A Javascript jelenleg le van tiltva a böngészőjében. A weboldal egyes funkciói nem fognak működni, ha a JavaScript le van tiltva.
Regisztráljon a megadott adataival és az Önt érdeklő gyógyszerrel, és mi összevetjük az Ön által megadott információkat a kiterjedt adatbázisunkban található cikkekkel, és haladéktalanul elküldjük Önnek e-mailben a PDF-példányt.
Szereplők: Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 és Medicine University of C1ical, 2 Livia Manzperi Department of C1ical Catania, Catania, 95123, Olaszország;2 Kísérleti Onkológiai és Hematológiai Központ, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Olaszország; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Olaszország; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Olaszország; 5 Medicine Genetics, ASP, Syracuse, 96100, Olaszország; 6. Cataniai Egyetem, Biomedikai és Biotechnológiai Tudományok Tanszéke, Orvosi Genetika, Catania, Olaszország, 95123; 7. Oasi Kutatóintézet-IRCCS, Troina, 94018, Olaszország Kommunikáció: Stefania Stella, tel.: +39 095 378 1946, e-mail: [email protected]; [email protected] Célkitűzés: A BRCA1 és BRCA2 gén csíravonal-mutációi, valamint a kialakult emlőrák (BC), petefészekrák (OC) és egyéb, a rák élethosszig tartó kockázatával összefüggő betegségek. A BRCA gén tesztelése kulcsfontosságú az egyéni kockázat felméréséhez, valamint az egészséges hordozók megelőzési módszereinek megtalálásához és a rákos betegek kezelésének személyre szabásához. A BRCA1 és BRCA2 elváltozások prevalenciája földrajzi régiónként nagy mértékben változik, és bár léteznek adatok a BRCA patogén variánsairól a szicíliai családokban, hiányoznak a kifejezetten a kelet-szicíliai populációkat célzó vizsgálatok. Tanulmányunk célja a BRCA patogén csíravonal-elváltozások előfordulásának és eloszlásának vizsgálata volt egy kelet-szicíliai BC-betegek csoportjában, és azok összefüggésének felmérése specifikus BC-tulajdonságokkal a következő generációs szekvenálás segítségével. Az elváltozások jelenléte korrelált a tumor fokozatával és a proliferációs indexszel. EREDMÉNYEK: Összesen 35 betegnél (9%) volt BRCA patogén variáns, 17-nél (49%) BRCA1 és 18-nál (51%) BRCA2. A BRCA1 elváltozások a tripla-negatív BC-betegeknél gyakoribbak, míg a BRCA2 mutációk gyakoribbak a luminális BC-betegeknél. A nem hordozókkal összehasonlítva a BRCA1 variánsokkal rendelkező alanyoknál szignifikánsan... magasabb tumor fokozat és proliferatív index. Következtetések: Eredményeink áttekintést nyújtanak a BRCA mutációs státuszáról a kelet-szicíliai BC-s betegeknél, és megerősítik az NGS-analízis szerepét az örökletes BC-s betegek azonosításában. Összességében ezek az adatok összhangban vannak a korábbi bizonyítékokkal, amelyek alátámasztják a BRCA-szűrést a mutációhordozók rákjának megfelelő megelőzésére és kezelésére.
Az emlőrák (BC) a világon a leggyakoribb rosszindulatú daganat, és a nők körében a leghalálosabb rák.1 Az emlőrák prognózisát és klinikai viselkedését meghatározó biológiai jellemzőket széles körben tanulmányozták és az idők során részben tisztázták. Valójában jelenleg számos szurrogát markert használnak a BC különböző molekuláris altípusokba sorolására. Ezek az ösztrogén (ER) és/vagy progeszteronreceptor (PgR), a humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2) amplifikációja, a Ki-67 proliferációs index és a tumor fokozata (G).2 Ezen változók kombinációja a következő BC kategóriákat azonosította: 1) A luminális tumorok, amelyek ER és/vagy PgR expressziót mutattak, a BC-k 75%-át tették ki. Ezeket a tumorokat tovább osztották Luminal A-ra, amikor a Ki-67 20% alatt volt és HER2 negatív, valamint Luminal B-re, amikor a Ki-67 20% vagy annál magasabb volt, és HER2 amplifikáció jelenlétében, függetlenül a proliferációs indextől; 2) HER2+ tumorok, amelyek ER és PgR negatívak, de HER2 amplifikációt mutatnak. Ez a csoport az összes emlődaganat 10%-át teszi ki; 3) A tripla-negatív emlőrák (TNBC), amely nem mutat ER- és PgR-expressziót, valamint HER2-amplifikációt, az emlőrákok körülbelül 15%-át teszi ki.2-4
Ezen BC altípusok közül a tumor fokozata és a proliferációs index olyan keresztmetszeti biomarkereket képvisel, amelyek közvetlenül és függetlenül kapcsolódnak a tumor agresszivitásához és prognózisához.5,6
