Javascript on tällä hetkellä poistettu käytöstä selaimessasi. Jotkin tämän verkkosivuston ominaisuudet eivät toimi, kun JavaScript on poistettu käytöstä.
Rekisteröidy omilla tiedoillasi ja kiinnostavalla lääkkeelläsi, niin yhdistämme antamasi tiedot laajan tietokantaamme artikkeleihin ja lähetämme sinulle viipymättä PDF-kopion sähköpostitse.
Näyttelijät Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 University of Medicine Department of Medicine, C1icallin, 6, 7 Livia Manzperi Exmental University Catania, Catania, 95123, Italia;2 Center for Experimental Oncology and Hematology, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Italia; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italia; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Italia; 6 Biolääketieteen ja biotekniikan laitos, Catanian yliopisto, Lääketieteellinen genetiikka, Catania, Italia, 95123; 7 Oasi-tutkimuslaitos-IRCCS, Troina, 94018, Italia Viestintä: Stefania Stella, puh. +39 095 378 1946, sähköposti [email protected]; [email protected] Tavoite: BRCA1- ja BRCA2-geenien ituradan mutaatiot sekä todettu rintasyöpä, munasarjasyöpä ja muut syöpätyypit, jotka liittyvät elinikäiseen syöpäriskiin. BRCA-geenin testaus on avainasemassa yksilöllisen riskin arvioinnissa sekä ehkäisymenetelmien löytämisessä terveillä kantajilla ja hoitojen räätälöimisessä syöpäpotilailla. BRCA1- ja BRCA2-muutosten esiintyvyys vaihtelee suuresti maantieteellisesti eri alueilla, ja vaikka tietoa BRCA-patogeenisistä varianteista sisilialaisissa perheissä on olemassa, tutkimuksia, jotka kohdistuisivat erityisesti Itä-Sisilian väestöön, ei ole. Tutkimuksemme tavoitteena oli tutkia BRCA-patogeenisten ituradan muutosten esiintyvyyttä ja jakautumista Itä-Sisilian syöpäpotilaiden kohortissa ja arvioida niiden yhteyttä tiettyihin syöpäominaisuuksiin käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointia. Muutosten esiintyminen korreloi kasvaimen asteen ja proliferaatioindeksin kanssa. TULOKSET: Kaiken kaikkiaan 35 potilaalla (9 %) oli BRCA-patogeeninen variantti, 17:llä (49 %) BRCA1-mutaatio ja 18:lla (51 %) BRCA2-mutaatio. BRCA1-muutokset ovat yleisiä kolmoisnegatiivisilla syöpäpotilailla, kun taas BRCA2-mutaatiot ovat yleisempiä luminaalisyöpäpotilailla. Verrattuna ei-kantajiin, BRCA1-variantteja kantavilla koehenkilöillä oli merkittävästi... korkeampi kasvaimen aste ja proliferatiivinen indeksi. Johtopäätökset: Löydöksemme antavat yleiskuvan BRCA-mutaatiostatuksesta itäisen Sisilian rintasyöpäpotilailla ja vahvistavat NGS-analyysin roolin perinnöllisen rintasyövän tunnistamisessa. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien todisteiden kanssa, jotka tukevat BRCA-seulontaa syövän asianmukaisessa ehkäisyssä ja hoidossa mutaation kantajilla.
Rintasyöpä on maailmanlaajuisesti yleisin pahanlaatuinen kasvain ja naisilla kuolettavin syöpä.1 Biologisia piirteitä, jotka määräävät rintasyövän ennusteen ja kliinisen käyttäytymisen, on tutkittu laajasti ja osittain selvitetty ajan myötä. Itse asiassa useita sijaismarkkereita käytetään tällä hetkellä rintasyövän luokittelemiseen eri molekyylialatyyppeihin. Näitä ovat estrogeeni- (ER) ja/tai progesteronireseptori (PgR), ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin 2 (HER2) amplifikaatio, proliferaatioindeksi Ki-67 ja kasvaimen aste (G).2 Näiden muuttujien yhdistelmä tunnisti seuraavat rintasyöpäluokat: 1) Luminaalikasvaimet, joissa ilmentyi ER- ja/tai PgR-reseptori, muodostivat 75 % rintasyöpäkasvaimista. Nämä kasvaimet jaettiin edelleen luminaaliseen A:han, kun Ki-67 oli alle 20 % ja HER2-negatiivinen, ja luminaaliseen B:hen, kun Ki-67 oli vähintään 20 % ja HER2-amplifikaatiota esiintyi proliferaatioindeksistä riippumatta; 2) HER2-positiiviset kasvaimet, jotka ovat ER- ja PgR-negatiivisia, mutta osoittavat HER2-amplifikaatiota. Tämä ryhmä muodostaa 10 % kaikista rintakasvaimista; 3) Kolmoisnegatiivinen rintasyöpä (TNBC), jossa ei ilmene ER- eikä PgR-reseptoreita eikä HER2-amplifikaatiota, muodostaa noin 15 % rintasyövistä.2–4
Näistä BC-alatyypeistä kasvaimen aste ja proliferaatioindeksi edustavat poikkileikkausbiomarkkereita, jotka liittyvät suoraan ja itsenäisesti kasvaimen aggressiivisuuteen ja ennusteeseen.5,6
