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Por Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Catania, Catania, 95123, Italia;2 Centro de Oncología y Hematología Experimental, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 3 Oncología Médica, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 4 Genética Médica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italia; 5 Medicine Genetics, ASP, Siracusa, 96100, Italia; 6 Departamento de Ciencias Biomédicas y Biotecnológicas, Universidad de Catania, Genética Médica, Catania, Italia, 95123; 7 Instituto de Investigación Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Italia Comunicaciones: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, correo electrónico [email protected]; [email protected] Objetivo: Mutaciones de la línea germinal en BRCA1 y BRCA2 y cáncer de mama (CM), ovario (CO) y otros cánceres establecidos asociados con un riesgo de cáncer a lo largo de la vida. La prueba del gen BRCA es clave para evaluar el riesgo individual, así como para encontrar métodos de prevención en portadores sanos y adaptar los tratamientos en pacientes con cáncer. La prevalencia de alteraciones de BRCA1 y BRCA2 varía ampliamente entre regiones geográficas, y aunque existen datos sobre variantes patogénicas de BRCA en familias sicilianas, faltan estudios dirigidos específicamente a poblaciones en el este de Sicilia. El objetivo de nuestro estudio fue investigar la incidencia y distribución de alteraciones patogénicas de la línea germinal de BRCA en una cohorte de pacientes con CM del este de Sicilia y evaluar su asociación con rasgos específicos de CM utilizando secuenciación de próxima generación. La presencia de alteraciones se correlacionó con el grado tumoral y el índice de proliferación. RESULTADOS: En general, 35 pacientes (9%) tenían una variante patogénica de BRCA, 17 (49%) en BRCA1 y 18 (51%) en BRCA2. Las alteraciones de BRCA1 son prevalentes en Pacientes con cáncer de mama triple negativo, mientras que las mutaciones BRCA2 son más comunes en pacientes con cáncer de mama luminal. En comparación con los no portadores, los sujetos con variantes BRCA1 tuvieron un grado tumoral y un índice proliferativo significativamente mayores. Conclusiones: Nuestros hallazgos proporcionan una visión general del estado mutacional de BRCA en pacientes con cáncer de mama del este de Sicilia y confirman el papel del análisis NGS en la identificación de pacientes con cáncer de mama hereditario. En general, estos datos son consistentes con la evidencia previa que respalda la detección de BRCA para la prevención y el tratamiento adecuados del cáncer en portadores de mutaciones.
El cáncer de mama (CM) es la neoplasia maligna más común en todo el mundo y el cáncer más mortal en mujeres.1 Las características biológicas que determinan el pronóstico y el comportamiento clínico del CM se han estudiado ampliamente y se han dilucidado parcialmente con el tiempo. De hecho, actualmente se utilizan varios marcadores sustitutos para clasificar el CM en diferentes subtipos moleculares. Estos son el receptor de estrógeno (RE) y/o progesterona (RP), la amplificación del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), el índice de proliferación Ki-67 y el grado tumoral (G).2 La combinación de estas variables identificó las siguientes categorías de CM: 1) Los tumores luminales, que muestran expresión de RE y/o RP, representaron el 75% de los CM. Estos tumores se dividieron además en Luminal A, cuando Ki-67 era inferior al 20% y HER2 negativo, y Luminal B, cuando Ki-67 era igual o superior al 20% y en presencia de amplificación de HER2, independientemente del índice de proliferación; 2) Tumores HER2+ que son negativos para ER y PgR pero muestran amplificación de HER2. Este grupo representa el 10% de todos los tumores de mama; 3) Cáncer de mama triple negativo (CMTN), que no muestra expresión de ER y PgR y presenta amplificación de HER2, representa aproximadamente el 15% de los cánceres de mama.2-4
Entre estos subtipos de cáncer de mama, el grado tumoral y el índice de proliferación representan biomarcadores transversales que se asocian directa e independientemente con la agresividad tumoral y el pronóstico.5,6