A fent említett biológiai jellemzőkön túl az öröklött genetikai változások szerepe, amelyek a mellrák kialakulásához vezetnek, az elmúlt években egyre fontosabbá vált.7 Az emlődaganatok körülbelül 10%-a öröklődik specifikus gének csíravonal-változásai miatt.8 Két nagyszabású epidemiológiai vizsgálat, amelyben több mint 180 000 nő vett részt, nemrégiben azonosított egy nyolc génből álló csoportot (azaz ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C és RAD51D), amelyek elsősorban az örökletes mellrákért felelősek. Ezen gének közül a BRCA1 és a BRCA2 (a továbbiakban BRCA1/2) mutatta a legerősebb összefüggést az emlődaganatok kialakulásával.9-12 Valójában a csíravonal BRCA1/2 mutációi jelentősen növelik a mellrák, valamint más rosszindulatú daganatok, köztük a petefészek-, prosztata-, hasnyálmirigy-, vastagbél- és végbélrák és melanoma élettartamra vetített kockázatát.13 és 80 éves kor között a mellrák kumulatív előfordulása 72% a BRCA1 patogén variánssal (PV) rendelkező nőknél, és 69% a BRCA2 PV-vel rendelkező nőknél.14
Figyelemre méltó, hogy egy friss publikáció szerint a mellrák kockázata a PV típusától függ. Valójában a patogén csonkító variánsokhoz képest a feltűnő misszensz variánsok, különösen a BRCA1 génben, a mellrák csökkent kockázatával járnak, különösen az idősebb nőknél.15
A BRCA1 vagy BRCA2 PV jelenléte különböző biológiai és klinikopatológiai jellemzőkkel társult.16,17 A BRCA1-hez társuló emlőrákok klinikailag agresszívek, rosszul differenciáltak és magas proliferációjúak. Ezek a tumorok általában tripla-negatívak és korán jelentkeznek. A BRCA2-mutáns betegeknél előforduló tumorok jellemzően közepes vagy jól differenciált fokozatot és változó proliferatív indexeket mutatnak. Ezek a tumorok gyakoribbak a B lumenben, és általában idősebb felnőtteknél fordulnak elő.16-18 Figyelemre méltó, hogy a BRCA1 és BRCA2 mutációi növelik az érzékenységet specifikus kezelésekkel szemben, beleértve a platina sókat és a célzott gyógyszereket, például a poli(ADP-ribóz) polimeráz inhibitorokat (PARPi).19,20
Az elmúlt néhány évben a következő generációs szekvenálás (NGS) klinikai gyakorlatba való bevezetése lehetővé tette, hogy egyre több emlőrákos betegnél végezzenek molekuláris vizsgálatot a rákhajlami szindrómák, köztük a BRCA1/2 molekuláris vizsgálatára.21 Ezzel egyidejűleg a családi kórtörténetre, a demográfiai és klinikopatológiai jellemzőkre vonatkozó pontos kritériumokon alapuló definíciók is megjelentek, hogy jobban azonosítsák a BRCA1/2 tesztelésre érdemes egyéneket.22,23 Ebben az összefüggésben egyre több bizonyíték gyűlik a BRCA1/2 szűréséről bizonyos populációkban, ami rávilágít a földrajzi régiók közötti különbségekre.24–27 Bár vannak jelentések a nyugat-szicíliai emlőrákos kohorszról, kevesebb adat áll rendelkezésre a BRCA1/2 szűrésről a kelet-szicíliai populációban.28,29
Jelen tanulmányban a kelet-szicíliai emlőrákos betegeknél végzett BRCA1/2 csíravonal-szűrés eredményeit ismertetjük, továbbá összefüggésbe hozva a BRCA1 vagy BRCA2 mutációk jelenlétét ezen tumorok fő klinikopatológiai jellemzőivel.
Retrospektív vizsgálatot végeztek a cataniai Rodolico – San Marco Policlinico Kórház „Kísérleti Onkológiai és Hematológiai Központjában”. 2017 januárja és 2021 márciusa között összesen 455 emlő- és petefészek-, melanoma-, hasnyálmirigy- vagy prosztatarákos beteget utaltak molekuláris diagnosztikai laboratóriumunkba BRCA/2 genetikai vizsgálatra. A vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték, és minden résztvevő írásos beleegyezését adta a molekuláris elemzés előtt.
A BC szövettani és biológiai jellemzőit (ER, PgR, HER2 státusz, Ki-67 és fokozat) magbiopsziás vagy sebészeti mintákon értékelték, csak az agresszív tumorkomponenseket figyelembe véve. Ezen jellemzők alapján a BC-ket a következőképpen osztályozták: luminális A (ER+ és/vagy PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminális B (ER+ és/vagy PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminális B-HER2+ (ER és/vagy PgR+, HER2+), HER2+ (ER és PgR-, HER2+) vagy tripla negatív (ER és PgR-, HER2-).