Edellä mainittujen biologisten ominaisuuksien lisäksi periytyvien geneettisten muutosten rooli rintasyövän kehittymisessä on tullut yhä tärkeämmäksi viime vuosina.7 Noin joka kymmenes rintasyöpä periytyy tiettyjen geenien sukusolujen muutosten vuoksi.8 Kaksi suurta epidemiologista tutkimusta, joihin osallistui yli 180 000 naista, ovat äskettäin tunnistaneet kahdeksan geenin ryhmän (eli ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C ja RAD51D), jotka ovat ensisijaisesti vastuussa perinnöllisestä rintasyövästä. Näistä geeneistä BRCA1 ja BRCA2 (jäljempänä BRCA1/2) osoittivat voimakkaimman korrelaation rintasyöpien kehittymisen kanssa.9-12 Itse asiassa sukusolujen BRCA1/2-mutaatiot lisäävät merkittävästi rintasyövän sekä muiden pahanlaatuisten kasvainten, kuten munasarjojen, eturauhasen, haiman, kolorektaalisyövän ja melanooman, elinaikaista riskiä. 13–80 vuoden iässä rintasyövän kumulatiivinen ilmaantuvuus on 72 % naisilla, joilla on BRCA1-patogeeninen variantti (PV), ja 69 % naisilla, joilla on BRCA2-PV.14
Merkillepantavaa on, että tuore julkaisu viittaa siihen, että rintasyövän riski riippuu p-PV:n tyypistä. Itse asiassa verrattuna patogeenisiin lyhentyneisiin variantteihin, räikeät missense-variantit, erityisesti BRCA1-geenissä, liittyvät pienempään rintasyövän riskiin, erityisesti vanhemmilla naisilla.15
BRCA1- tai BRCA2-geenin PV:n esiintymiseen liittyi erilaisia ​​biologisia ja kliinisesti patologisia piirteitä.16,17 BRCA1-geeniin liittyvät rintasyöpäkasvaimet ovat yleensä kliinisesti aggressiivisia, huonosti erilaistuneita ja voimakkaasti proliferatiivisia. Nämä kasvaimet ovat yleensä kolmoisnegatiivisia ja alkavat varhain. BRCA2-mutatoituneilla potilailla esiintyvillä kasvaimilla on tyypillisesti kohtalainen tai hyvin erilaistunut aste ja vaihtelevat proliferatiiviset indeksit. Nämä kasvaimet ovat yleisempiä luumenissa B ja esiintyvät yleensä vanhemmilla aikuisilla.16-18 Huomionarvoista on, että BRCA1- ja BRCA2-geenien mutaatiot lisäävät herkkyyttä tietyille hoidoille, mukaan lukien platinasuolat ja kohdennetut lääkkeet, kuten poly(ADP-riboosi)polymeraasi-inhibiittorit (PARPi).19,20
Viime vuosina seuraavan sukupolven sekvensoinnin (NGS) käyttöönotto kliinisessä käytännössä on mahdollistanut yhä useammalle rintasyöpäpotilaalle molekyylitestauksen syöpäalttiusoireyhtymien, mukaan lukien BRCA1/2:n, varalta.21 Samanaikaisesti määritelmät perustuvat tarkkoihin kriteereihin, jotka koskevat sukuhistoriaa, demografisia ja kliinisiä ominaisuuksiin liittyviä ominaisuuksia, jotta voidaan tunnistaa paremmin BRCA1/2-testaukseen kelpaavat henkilöt.22,23 Tässä yhteydessä näyttöä BRCA1/2-seulonnasta tietyissä populaatioissa kertyy, mikä korostaa eroja maantieteellisten alueiden välillä.24–27 Vaikka Länsi-Sisiliassa on raportteja rintasyöpäkohortista, Itä-Sisilian väestöstä on saatavilla vähemmän tietoa BRCA1/2-seulonnasta.28,29
Kuvaamme tässä tuloksia ituradan BRCA1/2-seulonnasta itäisen Sisilian syöpäpotilailla ja korreloimme edelleen BRCA1- tai BRCA2-mutaatioiden esiintymisen näiden kasvainten tärkeimpiin kliinisiin ja patologisiin piirteisiin.
Retrospektiivinen tutkimus tehtiin Catanian Rodolico-sairaalan kokeellisen onkologian ja hematologian keskuksessa. Tammikuusta 2017 maaliskuuhun 2021 yhteensä 455 rinta- ja munasarjasyöpää, melanoomaa, haimasyöpää tai eturauhassyöpää sairastavaa potilasta lähetettiin molekyylidiagnostiikkalaboratorioomme BRCA/2-geenitestausta varten. Tutkimus tehtiin Helsingin julistuksen mukaisesti, ja kaikki osallistujat antoivat kirjallisen suostumuksensa ennen molekyylianalyysiä.
Syövän histologiset ja biologiset ominaisuudet (ER, PgR, HER2-status, Ki-67 ja aste) arvioitiin ydinbiopsioista tai kirurgisista näytteistä ottaen huomioon vain aggressiiviset kasvainkomponentit. Näiden ominaisuuksien perusteella syövät luokiteltiin seuraavasti: luminaalinen A (ER+ ja/tai PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminaalinen B (ER+ ja/tai PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminaalinen B-HER2+ (ER ja/tai PgR+, HER2+), HER2+ (ER ja PgR-, HER2+) tai kolmoisnegatiivinen (ER ja PgR-, HER2-).
