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Com Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Universidade de Catania, Catania, 95123, Itália;2 Centro de Oncologia Experimental e Hematologia, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itália; 3 Oncologia Médica, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itália; 4 Genética Médica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Itália; 5 Medicine Genetics, ASP, Siracusa, 96100, Itália; 6 Departamento de Ciências Biomédicas e Biotecnológicas, Universidade de Catania, Genética Médica, Catania, Itália, 95123; 7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Itália Comunicações: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, email [email protected]; [email protected] Objetivo: Mutações da linha germinativa em BRCA1 e BRCA2 estabeleceram câncer de mama (CM), ovário (CO) e outros associados a um risco de câncer ao longo da vida. O teste para o gene BRCA é fundamental para avaliar o risco individual, bem como para encontrar métodos de prevenção em portadores saudáveis ​​e personalizar tratamentos em pacientes com câncer. A prevalência de alterações em BRCA1 e BRCA2 varia amplamente entre as regiões geográficas e, embora existam dados sobre variantes patogênicas de BRCA em famílias sicilianas, faltam estudos direcionados especificamente a populações no leste da Sicília. O objetivo do nosso estudo foi investigar a incidência e a distribuição de alterações da linha germinativa patogênicas de BRCA em uma coorte de pacientes com CM do leste da Sicília e avaliar sua associação com características específicas de CM usando sequenciamento de última geração. A presença de alterações correlacionou-se com o grau do tumor e o índice de proliferação. RESULTADOS: No geral, 35 pacientes (9%) tinham uma variante patogênica de BRCA, 17 (49%) em BRCA1 e 18 (51%) em BRCA2. As alterações de BRCA1 são prevalentes em triplo-negativo Pacientes com CB, enquanto mutações no BRCA2 são mais comuns em pacientes com CB luminal. Em comparação com não portadores, indivíduos com variantes do BRCA1 apresentaram grau tumoral e índice proliferativo significativamente maiores. Conclusões: Nossas descobertas fornecem uma visão geral do status mutacional do BRCA em pacientes com CB do leste da Sicília e confirmam o papel da análise NGS na identificação de pacientes com CB hereditário. No geral, esses dados são consistentes com evidências anteriores que apoiam a triagem do BRCA para prevenção e tratamento adequados do câncer em portadores da mutação.
O câncer de mama (CM) é a malignidade mais comum no mundo e o câncer mais mortal em mulheres.1 As características biológicas que determinam o prognóstico e o comportamento clínico do CM foram extensivamente estudadas e parcialmente elucidadas ao longo do tempo. De fato, vários marcadores substitutos são usados ​​atualmente para classificar o CM em diferentes subtipos moleculares. Eles são o receptor de estrogênio (ER) e/ou progesterona (PgR), amplificação do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2), índice de proliferação Ki-67 e grau do tumor (G).2 A combinação dessas variáveis ​​identificou as seguintes categorias de CM: 1) Tumores luminais, mostrando expressão de ER e/ou PgR, representaram 75% dos CMs. Esses tumores foram divididos em Luminal A, quando Ki-67 estava abaixo de 20% e HER2 negativo, e Luminal B, quando Ki-67 era igual ou acima de 20% e na presença de amplificação de HER2, independentemente do índice de proliferação; 2) Tumores HER2+ que são ER e PgR negativos, mas apresentam amplificação de HER2. Este grupo representa 10% de todos os tumores de mama; 3) Câncer de mama triplo-negativo (TNBC), que não apresenta expressão de ER e PgR e amplificação de HER2, representa cerca de 15% dos cânceres de mama.2-4
Entre esses subtipos de CB, o grau do tumor e o índice de proliferação representam biomarcadores transversais que estão direta e independentemente associados à agressividade e ao prognóstico do tumor.5,6
