Javascript on teie brauseris hetkel keelatud. Mõned selle veebisaidi funktsioonid ei tööta, kui JavaScript on keelatud.
Registreeru oma täpsete andmete ja sind huvitava ravimiga ning me sobitame sinu esitatud teabe meie ulatuslikus andmebaasis olevate artiklitega ja saadame sulle viivitamatult PDF-koopia e-postiga.
Näitajad Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera ja 6, 6, 7 Ülikooli Meditsiini osakond, C1callin Experiment, 2 Livia Manzperi University of C1ical Catania, Catania, 95123, Itaalia;2 Eksperimentaalse onkoloogia ja hematoloogia keskus, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itaalia; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itaalia; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Itaalia; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Itaalia; 6 Catania Ülikooli Biomeditsiini- ja Biotehnoloogia Teaduste Osakond, Meditsiiniline Geneetika, Catania, Itaalia, 95123; 7 Oasi Uurimisinstituut-IRCCS, Troina, 94018, Itaalia Kommunikatsioon: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, e-post [email protected]; [email protected] Eesmärk: BRCA1 ja BRCA2 iduliini mutatsioonid ning väljakujunenud rinnavähk, munasarjavähk ja muud eluaegse vähiriskiga seotud haigused. BRCA geeni testimine on võtmetähtsusega nii individuaalse riski hindamisel kui ka ennetusmeetodite leidmisel tervetel kandjatel ja ravi kohandamisel vähihaigetel. BRCA1 ja BRCA2 muutuste levimus on geograafilistes piirkondades väga erinev ning kuigi Sitsiilia perekondades on andmeid BRCA patogeensete variantide kohta, puuduvad uuringud, mis oleksid spetsiaalselt suunatud Ida-Sitsiilia populatsioonidele. Meie uuringu eesmärk oli uurida BRCA patogeensete iduliini muutuste esinemissagedust ja levikut Ida-Sitsiilia BC patsientide kohordis ja hinnata nende seost spetsiifiliste BC tunnustega, kasutades järgmise põlvkonna sekveneerimist. Muutuste esinemine korreleerus kasvaja astme ja proliferatsiooniindeksiga. TULEMUSED: Kokku oli BRCA patogeenne variant 35 patsiendil (9%), BRCA1 variant 17-l (49%) ja BRCA2 variant 18-l (51%). BRCA1 muutused on levinud kolmiknegatiivse BC patsientidel, samas kui BRCA2 mutatsioonid on sagedasemad luminaalse BC patsientidel. Võrreldes mittekandjatega oli BRCA1 variantidega isikutel oluliselt... kõrgem kasvaja aste ja proliferatiivne indeks. Järeldused: Meie tulemused annavad ülevaate BRCA mutatsioonistaatusest Ida-Sitsiilia rinnavähihaigetel ja kinnitavad NGS-analüüsi rolli päriliku rinnavähiga patsientide tuvastamisel. Üldiselt on need andmed kooskõlas varasemate tõenditega, mis toetavad BRCA sõeluuringut vähi nõuetekohaseks ennetamiseks ja raviks mutatsioonikandjatel.
Rinnavähk on maailmas kõige levinum pahaloomuline kasvaja ja naiste seas surmavaim vähk.1 Bioloogilisi tunnuseid, mis määravad rinnavähi prognoosi ja kliinilise käitumise, on aja jooksul põhjalikult uuritud ja osaliselt selgitatud. Tegelikult kasutatakse rinnavähi klassifitseerimiseks erinevatesse molekulaarsetesse alatüüpidesse praegu mitmeid asendusmarkereid. Need on östrogeeni (ER) ja/või progesterooni retseptori (PgR), inimese epidermaalse kasvufaktori retseptori 2 (HER2) amplifikatsioon, proliferatsiooniindeks Ki-67 ja kasvaja aste (G).2 Nende muutujate kombinatsioon tuvastas järgmised rinnavähi kategooriad: 1) Luminaalsed kasvajad, mis näitasid ER ja/või PgR ekspressiooni, moodustasid 75% rinnavähist. Need kasvajad jagati edasi luminaalseks A-ks, kui Ki-67 oli alla 20% ja HER2 negatiivne, ning luminaalseks B-ks, kui Ki-67 oli 20% või üle selle ja HER2 amplifikatsiooni esinemise korral, olenemata proliferatsiooniindeksist; 2) HER2+ kasvajad, mis on ER ja PgR negatiivsed, kuid näitavad HER2 amplifikatsiooni. See rühm moodustab 10% kõigist rinnavähikutest; 3) Kolmiknegatiivne rinnavähk (TNBC), millel puudub ER- ja PgR-ekspressioon ning HER2 amplifikatsioon, moodustab umbes 15% rinnavähkidest.2-4
Nende BC alatüüpide hulgas esindavad kasvaja aste ja proliferatsiooniindeks ristlõike biomarkereid, mis on otseselt ja sõltumatult seotud kasvaja agressiivsuse ja prognoosiga.5,6