Ennen BRCA1- ja BRCA2-mutaatiostatuksen arviointia monialainen tiimi, johon kuuluivat onkologi, geneetikko ja psykologi, suoritti jokaiselle potilaalle kasvaingenetiikan konsultaation BRCA1- ja/tai BRCA1-mutaatioiden tai henkilöiden, joilla on suuri PV-riski, esiintymisen määrittämiseksi BRCA2-geenissä. Potilasvalinta suoritettiin Italian lääketieteellisen onkologian yhdistyksen (AIOM) ohjeiden ja paikallisten sisilialaisten suositusten mukaisesti.30,31 Näihin kriteereihin kuuluvat: (i) tunnettujen patogeenisten varianttien esiintyminen alttiusgeeneissä (esim. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) miehet, joilla on rintasyöpä; (iii) potilaat, joilla on sekä rintasyöpä että paksusuolensyöpä; (iv) naiset, joilla on alle 36-vuotias rintasyöpä, alle 60-vuotias kolmiulotteinen rintasyöpä tai alle 50-vuotias molemminpuolinen rintasyöpä; (v) alle 50-vuotias rintasyöpä ja vähintään yksi ensimmäisen asteen sukulainen: (a) rintasyöpä < 50 vuotta; (b) ei-musinoosi ja ei-rajatapausperäinen rintasyöpä missä tahansa iässä; (c) molemminpuolinen rintasyöpä; (d) miehen rintasyöpä; (e) haimasyöpä; (f) eturauhassyöpä; (vi) kaksi tai useampi henkilö, jolla on ollut rintasyöpä yli 50 vuotta aiemmin, ja suvussa rintasyöpää, paksusuolensyöpää tai haimasyöpää sukulaisilla, jotka ovat toisilleen ensimmäisen asteen sukulaisia ​​(mukaan lukien sukulaiset, joiden kanssa hän on ensimmäisen asteen sukulainen); (vii) Henkilökohtainen paksusuolensyöpä ja vähintään yksi ensimmäisen asteen sukulainen: (a) rintasyöpä alle 50 vuotta; (b) ei-soluihin tarttuva kohdunsyöpä; (c) molemminpuolinen rintasyöpä; (d) miehen rintasyöpä; (vii) naisen korkea-asteinen seroosi kohdunsyöpä.
Jokaiselta potilaalta otettiin 20 ml:n perifeerinen verinäyte, joka kerättiin EDTA-putkiin (BD Biosciences). Genominen DNA eristettiin 0,7 ml:sta kokoverinäytteistä käyttämällä QIAsymphony DSP DNA Midi kit Isolation Kit -pakkausta (QIAGEN, Hilden, Italia) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja johdettiin Qubit® 3.0 -fluorometrin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) läpi. Suoritettiin kvantifiointi. Kohderikastus ja kirjaston valmistelu suoritetaan Oncomine™ BRCA Research Assay Chef -laitteella, joka on valmis ladattavaksi Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 -pakkaukseen automaattista kirjaston valmistelua varten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pakkaus koostuu kahdesta multipleksisesta PCR-alukepoolista, joita voidaan käyttää kaikkien BRCA1 (NM_007300.3) ja BRCA2 (NM_000059.3) -geenien tutkimiseen. Lyhyesti sanottuna 15 µl kutakin laimennettua näyte-DNA:ta (10 ng) lisättiin viivakoodatuille levyille kirjaston valmistelua varten, ja kaikki reagenssit ja tarvikkeet ladattiin Ion Chef™ -laitteeseen. Automaattinen kirjaston valmistelu ja viivakoodatun näytekirjaston yhdistäminen suoritettiin sitten Ion Chef™ -laitteella. Valmisteltujen kirjastojen lukumäärä arvioitiin sitten Qubit® 3.0 -fluorometrillä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lopuksi kirjastot yhdistetään ekvimolaarisissa suhteissa Ion Chef™ -kirjastonäyteputkiin (viivakoodatut putket) ja ladataan Ion Chef™ -laitteeseen. laite. Sekvensointi suoritettiin Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) -laitteella (Thermo Fisher Scientific) käyttäen Ion 510 -sirua (Thermo Fisher Scientific). Data-analyysi suoritettiin Amplicon Suitella (SmartSeq srl) ja Ion Reporter -ohjelmistolla.
Kaikki varianttien nimikkeistö noudatti Human Genome Variation Consortiumin nykyisiä ohjeita, jotka ovat saatavilla verkossa (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). BRCA1/2-varianttien kliininen merkitys määriteltiin käyttämällä International Consortium ENIGMA -luokitusta (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) ja tutustumalla eri tietokantoihin, kuten ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD ja UMD. Luokittelu sisältää viisi erillistä riskiluokkaa: hyvänlaatuinen (luokka I), todennäköisesti hyvänlaatuinen (luokka II), merkitykseltään epävarma variantti (VUS, luokka III), todennäköisesti patogeeninen (luokka IV) ja patogeeninen (luokka V). VarSome analysoi myös mutaatioiden vaikutusta proteiinien rakenteeseen ja toimintaan. Se on informatiivinen työkalu, jolla on pääsy 30 tietokantaan.32
Kunkin VUS:n mahdollisen kliinisen merkityksen määrittämiseksi käytettiin seuraavia laskennallisia proteiiniennustusalgoritmeja: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ja Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Luokkaan 1 ja 2 luokiteltuja variantteja pidettiin villityypin variantteina.