Além das características biológicas mencionadas acima, o papel das alterações genéticas herdadas que levam ao desenvolvimento do CM tornou-se cada vez mais importante nos últimos anos.7 Cerca de 1 em cada 10 tumores de mama são herdados devido a alterações na linha germinativa em genes específicos.8 Dois grandes estudos epidemiológicos envolvendo mais de 180.000 mulheres identificaram recentemente um grupo de oito genes (ou seja, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C e RAD51D) responsáveis ​​principalmente pelo CM hereditário. Entre esses genes, BRCA1 e BRCA2 (doravante denominados BRCA1/2) mostraram a correlação mais forte com o desenvolvimento de tumores de mama.9-12 De fato, as mutações da linha germinativa BRCA1/2 aumentam significativamente o risco ao longo da vida de CM, bem como de outras malignidades, incluindo ovário, próstata, pâncreas, colorretal e melanoma. Dos 13 aos 80 anos, a incidência cumulativa de CM é de 72% em mulheres com uma variante patogênica do BRCA1 (PV) e 69% em mulheres com BRCA2 PV.14
Notavelmente, uma publicação recente sugere que o risco de CM depende do tipo de PV. Na verdade, em comparação com variantes truncadas patogênicas, variantes com sentido errado gritantes, especialmente no gene BRCA1, estão associadas a um risco reduzido de CM, especialmente em mulheres mais velhas.15
A presença de PV BRCA1 ou BRCA2 foi associada a diferentes características biológicas e clinicopatológicas.16,17 Os CB associados a BRCA1 tendem a ser clinicamente agressivos, pouco diferenciados e altamente proliferativos. Esses tumores geralmente são triplo-negativos e têm início precoce. Os tumores que ocorrem em pacientes com mutação BRCA2 geralmente exibem graus moderados a bem diferenciados e índices proliferativos variáveis. Esses tumores são mais comuns no lúmen B e geralmente ocorrem em adultos mais velhos.16-18 Notavelmente, as mutações em BRCA1 e BRCA2 aumentam a sensibilidade a tratamentos específicos, incluindo sais de platina e medicamentos direcionados, como inibidores da poli(ADP-ribose) polimerase (PARPi).19,20
Nos últimos anos, a implementação do sequenciamento de nova geração (NGS) na prática clínica permitiu que um número crescente de pacientes com CM fossem submetidos a testes moleculares para síndromes de suscetibilidade ao câncer, incluindo BRCA1/2.21 Ao mesmo tempo, definições baseadas em critérios precisos sobre histórico familiar, características demográficas e clinicopatológicas para melhor identificar indivíduos dignos do teste BRCA1/2.22,23 Nesse contexto, evidências estão se acumulando sobre a triagem de BRCA1/2 em populações específicas, destacando diferenças entre regiões geográficas.24–27 Embora existam relatos sobre a coorte de CM na Sicília ocidental, há menos dados disponíveis sobre a triagem de BRCA1/2 na população da Sicília oriental.28,29
Descrevemos aqui os resultados da triagem da linha germinativa BRCA1/2 em pacientes com câncer de mama do leste da Sicília, correlacionando ainda mais a presença de mutações BRCA1 ou BRCA2 com as principais características clinicopatológicas desses tumores.
Um estudo retrospectivo foi realizado no “Centro de Oncologia Experimental e Hematologia” do Hospital Policlínico Rodolico – San Marco em Catania. De janeiro de 2017 a março de 2021, um total de 455 pacientes com câncer de mama e ovário, melanoma, pâncreas ou próstata foram encaminhados ao nosso laboratório de diagnóstico molecular para teste genético BRCA/2. Este estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque, e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito antes da análise molecular.
As características histológicas e biológicas (ER, PgR, status HER2, Ki-67 e grau) do CB foram avaliadas em biópsias de núcleo ou amostras cirúrgicas, considerando apenas componentes tumorais agressivos. Com base nessas características, os CB foram classificados da seguinte forma: luminal A (ER+ e/ou PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminal B (ER+ e/ou PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminal B-HER2+ (ER e/ou PgR+, HER2+), HER2+ (ER e PgR-, HER2+) ou triplo negativo (ER e PgR-, HER2-).
