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作者 Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella, Dipartimento di Medicina Clinica1,21 di Catania, Catania, Catania. 95123, Italy;2 Center for Experimental Oncology and Hematology, AOU Policlinico "G.Rodolico - San Marco", Catania , 95123, Italy; 3 Oncologia Medica, AOU Policlinicu "G. Rodolico - San Marco", Catania, 95123, Italia; 4 Genetica Medica, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italia; 5 Medicine Genetica, ASP, Siracusa, 96100, Italia; 6 Dipartimentu di Scienze Biomediche è Biotecnologiche, Università di Catania, Genetica Medica, Catania, Italia, 95123; 7Istitutu di Ricerca Oasi-IRCCS, Troina, 94018, Italia Comunicazioni: Stefania Stella, tel +39 095 378 1946, email [email protected]; [email protected] Scopu: Mutazioni germinali in BRCA1 è BRCA2 è cancru di u senu (BC) stabilitu, di l'ovaru (OC) è altri assuciati à un risicu di cancru per tutta a vita. U test per u genu BRCA hè chjave per valutà u risicu individuale, è ancu per truvà metudi di prevenzione in portatori sani è adattà i trattamenti in i pazienti cun cancru. A prevalenza di alterazioni BRCA1 è BRCA2 varia assai trà e regioni geografiche, è ancu s'è esistenu dati nantu à e varianti patogene BRCA in e famiglie siciliane, mancanu studii chì miranu specificamente à e pupulazioni in Sicilia orientale. U scopu di u nostru studiu era di investigà l'incidenza è a distribuzione di alterazioni germinali patogene BRCA in una coorte di pazienti BC di a Sicilia orientale è di valutà a so associazione cù tratti BC specifici utilizendu u sequenziamentu di prossima generazione. A presenza di alterazioni era correlata cù u gradu di u tumore è l'indice di proliferazione. RISULTATI: In generale, 35 pazienti (9%) avianu una variante patogena BRCA, 17 (49%) in BRCA1 è 18 (51%) in BRCA2. L'alterazioni BRCA1 sò prevalenti in i pazienti BC triplu negativi, mentre chì e mutazioni BRCA2 sò più cumuni in i pazienti BC luminali. Paragunatu Cù i non-portatori, i sughjetti cù varianti BRCA1 avianu un gradu tumorale è un indice proliferativu significativamente più alti. Conclusioni: I nostri risultati furniscenu una panoramica di u statu mutazionale BRCA in i pazienti cun BC di a Sicilia orientale è cunfirmanu u rolu di l'analisi NGS in l'identificazione di i pazienti cun BC ereditariu. In generale, questi dati sò coerenti cù l'evidenza precedente chì sustene u screening BRCA per una prevenzione è un trattamentu adeguati di u cancru in i portatori di mutazioni.
U cancru di u senu (BC) hè a malignità a più cumuna in u mondu sanu è u cancru u più mortale in e donne.1 E caratteristiche biologiche chì determinanu a prognosi è u cumpurtamentu clinicu di u BC sò state studiate ampiamente è parzialmente elucidate cù u tempu. In fatti, parechji marcatori surrogati sò attualmente aduprati per classificà u BC in diversi sottotipi moleculari. Sò u receptore di estrogeni (ER) è/o progesterone (PgR), l'amplificazione di u receptore 2 di u fattore di crescita epidermica umana (HER2), l'indice di proliferazione Ki-67 è u gradu di u tumore (G).2 A cumminazione di queste variabili hà identificatu e seguenti categurie di BC: 1) Tumori luminali, chì mostranu espressione di ER è/o PgR, rapprisentavanu u 75% di i BC. Questi tumori sò stati ulteriormente divisi in Luminale A, quandu Ki-67 era inferiore à u 20% è HER2 negativu, è Luminale B, quandu Ki-67 era uguale o superiore à u 20% è in presenza di amplificazione di HER2, indipendentemente da l'indice di proliferazione; 2) Tumori HER2+ chì sò ER è PgR negativi ma mostranu amplificazione di HER2. Stu gruppu rapprisenta u 10% di tutti i tumori di u senu; 3) Cancru di u senu triplu negativu (TNBC), chì ùn mostra micca espressione di ER è PgR è amplificazione di HER2, rapprisenta circa u 15% di i cancri di u senu.2-4
Trà questi sottotipi di BC, u gradu di u tumore è l'indice di proliferazione rapprisentanu biomarcatori trasversali chì sò direttamente è indipindentamente assuciati à l'aggressività è a prognosi di u tumore.5,6
