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Com Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Universidade de Catania, Catania, 95123, Itália;2 Centro de Oncologia Experimental e Hematologia, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itália; 3 Oncologia Médica, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itália; 4 Genética Médica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Itália; 5 Medicine Genetics, ASP, Siracusa, 96100, Itália; 6 Departamento de Ciências Biomédicas e Biotecnológicas, Universidade de Catania, Genética Médica, Catania, Itália, 95123; 7 Instituto de Pesquisa Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Itália Comunicações: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, email [email protected]; [email protected] Objetivo: Mutações germinativas nos genes BRCA1 e BRCA2 estão associadas ao câncer de mama (CM), ovário (CO) e outros tipos de câncer, aumentando o risco de câncer ao longo da vida. O teste para o gene BRCA é fundamental para avaliar o risco individual, bem como para encontrar métodos de prevenção em portadores saudáveis ​​e personalizar tratamentos em pacientes com câncer. A prevalência de alterações nos genes BRCA1 e BRCA2 varia amplamente entre as regiões geográficas e, embora existam dados sobre variantes patogênicas de BRCA em famílias sicilianas, faltam estudos direcionados especificamente a populações do leste da Sicília. O objetivo do nosso estudo foi investigar a incidência e a distribuição de alterações germinativas patogênicas de BRCA em uma coorte de pacientes com CM do leste da Sicília e avaliar sua associação com características específicas do CM usando sequenciamento de nova geração. A presença de alterações correlacionou-se com o grau tumoral e o índice de proliferação. Resultados: No geral, 35 pacientes (9%) apresentaram uma variante patogênica de BRCA, sendo 17 (49%) no BRCA1 e 18 (51%) no BRCA2. Alterações no BRCA1 são prevalentes em pacientes com CM triplo-negativo. Considerando que as mutações BRCA2 são mais comuns em pacientes com câncer de mama luminal, em comparação com não portadoras, as pacientes com variantes BRCA1 apresentaram grau tumoral e índice proliferativo significativamente maiores. Conclusões: Nossos achados fornecem uma visão geral do status mutacional de BRCA em pacientes com câncer de mama do leste da Sicília e confirmam o papel da análise NGS na identificação de pacientes com câncer de mama hereditário. No geral, esses dados são consistentes com evidências anteriores que apoiam o rastreamento de BRCA para a prevenção e o tratamento adequados do câncer em portadoras de mutações.
O câncer de mama (CM) é a neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e o câncer mais letal em mulheres.1 As características biológicas que determinam o prognóstico e o comportamento clínico do CM têm sido extensivamente estudadas e parcialmente elucidadas ao longo do tempo. De fato, vários marcadores substitutos são atualmente usados ​​para classificar o CM em diferentes subtipos moleculares. São eles: receptor de estrogênio (RE) e/ou receptor de progesterona (RP), amplificação do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), índice de proliferação Ki-67 e grau tumoral (G).2 A combinação dessas variáveis ​​identificou as seguintes categorias de CM: 1) Tumores Luminais, que apresentam expressão de RE e/ou RP, representaram 75% dos CMs. Esses tumores foram subdivididos em Luminal A, quando o Ki-67 era inferior a 20% e HER2 negativo, e Luminal B, quando o Ki-67 era igual ou superior a 20% e na presença de amplificação de HER2, independentemente do índice de proliferação; 2) Tumores HER2+ que são negativos para ER e PgR, mas apresentam amplificação de HER2. Este grupo representa 10% de todos os tumores de mama; 3) Câncer de mama triplo-negativo (CMTN), que não apresenta expressão de ER e PgR nem amplificação de HER2, representa cerca de 15% dos cânceres de mama.2-4
Dentre esses subtipos de câncer de mama, o grau tumoral e o índice de proliferação representam biomarcadores transversais que estão direta e independentemente associados à agressividade tumoral e ao prognóstico.5,6