A BRCA1 és BRCA2 mutációs státuszának felmérése előtt egy onkológusból, genetikusból és pszichológusból álló multidiszciplináris csapat minden betegnél tumorgenetikai konzultációt végzett a BRCA1 és/vagy BRCA1, illetve a PV magas kockázatú egyének BRCA2 génben való jelenlétének meghatározása érdekében. A betegek kiválasztását az Olasz Orvosi Onkológiai Társaság (AIOM) irányelvei és a helyi szicíliai ajánlások szerint végezték.30,31 Ezek a kritériumok a következők: (i) ismert patogén variánsok előfordulása a fogékonysági génekben (pl. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) emlőrákos férfiak; (iii) emlőrákos és vastagbélrákos betegek; (iv) 36 év alatti emlőrákos, 60 év alatti TNBC-s vagy 50 év alatti kétoldali emlőrákos nők; (v) 50 év alatti emlőrák személyes kórtörténete és legalább egy elsőfokú rokon: (a) emlőrák < 50 év; (b) nem mucinózus és nem határeseti OC bármely korban; (c) kétoldali emlőrák; (d) férfi emlőrák; (e) hasnyálmirigyrák; (f) prosztatarák; (vi) két vagy több, 50 évnél régebbi emlőrákos beteg személyes kórtörténete, valamint emlőrák, oszteoartritisz vagy hasnyálmirigyrák családi előfordulása olyan rokonoknál, akik elsőfokú rokonok egymással (beleértve azokat a rokonokat is, akikkel az illető elsőfokú rokon); (vii) OC személyes kórtörténete és legalább egy elsőfokú rokon: (a) emlőrák <50 év; (b) non-karcinómás daganat; (c) kétoldali emlőrák; (d) férfi emlőrák; (vii) nő magas malignitású serózus OC-vel.
Minden betegtől 20 ml perifériás vérmintát vettünk, és EDTA-s csövekbe (BD Biosciences) gyűjtöttük. A genomiális DNS-t 0,7 ml teljes vérmintából izoláltuk a QIAsymphony DSP DNA Midi kit izolációs készlettel (QIAGEN, Hilden, Olaszország) a gyártó utasításai szerint, majd Qubit® 3.0 fluorométeren (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) átengedtük. Elvégeztük a kvantifikációt. A céldúsítást és a könyvtár előkészítését az Oncomine™ BRCA Research Assay Chef végzi, amely készen áll az Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kitbe való betöltésre az automatizált könyvtár előkészítéshez a gyártó utasításai szerint. A készlet két multiplex PCR primer készletet tartalmaz, amelyekkel az összes BRCA1 (NM_007300.3) és BRCA2 (NM_000059.3) gén vizsgálható. Röviden, mindkét hígított minta DNS-ből 15 µL-t (10 ng) adtunk vonalkódos lemezekhez a könyvtár előkészítéséhez, és az összes reagenst és fogyóeszközt betöltöttük az Ion Chef™ készülékre. Az automatizált könyvtár-előkészítést és a vonalkódos mintakönyvtár-poolingot ezután az Ion Chef™ készüléken végeztük el. Az előkészített könyvtárak számát ezután egy Qubit® 3.0 fluorométerrel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) értékeltük a gyártó utasításai szerint. Végül a könyvtárakat ekvimoláris arányban egyesítettük az Ion Chef™ könyvtárminta-csövekben (vonalkódos csövek), és betöltöttük az Ion Chef™ készülékbe. műszerrel. A szekvenálást Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) műszerrel (Thermo Fisher Scientific) végeztük, Ion 510 Chip (Thermo Fisher Scientific) felhasználásával. Az adatelemzést az Amplicon Suite (SmartSeq srl) és az Ion Reporter Software segítségével végeztük.
Minden variáns nómenklatúrája a Human Genome Variation Consortium aktuális irányelveit követte, amelyek online elérhetők (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). A BRCA1/2 variánsok klinikai jelentőségét az International Consortium ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) osztályozásával és különböző adatbázisok, például az ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD és UMD konzultálásával határozták meg. Az osztályozás öt különböző kockázati kategóriát tartalmaz: jóindulatú (I. kategória), valószínűleg jóindulatú (II. kategória), bizonytalan jelentőségű variáns (VUS, III. kategória), valószínűleg patogén (IV. kategória) és patogén (V. kategória). A VarSome a mutációk fehérjeszerkezetre és -funkcióra gyakorolt ​​hatását is elemezte, amely egy informatív eszköz, amely 30 adatbázishoz fér hozzá.32
Az egyes VUS-okhoz potenciális klinikai jelentőséget rendelni a következő számítógépes fehérje-előrejelző algoritmusokat alkalmazták: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) és Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Az 1. és 2. osztályba sorolt ​​variánsokat vad típusúnak tekintették.
