Jūsu pārlūkprogrammā pašlaik ir atspējots Javascript. Dažas šīs vietnes funkcijas nedarbosies, ja JavaScript būs atspējots.
Reģistrējieties ar savu konkrēto informāciju un konkrētajām interesējošajām zālēm, un mēs salīdzināsim jūsu sniegto informāciju ar rakstiem mūsu plašajā datubāzē un nekavējoties nosūtīsim jums PDF kopiju pa e-pastu.
Piemēram, Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefānija Stella, 1, 2 Silvija Rita Vitale, 1, 2 Federika Martorana, 1, 2 Mišela Massimino, 1, 2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Exeplelin University of Cellalin, 2 Livia Manzperi of C1ical Katānija, Katānija, 95123, Itālija;2 Eksperimentālās onkoloģijas un hematoloģijas centrs, AOU Policlinico “G.Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itālija; 3 Medical Oncology, AOU Policlinico “G. Rodolico – San Marco”, Catania, 95123, Itālija; 4 Medical Genetics, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Itālija; 5 Medicine Genetics, ASP, Sirakūzas, 96100, Itālija; 6. Katānijas Universitātes Biomedicīnas un biotehnoloģijas zinātņu katedra, Medicīniskā ģenētika, Katānija, Itālija, 95123; 7. Oasi pētniecības institūts — IRCCS, Troina, 94018, Itālija. Komunikācija: Stefānija Stella, tālr. +39 095 378 1946, e-pasts: [email protected]; [email protected] Mērķis: Germīnlīnijas mutācijas BRCA1 un BRCA2 gēnos un diagnosticēts krūts vēzis (BC), olnīcu vēzis (OC) un citi, kas saistīti ar vēža risku visa mūža garumā. BRCA gēna testēšana ir būtiska, lai novērtētu individuālo risku, kā arī lai atrastu profilakses metodes veseliem nesējiem un pielāgotu ārstēšanu vēža pacientiem. BRCA1 un BRCA2 izmaiņu izplatība dažādos ģeogrāfiskajos reģionos ir ļoti atšķirīga, un, lai gan ir dati par BRCA patogēnajiem variantiem Sicīlijas ģimenēs, trūkst pētījumu, kas īpaši vērsti uz populācijām Sicīlijas austrumos. Mūsu pētījuma mērķis bija izpētīt BRCA patogēno germīnlīnijas izmaiņu sastopamību un izplatību BC pacientu kohortā no Sicīlijas austrumiem un novērtēt to saistību ar specifiskām BC pazīmēm, izmantojot nākamās paaudzes sekvencēšanu. Izmaiņu klātbūtne korelēja ar audzēja pakāpi un proliferācijas indeksu. REZULTĀTI: Kopumā 35 pacientiem (9%) bija BRCA patogēnais variants, 17 (49%) BRCA1 un 18 (51%) BRCA2. BRCA1 izmaiņas ir izplatītas trīskārši negatīvas BC pacientiem, savukārt BRCA2 mutācijas ir biežākas luminālas BC pacientiem. Salīdzinot ar pacientiem bez gēna nesējiem, pacientiem ar BRCA1 variantiem bija ievērojami... augstāka audzēja pakāpe un proliferācijas indekss. Secinājumi: Mūsu atklājumi sniedz pārskatu par BRCA mutāciju statusu krūts vēža pacientiem no Sicīlijas austrumu daļas un apstiprina NGS analīzes lomu pacientu ar iedzimtu krūts vēzi identificēšanā. Kopumā šie dati atbilst iepriekšējiem pierādījumiem, kas apstiprina BRCA skrīningu pareizai vēža profilaksei un ārstēšanai mutāciju nesējiem.
