Šiuo metu jūsų naršyklėje išjungtas „Javascript“. Kai kurios šios svetainės funkcijos neveiks, kai „Javascript“ bus išjungtas.
Užsiregistruokite nurodydami savo konkrečius duomenis ir konkretų jus dominantį vaistą, ir mes sulyginsime jūsų pateiktą informaciją su straipsniais mūsų plačioje duomenų bazėje ir nedelsdami atsiųsime jums PDF kopiją el. paštu.
Naudoja: Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7, 2 Livia Manzperi University of C1ical, 2 Katanija, Katanija, 95123, Italija;2 Eksperimentinės onkologijos ir hematologijos centras, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italija; 3 Medicinos onkologija, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco“, Katanija, 95123, Italija; 4 Medicininė genetika, ARNAS Garibaldi, Katanija, 95123, Italija; 5 Medicine Genetics, ASP, Sirakūzai, 96100, Italija; 6 Katanijos universiteto Biomedicinos ir biotechnologijos mokslų katedra, Medicininė genetika, Katanija, Italija, 95123; 7 Oasi tyrimų institutas – IRCCS, Troina, 94018, Italija Ryšiai su visuomene: Stefania Stella, tel. +39 095 378 1946, el. paštas [email protected]; [email protected] Tikslas: BRCA1 ir BRCA2 geno gemalinių linijų mutacijos ir nustatytas krūties vėžys (BC), kiaušidžių vėžys (OC) ir kiti susiję su vėžio rizika visą gyvenimą. BRCA geno tyrimai yra labai svarbūs vertinant individualią riziką, taip pat ieškant prevencijos metodų sveikiems nešiotojams ir pritaikant gydymą vėžiu sergantiems pacientams. BRCA1 ir BRCA2 pakitimų paplitimas skirtinguose geografiniuose regionuose labai skiriasi, ir nors yra duomenų apie BRCA patogeninius variantus Sicilijos šeimose, trūksta tyrimų, specialiai skirtų populiacijoms rytų Sicilijoje. Mūsų tyrimo tikslas buvo ištirti BRCA patogeninių gemalinių linijų pakitimų dažnį ir pasiskirstymą BC pacientų iš rytų Sicilijos kohortoje ir įvertinti jų ryšį su specifiniais BC požymiais naudojant naujos kartos sekvenavimą. Pakitimų buvimas koreliavo su naviko laipsniu ir proliferacijos indeksu. REZULTATAI: Iš viso 35 pacientai (9 %) turėjo BRCA patogeninį variantą, 17 (49 %) – BRCA1 ir 18 (51 %) – BRCA2. BRCA1 pakitimai dažni trigubai neigiamiems BC pacientams, o BRCA2 mutacijos dažnesnės luminalinio BC pacientams. Palyginti su nenešiotojais, tiriamieji, turintys BRCA1 variantus, turėjo reikšmingą... didesnis naviko laipsnis ir proliferacinis indeksas. Išvados: Mūsų išvados pateikia BRCA mutacijos būsenos apžvalgą BC pacientams iš rytų Sicilijos ir patvirtina NGS analizės vaidmenį nustatant pacientus, sergančius paveldima BC. Apskritai šie duomenys atitinka ankstesnius įrodymus, patvirtinančius BRCA patikrą tinkamam vėžio profilaktikai ir gydymui mutacijų nešiotojams.
Krūties vėžys (KK) yra dažniausias piktybinis navikas pasaulyje ir mirtingiausias vėžys moterims.1 Biologiniai požymiai, lemiantys KK prognozę ir klinikinį elgesį, buvo nuodugniai ištirti ir iš dalies išaiškinti laikui bėgant. Iš tiesų, šiuo metu KK klasifikavimui į skirtingus molekulinius potipius naudojami keli surogatiniai žymenys. Tai estrogenų (ER) ir (arba) progesterono receptorius (PgR), žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus 2 (HER2) amplifikacija, proliferacijos indeksas Ki-67 ir naviko laipsnis (G).2 Šių kintamųjų derinys nustatė šias KK kategorijas: 1) Luminaliniai navikai, rodantys ER ir (arba) PgR ekspresiją, sudarė 75 % KK. Šie navikai buvo toliau suskirstyti į luminalinį A, kai Ki-67 buvo mažesnis nei 20 % ir HER2 neigiamas, ir luminalinį B, kai Ki-67 buvo lygus arba didesnis nei 20 % ir esant HER2 amplifikacijai, neatsižvelgiant į proliferacijos indeksą; 2) HER2+ navikai, kurie yra ER ir PgR neigiami, bet rodo HER2 amplifikaciją. Ši grupė sudaro 10 % visų krūties navikų; 3) Trigubai neigiamas krūties vėžys (TNBC), kuriam nebūdinga ER ir PgR raiška bei HER2 amplifikacija, sudaro apie 15 % krūties vėžio atvejų.2–4
Tarp šių BC potipių naviko laipsnis ir proliferacijos indeksas yra skerspjūvio biožymenys, kurie yra tiesiogiai ir nepriklausomai susiję su naviko agresyvumu ir prognoze.5,6