Lisaks eelmainitud bioloogilistele tunnustele on viimastel aastatel üha olulisemaks muutunud pärilike geneetiliste muutuste roll rinnavähi tekkes.7 Umbes iga kümnes rinnakasvaja on päritud teatud geenide sugurakkude muutuste tõttu.8 Kaks suurt epidemioloogilist uuringut, milles osales üle 180 000 naise, on hiljuti tuvastanud kaheksa geeni rühma (st ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C ja RAD51D), mis vastutavad peamiselt päriliku rinnavähi eest. Nende geenide hulgas näitasid BRCA1 ja BRCA2 (edaspidi BRCA1/2) kõige tugevamat korrelatsiooni rinnavähi tekkega.9-12 Tegelikult suurendavad sugurakkude BRCA1/2 mutatsioonid oluliselt rinnavähi ja teiste pahaloomuliste kasvajate, sealhulgas munasarja-, eesnäärme-, pankrease-, kolorektaalse ja melanoomi eluaegset riski. 13–80-aastaselt on rinnavähi kumulatiivne esinemissagedus BRCA1 patogeense variandiga (PV) naistel 72% ja BRCA2 PV-ga naistel 69%.14
Tähelepanuväärselt viitab hiljutine publikatsioon sellele, et rinnavähi risk sõltub PV tüübist. Tegelikult on silmatorkavad missense-variandid, eriti BRCA1 geenis, seotud rinnavähi väiksema riskiga, eriti vanematel naistel, võrreldes patogeensete kärbitud variantidega.15
BRCA1 või BRCA2 PV esinemine seostus erinevate bioloogiliste ja kliinilis-patoloogiliste tunnustega.16,17 BRCA1-ga seotud rinnavähid on tavaliselt kliiniliselt agressiivsed, halvasti diferentseerunud ja väga proliferatiivsed. Need kasvajad on tavaliselt kolmiknegatiivsed ja algavad varakult. BRCA2 mutatsiooniga patsientidel esinevatel kasvajatel on tavaliselt mõõdukas kuni hästi diferentseerunud aste ja varieeruvad proliferatiivsed indeksid. Need kasvajad esinevad sagedamini B-luumenis ja esinevad tavaliselt vanematel täiskasvanutel.16-18 Märkimisväärselt suurendavad BRCA1 ja BRCA2 mutatsioonid tundlikkust spetsiifiliste ravimeetodite, sealhulgas plaatinasoolade ja sihipäraste ravimite, näiteks polü(ADP-riboos) polümeraasi inhibiitorite (PARPi) suhtes.19,20
Viimaste aastate jooksul on järgmise põlvkonna sekveneerimise (NGS) rakendamine kliinilises praktikas võimaldanud üha suuremal arvul rinnavähihaigetel läbida molekulaarseid uuringuid vähi suhtes vastuvõtlikkuse sündroomide, sealhulgas BRCA1/2 suhtes.21 Samal ajal on definitsioonid, mis põhinevad täpsetel kriteeriumidel perekonna ajaloo, demograafiliste ja kliinilis-patoloogiliste tunnuste kohta, paremini tuvastanud isikuid, kes on BRCA1/2 testimist väärt.22,23 Selles kontekstis koguneb tõendeid BRCA1/2 sõeluuringute kohta teatud populatsioonides, mis toob esile erinevusi geograafiliste piirkondade vahel.24–27 Kuigi Lääne-Sitsiilia rinnavähi kohordi kohta on aruandeid, on Ida-Sitsiilia populatsiooni BRCA1/2 sõeluuringu kohta vähem andmeid.28,29
Kirjeldame siinkohal Ida-Sitsiilia emakakaelavähihaigetel tehtud iduliini BRCA1/2 skriinimise tulemusi, korreleerides BRCA1 või BRCA2 mutatsioonide esinemist nende kasvajate peamiste kliiniliste patoloogiliste tunnustega.
Retrospektiivne uuring viidi läbi Catania Rodolico San Marco Policlinico haigla eksperimentaalse onkoloogia ja hematoloogia keskuses. Jaanuarist 2017 kuni märtsini 2021 suunati meie molekulaardiagnostika laborisse BRCA/2 geneetiliseks testimiseks kokku 455 rinna- ja munasarjavähi, melanoomi, kõhunäärme- või eesnäärmevähiga patsienti. Uuring viidi läbi vastavalt Helsingi deklaratsioonile ja kõik osalejad andsid enne molekulaaranalüüsi kirjaliku nõusoleku.
B-vähi histoloogilisi ja bioloogilisi omadusi (ER, PgR, HER2 staatus, Ki-67 ja aste) hinnati biopsia või kirurgiliste proovide põhjal, arvestades ainult agressiivseid kasvaja komponente. Nende omaduste põhjal klassifitseeriti B-vähid järgmiselt: luminaalne A (ER+ ja/või PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminaalne B (ER+ ja/või PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminaalne B-HER2+ (ER ja/või PgR+, HER2+), HER2+ (ER ja PgR-, HER2+) või kolmiknegatiivne (ER ja PgR-, HER2-).