Krūts vēzis (KB) ir visizplatītākais ļaundabīgais audzējs pasaulē un nāvējošākais vēzis sievietēm.1 Bioloģiskās pazīmes, kas nosaka KB prognozi un klīnisko uzvedību, laika gaitā ir plaši pētītas un daļēji izskaidrotas. Faktiski vairāki surogātmarķieri pašlaik tiek izmantoti, lai klasificētu KB dažādos molekulārajos apakštipos. Tie ir estrogēna (ER) un/vai progesterona receptors (PgR), cilvēka epidermas augšanas faktora receptora 2 (HER2) amplifikācija, proliferācijas indekss Ki-67 un audzēja pakāpe (G).2 Šo mainīgo kombinācija identificēja šādas KB kategorijas: 1) Lūmena audzēji, kas uzrāda ER un/vai PgR ekspresiju, veidoja 75% no KB. Šie audzēji tika tālāk iedalīti Lūmena A audzējos, kad Ki-67 bija zem 20% un HER2 negatīvs, un Lūmena B audzējos, kad Ki-67 bija vienāds ar vai lielāks par 20% un HER2 amplifikācijas klātbūtnē neatkarīgi no proliferācijas indeksa; 2) HER2+ audzēji, kas ir ER un PgR negatīvi, bet uzrāda HER2 amplifikāciju. Šī grupa veido 10% no visiem krūts audzējiem; 3) Trīskārši negatīvs krūts vēzis (TNBC), kam nav ER un PgR ekspresijas un HER2 amplifikācijas, veido aptuveni 15 % krūts vēža gadījumu.2–4
Starp šiem BC apakštipiem audzēja pakāpe un proliferācijas indekss ir šķērsgriezuma biomarķieri, kas ir tieši un neatkarīgi saistīti ar audzēja agresivitāti un prognozi.5,6
Papildus iepriekšminētajām bioloģiskajām iezīmēm pēdējos gados arvien svarīgāka kļūst iedzimtu ģenētisku izmaiņu loma, kas izraisa krūts vēža attīstību.7 Apmēram viens no desmit krūts audzējiem tiek iedzimts noteiktu gēnu dzimumšūnu izmaiņu dēļ.8 Divos lielos epidemioloģiskos pētījumos, kuros piedalījās vairāk nekā 180 000 sieviešu, nesen tika identificēta astoņu gēnu grupa (t. i., ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C un RAD51D), kas galvenokārt ir atbildīgi par iedzimtu krūts vēzi. Starp šiem gēniem BRCA1 un BRCA2 (turpmāk tekstā — BRCA1/2) uzrādīja visspēcīgāko korelāciju ar krūts audzēju attīstību.9–12 Faktiski dzimumšūnu BRCA1/2 mutācijas ievērojami palielina krūts vēža, kā arī citu ļaundabīgu audzēju, tostarp olnīcu, prostatas, aizkuņģa dziedzera, kolorektālā vēža un melanomas, risku dzīves laikā. No 13 līdz 80 gadu vecumam krūts vēža kumulatīvā sastopamība ir 72 % sievietēm ar BRCA1 patogēno variantu (PV) un 69 % sievietēm ar BRCA2 PV.14
Jāatzīmē, ka nesen publicētā publikācijā ir norādīts, ka krūts vēža risks ir atkarīgs no PV veida. Faktiski, salīdzinot ar patogēniem saīsinošiem variantiem, acīmredzami misensa varianti, īpaši BRCA1 gēnā, ir saistīti ar samazinātu krūts vēža risku, īpaši vecākām sievietēm.15
BRCA1 vai BRCA2 PV klātbūtne bija saistīta ar dažādām bioloģiskām un klīniski patoloģiskām pazīmēm.16,17 Ar BRCA1 saistītie krūts audzēji mēdz būt klīniski agresīvi, vāji diferencēti un ļoti proliferatīvi. Šie audzēji parasti ir trīskārši negatīvi un sākas agri. Audzēji, kas rodas pacientiem ar BRCA2 mutāciju, parasti izrāda vidēji smagas vai ļoti diferencētas pakāpes un mainīgus proliferācijas rādītājus. Šie audzēji biežāk sastopami B lūmenā un parasti rodas gados vecākiem pieaugušajiem.16–18 Jāatzīmē, ka BRCA1 un BRCA2 mutācijas palielina jutību pret specifiskām ārstēšanas metodēm, tostarp platīna sāļiem un mērķtiecīgām zālēm, piemēram, poli(ADP-ribozes) polimerāzes inhibitoriem (PARPi).19,20