Además de las características biológicas mencionadas, el papel de las alteraciones genéticas hereditarias que conducen al desarrollo del cáncer de mama ha cobrado cada vez más importancia en los últimos años.7 Aproximadamente 1 de cada 10 tumores de mama son hereditarios debido a alteraciones de la línea germinal en genes específicos.8 Dos grandes estudios epidemiológicos que involucran a más de 180.000 mujeres han identificado recientemente un grupo de ocho genes (es decir, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C y RAD51D) responsables principalmente del cáncer de mama hereditario. Entre estos genes, BRCA1 y BRCA2 (en adelante, BRCA1/2) mostraron la correlación más fuerte con el desarrollo de tumores de mama.9-12 De hecho, las mutaciones de la línea germinal BRCA1/2 aumentan significativamente el riesgo de por vida de cáncer de mama, así como de otras neoplasias malignas, incluyendo cáncer de ovario, próstata, páncreas, colorrectal y melanoma. Desde los 13 hasta los 80 años, la incidencia acumulada de cáncer de mama es del 72% en mujeres con una Variante patogénica (VP) de BRCA1 y 69% en mujeres con una VP de BRCA2.14
Cabe destacar que una publicación reciente sugiere que el riesgo de cáncer de mama depende del tipo de variante patogénica. De hecho, en comparación con las variantes truncadoras patogénicas, las variantes de cambio de sentido evidentes, especialmente en el gen BRCA1, se asocian con un riesgo reducido de cáncer de mama, sobre todo en mujeres mayores.¹⁵
La presencia de variantes patogénicas (VP) de BRCA1 o BRCA2 se asoció con diferentes características biológicas y clinicopatológicas.^16,17 Los cánceres de mama asociados a BRCA1 tienden a ser clínicamente agresivos, poco diferenciados y altamente proliferativos. Estos tumores suelen ser triple negativos y de aparición temprana. Los tumores que se presentan en pacientes con mutaciones en BRCA2 suelen exhibir grados de diferenciación moderados a bien diferenciados e índices proliferativos variables. Estos tumores son más comunes en la luz B y generalmente ocurren en adultos mayores.^16-18 Cabe destacar que las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 aumentan la sensibilidad a tratamientos específicos, incluyendo sales de platino y fármacos dirigidos como los inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARPi).^19,20
En los últimos años, la implementación de la secuenciación de próxima generación (NGS) en la práctica clínica ha permitido que un número creciente de pacientes con cáncer de mama se sometan a pruebas moleculares para detectar síndromes de susceptibilidad al cáncer, incluidos los relacionados con BRCA1/2.21 Al mismo tiempo, se han desarrollado definiciones basadas en criterios precisos sobre antecedentes familiares, características demográficas y clinicopatológicas para identificar mejor a las personas que merecen someterse a las pruebas de BRCA1/2.22,23 En este contexto, se está acumulando evidencia sobre el cribado de BRCA1/2 en poblaciones específicas, lo que pone de manifiesto diferencias entre regiones geográficas.24–27 Si bien existen informes sobre la cohorte de cáncer de mama en Sicilia occidental, se dispone de menos datos sobre el cribado de BRCA1/2 en la población de Sicilia oriental.28,29
En este artículo describimos los resultados del cribado de la línea germinal de BRCA1/2 en pacientes con cáncer de mama del este de Sicilia, correlacionando además la presencia de mutaciones en BRCA1 o BRCA2 con las principales características clinicopatológicas de estos tumores.
Se realizó un estudio retrospectivo en el “Centro de Oncología y Hematología Experimental” del Hospital Policlínico Rodolico – San Marco en Catania. Desde enero de 2017 hasta marzo de 2021, un total de 455 pacientes con cáncer de mama y ovario, melanoma, páncreas o próstata fueron remitidos a nuestro laboratorio de diagnóstico molecular para la realización de pruebas genéticas BRCA/2. Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki, y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes del análisis molecular.
Las características histológicas y biológicas (ER, PgR, estado de HER2, Ki-67 y grado) del cáncer de mama se evaluaron en biopsias centrales o muestras quirúrgicas, considerando solo los componentes tumorales agresivos. Con base en estas características, los cánceres de mama se clasificaron de la siguiente manera: luminal A (ER+ y/o PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminal B (ER+ y/o PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminal B-HER2+ (ER y/o PgR+, HER2+), HER2+ (ER y PgR-, HER2+) o triple negativo (ER y PgR-, HER2-).