Be minėtų biologinių ypatybių, pastaraisiais metais vis svarbesnis tapo paveldimų genetinių pakitimų, lemiančių krūties vėžio (BC) vystymąsi, vaidmuo.7 Maždaug 1 iš 10 krūties navikų yra paveldimas dėl gemalo linijos pakitimų specifiniuose genuose.8 Dviejuose dideliuose epidemiologiniuose tyrimuose, kuriuose dalyvavo daugiau nei 180 000 moterų, neseniai buvo nustatyta aštuonių genų grupė (t. y. ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C ir RAD51D), daugiausia atsakinga už paveldimą BC. Tarp šių genų BRCA1 ir BRCA2 (toliau – BRCA1/2) parodė stipriausią koreliaciją su krūties navikų išsivystymu.9–12 Iš tiesų, gemalo linijos BRCA1/2 mutacijos reikšmingai padidina BC, taip pat kitų piktybinių navikų, įskaitant kiaušidžių, prostatos, kasos, kolorektalinius ir melanomą, riziką per gyvenimą. Nuo 13 iki 80 metų amžiaus bendras BC paplitimas yra 72 % moterų, turinčių patogeninį BRCA1 variantą (PV), ir 69 % moterų, turinčių BRCA2 PV.14
Pažymėtina, kad neseniai paskelbtoje publikacijoje teigiama, jog krūties vėžio rizika priklauso nuo PV tipo. Iš tiesų, palyginti su patogeniniais sutrumpėjusiais variantais, akivaizdūs misensiniai variantai, ypač BRCA1 gene, yra susiję su sumažėjusia krūties vėžio rizika, ypač vyresnio amžiaus moterims.15
BRCA1 arba BRCA2 PV buvimas buvo susijęs su skirtingais biologiniais ir klinikopatologiniais požymiais.16,17 Su BRCA1 susiję krūties vėžys paprastai būna kliniškai agresyvūs, silpnai diferencijuoti ir labai proliferuojantys. Šie navikai paprastai būna trigubai neigiami ir prasideda anksti. Navikai, atsirandantys pacientams su BRCA2 mutacija, paprastai pasižymi vidutinio arba gerai diferencijuotu laipsniu ir kintamais proliferacijos rodikliais. Šie navikai dažniau pasitaiko B spindyje ir dažniausiai pasireiškia vyresnio amžiaus suaugusiesiems.16–18 Pažymėtina, kad BRCA1 ir BRCA2 mutacijos padidina jautrumą specifiniam gydymui, įskaitant platinos druskas ir tikslinius vaistus, tokius kaip poli(ADP-ribozės) polimerazės inhibitoriai (PARPi).19,20
Per pastaruosius kelerius metus klinikinėje praktikoje įdiegus naujos kartos sekvenavimą (NGS), vis daugiau BC pacientų gali atlikti molekulinius vėžio jautrumo sindromų, įskaitant BRCA1/2, tyrimus.21 Tuo pačiu metu apibrėžimai, pagrįsti tiksliais kriterijais, susijusiais su šeimos istorija, demografinėmis ir klinikopatologinėmis charakteristikomis, siekiant geriau nustatyti asmenis, vertus BRCA1/2 tyrimo.22,23 Atsižvelgiant į tai, kaupiasi įrodymai apie BRCA1/2 patikrą konkrečiose populiacijose, pabrėžiant skirtumus tarp geografinių regionų.24–27 Nors yra pranešimų apie BC kohortą vakarų Sicilijoje, yra mažiau duomenų apie BRCA1/2 patikrą rytų Sicilijos populiacijoje.28,29
Čia aprašome gemalinės BRCA1/2 patikros rezultatus, atliktus su krūties vėžiu sergančiais pacientais iš rytų Sicilijos, toliau koreliuodami BRCA1 arba BRCA2 mutacijų buvimą su pagrindiniais šių navikų klinikiniais ir patologiniais požymiais.
Retrospektyvinis tyrimas buvo atliktas „Eksperimentinės onkologijos ir hematologijos centre“ Rodolico – San Marco poliklinikoje Katanijoje. Nuo 2017 m. sausio mėn. iki 2021 m. kovo mėn. į mūsų molekulinės diagnostikos laboratoriją BRCA/2 genetiniams tyrimams atlikti buvo nukreiptos iš viso 455 pacientės, sergančios krūties ir kiaušidžių, melanomos, kasos ar prostatos vėžiu. Šis tyrimas buvo atliktas laikantis Helsinkio deklaracijos, ir visi dalyviai prieš molekulinę analizę pateikė raštišką informuotą sutikimą.
BK histologinės ir biologinės charakteristikos (ER, PgR, HER2 statusas, Ki-67 ir laipsnis) buvo įvertintos pagrindinės biopsijos arba chirurginių mėginių analizėje, atsižvelgiant tik į agresyvius naviko komponentus. Remiantis šiomis charakteristikomis, BK buvo klasifikuojamos taip: luminalinis A (ER+ ir (arba) PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminalinis B (ER+ ir (arba) PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminalinis B-HER2+ (ER ir (arba) PgR+, HER2+), HER2+ (ER ir PgR-, HER2+) arba trigubai neigiamas (ER ir PgR-, HER2-).