Antes de avaliar o status da mutação BRCA1 e BRCA2, uma equipe multidisciplinar incluindo um oncologista, um geneticista e um psicólogo conduziu uma consulta de genética tumoral para cada paciente para determinar a presença de BRCA1 e/ou BRCA1. ou indivíduos com alto risco de PV no gene BRCA2. A seleção do paciente foi realizada de acordo com as diretrizes da Sociedade Italiana de Oncologia Médica (AIOM) e recomendações locais da Sicília.30,31 Esses critérios incluem: (i) histórico familiar de variantes patogênicas conhecidas em genes de suscetibilidade (por exemplo, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) homens com CB; (iii) aqueles com CB e OC; (iv) mulheres com CB <36 anos, TNBC <60 anos ou CB bilateral <50 anos; (v) histórico médico pessoal de CB <50 anos e pelo menos um parente de primeiro grau: (a) CB <50 anos; (b) OC não mucinoso e não limítrofe de qualquer idade; (c) CB bilateral; (d) CB masculino; (e) câncer de pâncreas; (f) câncer de próstata; (vi) dois ou mais Histórico pessoal de CB > 50 anos e histórico familiar de CB, CO ou câncer de pâncreas para parentes que são parentes de primeiro grau entre si (incluindo parentes com quem ela é parente de primeiro grau); (vii) Histórico pessoal de CO e pelo menos um parente de primeiro grau: (a) CB < 50 anos; (b) NOC; (c) CB bilateral; (d) CB masculino; (vii) mulher com CO seroso de alto grau.
Uma amostra de sangue periférico de 20 mL foi obtida de cada paciente e coletada em tubos de EDTA (BD Biosciences). O DNA genômico foi isolado de amostras de sangue total de 0,7 mL usando o kit de isolamento QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Itália) de acordo com as instruções do fabricante e passado por um fluorômetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Realize a quantificação. O enriquecimento do alvo e a preparação da biblioteca são realizados pelo Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pronto para ser carregado no Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit para preparação automatizada da biblioteca de acordo com as instruções do fabricante. O kit consiste em dois pools de primers de PCR multiplex que podem ser usados ​​para estudar todos os genes BRCA1 (NM_007300.3) e BRCA2 (NM_000059.3). Resumidamente, 15 µL de cada amostra de DNA diluída (10 ng) foram adicionados a placas com código de barras para preparação da biblioteca e todos os reagentes e consumíveis foram carregados no instrumento Ion Chef™. A preparação automatizada da biblioteca e o agrupamento da biblioteca de amostras com código de barras foram então realizados no instrumento Ion Chef™. O número de bibliotecas preparadas foi então avaliado por um fluorômetro Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, as bibliotecas são combinadas em proporções equimolares em tubos de amostra da biblioteca Ion Chef™ (tubos com código de barras) e carregados no instrumento Ion Chef™. O sequenciamento foi realizado usando um instrumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) usando um chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). A análise de dados foi realizada pelo Amplicon Suite (SmartSeq srl) e pelo software Ion Reporter.
A nomenclatura de todas as variantes seguiu as diretrizes atuais do Consórcio de Variação do Genoma Humano, disponíveis online (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). A significância clínica das variantes BRCA1/2 foi definida usando a classificação do Consórcio Internacional ENIGMA (Rede Baseada em Evidências para Interpretação de Alelos Mutantes da Linha Germinal, https://enigmaconsortium.org/) e consultando diferentes bancos de dados, como ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD e UMD. A classificação inclui cinco categorias de risco distintas: benigno (categoria I), provavelmente benigno (categoria II), variante de significância incerta (VUS, categoria III), provavelmente patogênico (categoria IV) e patogênico (categoria V). O VarSome também analisou o efeito das mutações na estrutura e função das proteínas, uma ferramenta informativa com acesso a 30 bancos de dados.32
Para atribuir significância clínica potencial a cada VUS, os seguintes algoritmos computacionais de predição de proteínas foram usados: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) e Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). As variantes classificadas como classe 1 e 2 foram consideradas do tipo selvagem.
O sequenciamento de Sanger confirmou a presença de cada variante patogênica. Resumidamente, um par de primers específicos foi projetado para cada variante detectada usando as sequências de referência dos genes BRCA1 e BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 e NG_012772.3, NM_000059.3, respectivamente). Portanto, a PCR direcionada foi realizada seguida pelo sequenciamento de Sanger.