Antes de evaluar el estado de mutación de BRCA1 y BRCA2, un equipo multidisciplinario que incluía un oncólogo, un genetista y un psicólogo realizó una consulta de genética tumoral para cada paciente para determinar la presencia de BRCA1 y/o BRCA1. o individuos con un alto riesgo de PV en el gen BRCA2. La selección de pacientes se realizó de acuerdo con las directrices de la Sociedad Italiana de Oncología Médica (AIOM) y las recomendaciones locales sicilianas.30,31 Estos criterios incluyen: (i) antecedentes familiares de variantes patogénicas conocidas en genes de susceptibilidad (por ejemplo, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) hombres con BC; (iii) aquellos con BC y OC; (iv) mujeres con BC <36 años, TNBC <60 años o BC bilateral <50 años; (v) antecedentes médicos personales de BC <50 años y al menos un familiar de primer grado: (a) BC < 50 años; (b) OC no mucinoso y no limítrofe de cualquier edad; (c) BC bilateral; (d) BC masculino; (e) cáncer de páncreas; (f) cáncer de próstata; (vi) dos o más Antecedentes personales de BC > 50 años y antecedentes familiares de BC, OC o cáncer de páncreas para parientes que son parientes de primer grado entre sí (incluidos los parientes con los que ella es pariente de primer grado); (vii) Antecedentes personales de OC y al menos un pariente de primer grado: (a) BC <50 años; (b) NOC; (c) BC bilateral; (d) BC masculino; (vii) mujer con OC seroso de alto grado.
Se obtuvo una muestra de sangre periférica de 20 ml de cada paciente y se recogió en tubos con EDTA (BD Biosciences). El ADN genómico se aisló a partir de muestras de sangre entera de 0,7 ml utilizando el kit de aislamiento QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Italia) según las instrucciones del fabricante y se pasó a través de un fluorómetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para realizar la cuantificación. El enriquecimiento de objetivos y la preparación de la biblioteca se realizan mediante el Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, listo para ser cargado en el kit Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 para la preparación automatizada de la biblioteca según las instrucciones del fabricante. El kit consta de dos grupos de cebadores de PCR multiplex que se pueden utilizar para estudiar todos los genes BRCA1 (NM_007300.3) y BRCA2 (NM_000059.3). Brevemente, se añadieron 15 µL de cada muestra de ADN diluida (10 ng) a placas con código de barras para la preparación de la biblioteca y todos los reactivos y consumibles se cargaron en el instrumento Ion Chef™. A continuación, se realizó la preparación automatizada de la biblioteca y la agrupación de la biblioteca de muestras con código de barras en el instrumento Ion Chef™. El número de bibliotecas preparadas se evaluó mediante un fluorómetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Finalmente, las bibliotecas se combinan en proporciones equimolares en Ion Se cargaron tubos de muestra de la biblioteca Chef™ (tubos con código de barras) en el instrumento Ion Chef™. La secuenciación se realizó utilizando un instrumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) con un chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). El análisis de datos se realizó con el software Amplicon Suite (SmartSeq srl) e Ion Reporter.
Toda la nomenclatura de variantes siguió las directrices actuales del Consorcio de Variación del Genoma Humano, disponible en línea (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). La importancia clínica de las variantes BRCA1/2 se definió utilizando la clasificación del Consorcio Internacional ENIGMA (Red Basada en la Evidencia para la Interpretación de Alelos Mutantes de la Línea Germinal, https://enigmaconsortium.org/) y consultando diferentes bases de datos como ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD y UMD. La clasificación incluye cinco categorías de riesgo distintas: benigna (categoría I), probablemente benigna (categoría II), variante de significado incierto (VUS, categoría III), probablemente patogénica (categoría IV) y patogénica (categoría V). VarSome también analizó el efecto de las mutaciones en la estructura y función de las proteínas, una herramienta informativa con acceso a 30 bases de datos.32
Para asignar un significado clínico potencial a cada VUS, se utilizaron los siguientes algoritmos computacionales de predicción de proteínas: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) y Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Las variantes clasificadas como clase 1 y 2 se consideraron de tipo salvaje.
La secuenciación de Sanger confirmó la presencia de cada variante patogénica. En resumen, se diseñó un par de cebadores específicos para cada variante detectada utilizando las secuencias de referencia de los genes BRCA1 y BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 y NG_012772.3, NM_000059.3, respectivamente). Por lo tanto, se realizó una PCR dirigida seguida de la secuenciación de Sanger.