Prieš vertinant BRCA1 ir BRCA2 mutacijų būseną, daugiadisciplininė komanda, kurią sudarė onkologas, genetikas ir psichologas, kiekvienam pacientui atliko naviko genetikos konsultaciją, kad nustatytų BRCA1 ir (arba) BRCA1 buvimą arba asmenis, kuriems yra didelė PV rizika BRCA2 gene. Pacientų atranka buvo atlikta pagal Italijos medicininės onkologijos draugijos (AIOM) gaires ir vietines Sicilijos rekomendacijas.30,31 Šie kriterijai apima: (i) žinomų patogeninių jautrumo genų variantų šeimos anamnezėje (pvz., BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) vyrai, sergantys krūties vėžiu; (iii) sergantys krūties vėžiu ir vėžiu; (iv) moterys, sergančios krūties vėžiu <36 metų, TNBC <60 metų arba abipusiu krūties vėžiu <50 metų; (v) asmeninė krūties vėžio anamnezė <50 metų ir bent vienas pirmos eilės giminaitis: (a) krūties vėžys <50 metų; (b) bet kokio amžiaus nemucinozinis ir ne ribinis krūties vėžys; (c) abipusis krūties vėžys; (d) vyrų krūties vėžys; (e) kasos vėžys; (f) prostatos vėžys; (vi) du ar daugiau asmenų, sergančių krūties vėžiu (BC) ilgiau nei 50 metų, ir šeimos anamnezėje BC, OC arba kasos vėžys giminaičiams, kurie yra vienas kito pirmos eilės giminaičiai (įskaitant giminaičius, su kuriais ji yra pirmos eilės giminaitė); (vii) asmuo, sergantis OC, ir bent vienas pirmos eilės giminaitis: (a) BC < 50 metų; (b) NOC; (c) abipusis BC; (d) vyro BC; (vii) moters, sergančios aukštos diferenciacijos serozine OC.
Iš kiekvieno paciento buvo paimtas 20 ml periferinio kraujo mėginys ir surinktas į EDTA mėgintuvėlius („BD Biosciences“). Genominė DNR buvo išskirta iš 0,7 ml viso kraujo mėginių, naudojant „QIAsymphony DSP DNA Midi“ izoliacijos rinkinį („QIAGEN“, Hildenas, Italija) pagal gamintojo instrukcijas, ir perleista per „Qubit® 3.0“ fluorometrą („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV). Atliktas kiekybinis įvertinimas. Tikslinis sodrinimas ir bibliotekos paruošimas atliekamas naudojant „Oncomine™ BRCA Research Assay Chef“, paruoštą įkelti į „Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit“ automatiniam bibliotekos paruošimui pagal gamintojo instrukcijas. Rinkinį sudaro du multipleksiniai PGR pradmenų telkiniai, kuriuos galima naudoti visiems BRCA1 (NM_007300.3) ir BRCA2 (NM_000059.3) genams tirti. Trumpai tariant, 15 µL kiekvienos praskiestos mėginio DNR (10 ng) buvo įpilta į brūkšniniais kodais pažymėtas plokšteles bibliotekos paruošimui, o visi reagentai ir eksploatacinės medžiagos buvo įkeltos į „Ion Chef™“ prietaisą. Tada automatinis bibliotekos paruošimas ir brūkšniniais kodais pažymėtų mėginių bibliotekos sujungimas buvo atliktas naudojant „Ion Chef™“ prietaisą. Paruoštų bibliotekų skaičius buvo įvertintas naudojant „Qubit® 3.0“ fluorometrą („Thermo Fisher Scientific“, Waltham, MA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Galiausiai bibliotekos sujungiamos ekvimoliniais santykiais „Ion Chef™“ bibliotekos mėginių mėgintuvėliuose (brūkšniniais kodais pažymėtuose mėgintuvėliuose) ir įkeliamos į „Ion Chef™“. prietaisas. Sekvenavimas buvo atliktas naudojant „Ion Torrent S5“ („Thermo Fisher Scientific“) prietaisą („Thermo Fisher Scientific“) su „Ion 510“ lustu („Thermo Fisher Scientific“). Duomenų analizė atlikta naudojant „Amplicon Suite“ („SmartSeq srl“) ir „Ion Reporter“ programinę įrangą.
Visa variantų nomenklatūra atitiko dabartines Žmogaus genomo variacijos konsorciumo gaires, kurias galima rasti internete (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). BRCA1/2 variantų klinikinė reikšmė buvo apibrėžta naudojant Tarptautinio konsorciumo ENIGMA (Įrodymais pagrįstas tinklas gemalinių ląstelių mutantų alelių interpretavimui, https://enigmaconsortium.org/) klasifikaciją ir konsultuojantis su skirtingomis duomenų bazėmis, tokiomis kaip ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD ir UMD. Klasifikacija apima penkias skirtingas rizikos kategorijas: gerybinis (I kategorija), tikėtinas gerybinis (II kategorija), neaiškios reikšmės variantas (VUS, III kategorija), tikėtinas patogeninis (IV kategorija) ir patogeninis (V kategorija). „VarSome“ taip pat analizavo mutacijų poveikį baltymų struktūrai ir funkcijai – tai informatyvus įrankis, turintis prieigą prie 30 duomenų bazių.32
Norint priskirti kiekvienam VUS potencialią klinikinę reikšmę, buvo naudojami šie skaičiavimo baltymų prognozavimo algoritmai: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ir Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). 1 ir 2 klasei priskirti variantai buvo laikomi laukinio tipo.