Além das características biológicas já mencionadas, o papel das alterações genéticas hereditárias que levam ao desenvolvimento do câncer de mama tem se tornado cada vez mais importante nos últimos anos.7 Cerca de 1 em cada 10 tumores de mama são hereditários devido a alterações na linhagem germinativa em genes específicos.8 Dois grandes estudos epidemiológicos envolvendo mais de 180.000 mulheres identificaram recentemente um grupo de oito genes (ou seja, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C e RAD51D) primariamente responsáveis ​​pelo câncer de mama hereditário. Entre esses genes, BRCA1 e BRCA2 (doravante denominados BRCA1/2) apresentaram a correlação mais forte com o desenvolvimento de tumores de mama.9-12 De fato, mutações na linhagem germinativa de BRCA1/2 aumentam significativamente o risco ao longo da vida de câncer de mama, bem como de outras neoplasias malignas, incluindo câncer de ovário, próstata, pâncreas, colorretal e melanoma. Dos 13 aos 80 anos de idade, a incidência cumulativa de câncer de mama é de 72% em mulheres com uma variante patogênica de BRCA1. (PV) e 69% em mulheres com PV BRCA2.14
Notavelmente, uma publicação recente sugere que o risco de câncer de mama depende do tipo de variante patogênica. De fato, em comparação com variantes truncadas patogênicas, variantes missense evidentes, especialmente no gene BRCA1, estão associadas a um risco reduzido de câncer de mama, principalmente em mulheres mais velhas.15
A presença de variantes patogênicas (VP) nos genes BRCA1 ou BRCA2 foi associada a diferentes características biológicas e clinicopatológicas.^16,17 Os carcinomas de mama (CM) associados ao BRCA1 tendem a ser clinicamente agressivos, pouco diferenciados e altamente proliferativos. Esses tumores geralmente são triplo-negativos e têm início em idade precoce. Os tumores que ocorrem em pacientes com mutação no BRCA2 tipicamente exibem graus de diferenciação moderados a bem diferenciados e índices proliferativos variáveis. Esses tumores são mais comuns no lúmen B e geralmente ocorrem em adultos mais velhos.^16-18 Notavelmente, as mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 aumentam a sensibilidade a tratamentos específicos, incluindo sais de platina e drogas-alvo, como os inibidores da poli(ADP-ribose) polimerase (PARPi).^19,20
Nos últimos anos, a implementação do sequenciamento de nova geração (NGS) na prática clínica permitiu que um número crescente de pacientes com câncer de mama fosse submetido a testes moleculares para síndromes de predisposição ao câncer, incluindo BRCA1/2.21 Concomitantemente, definições baseadas em critérios precisos referentes ao histórico familiar, características demográficas e clinicopatológicas visam identificar melhor os indivíduos elegíveis para o teste BRCA1/2.22,23 Nesse contexto, evidências sobre o rastreamento de BRCA1/2 em populações específicas estão se acumulando, destacando diferenças entre regiões geográficas.24–27 Embora existam relatos sobre a coorte de câncer de mama no oeste da Sicília, há menos dados disponíveis sobre o rastreamento de BRCA1/2 na população do leste da Sicília.28,29
Descrevemos aqui os resultados da triagem germinativa dos genes BRCA1/2 em pacientes com câncer de mama do leste da Sicília, correlacionando ainda a presença de mutações nos genes BRCA1 ou BRCA2 com as principais características clinicopatológicas desses tumores.
Foi realizado um estudo retrospectivo no Centro de Oncologia e Hematologia Experimental do Hospital Policlinico Rodolico – San Marco, em Catania. De janeiro de 2017 a março de 2021, um total de 455 pacientes com câncer de mama e ovário, melanoma, pâncreas ou próstata foram encaminhadas ao nosso laboratório de diagnóstico molecular para teste genético BRCA/2. Este estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, e todos os participantes forneceram consentimento livre e esclarecido por escrito antes da análise molecular.
As características histológicas e biológicas (status de ER, PgR, HER2, Ki-67 e grau) do câncer de mama foram avaliadas em biópsias por agulha grossa ou amostras cirúrgicas, considerando apenas os componentes tumorais agressivos. Com base nessas características, os cânceres de mama foram classificados da seguinte forma: luminal A (ER+ e/ou PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminal B (ER+ e/ou PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminal B-HER2+ (ER e/ou PgR+, HER2+), HER2+ (ER e PgR-, HER2+) ou triplo negativo (ER e PgR-, HER2-).