Los pacientes que dieron negativo para el gen BRCA1/2 fueron analizados mediante amplificación de sondas dependiente de ligación múltiple (MLPA) según las instrucciones del fabricante para evaluar la presencia de grandes reordenamientos genómicos (LGR). En resumen, las muestras de ADN se desnaturalizan y se utilizan hasta 60 sondas específicas para los genes BRCA1 y BRCA2, cada una de las cuales detecta una secuencia de ADN específica de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud. Los productos de amplificación de sondas, que consisten en un conjunto único de amplicones de PCR, se analizaron mediante electroforesis capilar y con el software Cofalyser.Net junto con las tablas Cofalyser específicas para cada lote (www.mrcholland.com).
Las variables clinicopatológicas seleccionadas (grado histológico e índice de proliferación Ki-67%) se asociaron con la presencia de BRCA1/2 PV, calculada utilizando el software Prism v. 8.4 mediante la prueba exacta de Fisher, asumiendo un valor p <0,05 como significativo.
Entre enero de 2017 y marzo de 2021, se analizaron 455 pacientes para detectar mutaciones germinales BRCA1/2. Las pruebas de mutación se realizaron en el Centro de Oncología y Hematología Experimental del Hospital Policlinico. Según la guía siciliana (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), el Rodolico de Catania – San Marco” en total, 389 pacientes tenían cáncer de mama, 37 cáncer de ovario, 16 cáncer de páncreas, 8 cáncer de próstata y 5 melanoma. La distribución de los pacientes según el tipo de cáncer y los resultados del análisis se muestran en la Figura 1.
La figura 1 muestra un diagrama de flujo que ofrece una visión general del estudio. Se analizaron pacientes con tumores de mama, melanoma, páncreas, próstata u ovario para detectar mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2.
Abreviaturas: PV, variante patogénica; VUS, variante de significado incierto; WT, secuencia BRCA1/2 de tipo silvestre.
Centramos selectivamente nuestros estudios en cohortes de cáncer de mama. Las pacientes tenían una edad media de 49 años (rango 23-89) y eran predominantemente mujeres (n=376, o 97%).
De estos sujetos, 64 (17%) tenían mutaciones BRCA1/2 y todas eran mujeres. Treinta y cinco (9%) tenían PV y 29 (7,5%) tenían VUS. Diecisiete (48,6%) de las 35 variantes patogénicas ocurrieron en BRCA1 y 18 (51,4%) en BRCA2, mientras que 5 VUS ocurrieron en BRCA1 (17,2%) y 24 (82,8%) en BRCA2 (Figuras 1 y 2). LGR no estuvo presente en el análisis MLPA.
Figura 2. Análisis de mutaciones BRCA1 y BRCA2 en 389 pacientes con cáncer de mama. (A) Distribución de variantes patogénicas (PV) (rojo), variantes de significado incierto (VUS) (naranja) y WT (azul) en 389 pacientes con cáncer de mama; (B) 389 pacientes con cáncer de mama Treinta y cinco (9%) tenían variantes patogénicas BRCA1/2 (PV). Entre ellas, 17 (48,6%) eran portadoras de BRCA1 PV (rojo oscuro) y 18 (51,4%) eran portadoras de BRCA2 (rojo claro); (C) 29 (7,5%) de 389 sujetos portaban VUS, 5 (17,2%) genes BRCA1 (naranja oscuro) y 24 (82,8%) genes BRCA2 (naranja claro).
Abreviaturas: PV, variante patogénica; VUS, variante de significado incierto; WT, secuencia BRCA1/2 de tipo silvestre.
A continuación, investigamos la prevalencia de subtipos moleculares de BC en pacientes con BRCA1/2 PV. La distribución incluyó 2 (5,7%) luminales A, 15 (42,9%) luminales B, 3 (8,6%) luminales B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ y 13 (37,1%) pacientes con TNBC. Entre los pacientes BRCA1-positivos, 5 (29,4%) tenían BC luminal B, 2 (11,8%) tenían enfermedad HER2+ y 10 (58,8%) tenían TNBC. Los tumores sin mutaciones BRCA1 eran luminales A o luminales B-HER2+ (Figura 3). En el subgrupo BRCA2-positivo, 10 (55,6%) tumores eran luminales B, 3 (16,7%) eran luminales B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC y 2 (11,1%) eran luminales A (Figura 3). No En este grupo se encontraron tumores HER2+. Por lo tanto, las mutaciones BRCA1 son frecuentes en pacientes con cáncer de mama triple negativo, mientras que las alteraciones BRCA2 predominan en individuos con subtipo luminal B.