Os pacientes que apresentaram resultado negativo para o gene BRCA1/2 foram testados por amplificação de sonda dependente de ligação multiplex (MLPA), de acordo com as instruções do fabricante, para avaliar a presença de grandes rearranjos genômicos (LGR). Resumidamente, amostras de DNA são desnaturadas e até 60 sondas específicas para os genes BRCA1 e BRCA2 são usadas, cada uma detectando uma sequência de DNA específica com aproximadamente 60 nucleotídeos de comprimento. Os produtos de amplificação da sonda, consistindo em um conjunto exclusivo de amplicons de PCR, foram então analisados ​​por eletroforese capilar e pelo software Cofalyser.Net em conjunto com as tabelas Cofalyser específicas para cada lote (www.mrcholland.com).
Variáveis ​​clinicopatológicas selecionadas (grau histológico e índice de proliferação Ki-67%) foram associadas à presença de PV BRCA1/2, calculadas usando o software Prism v. 8.4 usando o teste exato de Fisher, assumindo valor de p < 0,05 como significativo.
Entre janeiro de 2017 e março de 2021, 455 pacientes foram rastreados para mutações germinativas no gene BRCA1/2. Os testes de mutação foram realizados no Centro de Oncologia e Hematologia Experimental do Hospital Policlínico. De acordo com a diretriz siciliana (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, nº 02, 10 de janeiro de 2020), o Rodolico de Catania – San Marco, no total, 389 pacientes foram diagnosticados com câncer de mama, 37 com câncer de ovário, 16 com câncer de pâncreas, 8 com câncer de próstata e 5 com melanoma. A distribuição dos pacientes de acordo com o tipo de câncer e os resultados da análise é mostrada na Figura 1.
A Figura 1 mostra um fluxograma com uma visão geral do estudo. Pacientes com tumores de mama, melanoma, pâncreas, próstata ou ovário foram testados para mutações nos genes BRCA1 e BRCA2.
Abreviações: PVs, variante patogênica; VUS, variante de significado incerto; WT, sequência BRCA1/2 de tipo selvagem.
Nós focamos seletivamente nossos estudos em coortes de câncer de mama. Os pacientes tinham uma idade média de 49 anos (variação de 23 a 89) e eram predominantemente mulheres (n=376, ou 97%).
Desses indivíduos, 64 (17%) tinham mutações BRCA1/2 e eram todos do sexo feminino. Trinta e cinco (9%) tinham PV e 29 (7,5%) tinham VUS. Dezessete (48,6%) das 35 variantes patogênicas ocorreram em BRCA1 e 18 (51,4%) em BRCA2, enquanto 5 VUS ocorreram em BRCA1 (17,2%) e 24 (82,8%) em BRCA2 (Figuras 1 e 2). LGR não estava presente na análise MLPA.
Figura 2. Análise de mutações BRCA1 e BRCA2 em 389 pacientes com câncer de mama. (A) Distribuição de variantes patogênicas (PV) (vermelho), variantes de significância incerta (VUS) (laranja) e WT (azul) em 389 pacientes com câncer de mama; (B) 389 pacientes com câncer de mama Trinta e cinco (9%) tinham variantes patogênicas (PVs) BRCA1/2. Entre elas, 17 (48,6%) eram portadoras de PV BRCA1 (vermelho escuro) e 18 (51,4%) eram portadoras de BRCA2 (vermelho claro); (C) 29 (7,5%) de 389 indivíduos eram portadores de VUS, 5 (17,2%) genes BRCA1 (laranja escuro) e 24 (82,8%) genes BRCA2 (laranja claro).
Abreviações: PVs, variante patogênica; VUS, variante de significado incerto; WT, sequência BRCA1/2 de tipo selvagem.
Em seguida, investigamos a prevalência de subtipos moleculares de CB em pacientes com PV BRCA1/2. A distribuição incluiu 2 (5,7%) luminal A, 15 (42,9%) luminal B, 3 (8,6%) luminal B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ e 13 (37,1%) pacientes com TNBC. Entre os pacientes positivos para BRCA1, 5 (29,4%) tinham CB luminal B, 2 (11,8%) tinham doença HER2+ e 10 (58,8%) tinham TNBC. Os tumores sem mutações BRCA1 eram luminal A ou luminal B-HER2+ (Figura 3). No subgrupo positivo para BRCA2, 10 (55,6%) tumores eram luminal B, 3 (16,7%) eram luminal B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC e 2 (11,1%) eram luminal A (Figura 3). Nenhum tumor HER2+ estava presente neste grupo. Portanto, mutações BRCA1 são prevalentes em pacientes com TNBC, enquanto alterações BRCA2 são predominantes em indivíduos com lúmen B.