A Sanger-szekvenálás megerősítette az egyes patogén variánsok jelenlétét. Röviden, minden egyes detektált variánshoz egy specifikus primert terveztek a BRCA1 és BRCA2 gén referencia szekvenciáinak felhasználásával (NG_005905.2, NM_007294.3 és NG_012772.3, NM_000059.3). Ezért célzott PCR-t végeztek, majd Sanger-szekvenálást végeztek.
A BRCA1/2 génre negatív eredményt adó betegeket a gyártó utasításai szerint multiplex ligációtól függő próbaamplifikációval (MLPA) tesztelték a nagy genomiális átrendeződések (LGR) jelenlétének felmérésére. Röviden, a DNS-mintákat denaturálták, és legfeljebb 60 BRCA1 és BRCA2 génspecifikus próbát használtak, amelyek mindegyike egy körülbelül 60 nukleotid hosszúságú specifikus DNS-szekvenciát detektált. A próbaamplifikációs termékeket, amelyek egyedi PCR-amplikonokból álltak, ezután kapilláris elektroforézissel és a Cofalyser.Net szoftverrel elemezték a megfelelő tételspecifikus Cofalyser-táblázatokkal együtt (www.mrcholland.com).
Válogatott klinikopatológiai változókat (hisztológiai fokozat és Ki-67%-os proliferációs index) BRCA1/2 PV jelenlétével hoztunk összefüggésbe, melyeket a Prism szoftver 8.4-es verziójával számítottunk ki Fisher-féle egzakt teszttel, feltételezve, hogy a p-érték <0,05 szignifikáns.
2017 januárja és 2021 márciusa között 455 beteget szűrtek csíravonal BRCA1/2 mutációkra. A mutációtesztet a Policlinico Kórház Kísérleti Onkológiai és Hematológiai Központjában végezték. A szicíliai irányelvek (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Jannaio 2020) szerint a Catania – San Marco Rodolico kórházban összesen 389 beteget vizsgáltak: emlőrákos, 37 petefészekrákos, 16 hasnyálmirigyrákos, 8 prosztatarákos és 5 melanómás beteget. A betegek ráktípus szerinti megoszlását és az elemzési eredményeket az 1. ábra mutatja.
Az 1. ábra a vizsgálat áttekintését bemutató folyamatábrát mutatja. Emlő-, melanóma-, hasnyálmirigy-, prosztata- vagy petefészekdaganattal rendelkező betegeket teszteltek a BRCA1 és BRCA2 gének mutációira.
Rövidítések: PV-k, patogén variáns; VUS, bizonytalan jelentőségű variáns; WT, vad típusú BRCA1/2 szekvencia.
Tanulmányainkat szelektíven az emlőrákos kohorszokra összpontosítottuk. A betegek medián életkora 49 év volt (tartomány: 23-89), és túlnyomórészt nők voltak (n = 376, vagyis 97%).
Ezen alanyok közül 64-nek (17%) volt BRCA1/2 mutációja, és mindannyian nők voltak. Harmincöt (9%) betegnél PV, 29-nél (7,5%) pedig VUS volt megfigyelhető. A 35 patogén variáns közül tizenhét (48,6%) a BRCA1-ben és 18 (51,4%) a BRCA2-ben fordult elő, míg 5 VUS a BRCA1-ben (17,2%) és 24 (82,8%) a BRCA2-ben fordult elő (1. és 2. ábra). Az LGR nem volt jelen az MLPA elemzésben.
2. ábra. A BRCA1 és BRCA2 mutációk elemzése 389 emlőrákos betegnél. (A) A patogén variánsok (PV) (piros), a bizonytalan jelentőségű variánsok (VUS) (narancssárga) és a WT (kék) megoszlása ​​389 emlőrákos betegnél; (B) 389 emlőrákos beteg Harmincöt (9%) betegnél BRCA1/2 patogén variánsok (PV) voltak jelen. Közülük 17 (48,6%) BRCA1 PV hordozó (sötétpiros) és 18 (51,4%) BRCA2 hordozó (világospiros); (C) A 389 alany közül 29 (7,5%) hordozott VUS-t, 5 (17,2%) BRCA1 gént (sötétnarancssárga) és 24 (82,8%) BRCA2 gént (világosnarancssárga).
Rövidítések: PV-k, patogén variáns; VUS, bizonytalan jelentőségű variáns; WT, vad típusú BRCA1/2 szekvencia.