Figura 3 Prevalencia de subtipos de cáncer de mama en pacientes con variantes patogénicas en BRCA1 y BRCA2. Histogramas que muestran la distribución de las variantes patogénicas de BRCA1 (rojo oscuro) y BRCA2 (rojo claro) entre los subtipos moleculares de pacientes con cáncer de mama. Los números que aparecen en cada recuadro representan el porcentaje de pacientes con variantes patogénicas de BRCA1 y BRCA2 para cada subtipo de cáncer de mama.
Abreviaturas: PV, variante patogénica; HER2+, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano positivo; TNBC, cáncer de mama triple negativo.
Posteriormente, evaluamos el tipo y la localización genética de las variantes patogénicas (PV) de BRCA1 y BRCA2. En las PV de BRCA1, observamos 7 variantes de un solo nucleótido (SNV), 6 deleciones, 3 duplicaciones y 1 inserción. Solo una mutación (c.5522delG) representa un nuevo descubrimiento. La PV de BRCA1 más común detectada en ambos sujetos fue c.5035_5039delCTAAT. Esta alteración implica una deleción de cinco nucleótidos (CTAAT) en el exón 15 de BRCA1, lo que resulta en la sustitución del aminoácido leucina por tirosina en el codón 1679, y debido a un cambio de marco de traducción con un codón de parada alternativo predicho conduce a la truncación prematura de la proteína. Todos los demás cambios se detectan en un solo caso. Cabe destacar que una de las PV reportadas se ubicó en la región de consenso del sitio de empalme (c.4357+1G>T) (Tabla 1).
Con respecto a BRCA2 PV, observamos 6 deleciones, 6 SNV y 2 duplicaciones. Ninguno de los cambios encontrados es nuevo. Tres mutaciones se repitieron en nuestra población, c.428dup y c.8487+1G>A observadas en 3 sujetos, seguidas de c.5851_5854delAGTT recuperada en dos casos. La alteración c.428dup implica una repetición de C en el exón 5 de BRCA2, que se predice que codifica una proteína truncada y no funcional. La mutación c.8487+1G>A ocurre en la región intrónica del intrón 19 de BRCA2 (± 1,2) y afecta la secuencia consenso de empalme, lo que resulta en un empalme alterado que da como resultado una proteína anormal o ausente. La variante patogénica c.5851_5854delAGTT se debe a una deleción de 4 nucleótidos desde las posiciones de nucleótidos 5851 a 5854 en el exón codificante. 10 del gen BRCA2 y da como resultado un cambio de marco de lectura traslacional con un codón de parada alternativo predicho (p.S1951WfsTer). Cabe destacar que, como se informó anteriormente, ambas alteraciones c.631G>A y c.7008-2A>T se detectaron en el mismo paciente.34 La primera mutación implica el reemplazo de adenosina (A) en el exón 7 de BRCA2 por un nucleótido que contiene guanina (G), lo que resulta en un cambio de valina a isoleucina en el codón 211. El aminoácido isoleucina es un aminoácido con propiedades muy similares. Este cambio afecta el empalme normal del ARNm. La segunda variante se encuentra en una región intrónica y da como resultado una doble sustitución de A por timina (T) antes del exón 13 del gen que codifica BRCA2. El cambio c.7008-2A>T puede generar múltiples transcripciones de diferentes longitudes. Además, en el grupo de PV de BRCA2, 4 de 18 cambios (22,2%) eran intrónicos.