Antes de avaliar o estado de mutação dos genes BRCA1 e BRCA2, uma equipe multidisciplinar, incluindo um oncologista, um geneticista e um psicólogo, realizou uma consulta de genética tumoral para cada paciente, a fim de determinar a presença de mutações nos genes BRCA1 e/ou BRCA2, ou indivíduos com alto risco de variantes patogênicas (VP) no gene BRCA2. A seleção dos pacientes foi realizada de acordo com as diretrizes da Sociedade Italiana de Oncologia Médica (AIOM) e as recomendações locais da Sicília.30,31 Esses critérios incluem: (i) histórico familiar de variantes patogênicas conhecidas em genes de susceptibilidade (por exemplo, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) homens com câncer de mama (CM); (iii) pacientes com CM e câncer de ovário (CO); (iv) mulheres com CM <36 anos, CM triplo-negativo (CMTN) <60 anos ou CM bilateral <50 anos; (v) histórico médico pessoal de CM <50 anos e pelo menos um parente de primeiro grau: (a) CM <50 anos; (b) CO não mucinoso e não borderline de qualquer idade; (c) CM bilateral; (d) câncer de mama masculino; (e) câncer de pâncreas; (f) câncer de próstata; (vi) dois ou mais histórico pessoal de câncer de mama > 50 anos e histórico familiar de câncer de mama, câncer de ovário ou câncer de pâncreas para parentes que são parentes de primeiro grau entre si (incluindo parentes com quem ela é parente de primeiro grau); (vii) histórico pessoal de câncer de ovário e pelo menos um parente de primeiro grau: (a) câncer de mama < 50 anos; (b) câncer de ovário não-colonial; (c) câncer de mama bilateral; (d) câncer de mama masculino; (vii) mulher com câncer de ovário seroso de alto grau.
Uma amostra de 20 mL de sangue periférico foi obtida de cada paciente e coletada em tubos com EDTA (BD Biosciences). O DNA genômico foi isolado de amostras de 0,7 mL de sangue total utilizando o kit de isolamento de DNA QIAsymphony DSP Midi (QIAGEN, Hilden, Itália), de acordo com as instruções do fabricante, e analisado em um fluorômetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) para realizar a quantificação. O enriquecimento de alvos e a preparação da biblioteca são realizados pelo Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pronto para ser carregado no kit Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 para preparação automatizada de bibliotecas, de acordo com as instruções do fabricante. O kit consiste em dois pools de primers de PCR multiplex que podem ser usados ​​para estudar todos os genes BRCA1 (NM_007300.3) e BRCA2 (NM_000059.3). Resumidamente, 15 µL de cada amostra de DNA diluída (10 ng) foram adicionados a placas com código de barras para preparação da biblioteca, e todos os reagentes e consumíveis foram carregados no instrumento Ion Chef™. A preparação automatizada da biblioteca e o agrupamento das bibliotecas de amostras com código de barras foram então realizados no instrumento Ion Chef™. O número de bibliotecas preparadas foi então avaliado por um fluorômetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, as bibliotecas são combinadas em proporções equimolares no Ion As amostras da biblioteca Chef™ foram coletadas em tubos (tubos com código de barras) e carregadas no instrumento Ion Chef™. O sequenciamento foi realizado utilizando um instrumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) com um chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). A análise dos dados foi realizada pelos softwares Amplicon Suite (SmartSeq srl) e Ion Reporter.
Toda a nomenclatura de variantes seguiu as diretrizes atuais do Consórcio de Variação do Genoma Humano, disponíveis online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). A relevância clínica das variantes BRCA1/2 foi definida utilizando a classificação do Consórcio Internacional ENIGMA (Rede Baseada em Evidências para Interpretação de Alelos Mutantes Germinativos, https://enigmaconsortium.org/) e consultando diferentes bancos de dados, como ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD e UMD. A classificação inclui cinco categorias de risco distintas: benigna (categoria I), provavelmente benigna (categoria II), variante de significado incerto (VUS, categoria III), provavelmente patogênica (categoria IV) e patogênica (categoria V). O VarSome também analisou o efeito das mutações na estrutura e função da proteína, uma ferramenta informativa com acesso a 30 bancos de dados.32
Para atribuir potencial significado clínico a cada VUS, foram utilizados os seguintes algoritmos computacionais de predição de proteínas: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). As variantes classificadas como classe 1 e 2 foram consideradas do tipo selvagem.
O sequenciamento de Sanger confirmou a presença de cada variante patogênica. Resumidamente, um par de primers específicos foi desenhado para cada variante detectada, utilizando as sequências de referência dos genes BRCA1 e BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 e NG_012772.3, NM_000059.3, respectivamente). Em seguida, foi realizada a PCR direcionada, seguida pelo sequenciamento de Sanger.