Ezután megvizsgáltuk a BC molekuláris altípusok prevalenciáját BRCA1/2 PV-vel rendelkező betegeknél. Az eloszlás 2 (5,7%) luminális A, 15 (42,9%) luminális B, 3 (8,6%) luminális B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ és 13 (37,1%) TNBC beteget foglalt magában. A BRCA1-pozitív betegek közül 5 (29,4%) luminális B BC-vel, 2 (11,8%) HER2+ betegséggel és 10 (58,8%) TNBC-vel rendelkezett. A BRCA1 mutáció nélküli tumorok vagy luminális A, vagy luminális B-HER2+ voltak (3. ábra). A BRCA2-pozitív alcsoportban 10 (55,6%) tumor volt luminális B, 3 (16,7%) luminális B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC és 2 (11,1%) luminális A (3. ábra). Ebben a betegcsoportban nem volt HER2+ tumor. csoport. Így a BRCA1 mutációk gyakoriak a TNBC-s betegeknél, míg a BRCA2 elváltozások a lumen B egyéneknél dominálnak.
3. ábra Az emlőrák altípusok prevalenciája a BRCA1 és BRCA2 génekben patogén variánsokkal rendelkező betegeknél. Hisztogramok, amelyek a BRCA1- (sötétpiros) és BRCA2- (világospiros) PV-k eloszlását mutatják az emlőrákos betegek molekuláris altípusai között. Az egyes mezőkben feltüntetett számok a BRCA1 és BRCA2 PV-vel rendelkező betegek százalékos arányát jelentik az egyes emlőrák altípusok esetében.
Rövidítések: PV-k, patogén variáns; HER2+, humán epidermális növekedési faktor receptor 2 pozitív; TNBC, tripla-negatív emlőrák.
Ezt követően értékeltük a BRCA1 és BRCA2 PV-k típusát és génlokalizációját. A BRCA1 PV-ben 7 egypontos nukleotid variánst (SNV), 6 deléciót, 3 duplikációt és 1 inszerciót figyeltünk meg. Csak egy mutáció (c.5522delG) jelent új felfedezést. A leggyakrabban észlelt BRCA1 PV mindkét alanynál a c.5035_5039delCTAAT volt. Ez a változás öt nukleotid delécióját (CTAAT) foglalja magában a BRCA1 15-ös exonjában, ami a leucin aminosav tirozinra való helyettesítését eredményezi a 1679-es kodonnál, és a transzlációs kereteltolódás miatt egy előre jelzett alternatív stop kodonnal a fehérje korai csonkolódásához vezet. Minden más változást csak egy esetben észleltünk. Figyelemre méltó, hogy az egyik jelentett PV a splice hely konszenzus régiójában helyezkedett el (c.4357+1G>T) (1. táblázat).
A BRCA2 PV esetében 6 deléciót, 6 SNV-t és 2 duplikációt figyeltünk meg. A talált változások egyike sem új. Három mutáció ismétlődött a populációnkban, a c.428dup és a c.8487+1G>A 3 alanynál, majd két esetben a c.5851_5854delAGTT. A c.428dup változás a BRCA2 5. exonjában található C ismétlődését jelenti, amelyről feltételezik, hogy egy csonkolt, nem funkcionális fehérjét kódol. A c.8487+1G>A mutáció a BRCA2 19. intronjának intron régiójában (± 1,2) fordul elő, és a splicing konszenzus szekvenciáját érinti, ami megváltozott splicingot eredményez, ami abnormális vagy hiányzó fehérjét eredményez. A c.5851_5854delAGTT patogén variáns a BRCA2 gén 10. kódoló exonjának 5851-5854. nukleotidpozícióiból származó 4 nukleotid deléciónak köszönhető, és transzlációs kereteltolódást eredményez egy feltételezett alternatív stop kodonnal. (p.S1951WfsTer). Figyelemre méltó, hogy amint azt korábban közöltük, mind a c.631G>A, mind a c.7008-2A>T elváltozást ugyanazon betegnél észlelték.34 Az első mutáció az adenozin (A) cseréjét jelenti a BRCA2 7-es exonjában egy guanint (G) tartalmazó nukleotiddal, ami a valin izoleucinra cserélődését eredményezi a 211-es kodonnál. Az izoleucin aminosav egy nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkező aminosav. Ez a változás befolyásolja a normál mRNS splicingot. A második variáns egy intronikus régióban található, és kettős A-ról timinre (T) történő szubsztitúciót eredményez a BRCA2-t kódoló gén 13-as exonja előtt. A c.7008-2A>T változás több különböző hosszúságú transzkriptumot generálhat. Továbbá a BRCA2 PV-k csoportjában a 18 változásból 4 (22,2%) intronikus volt.