Sanger-sekvensointi vahvisti jokaisen patogeenisen variantin läsnäolon. Lyhyesti sanottuna jokaiselle havaitulle variantille suunniteltiin spesifinen alukepari käyttämällä BRCA1- ja BRCA2-geenien referenssisekvenssejä (NG_005905.2, NM_007294.3 ja NG_012772.3, NM_000059.3). Siksi suoritettiin kohdennettu PCR, jota seurasi Sanger-sekvensointi.
Potilaat, joilla ei ollut BRCA1/2-geeniä, testattiin moninkertaisesta ligaatiosta riippuvalla koetinmonistusmenetelmällä (MLPA) valmistajan ohjeiden mukaisesti suurten genomisten uudelleenjärjestelyjen (LGR) esiintymisen arvioimiseksi. Lyhyesti sanottuna DNA-näytteet denaturoidaan ja käytetään jopa 60 BRCA1- ja BRCA2-geenispesifistä koetinta, joista jokainen havaitsee tietyn, noin 60 nukleotidin pituisen DNA-sekvenssin. Koetinmonistustuotteet, jotka koostuivat ainutlaatuisesta PCR-amplikonien joukosta, analysoitiin sitten kapillaarielektroforeesilla ja Cofalyser.Net-ohjelmistolla yhdessä asianmukaisten eräkohtaisten Cofalyser-taulukoiden kanssa (www.mrcholland.com).
Valitut kliinopatologiset muuttujat (histologinen aste ja Ki-67 %:n proliferaatioindeksi) liittyivät BRCA1/2-PV:n esiintymiseen, joka laskettiin Prism-ohjelmistolla v. 8.4 käyttäen Fisherin tarkkaa testiä olettaen p-arvon < 0,05 olevan merkitsevä.
Tammikuun 2017 ja maaliskuun 2021 välisenä aikana 455 potilaalta tehtiin ituradan BRCA1/2-mutaatioiden seulonnat. Mutaatiotestaus tehtiin Policlinico-sairaalan kokeellisen onkologian ja hematologian keskuksessa. Sisilian ohjeiden (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10. tammikuuta 2020) mukaisesti Catanian Rodolico – San Marcon sairaalassa seulottiin yhteensä 389 potilasta. Potilaista 37 oli rintasyöpää, 37 munasarjasyöpää, 16 haimasyöpää, 8 eturauhassyöpää ja 5 melanoomaa. Potilaiden jakauma syöpätyypin ja analyysitulosten mukaan on esitetty kuvassa 1.
Kuvio 1 esittää vuokaavion, joka näyttää yleiskatsauksen tutkimuksesta. Rinta-, melanooma-, haima-, eturauhas- tai munasarjakasvaimia sairastavilta potilailta testattiin BRCA1- ja BRCA2-geenien mutaatioita.
Lyhenteet: PV, patogeeninen variantti; VUS, merkitykseltään epävarma variantti; WT, villityypin BRCA1/2-sekvenssi.
Tutkimuksemme keskittyivät valikoidusti rintasyöpäkohortteihin. Potilaiden mediaani-ikä oli 49 vuotta (vaihteluväli 23–89) ja he olivat pääasiassa naisia ​​(n = 376 eli 97 %).
Näistä koehenkilöistä 64:llä (17 %) oli BRCA1/2-mutaatioita, ja kaikki heistä olivat naisia. Kolmellakymmenelläviidellä (9 %) oli PV ja 29:llä (7,5 %) VUS. 35 patogeenisestä variantista seitsemäntoista (48,6 %) esiintyi BRCA1:ssä ja 18 (51,4 %) BRCA2:ssa, kun taas viisi VUS-variantia esiintyi BRCA1:ssä (17,2 %) ja 24 (82,8 %) BRCA2:ssa (kuvat 1 ja 2). LGR:ää ei havaittu MLPA-analyysissä.
Kuva 2. BRCA1- ja BRCA2-mutaatioiden analyysi 389 rintasyöpäpotilaalla. (A) Patogeenisten varianttien (PV) (punainen), merkitykseltään epävarmojen varianttien (VUS) (oranssi) ja WT:n (sininen) jakauma 389 rintasyöpäpotilaalla; (B) 389 rintasyöpäpotilasta Kolmekymmenelläviidellä (9 %) oli BRCA1/2-patogeenisiä variantteja (PV). Heistä 17 (48,6 %) oli BRCA1 PV -kantaja (tummanpunainen) ja 18 (51,4 %) BRCA2-kantaja (vaaleanpunainen); (C) 29:llä (7,5 %) 389:stä potilaasta oli VUS-geeni, 5:llä (17,2 %) BRCA1-geeni (tummanoranssi) ja 24:llä (82,8 %) BRCA2-geeni (vaaleanoranssi).
Lyhenteet: PV, patogeeninen variantti; VUS, merkitykseltään epävarma variantti; WT, villityypin BRCA1/2-sekvenssi.