Pēdējo gadu laikā nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) ieviešana klīniskajā praksē ir ļāvusi arvien lielākam skaitam krūts vēža pacientu veikt molekulāros testus vēža uzņēmības sindromu, tostarp BRCA1/2, noteikšanai.21 Vienlaikus definīcijas, kas balstītas uz precīziem kritērijiem attiecībā uz ģimenes anamnēzi, demogrāfiskajām un klīniski patoloģiskajām īpašībām, tiek izstrādātas, lai labāk identificētu personas, kuras ir pelnījušas BRCA1/2 testēšanu.22,23 Šajā kontekstā uzkrājas pierādījumi par BRCA1/2 skrīningu konkrētās populācijās, izceļot atšķirības starp ģeogrāfiskajiem reģioniem.24–27 Lai gan ir ziņojumi par krūts vēža kohortu Sicīlijas rietumos, ir pieejams mazāk datu par BRCA1/2 skrīningu Sicīlijas austrumu populācijā.28,29
Šeit mēs aprakstām germinālās BRCA1/2 skrīninga rezultātus BC pacientiem no Sicīlijas austrumiem, vēl vairāk korelējot BRCA1 vai BRCA2 mutāciju klātbūtni ar šo audzēju galvenajām klīniski patoloģiskajām iezīmēm.
Retrospektīvs pētījums tika veikts “Eksperimentālās onkoloģijas un hematoloģijas centrā” Rodolico – San Marco poliklīnikas slimnīcā Katānijā. No 2017. gada janvāra līdz 2021. gada martam uz mūsu molekulārās diagnostikas laboratoriju BRCA/2 ģenētiskajai testēšanai tika nosūtīti kopumā 455 pacienti ar krūts un olnīcu vēzi, melanomu, aizkuņģa dziedzera vai prostatas vēzi. Šis pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarāciju, un visi dalībnieki pirms molekulārās analīzes sniedza rakstisku informētu piekrišanu.
BĶV histoloģiskās un bioloģiskās īpašības (ER, PgR, HER2 statuss, Ki-67 un pakāpe) tika novērtētas, izmantojot kodolbiopsijas vai ķirurģiskos paraugus, ņemot vērā tikai agresīvus audzēja komponentus. Pamatojoties uz šīm īpašībām, BĶV tika klasificētas šādi: lūmena A (ER+ un/vai PgR+, HER2-, Ki-67<20%), lūmena B (ER+ un/vai PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), lūmena B-HER2+ (ER un/vai PgR+, HER2+), HER2+ (ER un PgR-, HER2+) vai trīskārši negatīvas (ER un PgR-, HER2-).
Pirms BRCA1 un BRCA2 mutāciju statusa novērtēšanas daudznozaru komanda, kurā bija onkologs, ģenētiķis un psihologs, katram pacientam veica audzēja ģenētikas konsultāciju, lai noteiktu BRCA1 un/vai BRCA1 klātbūtni. vai personas ar augstu PV risku BRCA2 gēnā. Pacientu atlase tika veikta saskaņā ar Itālijas Medicīniskās onkoloģijas biedrības (AIOM) vadlīnijām un vietējiem Sicīlijas ieteikumiem.30,31 Šie kritēriji ietver: (i) zināmu patogēnu variantu ģimenes anamnēze uzņēmības gēnos (piemēram, BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) vīrieši ar krūts vēzi; (iii) tie, kuriem ir krūts vēzis un vēzis; (iv) sievietes ar krūts vēzi <36 gadiem, TNBC <60 gadiem vai divpusēju krūts vēzi <50 gadiem; (v) krūts vēža personīgā anamnēze <50 gadiem un vismaz viens pirmās pakāpes radinieks: (a) krūts vēzis <50 gadi; (b) nemucinoza un nerobežlīnijas krūts vēzis jebkurā vecumā; (c) divpusējs krūts vēzis; (d) vīriešu krūts vēzis; (e) aizkuņģa dziedzera vēzis; (f) prostatas vēzis; (vi) divi vai vairāki krūts vēža personīgā anamnēze > 50 gadi un krūts vēža, vispārējās karcinomas vai aizkuņģa dziedzera vēža ģimenes anamnēze radiniekiem, kuri ir pirmās pakāpes radinieki viens otram (ieskaitot radiniekus, ar kuriem viņa ir pirmās pakāpes radinieke); (vii) OB personīgā anamnēze un vismaz viens pirmās pakāpes radinieks: (a) krūts vēzis < 50 gadi; (b) nekontrolēta karcinoma; (c) divpusējs krūts vēzis; (d) vīriešu krūts vēzis; (vii) sieviete ar augstas pakāpes serozu OB.