Enne BRCA1 ja BRCA2 mutatsiooni staatuse hindamist viis multidistsiplinaarne meeskond, kuhu kuulusid onkoloog, geneetik ja psühholoog, iga patsiendi jaoks läbi kasvajageneetika konsultatsiooni, et teha kindlaks BRCA1 ja/või BRCA1 olemasolu või isikud, kellel on kõrge PV risk BRCA2 geenis. Patsientide valik viidi läbi vastavalt Itaalia Meditsiinilise Onkoloogia Seltsi (AIOM) suunistele ja kohalikele Sitsiilia soovitustele.30,31 Need kriteeriumid hõlmavad järgmist: (i) teadaolevate patogeensete variantide esinemine vastuvõtlikkusgeenides (nt BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) mehed, kellel on rinnavähk; (iii) need, kellel on nii rinnavähk kui ka okulaarne karcinoma; (iv) naised, kellel on rinnavähk <36 aastat, ülitundlikkus rinnavähk <60 aastat või kahepoolne rinnavähk <50 aastat; (v) isiklik rinnavähi anamnees <50 aastat ja vähemalt ühe esimese astme sugulase esinemine: (a) rinnavähk <50 aastat; (b) mitte-mucinous ja mitte-piiripealne okulaarne karcinoma mis tahes vanuses; (c) kahepoolne rinnavähk; (d) meessoost rinnavähk; (e) kõhunäärmevähk; (f) eesnäärmevähk; (vi) kaks või enam isikut, kellel on rinnavähi anamneesis > 50 aastat ja perekonnas rinnavähi, okulaarse karcinoma või kõhunäärmevähi anamnees sugulastel, kes on üksteisele esimese astme sugulased (sh sugulased, kellega ta on esimese astme sugulane); (vii) isikul on rinnavähi anamnees ja vähemalt ühel esimese astme sugulasel: (a) rinnavähk < 50 aastat; (b) mitte-nakkuslik munasarjavähk; (c) kahepoolne rinnavähk; (d) meessoost rinnavähk; (vii) naine, kellel on kõrge astme seroosne okulaarne karcinoma.
Igalt patsiendilt võeti 20 ml perifeerse vere proov, mis koguti EDTA tuubidesse (BD Biosciences). Genoomne DNA eraldati 0,7 ml täisvereproovidest, kasutades QIAsymphony DSP DNA Midi komplekti isolatsioonikomplekti (QIAGEN, Hilden, Itaalia) vastavalt tootja juhistele ja juhiti läbi Qubit® 3.0 fluoromeetri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Viidi läbi kvantifitseerimine. Sihtmärgi rikastamine ja teekide ettevalmistamine toimub Oncomine™ BRCA Research Assay Chefi abil, mis on valmis laadimiseks Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 komplekti automatiseeritud teekide ettevalmistamiseks vastavalt tootja juhistele. Komplekt koosneb kahest multiplekssest PCR praimerite kogumist, mida saab kasutada kõigi BRCA1 (NM_007300.3) ja BRCA2 (NM_000059.3) geenide uurimiseks. Lühidalt, igast lahjendatud proovi DNA-st 15 µL (10 ng) lisati teekide ettevalmistamiseks vöötkoodiga plaatidele ja kõik reagendid ja kulumaterjalid laaditi Ion Chef™ instrumendile. Seejärel teostati Ion Chef™ instrumendil automatiseeritud teekide ettevalmistamine ja vöötkoodiga proovide teekide ühendamine. Valmistatud teekide arvu hinnati seejärel Qubit® 3.0 fluoromeetriga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. Lõpuks ühendatakse teegid ekvimolaarsetes suhetes Ion Chef™ teekide proovikatsutites (vöötkoodiga katsutid) ja laaditakse Ion Chef™ seadmesse. instrument. Sekveneerimine viidi läbi Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) instrumendiga (Thermo Fisher Scientific), kasutades Ion 510 kiipi (Thermo Fisher Scientific). Andmeanalüüs viidi läbi Amplicon Suite'i (SmartSeq srl) ja Ion Reporter tarkvara abil.