Seuraavaksi tutkimme rintasyövän molekyylialatyyppien esiintyvyyttä BRCA1/2-PV-potilailla. Jakaumaan kuului 2 (5,7 %) luminaalista A-potilasta, 15 (42,9 %) luminaalista B-potilasta, 3 (8,6 %) luminaalista B-HER2+-potilasta, 2 (5,7 %) HER2+-potilasta ja 13 (37,1 %) TNBC-potilasta. BRCA1-positiivisista potilaista 5 (29,4 %) oli luminaalinen B-syöpä, 2 (11,8 %) HER2+-tauti ja 10 (58,8 %) TNBC. Kasvaimet, joilla ei ollut BRCA1-mutaatioita, olivat joko luminaalista A- tai luminaalista B-HER2+-kasvaimia (kuva 3). BRCA2-positiivisessa alaryhmässä 10 (55,6 %) kasvainta oli luminaalista B-potilasta, 3 (16,7 %) oli luminaalista B-HER2+-potilasta, 3 (16,7 %) TNBC-kasvaimia ja 2 (11,1 %) oli luminaalista A-potilasta (kuva 3). Tässä tutkimuksessa ei ollut HER2+-kasvaimia. ryhmä. Näin ollen BRCA1-mutaatiot ovat yleisiä TNBC-potilailla, kun taas BRCA2-muutokset ovat vallitsevia lumen B -yksilöillä.
Kuva 3. Rintasyövän alatyyppien esiintyvyys potilailla, joilla on patogeenisiä BRCA1- ja BRCA2-variantteja. Histogrammit, jotka näyttävät BRCA1- (tummanpunainen) ja BRCA2- (vaaleanpunainen) PV-varianttien jakautumisen rintasyöpäpotilaiden molekyylialatyyppien kesken. Kunkin laatikon sisällä ilmoitetut numerot edustavat BRCA1- ja BRCA2-PV-potilaiden prosenttiosuutta kullakin rintasyövän alatyypillä.
Lyhenteet: PV, patogeeninen variantti; HER2+, ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori 2:n positiivinen; TNBC, kolmoisnegatiivinen rintasyöpä.
Seuraavaksi arvioimme BRCA1- ja BRCA2-PV:iden tyypin ja geenilokalisaation. BRCA1-PV:ssä havaitsimme 7 yksittäistä nukleotidivarianttia (SNV), 6 deleetiota, 3 duplikaatiota ja 1 insertion. Vain yksi mutaatio (c.5522delG) edustaa uutta löytöä. Yleisin molemmilla koehenkilöillä havaittu BRCA1-PV oli c.5035_5039delCTAAT. Tämä muutos sisältää viiden nukleotidin deleetion (CTAAT) BRCA1-eksonissa 15, mikä johtaa aminohappo leusiinin korvautumiseen tyrosiinilla kodonissa 1679 ja ennustetun vaihtoehtoisen lopetuskodonin aiheuttamaan translaation lukukehyksen siirtymään, mikä johtaa proteiinin ennenaikaiseen katkaisemiseen. Kaikki muut muutokset havaitaan vain yhdessä tapauksessa. Merkillepantavaa on, että yksi raportoiduista PV:istä sijaitsi silmukointikohdan konsensusalueella (c.4357+1G>T) (taulukko 1).
BRCA2 PV:n osalta havaitsimme 6 deleetiota, 6 SNV:tä ​​ja 2 duplikaatiota. Yksikään löydetyistä muutoksista ei ole uusi. Kolme mutaatiota toistui populaatiossamme, c.428dup ja c.8487+1G>A havaittiin kolmella koehenkilöllä, ja sen jälkeen c.5851_5854delAGTT havaittiin kahdessa tapauksessa. c.428dup-muutokseen liittyy C:n toisto BRCA2:n eksonissa 5, jonka ennustetaan koodaavan katkaistua, toimimatonta proteiinia. c.8487+1G>A -mutaatio esiintyy BRCA2:n intronin 19 intronialueella (± 1,2) ja vaikuttaa silmukoinnin konsensussekvenssiin, mikä johtaa muuttuneeseen silmukointiin ja epänormaaliin tai puuttuvaan proteiiniin. c.5851_5854delAGTT:n patogeeninen variantti johtuu 4 nukleotidin deleetiosta nukleotidikohdista 5851–5854 BRCA2-geenin koodaavassa eksonissa 10 ja johtaa translaation lukukehyksen siirtymään ennustetulla vaihtoehtoisella lopetuskodonilla. (p.S1951WfsTer). Kuten aiemmin on raportoitu, molemmat muutokset c.631G>A ja c.7008-2A>T havaittiin samalla potilaalla.34 Ensimmäinen mutaatio sisältää adenosiinin (A) korvautumisen BRCA2-geenin eksonissa 7 guaniinia (G) sisältävällä nukleotidilla, mikä johtaa valiinin muuttumiseen isoleusiiniksi kodonissa 211. Isoleusiiniaminohappo on aminohappo, jolla on hyvin samankaltaiset ominaisuudet. Tämä muutos vaikuttaa normaaliin mRNA:n silmukointiin. Toinen variantti sijaitsee intronialueella ja johtaa kaksinkertaiseen A:n vaihtumiseen tymiiniksi (T) ennen BRCA2:ta koodaavan geenin eksonia 13. c.7008-2A>T-muutos voi tuottaa useita eri pituisia transkripteja. Lisäksi BRCA2-geenin PV-ryhmässä 4/18 muutoksesta (22,2 %) oli intronimaisia.