No katra pacienta tika iegūts 20 ml perifēro asiņu paraugs un savākts EDTA mēģenēs (BD Biosciences). Genomiskā DNS tika izolēta no 0,7 ml pilnasins paraugiem, izmantojot QIAsymphony DSP DNA Midi komplekta izolācijas komplektu (QIAGEN, Hilden, Itālija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem, un izvadīta caur Qubit® 3.0 fluorometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Veikta kvantitatīvā noteikšana. Mērķa bagātināšanu un bibliotēkas sagatavošanu veic Oncomine™ BRCA Research Assay Chef, kas ir gatavs ielādei Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 komplektā automatizētai bibliotēkas sagatavošanai saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Komplekts sastāv no diviem multipleksiem PCR praimeru kopumiem, ko var izmantot, lai pētītu visus BRCA1 (NM_007300.3) un BRCA2 (NM_000059.3) gēnus. Īsumā, 15 µL katra atšķaidītā parauga DNS (10 ng) tika pievienoti svītrkodu plāksnēm bibliotēkas sagatavošanai, un visi reaģenti un palīgmateriāli tika ielādēti Ion Chef™ instrumentā. Pēc tam automatizēta bibliotēkas sagatavošana un svītrkodu paraugu bibliotēkas apvienošana tika veikta ar Ion Chef™ instrumentu. Sagatavoto bibliotēku skaits pēc tam tika novērtēts ar Qubit® 3.0 fluorometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Visbeidzot, bibliotēkas tiek apvienotas ekvimolārās attiecībās Ion Chef™ bibliotēkas paraugu mēģenēs (svītrkodu mēģenēs) un ielādētas Ion Chef™ ierīcē. instrumentu. Sekvencēšana tika veikta, izmantojot Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific) instrumentu (Thermo Fisher Scientific), izmantojot Ion 510 mikroshēmu (Thermo Fisher Scientific). Datu analīzi veica Amplicon Suite (SmartSeq srl) un Ion Reporter programmatūru.
Visa variantu nomenklatūra atbilda Cilvēka genoma variāciju konsorcija pašreizējām vadlīnijām, kas pieejamas tiešsaistē (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). BRCA1/2 variantu klīniskā nozīme tika definēta, izmantojot Starptautiskā konsorcija ENIGMA (Uz pierādījumiem balstīts tīkls dzimumšūnu mutantu alēļu interpretēšanai, https://enigmaconsortium.org/) klasifikāciju un konsultējoties ar dažādām datubāzēm, piemēram, ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD un UMD. Klasifikācija ietver piecas atšķirīgas riska kategorijas: labdabīgs (I kategorija), iespējams labdabīgs (II kategorija), neskaidras nozīmes variants (VUS, III kategorija), iespējams patogēns (IV kategorija) un patogēns (V kategorija). VarSome analizēja arī mutāciju ietekmi uz olbaltumvielu struktūru un funkciju — informatīvu rīku ar piekļuvi 30 datubāzēm.32
Lai katram VUS piešķirtu potenciālo klīnisko nozīmi, tika izmantoti šādi skaitļošanas proteīnu prognozēšanas algoritmi: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:///genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) un Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianti, kas klasificēti kā 1. un 2. klase, tika uzskatīti par savvaļas tipa variantiem.
Sanger sekvencēšana apstiprināja katra patogēnā varianta klātbūtni. Īsumā, katram atklātajam variantam tika izstrādāts specifisku praimeru pāris, izmantojot BRCA1 un BRCA2 gēnu atsauces sekvences (attiecīgi NG_005905.2, NM_007294.3 un NG_012772.3, NM_000059.3). Tāpēc tika veikta mērķtiecīga PCR, kam sekoja Sanger sekvencēšana.