Pacientes com resultado negativo para os genes BRCA1/2 foram submetidos ao teste de amplificação de sondas dependente de ligação multiplex (MLPA), seguindo as instruções do fabricante, para avaliar a presença de grandes rearranjos genômicos (LGR). Resumidamente, as amostras de DNA são desnaturadas e até 60 sondas específicas para os genes BRCA1 e BRCA2 são utilizadas, cada uma detectando uma sequência específica de DNA com aproximadamente 60 nucleotídeos de comprimento. Os produtos da amplificação das sondas, consistindo em um conjunto único de amplicons de PCR, foram então analisados ​​por eletroforese capilar e pelo software Cofalyser.Net, em conjunto com as tabelas Cofalyser específicas para cada lote (www.mrcholland.com).
Variáveis ​​clinicopatológicas selecionadas (grau histológico e índice de proliferação Ki-67%) foram associadas à presença de variantes patogênicas BRCA1/2, calculadas utilizando o software Prism v. 8.4 com o teste exato de Fisher, considerando um valor de p < 0,05 como significativo.
Entre janeiro de 2017 e março de 2021, 455 pacientes foram triados para mutações germinativas nos genes BRCA1/2. Os testes de mutação foram realizados no Centro de Oncologia Experimental e Hematologia do Hospital Policlinico. De acordo com as diretrizes sicilianas (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02 - Sexta-feira, 10 de janeiro de 2020), do Rodolico de Catania - San Marco, 389 pacientes apresentavam câncer de mama, 37 câncer de ovário, 16 câncer de pâncreas, 8 câncer de próstata e 5 melanoma. A distribuição dos pacientes de acordo com o tipo de câncer e os resultados da análise são mostrados na Figura 1.
A Figura 1 apresenta um fluxograma com uma visão geral do estudo. Pacientes com tumores de mama, melanoma, pâncreas, próstata ou ovário foram testados para mutações nos genes BRCA1 e BRCA2.
Abreviações: PVs, variante patogênica; VUS, variante de significado incerto; WT, sequência BRCA1/2 do tipo selvagem.
Concentramos nossos estudos seletivamente em coortes de câncer de mama. As pacientes tinham uma idade mediana de 49 anos (variação de 23 a 89) e eram predominantemente do sexo feminino (n=376, ou 97%).
Desses indivíduos, 64 (17%) apresentavam mutações nos genes BRCA1/2 e eram todos do sexo feminino. Trinta e cinco (9%) apresentavam variantes patogênicas (VP) e 29 (7,5%) variantes de significado incerto (VSI). Dezessete (48,6%) das 35 variantes patogênicas ocorreram no gene BRCA1 e 18 (51,4%) no BRCA2, enquanto 5 VSI ocorreram no BRCA1 (17,2%) e 24 (82,8%) no BRCA2 (Figuras 1 e 2). A região de crescimento longo (LGR) não foi detectada na análise MLPA.
Figura 2. Análise das mutações BRCA1 e BRCA2 em 389 pacientes com câncer de mama. (A) Distribuição de variantes patogênicas (VP) (vermelho), variantes de significado incerto (VSI) (laranja) e tipo selvagem (WT) (azul) em 389 pacientes com câncer de mama; (B) 389 pacientes com câncer de mama. Trinta e cinco (9%) apresentaram variantes patogênicas (VP) em BRCA1/2. Destas, 17 (48,6%) eram portadoras de VP em BRCA1 (vermelho escuro) e 18 (51,4%) eram portadoras de VP em BRCA2 (vermelho claro); (C) 29 (7,5%) das 389 pacientes apresentaram VSI, sendo 5 (17,2%) em genes BRCA1 (laranja escuro) e 24 (82,8%) em genes BRCA2 (laranja claro).
Abreviações: PVs, variante patogênica; VUS, variante de significado incerto; WT, sequência BRCA1/2 do tipo selvagem.
Em seguida, investigamos a prevalência dos subtipos moleculares de câncer de mama em pacientes com variantes patogênicas (VP) de BRCA1/2. A distribuição incluiu 2 (5,7%) pacientes com subtipo luminal A, 15 (42,9%) com subtipo luminal B, 3 (8,6%) com subtipo luminal B-HER2+, 2 (5,7%) com subtipo HER2+ e 13 (37,1%) com câncer de mama triplo-negativo (CMTN). Entre as pacientes com BRCA1 positivo, 5 (29,4%) apresentavam câncer de mama luminal B, 2 (11,8%) com doença HER2+ e 10 (58,8%) com CMTN. Os tumores sem mutações em BRCA1 eram luminais A ou luminais B-HER2+ (Figura 3). No subgrupo com BRCA2 positivo, 10 (55,6%) tumores eram luminais B, 3 (16,7%) eram luminais B-HER2+, 3 (16,7%) eram CMTN e 2 (11,1%) eram luminais. A (Figura 3). Nenhum tumor HER2+ estava presente neste grupo. Assim, as mutações BRCA1 são prevalentes em pacientes com câncer de mama triplo-negativo (CMTN), enquanto as alterações BRCA2 são predominantes em indivíduos com câncer de mama luminal B.