Sitten kartoitimme BRCA1/2:n haitalliset mutaatiot toiminnallisissa domeeneissa ja proteiinia sitovissa alueissa (kuva 4). BRCA1-geenissä 50 % PV:istä sijaitsi rintasyöpäklusterialueella (BCCR), kun taas 22 % mutaatioista sijaitsi munasarjasyöpäklusterialueella (OCCR) (kuva 4A). BRCA2 PV:ssä 35,7 % varianteista sijaitsi BCCR-alueella ja 42,8 % mutaatioista sijaitsi OCCR:ssä (kuva 4B). Seuraavaksi arvioimme PV:n sijaintia BRCA1- ja BRCA2-proteiinidomeeneissa. BRCA1-proteiinin osalta löysimme kolme PV:tä silmukka- ja kierrettyjen kierteiden domeeneista ja kaksi mutaatiota BRCT-domeenista (kuva 4A). BRCA2-proteiinin osalta neljä PV:tä kartoitettiin BRC-toistodomeeniin, kun taas kolme introni- ja kolme eksonista muutosta havaittiin oligo/oligosakkaridia sitovissa (OB) ja tornidomeeneissa (T) (kuva 4B).
Kuva 4. Kaaviomainen esitys BRCA1- ja BRCA2-proteiineista ja patogeenisten varianttien lokalisaatiosta. Tämä kuva esittää BRCA1 (A) ja BRCA2 (B) -patogeenisten varianttien jakauman rintasyöpäpotilailla. Eksoniset mutaatiot on esitetty sinisellä, kun taas intronivariantit on esitetty oranssilla. Palkin korkeus edustaa tapausten lukumäärää. BRCA1- ja BRCA2-proteiinit ja niiden toiminnalliset domeenit raportoidaan. (A) BRCA1-proteiini sisältää silmukkadomeenin (RING) ja tumalokalisaatiosekvenssin (NLS), kierteisen kierteen domeenin, SQ/TQ-klusteridomeenin (SCD) ja BRCA1:n C-terminaalisen domeenin (BRCT). (B) BRCA2-proteiini sisältää kahdeksan BRC-toistoa, DNA:ta sitovan domeenin, jossa on kierteinen domeeni (Helical), kolme oligonukleotidi-/oligosakkaridia sitovaa (OB) poimua, tornidomeenin (T) ja NLS:n C-puolella. Alareunassa on alueet, joita kutsutaan rintasyöpäklusterialueeksi (BCCR) ja munasarjasyöpäklusterialueeksi (OCCR). *Edustaa mutaatioita, jotka määrittävät lopetuskodoneja.
Seuraavaksi tutkimme rintasyövän kliinis-patologisia piirteitä, jotka saattaisivat korreloida BRCA1/2-PV:n esiintymiseen. Täydelliset kliiniset tiedot olivat saatavilla 181 BRCA1/2-negatiiviselta potilaalta (ei-kantajilta) ja kaikilta kantajilta (n = 35). Kasvaimen proliferaationopeuden ja asteen välillä havaittiin korrelaatio.
Laskimme Ki-67-jakauman kohorttimme mediaanin (25 %, vaihteluväli <10–90 %) perusteella. Henkilöt, joiden Ki-67-arvo oli < 25 %, määriteltiin "alhaisiksi Ki-67-arvoiksi", kun taas henkilöt, joiden arvot olivat ≥ 25 %, katsottiin "korkeiksi Ki-67-arvoiksi". Merkittäviä Ki-67-eroja (p < 0,01) havaittiin BRCA1-geeniä kantamattomien ja BRCA1-geeniä kantavien välillä (kuva 5A).
Kuva 5. Ki-67:n korrelaatio astejakauman kanssa rintasyöpää sairastavilla naisilla, joilla on ja joilla ei ole BRCA1- ja BRCA2-PV:tä. (A) Laatikkodiagrammi, joka näyttää Ki-67:n mediaaniarvot 181:llä rintasyöpää sairastamattomalla potilaalla verrattuna BRCA1 (18) tai BRCA2 (17) PV-potilaisiin. Alle 0,5:n p-arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. (B) Histogrammi, joka esittää rintasyöpäpotilaiden jaottelun histologisiin asteryhmiin (G2 ja G3) BRCA1- ja BRCA2-mutaatiostatuksen mukaan (WT-potilaat, BRCA1- ja BRCA2-PV:n kantajat).
Samoin tutkimme, korreloiko kasvaimen aste BRCA1/2-PV:n esiintymiseen. Koska G1-syöpää ei ollut populaatiossamme, jaoimme potilaat kahteen ryhmään (G2 tai G3). Ki-67-tulosten mukaisesti analyysi paljasti tilastollisesti merkitsevän korrelaation kasvaimen asteen ja BRCA1-mutaation välillä, ja G3-kasvainten osuus oli suurempi BRCA1-kantajilla verrattuna ei-kantajiin (p < 0,005) (kuva 5B).