Ezután feltérképeztük a BRCA1/2 káros mutációit a funkcionális doménekben és a fehérjekötő régiókban (4. ábra). A BRCA1 génben a PV-k 50%-a az emlőrák-klaszter régióban (BCCR), míg a mutációk 22%-a az ováriumrák-klaszter régióban (OCCR) helyezkedett el (4A. ábra). A BRCA2 PV-ben a variánsok 35,7%-a a BCCR régióban, a mutációk 42,8%-a pedig az OCCR régióban helyezkedett el (4B. ábra). Ezután értékeltük a PV elhelyezkedését a BRCA1 és BRCA2 fehérje doméneken belül. A BRCA1 fehérje esetében három PV-t találtunk a hurok és a tekercselt tekercs doménekben, valamint két mutációt a BRCT doménben (4A. ábra). A BRCA2 fehérje esetében 4 PV a BRC ismétlődő doménhez kapcsolódott, míg 3 intronikus és 3 exonikus változást detektáltunk az oligo/oligoszacharid-kötő (OB) és a torony (T) doménekben (4B. ábra).
4. ábra A BRCA1 és BRCA2 fehérjék sematikus ábrázolása és a patogén variánsok lokalizációja. Ez az ábra a BRCA1 (A) és BRCA2 (B) patogén variánsok eloszlását mutatja emlőrákos betegekben. Az exonikus mutációk kékkel, míg az intronikus variánsok narancssárgával vannak jelölve. Az oszlop magassága az esetek számát jelöli. A BRCA1 és BRCA2 fehérjéket és funkcionális doménjeiket ismertetjük. (A) A BRCA1 fehérje egy hurok domént (RING) és egy nukleáris lokalizációs szekvenciát (NLS), egy tekercselt tekercses domént, egy SQ/TQ klaszter domént (SCD) és egy BRCA1 C-terminális domént (BRCT) tartalmaz. (B) A BRCA2 fehérje nyolc BRC ismétlődést, egy helikális doménnel rendelkező DNS-kötő domént (Helical), három oligonukleotid/oligoszacharid-kötő (OB) hajtogatást, egy torony domént (T) és egy NLS-t a C oldalon tartalmaz. Az emlőrák klaszter régiónak (BCCR) és a petefészekrák klaszter régiónak (OCCR) nevezett területek alul láthatók. *A stop kodonokat meghatározó mutációkat jelöli.
Ezután megvizsgáltuk a BRCA1/2 PV jelenlétével összefüggésbe hozható emlőrák klinikopatológiai jellemzőit. Teljes klinikai dokumentáció állt rendelkezésre 181 BRCA1/2-negatív (nem hordozó) beteg és az összes hordozó (n = 35) esetében. Összefüggés mutatkozott a tumor proliferációs aránya és a fokozat között.
A Ki-67 eloszlását a kohorszunk mediánja (25%, tartomány <10-90%) alapján számítottuk ki. A <25%-os Ki-67 értékkel rendelkező személyeket „alacsony Ki-67”-ként, míg a ≥25%-os értékkel rendelkező egyéneket „magas Ki-67”-ként tekintettük. Jelentős Ki-67 különbségeket (p<0,01) találtunk a nem hordozók és a BRCA1 PV hordozók között (5A. ábra).
5. ábra A Ki-67 és a fokozat eloszlásának korrelációja BRCA1 és BRCA2 PV-vel rendelkező és nem rendelkező emlőrákos nőknél. (A) Boxplot, amely a medián Ki-67 értékeket mutatja 181 nem hordozó emlőrákos betegnél a BRCA1 (18) vagy BRCA2 (17) PV-vel rendelkező betegekhez képest. A 0,5 alatti P-értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. (B) Hisztogram, amely a emlőrákos betegek szövettani fokozatú csoportokba (G2 és G3) való besorolását mutatja a BRCA1 és BRCA2 mutációs státusz szerint (vad típusú alanyok, BRCA1 és BRCA2 PV-hordozók).
Hasonlóképpen megvizsgáltuk, hogy a tumor fokozata korrelál-e a BRCA1/2 PV jelenlétével. Mivel a G1 BC nem volt jelen a populációnkban, a betegeket két csoportra osztottuk (G2 vagy G3). A Ki-67 eredményekkel összhangban az elemzés statisztikailag szignifikáns korrelációt mutatott a tumor fokozata és a BRCA1 mutáció között, a BRCA1 hordozóknál a G3 tumorok nagyobb arányban fordultak elő a nem hordozókhoz képest (p<0,005) (5B. ábra).