In più di e caratteristiche biologiche sopra menzionate, u rolu di l'alterazioni genetiche ereditarie chì portanu à u sviluppu di u BC hè diventatu sempre più impurtante in l'ultimi anni.7 Circa 1 tumore di u senu nantu à 10 hè ereditatu per via di alterazioni di a linea germinale in geni specifici.8 Dui grandi studii epidemiologichi chì implicanu più di 180.000 donne anu recentemente identificatu un gruppu di ottu geni (vale à dì, ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C è RAD51D) principalmente rispunsevuli di u BC ereditariu. Trà questi geni, BRCA1 è BRCA2 (in seguitu chjamati BRCA1/2) anu mostratu a più forte currelazione cù u sviluppu di tumori di u senu.9-12 In fatti, e mutazioni di a linea germinale BRCA1/2 aumentanu significativamente u risicu di BC per tutta a vita è ancu altre malignità, cumprese ovariane, prostate, pancreatiche, colorettali è melanoma. Da 13 à 80 anni, l'incidenza cumulativa di BC hè di 72% in e donne cù una variante patogena (PV) BRCA1 è di 69% in e donne cù una variante BRCA2. PV.14
In particulare, una publicazione recente suggerisce chì u risicu di BC dipende da u tipu di PV. In fatti, paragunatu à e varianti troncanti patogene, e varianti missense evidenti, in particulare in u genu BRCA1, sò assuciate à un risicu riduttu di BC, in particulare in e donne anziane.15
A presenza di BRCA1 o BRCA2 PV era assuciata à diverse caratteristiche biologiche è clinicopatologiche.16,17 I BC assuciati à BRCA1 tendenu à esse clinicamente aggressivi, pocu differenziati è altamente proliferativi. Quessi tumori sò generalmente tripli negativi è anu una età di insorgenza precoce. I tumori chì si verificanu in pazienti cun mutazione BRCA2 mostranu tipicamente gradi da moderati à ben differenziati è indici proliferativi variabili. Quessi tumori sò più cumuni in u lume B è si verificanu di solitu in adulti anziani.16-18 In particulare, e mutazioni in BRCA1 è BRCA2 aumentanu a sensibilità à trattamenti specifici, cumpresi i sali di platinu è i farmaci mirati cum'è l'inibitori di a polimerasi poli(ADP-ribosio) (PARPi).19,20
In l'ultimi anni, l'implementazione di u sequenziamentu di prossima generazione (NGS) in a pratica clinica hà permessu à un numeru crescente di pazienti cun BC di sottumessu à testi moleculari per e sindromi di suscettibilità à u cancru, cumprese BRCA1 / 2.21 À u listessu tempu, definizioni basate nantu à criteri precisi riguardanti a storia familiare, e caratteristiche demografiche è clinicopatologiche per identificà megliu l'individui degni di test BRCA1 / 2.22,23 In questu cuntestu, l'evidenza si accumula nantu à u screening BRCA1 / 2 in pupulazioni specifiche, mettendu in risaltu e differenze trà e regioni geografiche.24-27 Ancu s'ellu ci sò rapporti nantu à a coorte BC in Sicilia occidentale, menu dati sò dispunibili nantu à u screening BRCA1 / 2 in a pupulazione di a Sicilia orientale.28,29
Descrivemu quì i risultati di u screening germinale BRCA1/2 in pazienti cun cancru di u senu (BC) di a Sicilia orientale, currelendu ulteriormente a presenza di mutazioni BRCA1 o BRCA2 cù e principali caratteristiche clinicopatologiche di sti tumori.
Un studiu retrospettivu hè statu realizatu à u "Centru di Oncologia Sperimentale è Ematologia" à l'Ospedale Policlinico. Rodolico - San Marco in Catania. Da ghjennaghju 2017 à marzu 2021, un totale di 455 pazienti cun cancru di u senu è di l'ovaru, melanoma, pancreas o di a prostata sò stati mandati à u nostru laburatoriu di diagnostica moleculare per testi genetichi BRCA / 2. Questu studiu hè statu realizatu in cunfurmità cù a Dichjarazione di Helsinki, è tutti i participanti anu furnitu u so accunsentu infurmatu scrittu prima di l'analisi moleculare.
E caratteristiche istologiche è biologiche (ER, PgR, statutu HER2, Ki-67, è gradu) di u BC sò state valutate nantu à biopsia core o campioni chirurgichi, cunsiderendu solu i cumpunenti tumorali aggressivi. Basendu si nantu à ste caratteristiche, i BC sò stati classificati cusì: luminale A (ER+ è/o PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminale B (ER+ è/o PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminale B-HER2+ (ER è/o PgR+, HER2+), HER2+ (ER è PgR-, HER2+) o triplu negativu (ER è PgR-, HER2-).