DNA-sekvensointitekniikan kehitys on mahdollistanut ennennäkemättömän edistyksen BRCA1/2-geenitestauksessa, millä on ratkaiseva merkitys potilaille, joilla on suvussa esiintynyt syöpää. Tähän mennessä noin 20 000 BRCA1/2-varianttia on tunnistettu ja luokiteltu American Society of Medical Geneticsin35 ja ENIGMA-järjestelmän mukaan.35,36 On hyvin tunnettua, että BRCA1/2-mutaatiospektri vaihtelee suuresti maantieteellisesti.37 Italiassa BRCA1/2-varianttien osuus vaihteli 8 prosentista 37 prosenttiin, mikä osoittaa suurta vaihtelua maan sisällä.38,39 Lähes 5 miljoonan asukkaan Sisilia on Italian viidenneksi suurin alue asukasmäärältään. Vaikka BRCA1/2:n levinneisyydestä Länsi-Sisiliassa on tietoa, saaren itäosasta ei ole laajoja todisteita.
Tutkimuksemme on yksi ensimmäisistä raporteista BRCA1/2-PV:n ilmaantuvuudesta rintasyöpäpotilailla Itä-Sisiliassa.28 Keskityimme analyysissämme rintasyöpään, koska se on ylivoimaisesti yleisin sairaus kohortissamme.
Kun testattiin 389 rintasyöpäpotilasta, 9 %:lla heistä oli BRCA1/2-variantigeenit, jotka jakautuivat tasaisesti BRCA1:n ja BRCA2:n kesken. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin Italian väestössä raportoitujen tulosten kanssa.28 Mielenkiintoista on, että 3 % (13/389) kohortistamme oli miehiä. Tämä luku on odotettua korkeampi miesten rintasyövässä (1 % kaikista rintasyövistä),40 mikä heijastaa populaatioiden valintaamme BRCA1/2-mutaatioriskin perusteella. Kenellekään näistä miehistä ei kuitenkaan kehittynyt BRCA1/2-variantigeenia, joten heidät voitiin tutkia jatkomolekyylianalyyseillä harvinaisempien mutaatioiden, kuten PALB2:n, RAD51C:n ja D:n, esiintymisen poissulkemiseksi. Merkitykseltään epävarmoja variantteja löydettiin 7 %:lla koehenkilöistä, joilla BRCA2 VUS oli ilmeinen. Tämäkin tulos on yhdenmukainen aiemman näytön kanssa.28,41,42
Kun analysoimme BC:n molekyylialatyyppien jakaumaa BRCA1/2-mutantti-naisilla, vahvistimme tunnetut yhteydet TNBC:n ja BRCA1 PV:n välillä (58,8 %) sekä luminaalisen B BC:n ja BRCA2 PV:n välillä (55,6 %).16,43 Luminaalisen A- ja HER2+ -kasvaimet BRCA1- ja BRCA2 PV:n kantajilla ovat yhdenmukaisia ​​olemassa olevan kirjallisuustiedon kanssa.16,43
Sitten keskitymme BRCA1/2-PV:n tyyppiin ja sijaintiin. Kohortissamme yleisin BRCA1-PV oli c.5035_5039delCTAAT. Vaikka Incorvaia ym. eivät kuvanneet tätä varianttia sisilialaisessa kohortissaan, mutta muut kirjoittajat ovat raportoineet sen ituradan BRCA1-PV:nä.34 Kohortistamme löydettiin useita BRCA1-PV:itä – esim. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA ja c.5266dupC – joita on havaittu Sisiliassa.28 Näistä kaksi BRCA1:n perustajamutaatiota (c.181T>G ja c.5266dupC) esiintyvät yleisesti Itä- ja Keski-Euroopan (Puola, Tšekki, Slovenia, Itävalta, Unkari, Valko-Venäjä ja Saksa) aškenasijuutalaisilla,44,45 ja Yhdysvalloissa ja Argentiinassa se määriteltiin äskettäin "toistuvaksi ituradan variantiksi" italialaisilla rintasyöpä- ja paksusuolisyöpäpotilailla. 34c.514del-variantti tunnistettiin aiemmin kahdeksalla rintasyöpäpotilaalla Pohjois-Sisiliassa Palermossa ja Messinassa. Mielenkiintoista kyllä, jopa Incorvaia ym. löysi c.3253dupA-variantin joistakin Catanian perheistä.28 Tyypillisimmät BRCA2-PV:t ovat c.428dup, c.5851_5854delAGTT ja intronivariantti c.8487+1G>A, joista on raportoitu yksityiskohtaisemmin28 Palermossa asuvalla potilaalla, jolla oli c.428dup. c.5851_5854delAGTT PV:tä havaittiin Luoteis-Sisiliassa, pääasiassa Trapanin ja Palermon alueilla, kun taas c.5851_5854delAGTT PV:tä havaittiin Luoteis-Sisiliassa, kotitalouksissa. 8487+1G>A-variantti oli yleisempi Messinan, Palermon ja Caltanissettan kotoisin olevilla henkilöillä.28 Rebbeck ym. kuvasimme aiemmin c.5851_5854delAGTT-muutoksen Kolumbiassa.37 Toinen BRCA2-PV, c.631+1G>A, on löydetty BC- ja OC-potilailla Sisiliasta (Agrigento, Siracusa ja Ragusa).28 Havaitsimme erityisesti kahden BRCA2-variantin (BRCA2 c.631G>A ja c.7008-2A>T) rinnakkaiselon samassa potilaassa, joiden oletimme segregoituvan cis-muodossa, kuten aiemmin on raportoitu.34,46 Näitä BRCA2-uble-mutaatioita havaitaan todellakin usein Italian alueella, ja niiden on havaittu aiheuttavan ennenaikaisia ​​lopetuskodoneja, jotka vaikuttavat lähetti-RNA:n silmukointiin ja aiheuttavat BRCA2-proteiinin epäonnistumisen.47,48
Kartoitimme myös BRCA1- ja BRCA2-PV:t proteiinidomeenien ja geenien oletetuissa OCCR- ja BCCR-alueissa. Rebbeck ym. kuvailivat näitä alueita munasarja- ja rintasyövän riskialueiksi.49 Todisteet ituradan varianttien sijainnin ja rinta- tai munasarjasyövän riskin välisestä yhteydestä ovat kuitenkin edelleen kiistanalaisia.28,50-52 Populaatiossamme BRCA1-PV:t sijaitsivat pääasiassa BCCR-alueella, kun taas BRCA2-PV:t sijaitsivat pääasiassa OCCR-alueella. Emme kuitenkaan löytäneet yhteyttä oletettujen OCCR- ja BCCR-alueiden ja rintasyövän ominaisuuksien välillä. Tämä voi johtua BRCA1/2-mutaatioita sairastavien potilaiden rajallisesta määrästä. Proteiinidomeenin näkökulmasta BRCA1-PV:t jakautuvat koko proteiiniin, ja BRCA2-muutoksia esiintyy ensisijaisesti BRC-toistodomeenissa.