Pacientiem, kuriem BRCA1/2 gēna tests bija negatīvs, tika veikta multipleksās ligācijas atkarīgā zondes amplifikācija (MLPA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem, lai novērtētu lielu genoma pārkārtojumu (LGR) klātbūtni. Īsumā, DNS paraugi tiek denaturēti un tiek izmantotas līdz 60 BRCA1 un BRCA2 gēnam specifiskas zondes, katra no kurām nosaka specifisku DNS secību aptuveni 60 nukleotīdu garumā. Zondes amplifikācijas produkti, kas sastāv no unikāla PCR amplikonu komplekta, pēc tam tika analizēti ar kapilāro elektroforēzi un Cofalyser.Net programmatūru kopā ar atbilstošām partijām specifiskām Cofalyser tabulām (www.mrcholland.com).
Atlasītie klīniski patoloģiskie mainīgie (histoloģiskā pakāpe un Ki-67% proliferācijas indekss) tika saistīti ar BRCA1/2 PV klātbūtni, kas tika aprēķināta, izmantojot Prism programmatūras 8.4. versiju, izmantojot Fišera precīzo testu, pieņemot, ka p-vērtība <0,05 ir statistiski nozīmīga.
Laikā no 2017. gada janvāra līdz 2021. gada martam 455 pacientiem tika veikta germinālās BRCA1/2 mutāciju skrīnings. Mutāciju testēšana tika veikta Poliklīnikas slimnīcas Eksperimentālās onkoloģijas un hematoloģijas centrā. Saskaņā ar Sicīlijas vadlīnijām (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, N. 02-Venerdì 10 Jannaio 2020), Katānijas-Sanmarko Rodolico slimnīcā kopumā tika pārbaudīti 389 pacienti: 37 krūts vēža pacienti, 37 olnīcu vēža pacienti, 16 aizkuņģa dziedzera vēža pacienti, 8 prostatas vēža pacienti un 5 melanomas pacienti. Pacientu sadalījums pēc vēža veida un analīzes rezultāti ir parādīti 1. attēlā.
1. attēlā redzama pētījuma pārskata blokshēma. Pacientiem ar krūts, melanomas, aizkuņģa dziedzera, prostatas vai olnīcu audzējiem tika pārbaudītas mutācijas BRCA1 un BRCA2 gēnos.
Saīsinājumi: PV, patogēns variants; VUS, neskaidras nozīmes variants; WT, savvaļas tipa BRCA1/2 secība.
Mūsu pētījumos selektīvi tika fokusētas krūts vēža kohortām. Pacientu vidējais vecums bija 49 gadi (diapazons no 23 līdz 89), un pārsvarā tās bija sievietes (n = 376 jeb 97%).
No šiem subjektiem 64 (17%) bija BRCA1/2 mutācijas, un visi bija sievietes. Trīsdesmit pieciem (9%) bija PV un 29 (7,5%) bija VUS. Septiņpadsmit (48,6%) no 35 patogēnajiem variantiem bija BRCA1 un 18 (51,4%) BRCA2, savukārt 5 VUS bija BRCA1 (17,2%) un 24 (82,8%) BRCA2 (1. un 2. attēls). LGR nebija konstatēts MLPA analīzē.
2. attēls. BRCA1 un BRCA2 mutāciju analīze 389 krūts vēža pacientēm. (A) Patogēno variantu (PV) (sarkans), neskaidras nozīmes variantu (VUS) (oranžs) un WT (zils) sadalījums 389 krūts vēža pacientēm; (B) 389 krūts vēža pacientes Trīsdesmit piecām (9%) bija BRCA1/2 patogēnie varianti (PV). No tām 17 (48,6%) bija BRCA1 PV nesējas (tumši sarkana) un 18 (51,4%) bija BRCA2 nesējas (gaiši sarkana); (C) 29 (7,5%) no 389 subjektiem bija VUS, 5 (17,2%) BRCA1 gēni (tumši oranža) un 24 (82,8%) BRCA2 gēni (gaiši oranža).