Sanger sekvenavimas patvirtino kiekvieno patogeninio varianto buvimą. Trumpai tariant, kiekvienam aptiktam variantui buvo sukurta specifinių pradmenų pora, naudojant BRCA1 ir BRCA2 genų etalonines sekas (atitinkamai NG_005905.2, NM_007294.3 ir NG_012772.3, NM_000059.3). Todėl buvo atlikta tikslinė PGR, po kurios sekė Sanger sekvenavimas.
Pacientams, kurių BRCA1/2 geno tyrimo rezultatas buvo neigiamas, buvo atliktas daugialypės ligacijos zondo amplifikacijos (MLPA) tyrimas pagal gamintojo instrukcijas, siekiant įvertinti didelių genominių pertvarkymų (LGR) buvimą. Trumpai tariant, DNR mėginiai denatūruojami ir naudojama iki 60 BRCA1 ir BRCA2 genui specifinių zondų, kurių kiekvienas aptinka specifinę maždaug 60 nukleotidų ilgio DNR seką. Zondo amplifikacijos produktai, sudaryti iš unikalaus PGR amplikonų rinkinio, buvo analizuojami kapiliarine elektroforeze ir naudojant „Cofalyser.Net“ programinę įrangą kartu su atitinkamomis partijoms skirtomis „Cofalyser“ lentelėmis (www.mrcholland.com).
Pasirinkti klinikopatologiniai kintamieji (histologinis laipsnis ir Ki-67 % proliferacijos indeksas) buvo susiję su BRCA1/2 PV buvimu, apskaičiuotu naudojant „Prism“ programinę įrangą, 8.4 versiją, naudojant Fišerio tikslųjį testą, darant prielaidą, kad p reikšmė < 0,05 yra reikšminga.
Nuo 2017 m. sausio mėn. iki 2021 m. kovo mėn. 455 pacientams buvo atliktas gemalinės BRCA1/2 mutacijų tyrimas. Mutacijų tyrimai buvo atlikti Poliklinikos ligoninės Eksperimentinės onkologijos ir hematologijos centre. Remiantis Sicilijos gairėmis (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 sausio 2020), Katanijos-San Marko Rodoliko ligoninėje iš viso buvo 389 pacientai: 37 sirgo krūties vėžiu, 37 kiaušidžių vėžiu, 16 – kasos vėžiu, 8 – prostatos vėžiu ir 5 – melanoma. Pacientų pasiskirstymas pagal vėžio tipą ir analizės rezultatai pateikti 1 paveiksle.
1 paveiksle pateikta tyrimo apžvalgos schema. Pacientams, sergantiems krūties, melanomos, kasos, prostatos ar kiaušidžių navikais, buvo atliekami BRCA1 ir BRCA2 genų mutacijų tyrimai.
Santrumpos: PV – patogeninis variantas; VUS – neaiškios reikšmės variantas; WT – laukinio tipo BRCA1/2 seka.
Savo tyrimus selektyviai sutelkėme į krūties vėžio kohortas. Pacienčių amžiaus mediana buvo 49 metai (nuo 23 iki 89 metų) ir daugiausia buvo moterys (n = 376 arba 97 %).
Iš šių tiriamųjų 64 (17 %) turėjo BRCA1/2 mutacijas ir visos buvo moterys. Trisdešimt penki (9 %) turėjo PV, o 29 (7,5 %) – VUS. Septyniolika (48,6 %) iš 35 patogeninių variantų atsirado BRCA1 ir 18 (51,4 %) BRCA2, o 5 VUS atsirado BRCA1 (17,2 %) ir 24 (82,8 %) BRCA2 (1 ir 2 pav.). MLPA analizėje LGR nebuvo aptikta.
2 pav. BRCA1 ir BRCA2 mutacijų analizė 389 krūties vėžiu sergančioms pacientėms. (A) Patogeninių variantų (PV) (raudona), neaiškios reikšmės variantų (VUS) (oranžinė) ir WT (mėlyna) pasiskirstymas 389 krūties vėžiu sergančioms pacientėms; (B) 389 krūties vėžiu sergančios pacientės Trisdešimt penkios (9 %) turėjo BRCA1/2 patogeninius variantus (PV). Iš jų 17 (48,6 %) buvo BRCA1 PV nešiotojos (tamsiai raudona) ir 18 (51,4 %) buvo BRCA2 nešiotojos (šviesiai raudona); (C) 29 (7,5 %) iš 389 tiriamųjų turėjo VUS, 5 (17,2 %) BRCA1 genus (tamsiai oranžinė) ir 24 (82,8 %) BRCA2 genus (šviesiai oranžinė).