Figura 3. Prevalência de subtipos de câncer de mama em pacientes com variantes patogênicas em BRCA1 e BRCA2. Histogramas mostrando a distribuição de variantes patogênicas (VPs) em BRCA1 (vermelho escuro) e BRCA2 (vermelho claro) entre os subtipos moleculares de pacientes com câncer de mama. Os números apresentados em cada caixa representam a porcentagem de pacientes com VP em BRCA1 e BRCA2 para cada subtipo de câncer de mama.
Abreviações: PVs, variante patogênica; HER2+, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano positivo; TNBC, câncer de mama triplo-negativo.
Em seguida, avaliamos o tipo e a localização gênica das variantes patogênicas (VPs) de BRCA1 e BRCA2. Nas VPs de BRCA1, observamos 7 variantes de nucleotídeo único (SNVs), 6 deleções, 3 duplicações e 1 inserção. Apenas uma mutação (c.5522delG) representa uma nova descoberta. A VP de BRCA1 mais comum detectada em ambos os indivíduos foi c.5035_5039delCTAAT. Essa alteração envolve uma deleção de cinco nucleotídeos (CTAAT) no éxon 15 de BRCA1, resultando na substituição do aminoácido leucina por tirosina no códon 1679 e, devido a uma mudança na fase de leitura com um códon de parada alternativo previsto, leva ao truncamento prematuro da proteína. Todas as outras alterações foram detectadas em apenas um caso. Notavelmente, uma das VPs relatadas estava localizada na região consenso do sítio de splicing (c.4357+1G>T) (Tabela 1).
Em relação à variante patogênica (VP) do BRCA2, observamos 6 deleções, 6 SNVs e 2 duplicações. Nenhuma das alterações encontradas é inédita. Três mutações foram recorrentes em nossa população: c.428dup e c.8487+1G>A, observadas em 3 indivíduos, seguidas por c.5851_5854delAGTT, encontrada em dois casos. A alteração c.428dup envolve uma repetição de C no éxon 5 do BRCA2, que codifica uma proteína truncada e não funcional. A mutação c.8487+1G>A ocorre na região intrônica do íntron 19 (± 1,2) do BRCA2 e afeta a sequência consenso de splicing, resultando em splicing alterado e, consequentemente, em proteína anormal ou ausente. A variante patogênica c.5851_5854delAGTT é causada por uma deleção de 4 nucleotídeos, das posições 5851 a 5854, no éxon 10 codificante do gene BRCA2. e resulta em uma mudança na fase de leitura com um códon de parada alternativo previsto (p.S1951WfsTer). Notavelmente, como relatado anteriormente, ambas as alterações c.631G>A e c.7008-2A>T foram detectadas no mesmo paciente.34 A primeira mutação envolve a substituição de adenosina (A) no éxon 7 do BRCA2 por um nucleotídeo contendo guanina (G), resultando em uma mudança de valina para isoleucina no códon 211. A isoleucina é um aminoácido com propriedades muito semelhantes. Essa alteração afeta o splicing normal do mRNA. A segunda variante está localizada em uma região intrônica e resulta em uma substituição dupla de A por timina (T) antes do éxon 13 do gene que codifica o BRCA2. A alteração c.7008-2A>T pode gerar múltiplos transcritos de diferentes comprimentos. Além disso, no grupo de variantes patogênicas (VPs) do BRCA2, 4 das 18 alterações (22,2%) eram intrônicas.