Prima di valutà u statu di mutazione di BRCA1 è BRCA2, una squadra multidisciplinaria chì include un oncologu, un geneticu è un psicologu hà realizatu una cunsultazione genetica tumorale per ogni paziente per determinà a presenza di BRCA1 è/o BRCA1. o individui cun un risicu elevatu di PV in u genu BRCA2. A selezzione di i pazienti hè stata effettuata secondu e linee guida di a Società Italiana di Oncologia Medica (AIOM) è e raccomandazioni lucali siciliane.30,31 Questi criteri includenu: (i) storia familiare di varianti patogene cunnisciute in i geni di suscettibilità (per esempiu, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) masci cun BC; (iii) quelli cun BC è OC; (iv) donne cun BC <36 anni, TNBC <60 anni, o BC bilaterale <50 anni; (v) storia medica persunale di BC <50 anni è almenu un parente di primu gradu: (a) BC <50 anni; (b) OC non mucinoso è non borderline di qualsiasi età; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (e) cancru di u pancreas; (f) cancru di a prustata; (vi) duie o più storie persunali di BC > 50 anni è storie familiale di BC, OC, o cancru di u pancreas per i parenti chì sò parenti di primu gradu trà di elli (cumpresi i parenti cù i quali hè parente di primu gradu); (vii) Storia persunale di OC è almenu un parente di primu gradu: (a) BC <50 anni; (b) NOC; (c) BC bilaterale; (d) BC maschile; (vii) femina cù OC sierosa di altu gradu.
Un campione di sangue perifericu di 20 mL hè statu ottenutu da ogni paziente è raccoltu in tubi EDTA (BD Biosciences). U DNA genomicu hè statu isolatu da campioni di sangue interu di 0,7 mL utilizendu u kit d'isolamentu QIAsymphony DSP DNA Midi (QIAGEN, Hilden, Italia) secondu l'istruzzioni di u fabricatore è passatu per un Fluorometru Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Eseguite a quantificazione. L'arricchimentu di u bersagliu è a preparazione di a biblioteca sò realizati da l'Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, pronti per esse caricati in u Kit Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 per a preparazione automatizata di a biblioteca secondu l'istruzzioni di u fabricatore. U kit hè custituitu da dui pools di primer PCR multiplex chì ponu esse aduprati per studià tutti i geni BRCA1 (NM_007300.3) è BRCA2 (NM_000059.3). In breve, 15 µL di ogni DNA campione diluitu (10 ng) hè statu aghjuntu à piastre cù codice à barre per a preparazione di a biblioteca è tutti i reagenti è i consumabili sò stati caricati nantu à u strumentu Ion Chef™. A preparazione automatizata di a biblioteca è u pooling di a biblioteca di campioni cù codice à barre sò stati poi realizati nantu à u strumentu Ion Chef™. U numeru di biblioteche preparate hè statu poi valutatu da un Fluorometru Qubit® 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. Infine, e biblioteche sò cumminate in rapporti equimolari in tubi di campioni di biblioteca Ion Chef™ (tubi cù codice à barre) è caricate. nantu à u strumentu Ion Chef™. U sequenziamentu hè statu realizatu cù un strumentu Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) (Thermo Fisher Scientific) utilizendu un chip Ion 510 (Thermo Fisher Scientific). L'analisi di i dati hè stata realizata da Amplicon Suite (SmartSeq srl) è u software Ion Reporter.
Tutta a nomenclatura di e varianti hà seguitu l'attuali linee guida di u Consorziu di Variazione di u Genomu Umanu, dispunibule in linea (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). A significazione clinica di e varianti BRCA1/2 hè stata definita utilizendu a classificazione di u Consorziu Internaziunale ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) è cunsultendu diverse basi di dati cum'è ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD è UMD. A classificazione include cinque distinte categurie di risicu: benigna (categoria I), probabilmente benigna (categoria II), variante di significazione incerta (VUS, categoria III), probabilmente patogena (categoria IV) è patogena (categoria V). VarSome hà ancu analizatu l'effettu di e mutazioni nantu à a struttura è a funzione di e proteine, un strumentu informativu cù accessu à 30 basi di dati.32
Per assignà una significazione clinica putenziale à ogni VUS, sò stati utilizati i seguenti algoritmi computazionali di predizione di proteine: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) è Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). E varianti classificate cum'è classe 1 è 2 sò state cunsiderate di tipu salvaticu.
U sequenziamentu Sanger hà cunfirmatu a presenza di ogni variante patogena. In breve, una coppia di primer specifichi hè stata cuncipita per ogni variante rilevata utilizendu e sequenze di riferimentu di i geni BRCA1 è BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 è NG_012772.3, NM_000059.3, rispettivamente). Dunque, hè stata realizata una PCR mirata seguita da u sequenziamentu Sanger.