Saīsinājumi: PV, patogēns variants; VUS, neskaidras nozīmes variants; WT, savvaļas tipa BRCA1/2 secība.
Pēc tam mēs pētījām BC molekulāro apakštipu izplatību pacientiem ar BRCA1/2 PV. Sadalījums ietvēra 2 (5,7%) luminālā A, 15 (42,9%) luminālā B, 3 (8,6%) luminālā B-HER2+, 2 (5,7%) HER2+ un 13 (37,1%) TNBC pacientus. Starp BRCA1 pozitīviem pacientiem 5 (29,4%) bija luminālā B BC, 2 (11,8%) bija HER2+ slimība un 10 (58,8%) bija TNBC. Audzēji bez BRCA1 mutācijām bija vai nu luminālā A, vai luminālā B-HER2+ (3. attēls). BRCA2 pozitīvajā apakšgrupā 10 (55,6%) audzēji bija luminālā B, 3 (16,7%) bija luminālā B-HER2+, 3 (16,7%) TNBC un 2 (11,1%) bija luminālā A (3. attēls). Šajā pētījumā HER2+ audzēji netika konstatēti. grupā. Tādējādi BRCA1 mutācijas ir izplatītas TNBC pacientiem, savukārt BRCA2 izmaiņas ir dominējošas lūmena B indivīdiem.
3. attēls. Krūts vēža apakštipu izplatība pacientēm ar patogēniem BRCA1 un BRCA2 variantiem. Histogrammas, kas parāda BRCA1- (tumši sarkana) un BRCA2- (gaiši sarkana) PV sadalījumu starp krūts vēža pacientu molekulārajiem apakštipiem. Katrā lodziņā norādītie skaitļi atspoguļo pacientu ar BRCA1 un BRCA2 PV procentuālo daļu katrā krūts vēža apakštipā.
Saīsinājumi: PV, patogēns variants; HER2+, cilvēka epidermas augšanas faktora receptora 2 pozitīvs; TNBC, trīskārši negatīvs krūts vēzis.
Pēc tam mēs novērtējām BRCA1 un BRCA2 PV tipu un gēnu lokalizāciju. BRCA1 PV mēs novērojām 7 viena nukleotīda variantus (SNV), 6 delēcijas, 3 dublēšanās un 1 ievietošanu. Tikai viena mutācija (c.5522delG) ir jauns atklājums. Visbiežāk abiem subjektiem konstatētā BRCA1 PV bija c.5035_5039delCTAAT. Šīs izmaiņas ietver piecu nukleotīdu delēciju (CTAAT) BRCA1 15. eksonā, kā rezultātā aminoskābe leicīns tiek aizstāta ar tirozīnu 1679. kodonā, un translācijas rāmja nobīdes dēļ ar paredzēto alternatīvo stopkodonu notiek priekšlaicīga olbaltumvielu saīsināšana. Visas pārējās izmaiņas ir konstatētas tikai vienā gadījumā. Jāatzīmē, ka viens no ziņotajiem PV atradās splaisas vietas konsensa reģionā (c.4357+1G>T) (1. tabula).