Luego, mapeamos las mutaciones deletéreas de BRCA1/2 en dominios funcionales y regiones de unión a proteínas (Fig. 4). En el gen BRCA1, el 50% de las variantes patogénicas (PV) se ubicaron en la región del grupo de cáncer de mama (BCCR), mientras que el 22% de las mutaciones se ubicaron en la región del grupo de cáncer de ovario (OCCR) (Fig. 4A). En las PV de BRCA2, el 35,7% de las variantes se ubicaron en la región BCCR y el 42,8% de las mutaciones se ubicaron en la OCCR (Fig. 4B). A continuación, evaluamos la ubicación de las PV dentro de los dominios de las proteínas BRCA1 y BRCA2. Para la proteína BRCA1, encontramos tres PV en los dominios de bucle y de hélice enrollada, y dos mutaciones en el dominio BRCT (Fig. 4A). Para la proteína BRCA2, 4 PV se mapearon al dominio de repetición BRC, mientras que 3 cambios intrónicos y 3 exónicos se detectaron en la unión a oligo/oligosacáridos (OB) y la torre dominios (T) ( Figura 4B).
Figura 4 Representación esquemática de las proteínas BRCA1 y BRCA2 y localización de variantes patogénicas. Esta figura muestra la distribución de variantes patogénicas de BRCA1 (A) y BRCA2 (B) en pacientes con cáncer de mama. Las mutaciones exónicas se muestran en azul, mientras que las variantes intrónicas se muestran en naranja. La altura de la barra representa el número de casos. Se informan las proteínas BRCA1 y BRCA2 y sus dominios funcionales. (A) La proteína BRCA1 contiene un dominio de bucle (RING) y una secuencia de localización nuclear (NLS), un dominio de hélice enrollada, un dominio de grupo SQ/TQ (SCD) y un dominio C-terminal BRCA1 (BRCT). (B) La proteína BRCA2 contiene ocho repeticiones BRC, un dominio de unión al ADN con un dominio helicoidal (Helical), tres pliegues de unión a oligonucleótidos/oligosacáridos (OB), un dominio de torre (T) y una NLS en el lado C. Las áreas llamadas Región de Agrupación de Cáncer de Mama (BCCR) y Región de Agrupación de Cáncer de Ovario (OCCR) son Se muestra en la parte inferior.*Representa las mutaciones que determinan los codones de parada.
Luego investigamos las características clinicopatológicas del cáncer de mama que podrían correlacionarse con la presencia de BRCA1/2 PV. Se dispuso de registros clínicos completos para 181 pacientes BRCA1/2 negativos (no portadores) y todos los portadores (n = 35). Hubo una correlación entre la tasa de proliferación tumoral y el grado.
Calculamos la distribución de Ki-67 basándonos en la mediana de nuestra cohorte (25%, rango <10-90%). Los sujetos con Ki-67 < 25% se definieron como “Ki-67 bajo”, mientras que los individuos con valores ≥ 25% se consideraron “Ki-67 alto”. Se encontraron diferencias significativas de Ki-67 (p<0,01) entre los no portadores y los portadores de BRCA1 PV (Fig. 5A).
Figura 5 Correlación de Ki-67 con la distribución del grado en mujeres con cáncer de mama con y sin PV BRCA1 y BRCA2. (A) Diagrama de caja que muestra los valores medianos de Ki-67 en 181 pacientes con cáncer de mama no portadoras frente a pacientes con PV BRCA1 (18) o BRCA2 (17). Los valores de P inferiores a 0,5 se consideraron estadísticamente significativos. (B) Histograma que representa la asignación de pacientes con cáncer de mama a grupos de grado histológico (G2 y G3) según el estado de mutación de BRCA1 y BRCA2 (sujetos WT, portadores de PV BRCA1 y BRCA2).
Asimismo, examinamos si el grado tumoral se correlacionaba con la presencia de BRCA1/2 PV. Dado que el cáncer de mama G1 estaba ausente en nuestra población, dividimos a los pacientes en dos grupos (G2 o G3). De acuerdo con los resultados de Ki-67, el análisis reveló una correlación estadísticamente significativa entre el grado tumoral y la mutación BRCA1, con una mayor proporción de tumores G3 en portadores de BRCA1 en comparación con los no portadores (p<0,005) (Figura 5B).
Los avances en la tecnología de secuenciación de ADN han permitido avances sin precedentes en las pruebas genéticas de BRCA1/2, con implicaciones cruciales para los pacientes con antecedentes familiares de cáncer. Hasta la fecha, se han identificado y clasificado aproximadamente 20.000 variantes de BRCA1/2 según la Sociedad Americana de Genética Médica 35 y el sistema ENIGMA.35,36 Es bien sabido que el espectro mutacional de BRCA1/2 varía ampliamente entre las regiones geográficas.37 Dentro de Italia, la tasa de PV de BRCA1/2 osciló entre el 8% y el 37%, mostrando una amplia variabilidad intrapaís.38,39 Con una población de casi 5 millones, Sicilia es la quinta región más grande de Italia en términos de número de habitantes. Aunque existen datos sobre la distribución de BRCA1/2 en el oeste de Sicilia, no hay evidencia extensa en la parte oriental de la isla.