I pazienti chì anu avutu un risultatu negativu per u genu BRCA1/2 sò stati testati per amplificazione di sonde dipendente da a ligazione multiplex (MLPA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore per valutà a presenza di grandi riarrangiamenti genomichi (LGR). In breve, i campioni di DNA sò denaturati è sò aduprate finu à 60 sonde specifiche di i geni BRCA1 è BRCA2, ognuna di e quali rileva una sequenza di DNA specifica di circa 60 nucleotidi di lunghezza. I prudutti di amplificazione di a sonda, custituiti da un inseme unicu di ampliconi PCR, sò stati poi analizzati per elettroforesi capillare è da u software Cofalyser.Net in cunghjunzione cù e tabelle Cofalyser specifiche per u batch (www.mrcholland.com).
E variabili clinicopatologiche selezziunate (gradu istologicu è indice di proliferazione Ki-67%) sò state assuciate à a presenza di BRCA1/2 PV, calculate cù u software Prism v. 8.4 aduprendu u test esattu di Fisher assumendu chì un valore p <0,05 sia significativu.
Trà ghjennaghju 2017 è marzu 2021, 455 pazienti sò stati esaminati per e mutazioni germinali BRCA1/2. I testi di mutazione sò stati realizati à u Centru di Oncologia Sperimentale è Ematologia di l'Ospedale Policlinico. Sicondu a linea guida siciliana (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), u Rodolico di Catania - San Marco "in totale, 389 pazienti. Ci eranu cancri di u senu, 37 cancri di l'ovaru, 16 cancri di u pancreas, 8 cancri di a prostata è 5 melanoma. A distribuzione di i pazienti secondu u tipu di cancru è i risultati di l'analisi hè mostrata in a Figura 1.
A figura 1 mostra un diagramma di flussu chì mostra una panoramica di u studiu. I pazienti cun tumori di u senu, di u melanoma, di u pancreas, di a prostata o di l'ovariu sò stati testati per mutazioni in i geni BRCA1 è BRCA2.
Abbreviazioni: PVs, variante patogena; VUS, variante di significatu incertu; WT, sequenza BRCA1/2 di tipu salvaticu.
Avemu focalizatu selettivamente i nostri studii nantu à e coorti di cancru di u senu. I pazienti avianu una età mediana di 49 anni (intervallu 23-89) è eranu principalmente femine (n = 376, o 97%).
Di sti sughjetti, 64 (17%) avianu mutazioni BRCA1/2 è eranu tutti femine. Trentacinque (9%) avianu PV è 29 (7,5%) avianu VUS. Diciassette (48,6%) di e 35 varianti patogene si sò verificate in BRCA1 è 18 (51,4%) in BRCA2, mentre chì 5 VUS si sò verificate in BRCA1 (17,2%) è 24 (82,8%) in BRCA2 (Figure 1 è 2). LGR ùn era micca presente in l'analisi MLPA.
Figura 2. Analisi di e mutazioni BRCA1 è BRCA2 in 389 pazienti cun cancru di u senu. (A) Distribuzione di e varianti patogene (PV) (rossu), varianti di significatu incertu (VUS) (aranciu) è WT (blu) in 389 pazienti cun cancru di u senu; (B) 389 pazienti cun cancru di u senu Trentacinque (9%) avianu varianti patogene (PV) BRCA1/2. Trà elle, 17 (48,6%) eranu portatrici di PV BRCA1 (rossu scuru) è 18 (51,4%) eranu portatrici di BRCA2 (rossu chjaru); (C) 29 (7,5%) di 389 sughjetti purtavanu VUS, 5 (17,2%) geni BRCA1 (aranciu scuru) è 24 (82,8%) geni BRCA2 (aranciu chjaru).
Abbreviazioni: PVs, variante patogena; VUS, variante di significatu incertu; WT, sequenza BRCA1/2 di tipu salvaticu.
Dopu, avemu investigatu a prevalenza di i sottotipi moleculari di BC in i pazienti cun BRCA1/2 PV. A distribuzione includeva 2 (5,7%) luminal A, 15 (42,9%) luminal B, 3 (8,6%) luminal B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ è 13 (37,1%) pazienti TNBC. Trà i pazienti BRCA1-pusitivi, 5 (29,4%) avianu BC luminal B, 2 (11,8%) avianu a malatia HER2+, è 10 (58,8%) avianu TNBC. I tumori senza mutazioni BRCA1 eranu luminal A o luminal B-HER2+ (Figura 3). In u sottogruppu BRCA2-pusitivu, 10 (55,6%) tumori eranu luminal B, 3 (16,7%) eranu luminal B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC è 2 (11,1%) eranu luminal A (Figura 3). Nisun tumore HER2+ era prisente in questu gruppu. Cusì, e mutazioni BRCA1 sò prevalenti in i pazienti TNBC, mentre chì l'alterazioni BRCA2 sò predominanti in l'individui di lume B.