Em seguida, mapeamos as mutações deletérias de BRCA1/2 em domínios funcionais e regiões de ligação a proteínas (Fig. 4). No gene BRCA1, 50% das variantes patogênicas (VPs) estavam localizadas na região de agrupamento de câncer de mama (BCCR), enquanto 22% das mutações estavam localizadas na região de agrupamento de câncer de ovário (OCCR) (Fig. 4A). Nas VPs de BRCA2, 35,7% das variantes estavam localizadas na região BCCR e 42,8% das mutações estavam localizadas na OCCR (Fig. 4B). A seguir, avaliamos a localização das VPs dentro dos domínios das proteínas BRCA1 e BRCA2. Para a proteína BRCA1, encontramos três VPs nos domínios de alça e hélice enrolada, e duas mutações no domínio BRCT (Fig. 4A). Para a proteína BRCA2, 4 VPs foram mapeadas para o domínio de repetição BRC, enquanto 3 alterações intrônicas e 3 exônicas foram detectadas nos domínios de ligação a oligossacarídeos (OB) e torre (tower). (T) domínios ( Figura 4B).
Figura 4. Representação esquemática das proteínas BRCA1 e BRCA2 e localização das variantes patogênicas. Esta figura mostra a distribuição das variantes patogênicas de BRCA1 (A) e BRCA2 (B) em pacientes com câncer de mama. As mutações exônicas são mostradas em azul, enquanto as variantes intrônicas são mostradas em laranja. A altura da barra representa o número de casos. As proteínas BRCA1 e BRCA2 e seus domínios funcionais são apresentados. (A) A proteína BRCA1 contém um domínio de alça (RING) e uma sequência de localização nuclear (NLS), um domínio de hélice enrolada, um domínio de agrupamento SQ/TQ (SCD) e um domínio C-terminal BRCA1 (BRCT). (B) A proteína BRCA2 contém oito repetições BRC, um domínio de ligação ao DNA com um domínio helicoidal (Helical), três dobras de ligação a oligonucleotídeos/oligossacarídeos (OB), um domínio de torre (T) e uma NLS no lado C. As áreas denominadas Região de Agrupamento do Câncer de Mama (BCCR) e Região de Agrupamento do Câncer de Ovário (OCCR) são mostradas em A parte inferior.*Representa mutações que determinam os códons de parada.
Em seguida, investigamos as características clinicopatológicas do câncer de mama que poderiam estar correlacionadas com a presença de variantes patogênicas (VP) nos genes BRCA1/2. Registros clínicos completos estavam disponíveis para 181 pacientes BRCA1/2-negativas (não portadoras) e para todas as portadoras (n = 35). Houve correlação entre a taxa de proliferação tumoral e o grau de diferenciação.
Calculamos a distribuição de Ki-67 com base na mediana da nossa coorte (25%, intervalo <10-90%). Os indivíduos com Ki-67 < 25% foram definidos como “baixo Ki-67”, enquanto os indivíduos com valores ≥ 25% foram considerados “alto Ki-67”. Foram encontradas diferenças significativas de Ki-67 (p<0,01) entre não portadores e portadores de variantes patogênicas do BRCA1 (Fig. 5A).
Figura 5 Correlação do Ki-67 com a distribuição de graus em mulheres com câncer de mama com e sem variantes patogênicas (VPs) de BRCA1 e BRCA2. (A) Diagrama de caixa mostrando os valores medianos de Ki-67 em 181 pacientes com câncer de mama não portadoras versus pacientes com VPs de BRCA1 (18) ou BRCA2 (17). Valores de p abaixo de 0,5 foram considerados estatisticamente significativos. (B) Histograma representando a classificação de pacientes com câncer de mama em grupos de grau histológico (G2 e G3) de acordo com o status de mutação de BRCA1 e BRCA2 (indivíduos WT, portadores de VPs de BRCA1 e BRCA2).
Da mesma forma, examinamos se o grau do tumor se correlacionava com a presença de variantes patogênicas (VP) de BRCA1/2. Como o câncer de mama grau 1 (G1) estava ausente em nossa população, dividimos as pacientes em dois grupos (G2 ou G3). De acordo com os resultados do Ki-67, a análise revelou uma correlação estatisticamente significativa entre o grau do tumor e a mutação BRCA1, com uma proporção maior de tumores G3 em portadoras de BRCA1 em comparação com não portadoras (p<0,005) (Figura 5B).
Os avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA possibilitaram progressos sem precedentes nos testes genéticos BRCA1/2, com implicações cruciais para pacientes com histórico familiar de câncer. Até o momento, aproximadamente 20.000 variantes BRCA1/2 foram identificadas e classificadas de acordo com a Sociedade Americana de Genética Médica³⁵ e o sistema ENIGMA.^35,36 É sabido que o espectro mutacional de BRCA1/2 varia amplamente entre as regiões geográficas.³⁷ Na Itália, a taxa de variantes patogênicas (VP) de BRCA1/2 variou de 8% a 37%, demonstrando ampla variabilidade dentro do país.^38,39 Com uma população de quase 5 milhões de habitantes, a Sicília é a quinta maior região da Itália em termos de população. Embora existam dados sobre a distribuição de BRCA1/2 na Sicília ocidental, não há evidências extensivas na parte oriental da ilha.
