmiertelność z ich powodu w 185 krajach na całym świecie. CA Cancer J Clin. 2021; 71(3): 209-249. doi: 10.3322/caac.21660