Figura 3 Prevalência de subtipos de câncer de mama em pacientes com variantes patogênicas em BRCA1 e BRCA2. Histogramas mostrando a distribuição de PVs BRCA1- (vermelho escuro) e BRCA2- (vermelho claro) entre subtipos moleculares de pacientes com câncer de mama. Os números relatados em cada caixa representam a porcentagem de pacientes com PV BRCA1 e BRCA2 para cada subtipo de câncer de mama.
Abreviações: PVs, variante patogênica; HER2+, receptor 2 positivo do fator de crescimento epidérmico humano; TNBC, câncer de mama triplo-negativo.
Subsequentemente, avaliamos o tipo e a localização genética dos PVs BRCA1 e BRCA2. No PV BRCA1, observamos 7 variantes de nucleotídeo único (SNVs), 6 deleções, 3 duplicações e 1 inserção. Apenas uma mutação (c.5522delG) representa uma nova descoberta. O PV BRCA1 mais comum detectado em ambos os indivíduos foi c.5035_5039delCTAAT. Essa alteração envolve uma deleção de cinco nucleotídeos (CTAAT) no exon 15 do BRCA1, resultando na substituição do aminoácido leucina por tirosina no códon 1679 e, devido a uma mudança no quadro de tradução com um códon de parada alternativo previsto, leva ao truncamento prematuro da proteína. Todas as outras alterações são detectadas em apenas um caso. Notavelmente, um dos PVs relatados estava localizado na região de consenso do sítio de splicing (c.4357+1G>T) (Tabela 1).
Em relação ao PV do BRCA2, observamos 6 deleções, 6 SNVs e 2 duplicações. Nenhuma das alterações encontradas é nova. Três mutações ocorreram novamente em nossa população, c.428dup e c.8487+1G>A observadas em 3 indivíduos, seguidas por c.5851_5854delAGTT recuperada em dois casos. A alteração c.428dup envolve uma repetição de C no exon 5 do BRCA2, previsto para codificar uma proteína truncada e não funcional. A mutação c.8487+1G>A ocorre na região intrônica do íntron 19 do BRCA2 (± 1,2) e afeta a sequência de consenso de splicing, resultando em splicing alterado, resultando em proteína anormal ou ausente. A variante patogênica c.5851_5854delAGTT é devida a uma deleção de 4 nucleotídeos das posições de nucleotídeos 5851 a 5854 no exon 10 de codificação do Gene BRCA2 e resulta em uma mudança de quadro translacional com um códon de parada alternativo previsto (p.S1951WfsTer). Notavelmente, como relatado anteriormente, ambas as alterações c.631G>A e c.7008-2A>T foram detectadas no mesmo paciente.34 A primeira mutação envolve a substituição de adenosina (A) no exon 7 do BRCA2 por um nucleotídeo contendo guanina (G), resultando em uma mudança de valina para isoleucina no códon 211, isoleucina O aminoácido é um aminoácido com propriedades muito semelhantes. Essa mudança afeta o splicing normal do mRNA. A segunda variante está localizada em uma região intrônica e resulta em uma substituição dupla de A para timina (T) antes do exon 13 do gene que codifica o BRCA2. A mudança c.7008-2A>T pode gerar múltiplas transcrições de diferentes comprimentos. Além disso, no grupo de PVs do BRCA2, 4 de 18 mudanças (22,2%) eram intrônicas.