Kõik variantide nomenklatuurid järgisid Human Genome Variation Consortiumi kehtivaid suuniseid, mis on saadaval veebis (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). BRCA1/2 variantide kliiniline tähtsus määratleti rahvusvahelise konsortsiumi ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) klassifikatsiooni abil ja konsulteerides erinevate andmebaasidega, nagu ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD ja UMD. Klassifikatsioon hõlmab viit erinevat riskikategooriat: healoomuline (I kategooria), tõenäoliselt healoomuline (II kategooria), ebakindla tähtsusega variant (VUS, III kategooria), tõenäoliselt patogeenne (IV kategooria) ja patogeenne (V kategooria). VarSome analüüsis ka mutatsioonide mõju valgu struktuurile ja funktsioonile, mis on informatiivne tööriist juurdepääsuga 30 andmebaasile.32
Igale VUS-ile potentsiaalse kliinilise olulisuse omistamiseks kasutati järgmisi arvutuslikke valgu ennustamise algoritme: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) ja Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Klassi 1 ja 2 klassifitseeritud variante peeti metsiktüübiks.
Sangeri sekveneerimine kinnitas iga patogeense variandi olemasolu. Lühidalt, iga tuvastatud variandi jaoks kavandati spetsiifiliste praimerite paar, kasutades BRCA1 ja BRCA2 geeni referentsjärjestusi (vastavalt NG_005905.2, NM_007294.3 ja NG_012772.3, NM_000059.3). Seetõttu viidi läbi suunatud PCR, millele järgnes Sangeri sekveneerimine.
BRCA1/2 geeni suhtes negatiivse tulemusega patsiente testiti tootja juhiste kohaselt multipleksligatsioonist sõltuva sondi amplifikatsiooni (MLPA) abil, et hinnata suurte genoomsete ümberkorralduste (LGR) esinemist. Lühidalt, DNA proovid denatureeritakse ja kasutatakse kuni 60 BRCA1 ja BRCA2 geenispetsiifilist sondi, millest igaüks tuvastab umbes 60 nukleotiidi pikkuse spetsiifilise DNA järjestuse. Seejärel analüüsiti sondi amplifikatsiooniprodukte, mis koosnesid unikaalsest PCR-amplikonide komplektist, kapillaarelektroforeesi ja Cofalyser.Net tarkvara abil koos sobivate partiispetsiifiliste Cofalyseri tabelitega (www.mrcholland.com).
Valitud kliinilis-patoloogilised muutujad (histoloogiline aste ja Ki-67% proliferatsiooniindeks) seostati BRCA1/2 PV esinemisega, mis arvutati Prism tarkvara v. 8.4 abil, kasutades Fisheri täpset testi, eeldades, et p-väärtus <0,05 on oluline.
Ajavahemikul jaanuar 2017 kuni märts 2021 skriiniti 455 patsienti BRCA1/2 iduliini mutatsioonide suhtes. Mutatsioonitestid viidi läbi Policlinico haigla eksperimentaalse onkoloogia ja hematoloogia keskuses. Sitsiilia suuniste (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10. jaanuar 2020) kohaselt oli Catania – San Marco Rodolico haiglas kokku 389 patsienti: rinnavähk, 37 munasarjavähk, 16 kõhunäärmevähk, 8 eesnäärmevähk ja 5 melanoom. Patsientide jaotus vähi tüübi ja analüüsi tulemuste järgi on näidatud joonisel 1.
Joonis 1 näitab uuringu ülevaadet andvat vooskeem. Rinna-, melanoomi-, kõhunäärme-, eesnäärme- või munasarjakasvajatega patsiente testiti BRCA1 ja BRCA2 geenide mutatsioonide suhtes.
Lühendid: PV-d, patogeenne variant; VUS, ebakindla tähtsusega variant; WT, metsiktüüpi BRCA1/2 järjestus.
Meie uuringud keskendusid valikuliselt rinnavähi kohortidele. Patsientide mediaanvanus oli 49 aastat (vahemikus 23–89) ja nad olid valdavalt naised (n = 376 ehk 97%).
Nendest uuritavatest 64-l (17%) olid BRCA1/2 mutatsioonid ja kõik olid naised. 35-l (9%) oli PV ja 29-l (7,5%) VUS. 35 patogeensest variandist 17 (48,6%) esinesid BRCA1-s ja 18 (51,4%) BRCA2-s, samas kui 5 VUS-i esines BRCA1-s (17,2%) ja 24 (82,8%) BRCA2-s (joonis 1 ja 2). LGR-i MLPA analüüsis ei esinenud.
Joonis 2. BRCA1 ja BRCA2 mutatsioonide analüüs 389 rinnavähipatsiendil. (A) Patogeensete variantide (PV) (punane), ebaselge tähtsusega variantide (VUS) (oranž) ja WT (sinine) jaotus 389 rinnavähipatsiendil; (B) 389 rinnavähipatsienti Kolmekümnel viiel (9%) olid BRCA1/2 patogeensed variandid (PV). Nende hulgas oli 17 (48,6%) BRCA1 PV kandjat (tumepunane) ja 18 (51,4%) BRCA2 kandjat (helepunane); (C) 389 subjektist 29-l (7,5%) oli VUS, 5-l (17,2%) BRCA1 geeni (tumeoranž) ja 24-l (82,8%) BRCA2 geeni (heleoranž).