A DNS-szekvenálási technológia fejlődése példátlan előrelépéseket tett lehetővé a BRCA1/2 genetikai tesztelésében, ami döntő fontosságú a családi rákbetegségben szenvedő betegek számára. A mai napig körülbelül 20 000 BRCA1/2 variánst azonosítottak és osztályoztak az Amerikai Orvosi Genetikai Társaság35 és az ENIGMA rendszer szerint.35,36 Köztudott, hogy a BRCA1/2 mutációs spektruma földrajzi régiónként széles skálán mozog.37 Olaszországon belül a BRCA1/2 PV-k aránya 8% és 37% között mozgott, ami nagyfokú országon belüli változékonyságot mutat.38,39 Közel 5 millió lakosával Szicília Olaszország ötödik legnagyobb régiója a lakosok számát tekintve. Bár léteznek adatok a BRCA1/2 eloszlásáról Nyugat-Szicíliában, a sziget keleti részén nincsenek kiterjedt bizonyítékok.
Tanulmányunk az egyik első jelentés a BRCA1/2 PV előfordulásáról BC-s betegeknél Kelet-Szicíliában.28 Elemzésünket a BC-re összpontosítottuk, mivel ez messze a leggyakoribb betegség a kohorszunkban.
389 emlőrákos beteg vizsgálatakor 9%-uk hordozott BRCA1/2 PV-t, egyenletesen elosztva a BRCA1 és a BRCA2 között. Ezek az eredmények összhangban vannak az olasz populációban korábban jelentett eredményekkel.28 Érdekes módon kohorszunk 3%-a (13/389) férfi volt. Ez az arány magasabb a férfi emlőrák esetében vártnál (az összes emlőrák 1%-a),40 ami a BRCA1/2 mutációs kockázat alapján kiválasztott populációinkat tükrözi. Ezen férfiak közül azonban egyik sem fejlesztett ki BRCA1/2 PV-t, így további molekuláris elemzésre voltak alkalmasak, hogy kizárják a kevésbé gyakori mutációk, például a PALB2, RAD51C és D jelenlétét. Bizonytalan jelentőségű variánsokat az alanyok 7%-ánál találtak, akiknél BRCA2 VUS volt kimutatható. Még ez az eredmény is összhangban van a már meglévő bizonyítékokkal.28,41,42
Amikor a BRCA1/2 mutáns nőkben a BC molekuláris altípusainak eloszlását elemeztük, megerősítettük a TNBC és a BRCA1 PV (58,8%), valamint a luminális B BC és a BRCA2 PV (55,6%) közötti ismert összefüggéseket.16,43 A BRCA1 és BRCA2 PV hordozóknál a luminális A és HER2+ tumorok összhangban vannak a meglévő irodalmi adatokkal.16,43
Ezután a BRCA1/2 PV típusára és elhelyezkedésére összpontosítunk. Kohortunkban a leggyakoribb BRCA1 PV a c.5035_5039delCTAAT volt. Bár Incorvaia és munkatársai... nem írták le ezt a variánst a szicíliai kohorszukban, más szerzők csíravonal-variánsként (BRCA1 PV) számoltak be róla.34 Kohorszunkban számos BRCA1 PV-t találtak – pl. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA és c.5266dupC –, amelyeket Szicíliában is megfigyeltek.28 Ezek közül két BRCA1 alapító mutáció (c.181T>G és c.5266dupC) gyakran előfordul Kelet- és Közép-Európa (Lengyelország, Csehország, Szlovénia, Osztrák, Magyar, Fehéroroszország és Németország) askenázi zsidóinál,44,45 és az Egyesült Államokban és Argentínában nemrégiben „visszatérő csíravonal-variánsként” definiálták olasz emlőrákos és csontvelőgyulladásos betegeknél. A 34c.514del variánst korábban 8 emlőrákos betegnél azonosították Észak-Szicíliában, Palermóban és Messinában. Érdekes módon, még Incorvaia és munkatársai is... Cataniában néhány családban megtalálták a c.3253dupA variánst.28 A legreprezentatívabb BRCA2 PV-k a c.428dup, a c.5851_5854delAGTT és az intronikus variáns a c.8487+1G>A, amelyekről részletesebben is beszámoltak28 egy palermói betegnél, akinél c.428dup volt a diagnózis. A c.5851_5854delAGTT PV-t Északnyugat-Szicíliában, főként a Trapani és Palermo régióban figyelték meg háztartásokban, míg a c.5851_5854delAGTT PV-t Északnyugat-Szicíliában figyelték meg háztartásokban. A 8487+1G>A variáns gyakoribb volt Messina, Palermo és Caltanissetta városából származó alanyoknál.28 Rebbeck és munkatársai korábban leírták a c.5851_5854delAGTT elváltozást Kolumbiában.37 Egy másik BRCA2 PV-t, a c.631+1G>A-t, Szicíliában (Agrigento, Siracusa és Ragusa) találták BC és OC betegeknél.28 Figyelemre méltó, hogy két BRCA2 variáns (BRCA2 c.631G>A és c.7008-2A>T) együttélését figyeltük meg ugyanazon betegnél, amelyről feltételeztük, hogy cisz módban szegregálódik, ahogy azt korábban is közöltük.34,46 Ezeket a BRCA2 uble mutációkat valóban gyakran megfigyelik az olasz régióban, és kimutatták, hogy idő előtti stop kodonokat vezetnek be, befolyásolva a hírvivő RNS splicingját és a BRCA2 fehérje meghibásodását okozva.47,48
A BRCA1 és BRCA2 PV-ket fehérjedomének és gének feltételezett OCCR és BCCR régióiban is feltérképeztük. Rebbeck és munkatársai ezeket a régiókat a petefészek- és emlőrák kialakulásának kockázati területeiként írták le.49 A csíravonal-variánsok elhelyezkedése és az emlő- vagy petefészekrák kockázata közötti összefüggésre vonatkozó bizonyítékok azonban továbbra is ellentmondásosak.28,50-52 Populációnkban a BRCA1 PV-k túlnyomórészt a BCCR régióban helyezkedtek el, míg a BRCA2 PV-k túlnyomórészt az OCCR régióban. Azonban nem találtunk összefüggést a feltételezett OCCR és BCCR régiók, valamint a BC jellemzői között. Ez a BRCA1/2 mutációval rendelkező betegek korlátozott számának tudható be. Fehérjedomén szempontjából a BRCA1 PV-k a teljes fehérje mentén oszlanak el, és a BRCA2 elváltozások elsősorban a BRC ismétlődő doménben találhatók meg.