Em seguida, mapeamos mutações deletérias do BRCA1/2 em domínios funcionais e regiões de ligação de proteínas (Fig. 4). No gene BRCA1, 50% dos PVs estavam localizados na região do cluster do câncer de mama (BCCR), enquanto 22% das mutações estavam localizadas na região do cluster do câncer de ovário (OCCR) (Fig. 4A). No PV BRCA2, 35,7% das variantes estavam localizadas na região BCCR e 42,8% das mutações estavam localizadas no OCCR (Fig. 4B). Em seguida, avaliamos a localização do PV dentro dos domínios das proteínas BRCA1 e BRCA2. Para a proteína BRCA1, encontramos três PVs nos domínios loop e coiled coil, e duas mutações no domínio BRCT (Fig. 4A). Para a proteína BRCA2, 4 PVs mapeadas para o domínio de repetição BRC, enquanto 3 alterações intrônicas e 3 exônicas foram detectadas na ligação de oligo/oligossacarídeo (OB). e domínios de torre (T) ( Figura 4B).
Figura 4 Representação esquemática das proteínas BRCA1 e BRCA2 e localização de variantes patogênicas. Esta figura mostra a distribuição das variantes patogênicas de BRCA1 (A) e BRCA2 (B) em pacientes com câncer de mama. Mutações exônicas são mostradas em azul, enquanto variantes intrônicas são mostradas em laranja. A altura da barra representa o número de casos. As proteínas BRCA1 e BRCA2 e seus domínios funcionais são relatados. (A) A proteína BRCA1 contém um domínio de alça (RING) e uma sequência de localização nuclear (NLS), um domínio coiled-coil, um domínio de cluster SQ/TQ (SCD) e um domínio C-terminal BRCA1 (BRCT). (B) A proteína BRCA2 contém oito repetições BRC, um domínio de ligação a DNA com um domínio helicoidal (Helical), três dobras de ligação a oligonucleotídeos/oligossacarídeos (OB), um domínio de torre (T) e um NLS no lado C. Áreas chamadas de Região do Cluster do Câncer de Mama (BCCR) e Região do Cluster do Câncer de Ovário (OCCR) são mostrados na parte inferior.*Representa mutações que determinam códons de parada.
Em seguida, investigamos as características clinicopatológicas do CB que poderiam estar correlacionadas com a presença de PV BRCA1/2. Registros clínicos completos estavam disponíveis para 181 pacientes BRCA1/2 negativos (não portadores) e todos os portadores (n = 35). Houve uma correlação entre a taxa de proliferação do tumor e o grau.
Calculamos a distribuição de Ki-67 com base na mediana de nossa coorte (25%, intervalo <10-90%). Indivíduos com Ki-67 < 25% foram definidos como “baixo Ki-67”, enquanto indivíduos com valores ≥ 25% foram considerados “alto Ki-67”. Diferenças significativas de Ki-67 (p<0,01) foram encontradas entre não portadores e portadores de PV BRCA1 (Fig. 5A).
Figura 5 Correlação de Ki-67 com distribuição de grau em mulheres com câncer de mama com e sem PVs BRCA1 e BRCA2.(A) Boxplot mostrando valores medianos de Ki-67 em 181 pacientes com CB não portadoras versus pacientes com PVs BRCA1 (18) ou BRCA2 (17). Valores de p abaixo de 0,5 foram considerados estatisticamente significativos.(B) Histograma representando a atribuição de pacientes com câncer de CB em grupos de grau histológico (G2 e G3) de acordo com o status de mutação BRCA1 e BRCA2 (sujeitos WT, portadores de PVs BRCA1 e BRCA2).
Da mesma forma, examinamos se o grau do tumor estava correlacionado com a presença de BRCA1/2 PV. Como o BC G1 estava ausente em nossa população, dividimos os pacientes em dois grupos (G2 ou G3). De acordo com os resultados do Ki-67, a análise revelou uma correlação estatisticamente significativa entre o grau do tumor e a mutação BRCA1, com uma proporção maior de tumores G3 em portadores de BRCA1 em comparação aos não portadores (p < 0,005) (Figura 5B).