Santrumpos: PV – patogeninis variantas; VUS – neaiškios reikšmės variantas; WT – laukinio tipo BRCA1/2 seka.
Toliau tyrėme BC molekulinių potipių paplitimą pacientams, sergantiems BRCA1/2 PV. Pasiskirstymas apėmė 2 (5,7 %) luminalinį A, 15 (42,9 %) luminalinį B, 3 (8,6 %) luminalinį B-HER2+, 2 (5,7 %) HER2+ ir 13 (37,1 %) TNBC pacientus. Tarp BRCA1 teigiamų pacientų 5 (29,4 %) sirgo luminaliniu B BC, 2 (11,8 %) sirgo HER2+ liga, o 10 (58,8 %) sirgo TNBC. Navikai be BRCA1 mutacijų buvo arba luminaliniai A, arba luminaliniai B-HER2+ (3 pav.). BRCA2 teigiamoje pogrupyje 10 (55,6 %) navikų buvo luminaliniai B, 3 (16,7 %) buvo luminaliniai B-HER2+, 3 (16,7 %) TNBC ir 2 (11,1 %) buvo luminaliniai A (3 pav.). Šioje grupėje HER2+ navikų nebuvo. grupėje. Taigi, BRCA1 mutacijos yra paplitusios TNBC pacientams, o BRCA2 pakitimai vyrauja B spindžio asmenims.
3 pav. Krūties vėžio potipių paplitimas pacientėms, sergančioms patogeniniais BRCA1 ir BRCA2 variantais. Histogramos, rodančios BRCA1- (tamsiai raudona) ir BRCA2- (šviesiai raudona) PV pasiskirstymą tarp krūties vėžiu sergančių pacienčių molekulinių potipių. Kiekviename langelyje pateikti skaičiai rodo pacienčių, sergančių BRCA1 ir BRCA2 PV, procentinę dalį kiekvienam krūties vėžio potipiui.
Santrumpos: PV – patogeninis variantas; HER2+ – žmogaus epidermio augimo faktoriaus 2 receptoriaus teigiamas variantas; TNBC – trigubai neigiamas krūties vėžys.
Vėliau įvertinome BRCA1 ir BRCA2 PV tipą ir genų lokalizaciją. BRCA1 PV atveju stebėjome 7 vieno nukleotido variantus (SNV), 6 delecijas, 3 dubliacijas ir 1 įterpimą. Tik viena mutacija (c.5522delG) yra naujas atradimas. Dažniausiai abiem tiriamiesiems aptikta BRCA1 PV buvo c.5035_5039delCTAAT. Šis pakitimas apima penkių nukleotidų deleciją (CTAAT) BRCA1 15 egzone, dėl kurios aminorūgštis leucinas pakeičiama tirozinu 1679 kodone, o dėl transliacijos rėmelio poslinkio numatomu alternatyviu stop kodonu įvyksta priešlaikinis baltymo sutrumpėjimas. Visi kiti pokyčiai aptikti tik vienu atveju. Pažymėtina, kad vienas iš praneštų PV buvo splaisingo vietos konsensuso regione (c.4357+1G>T) (1 lentelė).
Kalbant apie BRCA2 PV, stebėjome 6 delecijas, 6 SNV ir 2 dubliacijas. Nė vienas iš rastų pokyčių nėra naujas. Mūsų populiacijoje pasikartojo trys mutacijos: c.428dup ir c.8487+1G>A, pastebėtos 3 tiriamiesiems, o po to dviem atvejais nustatyta c.5851_5854delAGTT. c.428dup pakitimas apima C kartojimąsi BRCA2 5 egzone, kuris, kaip manoma, koduoja sutrumpintą, neveikiantį baltymą. c.8487+1G>A mutacija atsiranda BRCA2 19 introno introninėje srityje (± 1,2) ir paveikia splaisingo konsensuso seką, dėl kurios pakitusi splaisingo eiga, susidaro nenormalus arba visai nėra baltymo. Patogeninis c.5851_5854delAGTT variantas atsiranda dėl 4 nukleotidų delecijos iš nukleotidų pozicijų nuo 5851 iki 5854 BRCA2 geno koduojančiame 10 egzone ir sukelia transliacijos rėmelio poslinkį su numatomu alternatyviu stop kodonu. (p.S1951WfsTer). Pažymėtina, kad, kaip jau buvo pranešta anksčiau, tam pačiam pacientui buvo aptikti abu pakitimai – c.631G>A ir c.7008-2A>T.34 Pirmoji mutacija apima adenozino (A) pakeitimą BRCA2 7 egzone guanino (G) turinčiu nukleotidu, dėl kurio valinas 211 kodone pasikeičia į izoleuciną. Izoleucinas – tai aminorūgštis, turinti labai panašias savybes. Šis pokytis paveikia normalų mRNR splaisingą. Antrasis variantas yra introninėje srityje ir sukelia dvigubą A pakeitimą į timiną (T) prieš BRCA2 geno, koduojančio 13 egzoną. c.7008-2A>T pokytis gali generuoti kelis skirtingo ilgio transkriptus. Be to, BRCA2 PV grupėje 4 iš 18 pakitimų (22,2 %) buvo introniniai.