Lühendid: PV-d, patogeenne variant; VUS, ebakindla tähtsusega variant; WT, metsiktüüpi BRCA1/2 järjestus.
Järgmisena uurisime rinnavähi molekulaarsete alatüüpide levimust BRCA1/2 PV-ga patsientidel. Jaotus hõlmas 2 (5,7%) luminaalset A, 15 (42,9%) luminaalset B, 3 (8,6%) luminaalset B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ ja 13 (37,1%) TNBC patsienti. BRCA1-positiivsete patsientide seas oli 5-l (29,4%) luminaalne B-BC, 2-l (11,8%) HER2+ haigus ja 10-l (58,8%) TNBC. BRCA1 mutatsioonideta kasvajad olid kas luminaalsed A või luminaalsed B-HER2+ (joonis 3). BRCA2-positiivses alarühmas oli 10 (55,6%) kasvajat luminaalsed B, 3 (16,7%) olid luminaalsed B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC ja 2 (11,1%) olid luminaalsed A (joonis 3). Selles uuringus ei esinenud ühtegi HER2+ kasvajat. Seega on BRCA1 mutatsioonid levinud TNBC patsientidel, samas kui BRCA2 muutused on valdavad luumen B-ga inimestel.
Joonis 3. Rinnavähi alatüüpide levimus BRCA1 ja BRCA2 patogeensete variantidega patsientidel. Histogrammid, mis näitavad BRCA1- (tumepunane) ja BRCA2- (helepunane) PV-de jaotust rinnavähiga patsientide molekulaarsete alatüüpide vahel. Igas kastis esitatud numbrid esindavad BRCA1 ja BRCA2 PV-ga patsientide protsenti iga rinnavähi alatüübi kohta.
Lühendid: PV-d, patogeenne variant; HER2+, inimese epidermaalse kasvufaktori retseptor 2 positiivne; TNBC, kolmiknegatiivne rinnavähk.
Seejärel hindasime BRCA1 ja BRCA2 PV-de tüüpi ja geeni lokaliseerimist. BRCA1 PV-s täheldasime 7 ühe nukleotiidi varianti (SNV), 6 deletsiooni, 3 duplikatsiooni ja 1 insertsiooni. Ainult üks mutatsioon (c.5522delG) kujutab endast uut avastust. Mõlemal subjektil tuvastatud kõige sagedamini esinev BRCA1 PV oli c.5035_5039delCTAAT. See muutus hõlmab viie nukleotiidi deletsiooni (CTAAT) BRCA1 eksonis 15, mille tulemuseks on aminohappe leutsiini asendamine türosiiniga koodonil 1679 ja translatsiooniraami nihke tõttu ennustatud alternatiivse stoppkoodoniga valgu enneaegne kärpimine. Kõik muud muutused tuvastati ainult ühel juhul. Märkimisväärne on see, et üks teatatud PV-dest asus splaissingu konsensuspiirkonnas (c.4357+1G>T) (tabel 1).
BRCA2 PV puhul täheldasime 6 deletsiooni, 6 SNV-d ja 2 duplikatsiooni. Ükski leitud muutustest ei ole uudne. Meie populatsioonis kordus kolm mutatsiooni: c.428dup ja c.8487+1G>A, mida täheldati 3 subjektil, millele järgnes kahel juhul c.5851_5854delAGTT. c.428dup muutus hõlmab C kordumist BRCA2 5. eksonis, mis eeldatavasti kodeerib kärbitud, mittefunktsionaalset valku. c.8487+1G>A mutatsioon esineb BRCA2 introni 19 intronipiirkonnas (± 1,2) ja mõjutab splaissingu konsensusjärjestust, mille tulemuseks on muutunud splaissing, mis omakorda põhjustab ebanormaalset või puuduvat valku. c.5851_5854delAGTT patogeenne variant tuleneb 4-nukleotiidi deletsioonist BRCA2 geeni kodeeriva 10. eksoni nukleotiidipositsioonidelt 5851 kuni 5854 ja põhjustab translatsioonilise raamnihke ennustatud alternatiivse stoppkoodoniga. (p.S1951WfsTer). Nagu varem teatatud, tuvastati samal patsiendil nii muutused c.631G>A kui ka c.7008-2A>T.34 Esimene mutatsioon hõlmab adenosiini (A) asendamist BRCA2 eksonis 7 guaniini (G) sisaldava nukleotiidiga, mille tulemuseks on valiini muutumine isoleutsiiniks koodonil 211, isoleutsiini aminohape on aminohape, millel on väga sarnased omadused. See muutus mõjutab normaalset mRNA splaissingut. Teine variant asub intronilises piirkonnas ja põhjustab topelt-A asenduse tümiiniks (T) enne BRCA2 kodeeriva geeni 13. eksonit. Muutus c.7008-2A>T võib genereerida mitu erineva pikkusega transkripti. Lisaks oli BRCA2 PV-de rühmas 18 muutusest 4 (22,2%) intronilised.