Figura 3 Prevalenza di i sottotipi di cancru di u senu in i pazienti cù varianti patogene in BRCA1 è BRCA2. Istogrammi chì mostranu a distribuzione di i PV BRCA1- (rossu scuru) è BRCA2- (rossu chjaru) trà i sottotipi moleculari di i pazienti cù cancru di u senu. I numeri riportati in ogni casella rapprisentanu a percentuale di pazienti cù PV BRCA1 è BRCA2 per ogni sottotipu di cancru di u senu.
Abbreviazioni: PV, variante patogena; HER2+, receptore 2 pusitivu à u fattore di crescita epidermica umana; TNBC, cancru di u senu triplu negativu.
In seguitu, avemu valutatu u tipu è a lucalizazione di u genu di i PV BRCA1 è BRCA2. In u PV BRCA1, avemu osservatu 7 varianti di nucleotidi singuli (SNV), 6 delezioni, 3 duplicazioni è 1 inserzione. Solu una mutazione (c.5522delG) rapprisenta una nova scuperta. U PV BRCA1 più cumunu rilevatu in i dui sughjetti era c.5035_5039delCTAAT. Questa alterazione implica una delezione di cinque nucleotidi (CTAAT) in l'exone 15 di BRCA1, chì risulta in a sustituzione di l'aminoacidu leucina da a tirosina à u codon 1679, è per via di un frameshift di traduzzione cù un codon di stop alternativu previstu porta à una troncatura prematura di e proteine. Tutti l'altri cambiamenti sò rilevati solu in un casu. In particulare, unu di i PV segnalati era situatu in a regione di consensu di u situ di splicing (c.4357 + 1G> T) (Tabella 1).
Riguardu à BRCA2 PV, avemu osservatu 6 delezioni, 6 SNV è 2 duplicazioni. Nisunu di i cambiamenti truvati hè novu. Trè mutazioni si sò ripresentate in a nostra pupulazione, c.428dup è c.8487+1G>A osservati in 3 sughjetti, seguitati da c.5851_5854delAGTT recuperati in dui casi. L'alterazione c.428dup implica una ripetizione di C in l'exone 5 di BRCA2, prevista per codificà una proteina troncata è non funzionale. A mutazione c.8487+1G>A si verifica in a regione intronica di l'introne 19 di BRCA2 (± 1,2) è affetta a sequenza di consensu di splicing, risultendu in un splicing alteratu chì risulta in una proteina anormale o assente. A variante patogena c.5851_5854delAGTT hè dovuta à una delezione di 4 nucleotidi da e pusizioni di nucleotidi 5851 à 5854 in l'exone codificante 10 di u genu BRCA2 è risulta in un Frameshift traduzionale cù un codon stop alternativu previstu (p.S1951WfsTer). In particulare, cum'è riportatu prima, e duie alterazioni c.631G>A è c.7008-2A>T sò state rilevate in u listessu paziente.34 A prima mutazione implica a sustituzione di l'adenosina (A) in l'exone 7 di BRCA2 cù un nucleotide chì cuntene guanina (G) chì risulta in un cambiamentu di valina in isoleucina à u codon 211, l'aminoacidu isoleucina hè un aminoacidu cù proprietà assai simili. Stu cambiamentu affetta u splicing normale di l'mRNA. A seconda variante si trova in una regione intronica è risulta in una doppia sustituzione di A à timina (T) prima di l'exone 13 di u genu chì codifica BRCA2. U cambiamentu c.7008-2A>T pò generà trascritti multipli di diverse lunghezze. Inoltre, in u gruppu di PV BRCA2, 4 di 18 cambiamenti (22,2%) eranu intronici.
Avemu dopu mappatu e mutazioni deleterie di BRCA1/2 in i duminii funziunali è e regioni di legame à e proteine ​​(Fig. 4). In u genu BRCA1, u 50% di i PV eranu situati in a regione di u cluster di u cancru di u senu (BCCR), mentre chì u 22% di e mutazioni eranu situate in a regione di u cluster di u cancru ovarianu (OCCR) (Fig. 4A). In BRCA2 PV, u 35,7% di e varianti eranu situate in a regione BCCR è u 42,8% di e mutazioni eranu situate in l'OCCR (Fig. 4B). In seguitu, avemu valutatu a situazione di i PV in i duminii proteichi BRCA1 è BRCA2. Per a proteina BRCA1, avemu trovu trè PV in i duminii loop è coiled coil, è duie mutazioni in u duminiu BRCT (Fig. 4A). Per a proteina BRCA2, 4 PV mappati in u duminiu di ripetizione BRC, mentre chì 3 cambiamenti intronici è 3 esonici sò stati rilevati in i duminii di legame oligo/oligosaccharide (OB) è tower (T) (Figura 4B).