Avanços na tecnologia de sequenciamento de DNA permitiram avanços sem precedentes nos testes genéticos BRCA1/2, com implicações cruciais para pacientes com histórico familiar de câncer. Até o momento, aproximadamente 20.000 variantes BRCA1/2 foram identificadas e classificadas de acordo com a Sociedade Americana de Genética Médica 35 e o sistema ENIGMA.35,36 É bem conhecido que o espectro mutacional BRCA1/2 varia amplamente entre regiões geográficas.37 Na Itália, a taxa de PVs BRCA1/2 variou de 8% a 37%, mostrando ampla variabilidade intra-país.38,39 Com uma população de quase 5 milhões, a Sicília é a quinta maior região da Itália em termos de número de habitantes. Embora existam dados sobre a distribuição de BRCA1/2 no oeste da Sicília, não há evidências extensas na parte leste da ilha.
Nosso estudo é um dos primeiros relatos sobre a incidência de PV BRCA1/2 em pacientes com CB no leste da Sicília.28 Focamos nossa análise no CB, pois esta é de longe a doença mais comum em nossa coorte.
Ao testar 389 pacientes com câncer de mama, 9% eram portadores de PVs BRCA1/2, distribuídos uniformemente entre BRCA1 e BRCA2. Esses resultados são consistentes com aqueles relatados anteriormente na população italiana.28 Curiosamente, 3% (13/389) de nossa coorte eram homens. Essa taxa é maior do que a esperada para câncer de mama masculino (1% de todos os cânceres de mama),40 refletindo nossa seleção de populações com base no risco de mutação BRCA1/2. No entanto, nenhum desses homens desenvolveu uma PV BRCA1/2, então eles eram candidatos para análise molecular adicional para descartar a presença de mutações menos comuns, como PALB2, RAD51C e D, entre outras. Variantes de significância incerta foram recuperadas em 7% dos indivíduos nos quais o VUS BRCA2 era evidente. Mesmo esse resultado é consistente com evidências preexistentes.28,41,42
Quando analisamos a distribuição dos subtipos moleculares de CB em mulheres mutantes BRCA1/2, confirmamos associações conhecidas entre CBTN e PV BRCA1 (58,8%) e entre CB B luminal e PV BRCA2 (55,6%).16,43 Os tumores luminal A e HER2+ em portadoras de PV BRCA1 e BRCA2 são consistentes com dados da literatura existente.16,43
Em seguida, focamos no tipo e na localização do PV BRCA1/2. Em nossa coorte, o PV BRCA1 mais comum foi c.5035_5039delCTAAT. Embora Incorvaia et al. não descreveram essa variante em sua coorte siciliana, outros autores a relataram como uma PV BRCA1 da linha germinativa.34 Vários PVs BRCA1 foram encontrados em nossa coorte – por exemplo, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA e c.5266dupC – que foram observados na Sicília.28 Destas, duas mutações fundadoras do BRCA1 (c.181T>G e c.5266dupC) são comumente encontradas em judeus asquenazes da Europa Oriental e Central (Polônia, Tcheca), eslovenos, austríacos, húngaros, bielorrussos e alemães), 44,45 e, nos Estados Unidos e na Argentina, foi recentemente definida como uma “variante da linha germinativa recorrente” em pacientes italianos com CB e CO. A variante 34c.514del foi previamente identificada em 8 pacientes com câncer de mama do norte da Sicília em Palermo e Messina. Curiosamente, até mesmo Incorvaia et al. encontraram a variante c.3253dupA em algumas famílias em Catania.28 Os PVs BRCA2 mais representativos são c.428dup, c.5851_5854delAGTT e a variante intrônica c.8487+1G>A, que foram relatados com mais detalhes 28 em um paciente em Palermo com c.428dup, o PV c.5851_5854delAGTT foi observado em domicílios no noroeste da Sicília, principalmente nas regiões de Trapani e Palermo, enquanto o PV c.5851_5854delAGTT foi observado em domicílios no noroeste da Sicília. A variante 8487+1G>A foi mais comum em indivíduos de Messina, Palermo e Caltanissetta.28 Rebbeck et al. descreveu anteriormente a alteração c.5851_5854delAGTT na Colômbia.37 Outra PV BRCA2, c.631+1G>A, foi encontrada em pacientes com CB e OC da Sicília (Agrigento, Siracusa e Ragusa).28 Notavelmente, observamos a coexistência de duas variantes BRCA2 (BRCA2 c.631G>A e c.7008-2A>T) no mesmo paciente, que assumimos como segregadas no modo cis, conforme relatado anteriormente.34,46 Essas mutações duplas BRCA2 são de fato frequentemente observadas na região italiana e foram encontradas para introduzir códons de parada prematuros, afetando o splicing do RNA mensageiro e causando a falha da proteína BRCA2.47,48