Seejärel kaardistasime BRCA1/2 kahjulikud mutatsioonid funktsionaalsetes domeenides ja valke siduvates piirkondades (joonis 4). BRCA1 geenis paiknes 50% PV-dest rinnavähi klastri piirkonnas (BCCR), samas kui 22% mutatsioonidest paiknes munasarjavähi klastri piirkonnas (OCCR) (joonis 4A). BRCA2 PV puhul paiknes 35,7% variantidest BCCR piirkonnas ja 42,8% mutatsioonidest paiknes OCCR-is (joonis 4B). Seejärel hindasime PV asukohta BRCA1 ja BRCA2 valgu domeenides. BRCA1 valgu puhul leidsime kolm PV-d silmus- ja spiraaldomeenides ning kaks mutatsiooni BRCT domeenis (joonis 4A). BRCA2 valgu puhul kaardistati 4 PV-d BRC kordusdomeenile, samas kui oligo/oligosahhariidi siduvas (OB) ja torni (T) domeenis tuvastati 3 intronilist ja 3 eksonilist muutust (joonis 4B).
Joonis 4. BRCA1 ja BRCA2 valkude skemaatiline esitus ja patogeensete variantide lokaliseerimine. See joonis näitab BRCA1 (A) ja BRCA2 (B) patogeensete variantide jaotust rinnavähihaigetel. Eksoonilised mutatsioonid on näidatud sinisega, samas kui introonsed variandid on näidatud oranžiga. Tulba kõrgus tähistab juhtude arvu. Esitatakse BRCA1 ja BRCA2 valgud ja nende funktsionaalsed domeenid. (A) BRCA1 valk sisaldab silmusdomeeni (RING) ja tuuma lokaliseerimisjärjestust (NLS), spiraaldomeeni, SQ/TQ klastri domeeni (SCD) ja BRCA1 C-terminaalset domeeni (BRCT). (B) BRCA2 valk sisaldab kaheksat BRC kordust, DNA-sidumisdomeeni spiraalse domeeniga (Helical), kolme oligonukleotiidi/oligosahhariidi siduvat (OB) volti, torni domeeni (T) ja NLS-i C poolel. Allosas on näidatud piirkonnad, mida nimetatakse rinnavähi klastri piirkonnaks (BCCR) ja munasarjavähi klastri piirkonnaks (OCCR). *Esitab mutatsioone, mis määravad stoppkoodonid.
Seejärel uurisime rinnavähi kliinilisi ja patoloogilisi tunnuseid, mis võivad olla seotud BRCA1/2 PV esinemisega. Täielikud kliinilised andmed olid saadaval 181 BRCA1/2-negatiivse patsiendi (mittekandjad) ja kõigi kandjate (n = 35) kohta. Kasvaja proliferatsiooni määra ja astme vahel oli korrelatsioon.
Ki-67 jaotuse arvutasime meie kohordi mediaani põhjal (25%, vahemik <10–90%). Isikuid, kelle Ki-67 oli < 25%, defineeriti kui „madala Ki-67“ tasemega isikuid, samas kui isikuid, kelle väärtused olid ≥ 25%, peeti „kõrge Ki-67“ tasemega isikuteks. Olulisi Ki-67 erinevusi (p < 0,01) leiti mittekandjate ja BRCA1 PV kandjate vahel (joonis 5A).
Joonis 5. Ki-67 korrelatsioon astmejaotusega rinnavähiga naistel, kellel on ja ei ole BRCA1 ja BRCA2 PV-sid. (A) Kastidiagramm, mis näitab Ki-67 mediaanväärtusi 181 rinnavähi mittekandjal patsiendil võrreldes BRCA1 (18) või BRCA2 (17) PV-ga patsientidega. P-väärtusi alla 0,5 peeti statistiliselt oluliseks. (B) Histogramm, mis kujutab rinnavähiga patsientide jaotust histoloogilistesse astmerühmadesse (G2 ja G3) vastavalt BRCA1 ja BRCA2 mutatsiooni staatusele (WT subjektid, BRCA1 ja BRCA2 PV-de kandjad).
Samuti uurisime, kas kasvaja aste korreleerus BRCA1/2 PV esinemisega. Kuna G1 BC meie populatsioonis puudus, jagasime patsiendid kahte rühma (G2 või G3). Kooskõlas Ki-67 tulemustega näitas analüüs statistiliselt olulist korrelatsiooni kasvaja astme ja BRCA1 mutatsiooni vahel, kusjuures BRCA1 kandjatel oli G3 kasvajate osakaal suurem kui mittekandjatel (p<0,005) (joonis 5B).