Figura 4 Rappresentazione schematica di e proteine ​​BRCA1 è BRCA2 è lucalizazione di e varianti patogene. Questa figura mostra a distribuzione di e varianti patogene BRCA1 (A) è BRCA2 (B) in i pazienti cun cancru di u senu. E mutazioni esoniche sò mostrate in blu, mentre chì e varianti introniche sò mostrate in aranciu. L'altezza di a barra rapprisenta u numeru di casi. E proteine ​​BRCA1 è BRCA2 è i so duminii funziunali sò riportati. (A) A proteina BRCA1 cuntene un duminiu ad anello (RING) è una sequenza di lucalizazione nucleare (NLS), un duminiu coiled-coil, un duminiu cluster SQ/TQ (SCD) è un duminiu C-terminale BRCA1 (BRCT). (B) A proteina BRCA2 cuntene ottu ripetizioni BRC, un duminiu di legame à u DNA cù un duminiu elicoidale (Helical), trè pieghe di legame à oligonucleotidi/oligosaccaridi (OB), un duminiu torre (T) è un NLS da u latu C. E zone chjamate Breast Cancer Cluster Region (BCCR) è Ovarian Cancer Cluster Region (OCCR) sò mostrate in fondu. * Rapprisenta mutazioni chì determinà i codoni di stop.
Avemu dopu investigatu e caratteristiche clinicopatologiche di u BC chì puderanu esse correlate cù a presenza di BRCA1/2 PV. Registri clinichi cumpleti eranu dispunibili per 181 pazienti BRCA1/2-negativi (non portatori) è tutti i portatori (n = 35). Ci era una currelazione trà u tassu di proliferazione tumorale è u gradu.
Avemu calculatu a distribuzione di Ki-67 basatu annantu à a mediana di a nostra coorte (25%, intervallu <10-90%). I sughjetti cù Ki-67 < 25% sò stati definiti cum'è "Ki-67 bassu", mentre chì l'individui cù valori ≥ 25% sò stati cunsiderati "Ki-67 altu". Differenze significative di Ki-67 (p <0,01) sò state trovate trà i non portatori è i portatori di BRCA1 PV (Fig. 5A).
Figura 5 Correlazione di Ki-67 cù a distribuzione di u gradu in e donne cun cancru di u senu cù è senza PV BRCA1 è BRCA2. (A) Boxplot chì mostra i valori mediani di Ki-67 in 181 pazienti cun cancru di u senu senza portatori versus pazienti cun PV BRCA1 (18) o BRCA2 (17). I valori P inferiori à 0,5 sò stati cunsiderati statisticamente significativi. (B) Istogramma chì rapprisenta l'assegnazione di i pazienti cun cancru di u senu in gruppi di gradu istologicu (G2 è G3) secondu u statu di mutazione BRCA1 è BRCA2 (soggetti WT, portatori di PV BRCA1 è BRCA2).
In listessu modu, avemu esaminatu se u gradu di u tumore era currelatu cù a presenza di BRCA1/2 PV. Siccomu G1 BC era assente in a nostra pupulazione, avemu divisu i pazienti in dui gruppi (G2 o G3). In cunfurmità cù i risultati di Ki-67, l'analisi hà rivelatu una currelazione statisticamente significativa trà u gradu di u tumore è a mutazione BRCA1, cù una proporzione più alta di tumori G3 in i portatori di BRCA1 paragunatu à i non portatori (p<0,005) (Figura 5B).
I progressi in a tecnulugia di sequenziamentu di u DNA anu permessu progressi senza precedenti in i testi genetichi BRCA1/2, cù implicazioni cruciali per i pazienti cun una storia familiare di cancru. Finu à oghje, circa 20.000 varianti BRCA1/2 sò state identificate è classificate secondu l'American Society of Medical Genetics 35 è u sistema ENIGMA.35,36 Hè ben cunnisciutu chì u spettru mutazionale BRCA1/2 varia assai trà e regioni geografiche.37 In Italia, u tassu di PV BRCA1/2 variava da 8% à 37%, mustrendu una larga variabilità intra-nazionale.38,39 Cù una pupulazione di quasi 5 milioni, a Sicilia hè a quinta regione più grande d'Italia in termini di numeru di abitanti. Ancu s'è esistenu dati nantu à a distribuzione di BRCA1/2 in a Sicilia occidentale, ùn ci hè micca evidenza estensiva in a parte orientale di l'isula.