Nosso estudo é um dos primeiros relatos sobre a incidência de PV BRCA1/2 em pacientes com câncer de mama no leste da Sicília.28 Concentramos nossa análise no câncer de mama, pois esta é de longe a doença mais comum em nossa coorte.
Ao testar 389 pacientes com câncer de mama, 9% apresentaram variantes patogênicas (VPs) em BRCA1/2, distribuídas igualmente entre BRCA1 e BRCA2. Esses resultados são consistentes com os relatados anteriormente na população italiana.²⁸ Curiosamente, 3% (13/389) da nossa coorte eram do sexo masculino. Essa taxa é maior do que a esperada para câncer de mama masculino (1% de todos os casos de câncer de mama),⁴⁰ refletindo nossa seleção de populações com base no risco de mutação em BRCA1/2. No entanto, nenhum desses homens desenvolveu uma VP em BRCA1/2, portanto, eles foram candidatos a análises moleculares adicionais para descartar a presença de mutações menos comuns, como PALB2, RAD51C e D, entre outras. Variantes de significado incerto foram encontradas em 7% dos indivíduos nos quais uma variante de significado incerto (VUS) em BRCA2 foi evidente. Mesmo esse resultado é consistente com evidências preexistentes.^28,41,42
Ao analisarmos a distribuição dos subtipos moleculares de câncer de mama em mulheres com mutações nos genes BRCA1/2, confirmamos as associações conhecidas entre o câncer de mama triplo-negativo (CMTN) e a variante patogênica (VP) do BRCA1 (58,8%) e entre o câncer de mama luminal B e a VP do BRCA2 (55,6%).¹⁶,⁴³ Os tumores luminais A e HER2+ em portadoras de VP dos genes BRCA1 e BRCA2 são consistentes com os dados da literatura existente.¹⁶,⁴³
Em seguida, focamos no tipo e localização da PV BRCA1/2. Em nossa coorte, a PV BRCA1 mais comum foi c.5035_5039delCTAAT. Embora Incorvaia et al. Embora não tenham descrito essa variante em sua coorte siciliana, outros autores a relataram como uma variante patogênica (VP) germinativa do BRCA1.34 Diversas VPs do BRCA1 foram encontradas em nossa coorte – por exemplo, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA e c.5266dupC – que foram observadas na Sicília.28 Destas, duas mutações fundadoras do BRCA1 (c.181T>G e c.5266dupC) são comumente encontradas em judeus asquenazes da Europa Oriental e Central (Polônia, República Tcheca), eslovenos, austríacos, húngaros, bielorrussos e alemães ), 44,45 e, nos Estados Unidos e na Argentina, foi recentemente definida como uma “variante germinativa recorrente” em pacientes italianos com câncer de mama e de ovário. A variante 34c.514del foi previamente identificada em 8 pacientes com câncer de mama do norte da Sicília, em Palermo e Messina. Curiosamente, mesmo Incorvaia et al. encontraram a variante c.3253dupA em algumas famílias em Catania.28 As variantes patogênicas (VPs) mais representativas do BRCA2 são c.428dup, c.5851_5854delAGTT e a variante intrônica c.8487+1G>A, que foram relatadas com mais detalhes28 em um paciente em Palermo com c.428dup. A VP c.5851_5854delAGTT foi observada em domicílios no noroeste da Sicília, principalmente nas regiões de Trapani e Palermo, enquanto a VP c.5851_5854delAGTT foi observada em domicílios no noroeste da Sicília. A variante 8487+1G>A foi mais comum em indivíduos de Messina, Palermo e Caltanissetta.28 Rebbeck et al. A alteração c.5851_5854delAGTT foi descrita anteriormente na Colômbia.37 Outra variante patogênica (VP) do BRCA2, c.631+1G>A, foi encontrada em pacientes com câncer de mama e de ovário na Sicília (Agrigento, Siracusa e Ragusa).28 Notavelmente, observamos a coexistência de duas variantes do BRCA2 (BRCA2 c.631G>A e c.7008-2A>T) na mesma paciente, que presumimos estarem segregadas em modo cis, como relatado anteriormente.34,46 Essas mutações duplas do BRCA2 são de fato frequentemente observadas na região italiana e demonstraram introduzir códons de parada prematuros, afetando o splicing do RNA mensageiro e causando a falha da proteína BRCA2.47,48