Nuestro estudio es uno de los primeros informes sobre la incidencia de BRCA1/2 PV en pacientes con cáncer de mama en el este de Sicilia.28 Centramos nuestro análisis en el cáncer de mama, ya que es, con mucho, la enfermedad más común en nuestra cohorte.
Al analizar a 389 pacientes con cáncer de mama, el 9% presentaba variantes patogénicas (VP) de BRCA1/2, distribuidas uniformemente entre BRCA1 y BRCA2. Estos resultados son consistentes con los previamente reportados en la población italiana.28 Curiosamente, el 3% (13/389) de nuestra cohorte eran hombres. Esta tasa es mayor de lo esperado para el cáncer de mama masculino (1% de todos los cánceres de mama),40 lo que refleja nuestra selección de poblaciones basada en el riesgo de mutación de BRCA1/2. Sin embargo, ninguno de estos hombres desarrolló una VP de BRCA1/2, por lo que fueron candidatos para un análisis molecular adicional para descartar la presencia de mutaciones menos comunes como PALB2, RAD51C y D, entre otras. Se recuperaron variantes de significado incierto en el 7% de los sujetos en los que se evidenció una variante de significado incierto (VUS) de BRCA2. Incluso este resultado es consistente con la evidencia preexistente.28,41,42
Al analizar la distribución de los subtipos moleculares de cáncer de mama en mujeres con mutaciones en BRCA1/2, confirmamos las asociaciones conocidas entre el cáncer de mama triple negativo (TNBC) y la variante patogénica (PV) de BRCA1 (58,8 %) y entre el cáncer de mama luminal B y la PV de BRCA2 (55,6 %).16,43 Los tumores luminales A y HER2+ en portadoras de variantes patogénicas de BRCA1 y BRCA2 son consistentes con los datos de la literatura existente.16,43
Luego nos centramos en el tipo y la ubicación del PV BRCA1/2. En nuestra cohorte, el PV BRCA1 más común fue c.5035_5039delCTAAT. Aunque Incorvaia et al. No describieron esta variante en su cohorte siciliana, otros autores la han reportado como una variante de línea germinal BRCA1 PV.34 Se encontraron varias variantes de línea germinal BRCA1 en nuestra cohorte, por ejemplo, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA y c.5266dupC, que se han observado en Sicilia.28 De estas, dos mutaciones fundadoras de BRCA1 (c.181T>G y c.5266dupC) se encuentran comúnmente en judíos asquenazíes de Europa central y oriental (Polonia, República Checa), eslovenos, austriacos, húngaros, bielorrusos y alemanes), 44,45 y, en los Estados Unidos y Argentina, se definió recientemente como una "variante de línea germinal recurrente" en pacientes italianos con BC y OC. La variante 34c.514del se identificó previamente en 8 pacientes con cáncer de mama del norte de Sicilia en Palermo y Messina. Curiosamente, incluso Incorvaia et al. Se encontró la variante c.3253dupA en algunas familias de Catania.28 Las variantes de probabilidad (PV) de BRCA2 más representativas son c.428dup, c.5851_5854delAGTT y la variante intrónica c.8487+1G>A, que se han descrito con más detalle.28 En un paciente de Palermo con c.428dup, la PV c.5851_5854delAGTT se observó en hogares del noroeste de Sicilia, principalmente en las regiones de Trapani y Palermo, mientras que la PV c.5851_5854delAGTT se observó en hogares del noroeste de Sicilia. La variante 8487+1G>A fue más común en sujetos de Messina, Palermo y Caltanissetta.28 Rebbeck et al. Anteriormente se describió la alteración c.5851_5854delAGTT en Colombia.37 Otra variante patogénica (PV) de BRCA2, c.631+1G>A, se ha encontrado en pacientes con cáncer de mama y de ovario de Sicilia (Agrigento, Siracusa y Ragusa).28 Cabe destacar que observamos la coexistencia de dos variantes de BRCA2 (BRCA2 c.631G>A y c.7008-2A>T) en la misma paciente, que asumimos que se segregan en cis, como se informó previamente.34,46 Estas mutaciones dobles de BRCA2 se observan con frecuencia en la región italiana y se ha descubierto que introducen codones de parada prematuros, afectando el empalme del ARN mensajero y causando la falla de la proteína BRCA2.47,48