Végül összefüggésbe hoztuk a BC klinikopatológiai jellemzőit a BRCA1/2 PV-vel. A bevont betegek korlátozott száma miatt csak a Ki-67 és a tumor fokozata között találtunk szignifikáns korrelációt. Bár a Ki-67 értékelése és értelmezése továbbra is némileg ellentmondásos, az biztos, hogy a magas proliferatív arány a betegség kiújulásának fokozott kockázatával és a túlélés csökkenésével jár. A mai napig a „magas” és az „alacsony” Ki-67 megkülönböztetésére szolgáló határérték 20%. Ez a küszöbérték azonban nem vonatkozik a BRCA1/2 mutációs betegpopulációnkra, amelynek medián Ki-67 értéke 25%. Ez a magas Ki-67 arányokban mutatkozó tendencia magyarázható a luminális B és TNBC kohorszainkban tapasztalható prevalenciával, amelyekben kevés luminális A tumor volt jelen. Egyes bizonyítékok azonban arra utalnak, hogy a magasabb Ki-67 határérték (25–30%) jobban rétegezheti a betegeket prognózisuk szerint.53,54 Elemzésünk eredményei alapján a szignifikáns korreláció nem meglepő. A magas Ki-67 és a fokozatok, valamint a BRCA1 PV jelenléte között fordul elő. Valójában, A BRCA1-gyel kapcsolatos tumorok jellemzőek a TNBC-re, és agresszívabb tüneteket mutatnak.16,17
Összefoglalva, ez a tanulmány a BRCA1/2 mutációs státuszáról számol be egy kelet-szicíliai emlőrákos kohorszban. Összességében eredményeink összhangban vannak a korábbi bizonyítékokkal, mind a mutációk prevalenciája, mind a emlőrák klinikopatológiai jellemzői tekintetében. Több, BRCA1/2-mutáns emlőrákos betegcsoportban végzett vizsgálatra van szükség, például multigenomális kiterjesztett mutációs analízis alkalmazásával, hogy felmérjük a BRCA1/2-nél eltérő és ritkábban előforduló fotovariánsok (PV) jelenlétét. Ez lehetővé teszi a genetikai mutációk miatt fokozott rákkockázatnak kitett, egyre növekvő számú alany azonosítását és megfelelő kezelését.
Megerősítettük, hogy a betegek tájékozott beleegyezésüket adták tumormintáik névtelen, kutatási célokra történő felhasználásához. Minden beteg írásbeli, tájékoztatáson alapuló beleegyezést adott a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően. Az AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco” szabályzatának megfelelően ez a vizsgálat mentesült az etikai felülvizsgálat alól, mivel a BRCA1/2 analízist a klinikai gyakorlatnak megfelelően végezték, és minden beteg írásbeli, tájékoztatáson alapuló beleegyezését adta. A betegek hozzájárulnak adataik kutatási célokra történő felhasználásához is.
Köszönettel tartozunk Paolo Vigneri professzornak az Etikai Bizottság kérésére az emlőrákos betegek ellátásában nyújtott segítségéért.
Federica Martorana tiszteletdíjakat számol be az Istituto Gentili, az Eli Lilly, a Novartis és a Pfizer részéről. A többi szerző nem jelent be összeférhetetlenséget ebben a munkában.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL és mások. Globális rákstatisztikák 2020: A GLOBOCAN 36 ráktípus előfordulási gyakoriságát és halálozási arányát becsüli meg a világ 185 országában. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660