Também mapeamos variantes patogênicas (VPs) de BRCA1 e BRCA2 em regiões putativas de controle ovariano (OCCR) e de controle de mama (BCCR) de domínios proteicos e genes. Essas regiões foram descritas por Rebbeck et al. como áreas de risco para o desenvolvimento de câncer de ovário e de mama, respectivamente.⁴⁹ No entanto, as evidências sobre a associação entre a localização de variantes germinativas e o risco de câncer de mama ou de ovário permanecem controversas.^28,50-52 Em nossa população, as VPs de BRCA1 estavam predominantemente localizadas na região BCCR, enquanto as VPs de BRCA2 estavam predominantemente localizadas na região OCCR. Contudo, não conseguimos encontrar nenhuma associação entre as regiões putativas de OCCR e BCCR e as características do câncer de mama. Isso pode ser devido ao número limitado de pacientes com mutações em BRCA1/2. Do ponto de vista do domínio proteico, as VPs de BRCA1 estão distribuídas ao longo de toda a proteína, e as alterações de BRCA2 são encontradas preferencialmente no domínio de repetição BRC.
Por fim, correlacionamos as características clinicopatológicas do câncer de mama com a variante proliferativa (VP) de BRCA1/2. Devido ao número limitado de pacientes incluídos, encontramos correlação significativa apenas entre o Ki-67 e o grau tumoral. Embora a avaliação e a interpretação do Ki-67 ainda sejam um tanto controversas, é certo que altas taxas de proliferação estão associadas a um risco aumentado de recorrência da doença e menor sobrevida. Até o momento, o ponto de corte para distinguir entre Ki-67 "alto" e "baixo" é de 20%. No entanto, esse limiar não se aplica à nossa população de pacientes com mutação BRCA1/2, que apresenta um valor mediano de Ki-67 de 25%. Essa tendência de altas taxas de Ki-67 pode ser explicada pela prevalência em nossas coortes de câncer de mama luminal B e triplo-negativo (CMTN), nas quais poucos tumores luminais A estavam presentes. Entretanto, algumas evidências parecem sugerir que um ponto de corte de Ki-67 mais alto (25-30%) pode estratificar melhor os pacientes de acordo com seu prognóstico.53,54 A partir dos resultados de nossa análise, uma correlação significativa não é surpreendente. Ocorre entre altas taxas de Ki-67 e baixas taxas de proliferação. Ki-67 e graus e a presença de PV BRCA1. De fato, tumores relacionados ao BRCA1 são típicos de TNBC e exibem características mais agressivas.16,17
Em conclusão, este estudo apresenta um relatório sobre o estado mutacional de BRCA1/2 em uma coorte de câncer de mama do leste da Sicília. No geral, nossos achados são consistentes com evidências preexistentes, tanto em termos de prevalência de mutações quanto de características clinicopatológicas no câncer de mama. Mais estudos em populações maiores de pacientes com câncer de mama com mutações em BRCA1/2, como por meio de análise mutacional multigenômica expandida, são necessários para avaliar a presença de variantes patogênicas distintas e menos frequentes que BRCA1/2. Isso permitirá a identificação e o manejo adequado do número crescente de indivíduos com risco aumentado de câncer devido a mutações genéticas.
Confirmamos que os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a liberação anônima de suas amostras tumorais para fins de pesquisa. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, em conformidade com a Declaração de Helsinque. De acordo com a política do AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, este estudo foi dispensado de revisão ética, uma vez que a análise BRCA1/2 foi realizada de acordo com a prática clínica e todos os pacientes deram seu consentimento livre e esclarecido por escrito. Os pacientes também consentiram com o uso de seus dados para fins de pesquisa.
Agradecemos ao Prof. Paolo Vigneri pela sua assistência no atendimento às pacientes com câncer de mama, conforme solicitado pelo Comitê de Ética.
Federica Martorana declara ter recebido honorários do Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis e Pfizer. Os demais autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Estatísticas Globais do Câncer 2020: GLOBOCAN estima a incidência e a mortalidade de 36 tipos de câncer em 185 países ao redor do mundo. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660