Tada mes nustatėme žalingų BRCA1/2 mutacijų funkciniuose domenuose ir baltymus jungiančiuose regionuose lokalizaciją (4 pav.). BRCA1 gene 50 % PV buvo krūties vėžio klasterio regione (BCCR), o 22 % mutacijų – kiaušidžių vėžio klasterio regione (OCCR) (4A pav.). BRCA2 PV atveju 35,7 % variantų buvo BCCR regione, o 42,8 % mutacijų – OCCR (4B pav.). Toliau įvertinome PV vietą BRCA1 ir BRCA2 baltymų domenuose. BRCA1 baltymo atveju radome tris PV kilpos ir spiralinės spiralės domenuose, o dvi mutacijas – BRCT domene (4A pav.). BRCA2 baltymo atveju 4 PV buvo priskirti BRC pasikartojimo domenui, o 3 introniniai ir 3 egzoniniai pokyčiai buvo aptikti oligo/oligosacharidus jungiančiame (OB) ir bokšto (T) domenuose (4B pav.).
4 pav. Scheminis BRCA1 ir BRCA2 baltymų vaizdas ir patogeninių variantų lokalizacija. Šiame paveikslėlyje parodytas BRCA1 (A) ir BRCA2 (B) patogeninių variantų pasiskirstymas krūties vėžiu sergančių pacientų organizme. Egzoninės mutacijos pavaizduotos mėlyna spalva, o introniniai variantai – oranžine spalva. Juostelės aukštis rodo atvejų skaičių. Pateikiami BRCA1 ir BRCA2 baltymai ir jų funkciniai domenai. (A) BRCA1 baltymas turi kilpos domeną (RING) ir branduolio lokalizacijos seką (NLS), spiralinį domeną, SQ/TQ klasterio domeną (SCD) ir BRCA1 C-galo domeną (BRCT). (B) BRCA2 baltymas turi aštuonis BRC pasikartojimus, DNR surišantį domeną su spiraliniu domenu (Helical), tris oligonukleotidų/oligosacharidų surišimo (OB) raukšles, bokšto domeną (T) ir NLS C pusėje. Apačioje parodytos sritys, vadinamos krūties vėžio klasterio regionu (BCCR) ir kiaušidžių vėžio klasterio regionu (OCCR). *Reiškia mutacijas, kurios lemia stop kodonus.
Tuomet ištyrėme krūties vėžio klinikopatologinius požymius, kurie gali būti susiję su BRCA1/2 PV buvimu. Išsamūs klinikiniai įrašai buvo prieinami 181 BRCA1/2 neigiamam pacientui (nenešiotojams) ir visiems nešiotojams (n = 35). Nustatyta koreliacija tarp naviko proliferacijos dažnio ir laipsnio.
Ki-67 pasiskirstymą apskaičiavome pagal mūsų kohortos medianą (25 %, intervalas <10–90 %). Tiriamieji, kurių Ki-67 < 25 %, buvo apibrėžti kaip „žemas Ki-67“, o asmenys, kurių vertės ≥ 25 %, buvo laikomi „aukštu Ki-67“. Reikšmingi Ki-67 skirtumai (p < 0,01) nustatyti tarp nenešiotojų ir BRCA1 PV nešiotojų (5A pav.).
5 pav. Ki-67 koreliacija su laipsnio pasiskirstymu krūties vėžiu sergančioms moterims, turinčioms ir neturinčioms BRCA1 ir BRCA2 PV. (A) Dėžutė, rodanti vidutines Ki-67 vertes 181 krūties vėžiu sergančiai pacientei be BRCA1 arba BRCA2 (17) PV pacientėms. P vertės, mažesnės nei 0,5, buvo laikomos statistiškai reikšmingomis. (B) Histograma, rodanti krūties vėžiu sergančių pacienčių suskirstymą į histologinio laipsnio grupes (G2 ir G3) pagal BRCA1 ir BRCA2 mutacijų būseną (WT tiriamosios, BRCA1 ir BRCA2 PV nešiotojos).
Taip pat tyrėme, ar naviko laipsnis koreliuoja su BRCA1/2 PV buvimu. Kadangi mūsų populiacijoje G1 BC nebuvo, pacientus suskirstėme į dvi grupes (G2 arba G3). Remiantis Ki-67 rezultatais, analizė atskleidė statistiškai reikšmingą koreliaciją tarp naviko laipsnio ir BRCA1 mutacijos, kai BRCA1 nešiotojams nustatyta didesnė G3 navikų dalis, palyginti su nenešiotojais (p < 0,005) (5B pav.).