U nostru studiu hè unu di i primi rapporti nantu à l'incidenza di BRCA1/2 PV in i pazienti cun BC in Sicilia orientale.28 Avemu focalizatu a nostra analisi nantu à u BC, postu chì questu hè di gran lunga a malatia più cumuna in a nostra coorte.
Quandu si sò testati 389 pazienti cun cancru di u senu (BC), u 9% purtava PV BRCA1/2, distribuiti uniformemente trà BRCA1 è BRCA2. Questi risultati sò coerenti cù quelli riportati prima in a pupulazione italiana.28 Hè interessante nutà chì u 3% (13/389) di a nostra coorte eranu masci. Questa tarifa hè più alta di quella prevista per u cancru di u senu maschile (1% di tutti i BC),40 riflettendu a nostra selezzione di pupulazioni basata annantu à u risicu di mutazione BRCA1/2. Tuttavia, nimu di questi omi hà sviluppatu un PV BRCA1/2, dunque eranu candidati per ulteriori analisi moleculari per escludere a presenza di mutazioni menu cumuni cum'è PALB2, RAD51C è D, frà altri. Varianti di significanza incerta sò state recuperate in u 7% di i sughjetti in i quali BRCA2 VUS era evidente. Ancu questu risultatu hè coerente cù l'evidenza preesistente.28,41,42
Quandu avemu analizatu a distribuzione di i sottotipi moleculari di BC in e donne mutanti BRCA1/2, avemu cunfirmatu l'associazioni cunnisciute trà TNBC è BRCA1 PV (58,8%) è trà BC luminale B è BRCA2 PV (55,6%).16,43 I tumori luminali A è HER2+ in i portatori di BRCA1 è BRCA2 PV sò coerenti cù i dati di a literatura esistente.16,43
Dopu ci cuncentramu nantu à u tipu è a situazione di u PV BRCA1/2. In a nostra coorte, u PV BRCA1 più cumunu era c.5035_5039delCTAAT. Ancu s'è Incorvaia et al. ùn anu micca discrittu sta variante in a so coorte siciliana, altri autori l'anu signalata cum'è una PV BRCA1 di linea germinale.34 Parechji PV BRCA1 sò stati trovati in a nostra coorte - per esempiu c.181T>G, c.514del, c.3253dupA è c.5266dupC - chì sò stati osservati in Sicilia.28 Di questi, duie mutazioni fundatrici di BRCA1 (c.181T>G è c.5266dupC) sò cumunemente truvate in l'ebrei ashkenaziti di l'Europa orientale è centrale (Pulonia, Ceca), slovena, austriaca, ungherese, bielorussa è tedesca), 44,45 è, in i Stati Uniti è in Argentina, hè stata recentemente definita cum'è una "variante germinale ricorrente" in pazienti italiani cù BC è OC. A variante 34c.514del hè stata identificata prima in 8 pazienti cun cancru di u senu di a Sicilia settentrionale in Palermo è Messina. Hè interessante nutà chì ancu Incorvaia et al. anu trovu a variante c.3253dupA in alcune famiglie in Catania.28 I PV BRCA2 più rappresentativi sò c.428dup, c.5851_5854delAGTT è a variante intronica c.8487+1G>A, chì sò stati riportati in più dettagliu 28 in un paziente in Palermo cù c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV hè statu osservatu in famiglie in Sicilia nordoccidentale, principalmente in e regioni di Trapani è Palermo, mentre chì c.5851_5854delAGTT PV hè statu osservatu in famiglie in Sicilia nordoccidentale. A variante 8487+1G>A era più cumuna in i sughjetti di Messina, Palermo è Caltanissetta.28 Rebbeck et al. hà descrittu prima l'alterazione c.5851_5854delAGTT in Colombia.37 Un altru BRCA2 PV, c.631+1G>A, hè statu trovu in pazienti BC è OC da Sicilia (Agrigento, Siracusa è Ragusa).28 In particulare, avemu osservatu a coesistenza di duie varianti BRCA2 (BRCA2 c.631G>A è c.7008-2A>T) in u listessu paziente, chì avemu suppostu esse segregatu in modu cis, cum'è riportatu prima cusì.34,46 Queste mutazioni BRCA2 sò in effetti osservate frequentemente in a regione italiana è hè statu trovu chì introducenu codoni di stop prematuri, affettendu u splicing di l'RNA messaggeru è causendu u fallimentu di a proteina BRCA2.47,48
Avemu ancu mappatu i PV BRCA1 è BRCA2 in e regioni putative OCCR è BCCR di i duminii proteichi è di i geni. Queste regioni sò state descritte da Rebbeck et al. cum'è zone di risicu per u sviluppu di u cancru di l'ovaru è di u senu, rispettivamente.49 Tuttavia, l'evidenza riguardu à l'associazione trà a situazione di e varianti germinali è u risicu di cancru di u senu o di l'ovaru ferma cuntruversa.28,50-52 In a nostra pupulazione, i PV BRCA1 eranu principalmente situati in a regione BCCR, mentre chì i PV BRCA2 eranu principalmente situati in a regione OCCR. Tuttavia, ùn simu stati capaci di truvà alcuna associazione trà e regioni putative OCCR è BCCR è e caratteristiche BC. Questu pò esse duvutu à u numeru limitatu di pazienti cù mutazioni BRCA1/2. Da una perspettiva di u duminiu proteicu, i PV BRCA1 sò distribuiti longu à tutta a proteina, è l'alterazioni BRCA2 si trovanu preferenzialmente in u duminiu di ripetizione BRC.