DNA sekveneerimise tehnoloogia edusammud on võimaldanud enneolematuid edusamme BRCA1/2 geneetilises testimises, millel on oluline tähtsus patsientidele, kellel on perekonnas esinenud vähki. Praeguseks on tuvastatud ja klassifitseeritud ligikaudu 20 000 BRCA1/2 varianti vastavalt Ameerika Meditsiinilise Geneetika Ühingu35 ja ENIGMA süsteemile.35,36 On hästi teada, et BRCA1/2 mutatsioonispekter on geograafilistes piirkondades väga erinev.37 Itaalias oli BRCA1/2 PV-de määr vahemikus 8% kuni 37%, mis näitab suurt riigisisest varieeruvust.38,39 Peaaegu 5 miljoni elanikuga on Sitsiilia elanike arvu poolest Itaalia suuruselt viies piirkond. Kuigi andmed BRCA1/2 leviku kohta Lääne-Sitsiilias on olemas, puuduvad ulatuslikud tõendid saare idaosas.
Meie uuring on üks esimesi aruandeid BRCA1/2 PV esinemissageduse kohta rinnavähihaigetel Ida-Sitsiilias.28 Keskendusime oma analüüsis rinnavähile, kuna see on meie kohordis vaieldamatult kõige levinum haigus.
389 rinnavähihaige testimisel leiti, et 9%-l olid BRCA1/2 PV-d, mis olid ühtlaselt jaotunud BRCA1 ja BRCA2 vahel. Need tulemused on kooskõlas Itaalia populatsioonis varem teatatutega.28 Huvitaval kombel olid meie kohordist 3% (13/389) mehed. See määr on meeste rinnavähi puhul oodatust kõrgem (1% kõigist rinnavähi juhtudest),40 mis peegeldab meie populatsioonide valikut BRCA1/2 mutatsiooniriski põhjal. Ühelgi neist meestest ei tekkinud aga BRCA1/2 PV-d, seega olid nad kandidaadid edasiseks molekulaarseks analüüsiks, et välistada vähem levinud mutatsioonide, näiteks PALB2, RAD51C ja D, esinemine. Ebakindla tähtsusega variante leiti 7%-l isikutest, kellel oli ilmne BRCA2 VUS. Isegi see tulemus on kooskõlas olemasolevate tõenditega.28,41,42
Kui analüüsisime rinnavähi molekulaarsete alatüüpide jaotust BRCA1/2 mutantsetel naistel, kinnitasime teadaolevaid seoseid TNBC ja BRCA1 PV vahel (58,8%) ning luminaalse B rinnavähi ja BRCA2 PV vahel (55,6%).16,43 Luminaalse A ja HER2+ kasvajad BRCA1 ja BRCA2 PV kandjatel on kooskõlas olemasolevate kirjandusandmetega.16,43
Seejärel keskendume BRCA1/2 PV tüübile ja asukohale. Meie kohordis oli kõige levinum BRCA1 PV c.5035_5039delCTAAT. Kuigi Incorvaia jt. ei kirjeldanud seda varianti oma Sitsiilia kohordis, teised autorid on sellest teatanud kui germinaalsest BRCA1 PV-st.34 Meie kohordis leiti mitu BRCA1 PV-d – nt c.181T>G, c.514del, c.3253dupA ja c.5266dupC –, mida on täheldatud Sitsiilias.28 Neist kahte BRCA1 asutajamutatsiooni (c.181T>G ja c.5266dupC) leidub tavaliselt Ida- ja Kesk-Euroopa (Poola, Tšehhi), Sloveenia, Austria, Ungari, Valgevene ja Saksamaa aškenazi juutidel44,45 ning Ameerika Ühendriikides ja Argentinas defineeriti see hiljuti kui „korduv germinaalse variant“ Itaalia patsientidel, kellel on rinnavähk ja okulaarne kartsinoom. Variant 34c.514del tuvastati varem 8 rinnavähipatsiendil Põhja-Sitsiilias Palermos ja Messinas. Huvitaval kombel isegi Incorvaia jt. leidsid Catanias mõnedes perekondades c.3253dupA variandi.28 Kõige tüüpilisemad BRCA2 PV-d on c.428dup, c.5851_5854delAGTT ja introoniline variant c.8487+1G>A, millest on üksikasjalikumalt teatatud28 Palermos patsiendil, kellel oli c.428dup, täheldati c.5851_5854delAGTT PV-d Loode-Sitsiilia leibkondades, peamiselt Trapani ja Palermo piirkondades, samas kui c.5851_5854delAGTT PV-d täheldati Loode-Sitsiilia leibkondades. 8487+1G>A variant oli sagedasem Messina, Palermo ja Caltanissetta uuritavatel.28 Rebbeck jt. kirjeldasime varem Colombias esinevat muutust c.5851_5854delAGTT.37 Teine BRCA2 PV, c.631+1G>A, on leitud Sitsiilia (Agrigento, Siracusa ja Ragusa) rinnavähi ja kõhunäärmevähi patsientidelt.28 Märkimisväärselt täheldasime samal patsiendil kahe BRCA2 variandi (BRCA2 c.631G>A ja c.7008-2A>T) koosesinemist, mille puhul eeldasime, et need on cis-režiimis eraldatud, nagu varem teatatud.34,46 Neid BRCA2 uble-mutatsioone täheldatakse Itaalia piirkonnas tõepoolest sageli ja on leitud, et need toovad sisse enneaegseid stoppkoodoneid, mõjutades messenger RNA splaissingut ja põhjustades BRCA2 valgu rikke.47,48