DNR sekoskaitos technologijos pažanga leido pasiekti precedento neturinčią BRCA1/2 genetinių tyrimų pažangą, o tai turi lemiamos reikšmės pacientams, kurių šeimoje yra buvę vėžio atvejų. Iki šiol pagal Amerikos medicininės genetikos draugijos35 ir ENIGMA sistemą nustatyta ir klasifikuota apie 20 000 BRCA1/2 variantų.35,36 Gerai žinoma, kad BRCA1/2 mutacijų spektras labai skiriasi skirtinguose geografiniuose regionuose.37 Italijoje BRCA1/2 PV dažnis svyravo nuo 8 % iki 37 %, o tai rodo didelį kintamumą šalies viduje.38,39 Sicilija, turinti beveik 5 milijonus gyventojų, yra penktas pagal dydį Italijos regionas pagal gyventojų skaičių. Nors yra duomenų apie BRCA1/2 paplitimą vakarų Sicilijoje, nėra išsamių įrodymų rytinėje salos dalyje.
Mūsų tyrimas yra vienas pirmųjų pranešimų apie BRCA1/2 PV paplitimą krūties vėžiu sergantiems pacientams rytų Sicilijoje.28 Savo analizę sutelkėme į krūties vėžį, nes tai yra bene dažniausia liga mūsų kohortoje.
Ištyrus 389 krūties vėžiu sergančius pacientus, 9 % jų turėjo BRCA1/2 PV, tolygiai pasiskirstiusius tarp BRCA1 ir BRCA2. Šie rezultatai atitinka anksčiau Italijos populiacijoje gautus rezultatus.28 Įdomu tai, kad 3 % (13/389) mūsų kohortos buvo vyrai. Šis rodiklis yra didesnis nei tikėtasi vyrų krūties vėžio atveju (1 % visų krūties vėžio atvejų),40 o tai atspindi mūsų populiacijų atranką pagal BRCA1/2 mutacijos riziką. Tačiau nė vienam iš šių vyrų nenustatyta BRCA1/2 PV, todėl jie buvo kandidatai tolesnei molekulinei analizei, siekiant atmesti retesnių mutacijų, tokių kaip PALB2, RAD51C ir D, buvimą. Neaiškios reikšmės variantai buvo rasti 7 % tiriamųjų, kuriems buvo pastebėtas BRCA2 VUS. Net ir šis rezultatas atitinka jau esamus įrodymus.28,41,42
Analizuodami BC molekulinių potipių pasiskirstymą BRCA1/2 mutantų turinčiose moteryse, patvirtinome žinomus ryšius tarp TNBC ir BRCA1 PV (58,8 %) bei tarp luminalinio B BC ir BRCA2 PV (55,6 %).16,43 Luminaliniai A ir HER2+ navikai BRCA1 ir BRCA2 PV nešiotojose atitinka esamus literatūros duomenis.16,43
Tada mes sutelkiame dėmesį į BRCA1/2 PV tipą ir vietą. Mūsų kohortoje dažbiausias BRCA1 PV buvo c.5035_5039delCTAAT. Nors Incorvaia ir kt. šio varianto savo Sicilijos kohortoje neaprašė, kiti autoriai jį nurodė kaip germinacinės BRCA1 PV.34 Mūsų kohortoje buvo rasta keletas BRCA1 PV, pvz., c.181T>G, c.514del, c.3253dupA ir c.5266dupC, kurios buvo pastebėtos Sicilijoje.28 Iš jų dvi BRCA1 pradinės mutacijos (c.181T>G ir c.5266dupC) dažnai aptinkamos Rytų ir Centrinės Europos (Lenkijos, Čekijos, Slovėnijos, Austrijos, Vengrijos, Baltarusijos ir Vokietijos) aškenazių žydams,44,45 o Jungtinėse Amerikos Valstijose ir Argentinoje neseniai buvo apibrėžtos kaip „pasikartojantis germinacinės linijos variantas“ Italijos pacientams, sergantiems krūties vėžiu ir vėžiu. 34c.514del variantas anksčiau buvo nustatytas 8 krūties vėžiu sergančioms pacientėms iš šiaurės Sicilijos Palerme ir Mesinoje. Įdomu tai, kad net Incorvaia ir kt. Kai kuriose Katanijos šeimose buvo rastas c.3253dupA variantas.28 Tipiškiausi BRCA2 PV yra c.428dup, c.5851_5854delAGTT ir introninis variantas c.8487+1G>A, kurie buvo išsamiau aprašyti28 pacientui Palerme, kuriam buvo diagnozuotas c.428dup. c.5851_5854delAGTT PV buvo pastebėtas namų ūkiuose šiaurės vakarų Sicilijoje, daugiausia Trapanio ir Palermo regionuose, o c.5851_5854delAGTT PV buvo pastebėtas namų ūkiuose šiaurės vakarų Sicilijoje. 8487+1G>A variantas buvo dažnesnis tiriamiesiems iš Mesinos, Palermo ir Kaltanisetos.28 Rebbeck ir kt. anksčiau aprašėme c.5851_5854delAGTT pakitimą Kolumbijoje.37 Kitas BRCA2 PV, c.631+1G>A, buvo rastas BC ir OC pacientams iš Sicilijos (Agrigento, Sirakūzų ir Ragūzos).28 Pažymėtina, kad tame pačiame paciente stebėjome dviejų BRCA2 variantų (BRCA2 c.631G>A ir c.7008-2A>T) sambūvį, kuris, mūsų manymu, buvo atskirtas cis režimu, kaip buvo pranešta anksčiau.34,46 Šios BRCA2 uble mutacijos iš tiesų dažnai stebimos Italijos regione ir buvo nustatyta, kad jos įveda priešlaikinius stop kodonus, paveikdamos informacinės RNR splaisingą ir sukeldamos BRCA2 baltymo gedimą.47,48
Taip pat nustatėme BRCA1 ir BRCA2 PV numanomuose baltymų domenų ir genų OCCR ir BCCR regionuose. Rebbeck ir kt. šiuos regionus apibūdino kaip atitinkamai kiaušidžių ir krūties vėžio rizikos sritis.49 Tačiau įrodymai apie ryšį tarp germinacinės linijos variantų vietos ir krūties ar kiaušidžių vėžio rizikos tebėra prieštaringi.28,50–52 Mūsų populiacijoje BRCA1 PV daugiausia buvo BCCR regione, o BRCA2 PV daugiausia buvo OCCR regione. Tačiau neradome jokio ryšio tarp numanomų OCCR ir BCCR regionų ir BC požymių. Tai gali būti dėl riboto pacientų, turinčių BRCA1/2 mutacijas, skaičiaus. Baltymų domeno požiūriu, BRCA1 PV yra pasiskirstę visame baltyme, o BRCA2 pakitimai pirmiausia aptinkami BRC pasikartojimo domene.