Também mapeamos PVs BRCA1 e BRCA2 em regiões putativas de OCCR e BCCR de domínios de proteínas e genes. Essas regiões foram descritas por Rebbeck et al. como áreas de risco para o desenvolvimento de câncer de ovário e de mama, respectivamente.49 No entanto, as evidências sobre a associação entre a localização de variantes da linha germinativa e o risco de câncer de mama ou de ovário permanecem controversas.28,50-52 Em nossa população, PVs BRCA1 estavam predominantemente localizados na região BCCR, enquanto PVs BRCA2 estavam predominantemente localizados na região OCCR. No entanto, não conseguimos encontrar nenhuma associação entre regiões putativas de OCCR e BCCR e características do BC. Isso pode ser devido ao número limitado de pacientes com mutações BRCA1/2. De uma perspectiva de domínio de proteína, PVs BRCA1 são distribuídas ao longo de toda a proteína, e alterações BRCA2 são encontradas preferencialmente no domínio de repetição BRC.
Finalmente, correlacionamos as características clinicopatológicas do CB com o PV BRCA1/2. Devido ao número limitado de pacientes incluídos, encontramos apenas uma correlação significativa entre Ki-67 e o grau do tumor. Embora a avaliação e a interpretação do Ki-67 permaneçam um tanto controversas, é certo que altas taxas proliferativas estão associadas a um risco aumentado de recorrência da doença e diminuição da sobrevida. Até o momento, o ponto de corte para distinguir entre Ki-67 “alto” e “baixo” é de 20%. No entanto, esse limite não se aplica à nossa população de pacientes com mutação BRCA1/2, que tem um valor mediano de Ki-67 de 25%. Essa tendência em altas taxas de Ki-67 pode ser explicada pela prevalência em nossas coortes luminal B e TNBC, das quais poucos tumores luminais A estavam presentes. No entanto, algumas evidências parecem sugerir que um ponto de corte mais alto de Ki-67 (25–30%) pode estratificar melhor os pacientes de acordo com seu prognóstico.53,54 A partir dos resultados de nossa análise, uma correlação significativa não é surpreendente. Ocorre entre altos níveis de Ki-67 e a presença de BRCA1 PV. Na verdade, os tumores relacionados ao BRCA1 são típicos do TNBC e apresentam características mais agressivas.16,17
Em conclusão, este estudo fornece um relatório sobre o status mutacional do BRCA1/2 em uma coorte de CB do leste da Sicília. No geral, nossas descobertas são consistentes com evidências preexistentes, tanto em termos de prevalência de mutação quanto em características clinicopatológicas no CB. Mais estudos em populações maiores de pacientes com CB mutante BRCA1/2, como o uso de análise mutacional expandida multigenômica, são necessários para avaliar a presença de PVs que são distintos e menos frequentes do que BRCA1/2. Isso permitirá a identificação e o tratamento adequado do número crescente de indivíduos com risco aumentado de câncer devido a mutações genéticas.
Confirmamos que os pacientes assinaram o consentimento informado para liberar suas amostras de tumor anonimamente para fins de pesquisa. Todos os pacientes assinaram o consentimento informado por escrito, de acordo com a Declaração de Helsinque. De acordo com a política da AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco”, este estudo foi isento de revisão ética porque a análise BRCA1/2 foi realizada de acordo com a prática clínica e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. Os pacientes também consentem com o uso de seus dados para fins de pesquisa.
Agradecemos ao Prof. Paolo Vigneri por sua assistência no tratamento de pacientes com câncer de mama, conforme solicitado pelo Comitê de Ética.
Federica Martorana informa honorários do Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. Os outros autores declaram não haver conflitos de interesse neste trabalho.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Estatísticas globais do câncer 2020: GLOBOCAN estima a incidência e a mortalidade de 36 tipos de câncer em 185 países ao redor do mundo. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-249. doi: 10.3322/caac.21660