Infine, avemu currelatu e caratteristiche clinicopatologiche di BC cù BRCA1/2 PV. A causa di u numeru limitatu di pazienti inclusi, avemu trovu solu una currelazione significativa trà Ki-67 è u gradu di u tumore. Ancu s'è a valutazione è l'interpretazione di Ki-67 ferma un pocu cuntruversa, hè certu chì i tassi proliferativi elevati sò assuciati à un risicu aumentatu di recidiva di a malatia è à una diminuzione di a sopravvivenza. Finu à oghje, u cutoff per distingue trà Ki-67 "altu" è "bassu" hè di 20%. Tuttavia, sta soglia ùn s'applica micca à a nostra pupulazione di pazienti cù mutazione BRCA1/2, chì hà un valore medianu di Ki-67 di 25%. Sta tendenza in i tassi elevati di Ki-67 pò esse spiegata da a prevalenza in e nostre coorti luminali B è TNBC, di e quali pochi tumori luminali A eranu presenti. Tuttavia, alcune evidenze parenu suggerisce chì un cutoff di Ki-67 più altu (25-30%) pò stratificà megliu i pazienti secondu a so prognosi.53,54 Da i risultati di a nostra analisi, una currelazione significativa ùn hè micca sorprendente. Si verifica trà Ki-67 altu è gradi è a presenza di BRCA1 PV. In fatti, i tumori ligati à BRCA1 sò tipici di TNBC è presentanu caratteristiche più aggressive.16,17
In cunclusione, questu studiu furnisce un rapportu nantu à u statu mutazionale di BRCA1/2 in una coorte di cancru cancerosu di a Sicilia orientale. In generale, i nostri risultati sò coerenti cù l'evidenza preesistente, sia in termini di prevalenza di mutazioni sia di caratteristiche clinicopatologiche in u cancru cancerosu. Più studii in pupulazioni più grande di pazienti cun cancru cancerosu mutante BRCA1/2, cum'è l'usu di l'analisi mutazionale espansa multigenoma, sò ghjustificati per valutà a presenza di PV chì sò distinti è menu frequenti di BRCA1/2. Questu permetterà l'identificazione è a gestione adatta di u numeru crescente di sughjetti à risicu aumentatu di cancru per via di mutazioni genetiche.
Avemu cunfirmatu chì i pazienti anu firmatu u so accunsentu infurmatu per liberà i so campioni di tumore in modu anonimu per scopi di ricerca. Tutti i pazienti anu firmatu u so accunsentu infurmatu scrittu secondu a Dichjarazione di Helsinki. Sicondu a pulitica di l'AOU Policlinico "G. Rodolico - S. Marco", questu studiu hè statu esentatu da a revisione etica perchè l'analisi BRCA1 / 2 hè stata realizata secondu a pratica clinica è tutti i pazienti anu datu u so accunsentu infurmatu scrittu. I pazienti accunsentenu ancu à l'usu di i so dati per scopi di ricerca.
Ringraziemu u prufessore Paolo Vigneri per u so aiutu in a cura di i pazienti cun cancru di u senu cum'è dumandatu da u Cumitatu Eticu.
Federica Martorana riceve onorari da Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis, Pfizer. L'altri autori dichjaranu chì ùn anu micca cunflitti d'interessi in questu travagliu.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Statistiche Globale di u Cancru 2020: GLOBOCAN stima l'incidenza è a mortalità di 36 cancri in 185 paesi in u mondu. CA Cancer J Clin. 2021; 71 (3): 209-249. doi: 10.3322 / caac.21660