Galiausiai, susiejome BC klinikopatologinius požymius su BRCA1/2 PV. Dėl riboto pacientų skaičiaus nustatėme reikšmingą koreliaciją tik tarp Ki-67 ir naviko laipsnio. Nors Ki-67 vertinimas ir interpretavimas išlieka tam tikrų ginčų, neabejotina, kad didelis proliferacijos dažnis yra susijęs su padidėjusia ligos atsinaujinimo rizika ir sumažėjusiu išgyvenamumu. Iki šiol riba, skirta atskirti „aukštą“ ir „žemą“ Ki-67, yra 20 %. Tačiau ši riba netaikoma mūsų BRCA1/2 mutacijos pacientų populiacijai, kurios vidutinė Ki-67 vertė yra 25 %. Šią didelio Ki-67 dažnio tendenciją galima paaiškinti paplitimu mūsų luminalinio B ir TNBC kohortose, kuriose buvo nedaug luminalinio A navikų. Tačiau kai kurie įrodymai rodo, kad didesnė Ki-67 riba (25–30 %) gali geriau stratifikuoti pacientus pagal jų prognozę.53,54 Remiantis mūsų analizės rezultatais, reikšminga koreliacija nestebina. Pasireiškia tarp didelio Ki-67 ir laipsnių bei BRCA1 PV buvimo. Iš tiesų, Su BRCA1 susiję navikai yra tipiški TNBC ir pasižymi agresyvesnėmis savybėmis.16,17
Apibendrinant, šiame tyrime pateikiama ataskaita apie BRCA1/2 mutacijų būseną BC kohortoje iš rytų Sicilijos. Apskritai mūsų išvados atitinka jau esamus įrodymus, tiek kalbant apie mutacijų paplitimą, tiek apie klinikopatologinius BC požymius. Reikalingi daugiau tyrimų su didesnėmis BRCA1/2 mutaciją turinčiomis BC pacientų populiacijomis, pavyzdžiui, naudojant daugiagenominę išplėstinę mutacijų analizę, siekiant įvertinti PV, kurie yra skirtingi ir retesni nei BRCA1/2, buvimą. Tai leis nustatyti ir tinkamai gydyti didėjantį skaičių tiriamųjų, kuriems dėl genetinių mutacijų yra padidėjusi vėžio rizika.
Patvirtinome, kad pacientai pasirašė informuotą sutikimą anonimiškai pateikti savo naviko mėginius tyrimų tikslais. Visi pacientai pasirašė rašytinį informuotą sutikimą pagal Helsinkio deklaraciją. Remiantis AOU poliklinikos „G. Rodolico – S. Marco“ politika, šiam tyrimui nebuvo taikoma etikos peržiūros procedūra, nes BRCA1/2 analizė buvo atlikta laikantis klinikinės praktikos ir visi pacientai davė rašytinį informuotą sutikimą. Pacientai taip pat sutinka, kad jų duomenys būtų naudojami tyrimų tikslais.
Dėkojame prof. Paolo Vigneri už jo pagalbą gydant krūties vėžiu sergančius pacientus, kaip prašė Etikos komitetas.
Federica Martorana praneša apie honorarus iš „Istituto Gentili“, „Eli Lilly“, „Novartis“ ir „Pfizer“. Kiti autoriai pareiškia, kad neturi jokių interesų konfliktų šiame darbe.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL ir kt. 2020 m. pasaulinė vėžio statistika: GLOBOCAN įvertino 36 vėžio rūšių sergamumą ir mirtingumą 185 pasaulio šalyse. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209–249. doi: 10.3322/caac.21660