Samuti kaardistasime BRCA1 ja BRCA2 PV-d oletatavates OCCR ja BCCR piirkondades valgu domeenides ja geenides. Rebbeck jt kirjeldasid neid piirkondi vastavalt munasarja- ja rinnavähi tekke riskipiirkondadena.49 Siiski on tõendid seose kohta iduliini variantide asukoha ja rinna- või munasarjavähi riski vahel endiselt vastuolulised.28,50-52 Meie populatsioonis asusid BRCA1 PV-d peamiselt BCCR piirkonnas, samas kui BRCA2 PV-d asusid peamiselt OCCR piirkonnas. Siiski ei suutnud me leida mingit seost oletatavate OCCR ja BCCR piirkondade ning rinnavähi tunnuste vahel. See võib olla tingitud piiratud arvust patsientidest, kellel on BRCA1/2 mutatsioonid. Valgu domeeni vaatenurgast on BRCA1 PV-d jaotunud kogu valgu ulatuses ja BRCA2 muutusi leidub eelistatavalt BRC kordusdomeenis.
Lõpuks korreleerisime rinnavähi kliinilis-patoloogilised tunnused BRCA1/2 PV-ga. Kuna uuringusse kaasatud patsientide arv oli piiratud, leidsime olulise korrelatsiooni ainult Ki-67 ja kasvaja astme vahel. Kuigi Ki-67 hindamine ja tõlgendamine on endiselt mõnevõrra vastuoluline, on kindel, et kõrge proliferatsioonimäär on seotud haiguse kordumise suurenenud riski ja lühema elulemusega. Praeguseks on „kõrge” ja „madala” Ki-67 eristamise piirväärtus 20%. See lävi ei kehti aga meie BRCA1/2 mutatsiooniga patsientide populatsiooni kohta, kelle Ki-67 mediaanväärtus on 25%. Seda kõrge Ki-67 määra suundumust saab seletada levimusega meie luminaalse B ja TNBC kohortides, kus esines vähe luminaalse A kasvajaid. Siiski näivad mõned tõendid viitavat sellele, et kõrgem Ki-67 piirväärtus (25–30%) võib patsiente paremini prognoosi järgi stratifitseerida.53,54 Meie analüüsi tulemuste põhjal ei ole oluline korrelatsioon üllatav. Esineb kõrge Ki-67 ja astmete ning BRCA1 PV esinemise vahel. Tegelikult BRCA1-ga seotud kasvajad on tüüpilised TNBC-le ja neil on agressiivsemad tunnused.16,17
Kokkuvõtteks annab see uuring ülevaate BRCA1/2 mutatsioonistaatusest Ida-Sitsiilia rinnavähi kohordis. Üldiselt on meie tulemused kooskõlas olemasolevate tõenditega nii mutatsioonide levimuse kui ka rinnavähi kliiniliste ja patoloogiliste tunnuste osas. BRCA1/2-mutatsiooniga rinnavähihaigete suuremate populatsioonide, näiteks multigenoomi laiendatud mutatsioonianalüüsi abil, on õigustatud BRCA1/2-st erinevate ja harvemate PV-de esinemise hindamiseks. See võimaldab tuvastada ja õigesti ravida üha suurenevat arvu subjekte, kellel on geneetiliste mutatsioonide tõttu suurenenud vähirisk.
Me kinnitasime, et patsiendid allkirjastasid teadliku nõusoleku oma kasvajaproovide anonüümseks avaldamiseks teadusuuringute eesmärgil. Kõik patsiendid allkirjastasid kirjaliku teadliku nõusoleku vastavalt Helsingi deklaratsioonile. AOU polikliiniku „G. Rodolico – S. Marco” poliitika kohaselt vabastati see uuring eetilisest läbivaatusest, kuna BRCA1/2 analüüs viidi läbi vastavalt kliinilisele praktikale ja kõik patsiendid andsid kirjaliku teadliku nõusoleku. Patsiendid annavad ka nõusoleku oma andmete kasutamiseks teadusuuringute eesmärgil.
Täname prof Paolo Vignerit abi eest rinnavähihaigete ravis eetikakomitee palvel.
Federica Martorana teatab Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartise ja Pfizeri honoraridest. Teised autorid kinnitavad, et neil ei ole selles töös huvide konflikte.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL jt. Globaalne vähistatistika 2020: GLOBOCAN hindab 36 vähiliigi esinemissagedust ja suremust 185 riigis üle maailma. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660