Lopuksi korreloimme rintasyövän kliiniset ja patologiset piirteet BRCA1/2-PV:n kanssa. Koska mukana oli vain vähän potilaita, löysimme merkittävän korrelaation vain Ki-67:n ja kasvaimen asteen välillä. Vaikka Ki-67:n arviointi ja tulkinta ovat edelleen jonkin verran kiistanalaisia, on varmaa, että korkeat proliferatiiviset luvut liittyvät lisääntyneeseen taudin uusiutumisriskiin ja lyhyempään eloonjäämiseen. Tähän mennessä raja "korkean" ja "matalan" Ki-67:n erottamiseksi on 20 %. Tämä kynnysarvo ei kuitenkaan koske BRCA1/2-mutaatiopotilaspopulaatiotamme, jonka Ki-67:n mediaaniarvo on 25 %. Tämä korkeiden Ki-67-lukujen trendi voidaan selittää esiintyvyydellä luminaali-B- ja TNBC-kohorteissamme, joissa luminaali-A-kasvaimia oli vain vähän. Jotkut todisteet kuitenkin viittaavat siihen, että korkeampi Ki-67-raja (25–30 %) saattaa paremmin stratifioida potilaat ennusteensa mukaan.53,54 Analyysimme tulosten perusteella merkittävä korrelaatio ei ole yllättävä. Korkean Ki-67:n ja asteiden sekä BRCA1-PV:n esiintymisen välillä esiintyy merkittävä korrelaatio. Itse asiassa, BRCA1-geeniin liittyvät kasvaimet ovat tyypillisiä TNBC:lle ja niillä on aggressiivisempia piirteitä.16,17
Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus tarjoaa raportin BRCA1/2-geenin mutaatiostatuksesta itäisestä Sisiliasta kotoisin olevassa rintasyövän kohortissa. Kaiken kaikkiaan löydöksemme ovat yhdenmukaisia ​​aiemman näytön kanssa sekä mutaatioiden esiintyvyyden että rintasyövän kliinis- ja patologisten piirteiden suhteen. Tarvitaan lisää tutkimuksia suuremmilla BRCA1/2-mutatoituneiden rintasyövän potilaspopulaatioilla, kuten käyttämällä monigenomisesti laajennettua mutaatioanalyysiä, jotta voidaan arvioida BRCA1/2-geenistä poikkeavien ja harvinaisempien PV-variaatioiden esiintymistä. Tämä mahdollistaa geneettisten mutaatioiden vuoksi lisääntyneen syöpäriskin omaavien henkilöiden kasvavan määrän tunnistamisen ja asianmukaisen hoidon.
Vahvistimme, että potilaat allekirjoittivat tietoisen suostumuksensa kasvainnäytteidensä luovuttamiseen nimettömästi tutkimustarkoituksiin. Kaikki potilaat allekirjoittivat kirjallisen tietoisen suostumuksen Helsingin julistuksen mukaisesti. AOU Policlinico “G.Rodolico – S.Marco” -poliklinikan käytännön mukaisesti tämä tutkimus vapautettiin eettisestä arvioinnista, koska BRCA1/2-analyysi suoritettiin kliinisen käytännön mukaisesti ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa. Potilaat suostuvat myös tietojensa käyttöön tutkimustarkoituksiin.
Kiitämme professori Paolo Vigneriä hänen avustaan ​​rintasyöpäpotilaiden hoidossa eettisen toimikunnan pyynnöstä.
Federica Martorana raportoi palkkiot Istituto Gentiltä, ​​Eli Lillyltä, Novartikselta ja Pfizeriltä. Muut kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja tässä työssä.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL ym. Maailmanlaajuiset syöpätilastot 2020: GLOBOCAN arvioi 36 syövän ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta 185 maassa ympäri maailmaa. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660