También mapeamos BRCA1 y BRCA2 PV en regiones putativas OCCR y BCCR de dominios de proteínas y genes. Estas regiones fueron descritas por Rebbeck et al. como áreas de riesgo para desarrollar cáncer de ovario y de mama, respectivamente.49 Sin embargo, la evidencia sobre la asociación entre la ubicación de variantes de la línea germinal y el riesgo de cáncer de mama u ovario sigue siendo controvertida.28,50-52 En nuestra población, los BRCA1 PV se ubicaron predominantemente en la región BCCR, mientras que los BRCA2 PV se ubicaron predominantemente en la región OCCR. Sin embargo, no pudimos encontrar ninguna asociación entre las regiones putativas OCCR y BCCR y las características de BC. Esto puede deberse al número limitado de pacientes con mutaciones BRCA1/2. Desde una perspectiva de dominio de proteína, los BRCA1 PV se distribuyen a lo largo de toda la proteína, y las alteraciones BRCA2 se encuentran preferentemente en el dominio de repetición BRC.
Finalmente, correlacionamos las características clinicopatológicas del cáncer de mama con la prevalencia de BRCA1/2. Debido al número limitado de pacientes incluidos, solo encontramos una correlación significativa entre Ki-67 y el grado tumoral. Aunque la evaluación e interpretación de Ki-67 sigue siendo algo controvertida, es seguro que las altas tasas de proliferación se asocian con un mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad y una menor supervivencia. Hasta la fecha, el punto de corte para distinguir entre Ki-67 "alto" y "bajo" es del 20%. Sin embargo, este umbral no se aplica a nuestra población de pacientes con mutación BRCA1/2, que tiene un valor medio de Ki-67 del 25%. Esta tendencia en las altas tasas de Ki-67 puede explicarse por la prevalencia en nuestras cohortes de luminal B y TNBC, de las cuales había pocos tumores luminales A. Sin embargo, algunas evidencias parecen sugerir que un punto de corte de Ki-67 más alto (25-30%) puede estratificar mejor a los pacientes según su pronóstico.53,54 A partir de los resultados de nuestro análisis, una correlación significativa no es sorprendente. Ocurre entre Ki-67 alto y grados y la presencia de BRCA1 PV. De hecho, los tumores relacionados con BRCA1 son típicos del TNBC y presentan características más agresivas.16,17
En conclusión, este estudio proporciona un informe sobre el estado mutacional de BRCA1/2 en una cohorte de cáncer de mama del este de Sicilia. En general, nuestros hallazgos son consistentes con la evidencia preexistente, tanto en términos de prevalencia de mutaciones como de características clinicopatológicas en el cáncer de mama. Se justifican más estudios en poblaciones más grandes de pacientes con cáncer de mama con mutaciones en BRCA1/2, como el uso de análisis mutacional expandido multigénico, para evaluar la presencia de variantes patogénicas que son distintas y menos frecuentes que BRCA1/2. Esto permitirá la identificación y el manejo adecuado del creciente número de sujetos con mayor riesgo de cáncer debido a mutaciones genéticas.
Confirmamos que los pacientes firmaron el consentimiento informado para la entrega anónima de sus muestras tumorales con fines de investigación. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado por escrito de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Según la política del AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, este estudio quedó exento de revisión ética porque el análisis de BRCA1/2 se realizó de acuerdo con la práctica clínica y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito. Los pacientes también consienten el uso de sus datos con fines de investigación.
Agradecemos al profesor Paolo Vigneri su ayuda en la atención de pacientes con cáncer de mama, tal como lo solicitó el Comité de Ética.
Federica Martorana declara haber recibido honorarios del Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis y Pfizer. Los demás autores declaran no tener conflictos de intereses en este trabajo.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Estadísticas mundiales del cáncer 2020: GLOBOCAN estima la incidencia y la mortalidad de 36 tipos de cáncer en 185 países de todo el mundo. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660