Attiecībā uz BRCA2 PV mēs novērojām 6 delēcijas, 6 SNV un 2 dublācijas. Neviena no atrastajām izmaiņām nav jauna. Mūsu populācijā atkārtojās trīs mutācijas: c.428dup un c.8487+1G>A, kas novērotas 3 subjektiem, kam sekoja c.5851_5854delAGTT, kas iegūta divos gadījumos. c.428dup izmaiņa ietver C atkārtojumu BRCA2 5. eksonā, kas, domājams, kodē saīsinātu, nefunkcionējošu proteīnu. c.8487+1G>A mutācija rodas BRCA2 19. introna introniskajā reģionā (± 1,2) un ietekmē splaisinga konsensa secību, kā rezultātā mainās splaisings, kā rezultātā proteīns kļūst patoloģisks vai neesošs. c.5851_5854delAGTT patogēnais variants ir saistīts ar 4 nukleotīdu delēciju no nukleotīdu pozīcijām 5851 līdz 5854 BRCA2 gēna kodējošajā 10. eksonā un izraisa translācijas rāmja nobīdi ar paredzētu alternatīvu stopkodonu. (p.S1951WfsTer). Jāatzīmē, ka, kā jau ziņots iepriekš, vienam un tam pašam pacientam tika konstatētas gan izmaiņas c.631G>A, gan c.7008-2A>T.34 Pirmā mutācija ietver adenozīna (A) aizstāšanu BRCA2 7. eksonā ar guanīnu (G) saturošu nukleotīdu, kā rezultātā 211. kodonā valīns tiek aizstāts ar izoleicīnu, izoleicīna aminoskābe ir aminoskābe ar ļoti līdzīgām īpašībām. Šīs izmaiņas ietekmē normālu mRNS splaisošanu. Otrais variants atrodas introniskā reģionā un izraisa dubultu A aizstāšanu ar timīnu (T) pirms BRCA2 kodējošā gēna 13. eksona. Izmaiņa c.7008-2A>T var ģenerēt vairākus dažāda garuma transkriptus. Turklāt BRCA2 PV grupā 4 no 18 izmaiņām (22,2%) bija introniskas.
Pēc tam mēs kartējām BRCA1/2 kaitīgās mutācijas funkcionālajos domēnos un proteīnu saistošajos reģionos (4. att.). BRCA1 gēnā 50% PV atradās krūts vēža klastera reģionā (BCCR), savukārt 22% mutāciju atradās olnīcu vēža klastera reģionā (OCCR) (4.A att.). BRCA2 PV 35,7% variantu atradās BCCR reģionā un 42,8% mutāciju atradās OCCR (4.B att.). Pēc tam mēs novērtējām PV atrašanās vietu BRCA1 un BRCA2 proteīnu domēnos. BRCA1 proteīnam mēs atradām trīs PV cilpas un spirālveida spirāles domēnos un divas mutācijas BRCT domēnā (4.A att.). BRCA2 proteīnam 4 PV tika kartēti BRC atkārtojuma domēnā, savukārt 3 introniskas un 3 eksoniskas izmaiņas tika konstatētas oligo/oligosaharīdu saistošajā (OB) un torņa (T) domēnos (4.B att.).
4. attēls. BRCA1 un BRCA2 proteīnu shematisks attēlojums un patogēno variantu lokalizācija. Šajā attēlā parādīts BRCA1 (A) un BRCA2 (B) patogēno variantu sadalījums krūts vēža pacientēm. Eksoniskās mutācijas ir attēlotas zilā krāsā, bet introniskie varianti ir attēloti oranžā krāsā. Stieņa augstums norāda gadījumu skaitu. Tiek ziņots par BRCA1 un BRCA2 proteīniem un to funkcionālajiem domēniem. (A) BRCA1 proteīns satur cilpas domēnu (RING) un kodola lokalizācijas secību (NLS), spirālveida domēnu, SQ/TQ klastera domēnu (SCD) un BRCA1 C-termināla domēnu (BRCT). (B) BRCA2 proteīns satur astoņus BRC atkārtojumus, DNS saistošu domēnu ar spirālveida domēnu (Helical), trīs oligonukleotīdu/oligosaharīdu saistošus (OB) krokas, torņa domēnu (T) un NLS C pusē. Apakšā ir parādītas zonas, ko sauc par krūts vēža klastera reģionu (BCCR) un olnīcu vēža klastera reģionu (OCCR). *Apzīmē mutācijas, kas nosaka stopkodonus.
Pēc tam mēs pētījām krūts vēža klīniski patoloģiskās pazīmes, kas varētu korelēt ar BRCA1/2 PV klātbūtni. Pilnīgi klīniskie ieraksti bija pieejami par 181 BRCA1/2 negatīvu pacientu (nenesējiem) un visiem nesējiem (n = 35). Tika konstatēta korelācija starp audzēja proliferācijas ātrumu un pakāpi.
Ki-67 sadalījumu aprēķinājām, pamatojoties uz mūsu kohortas mediānu (25%, diapazons <10–90%). Subjekti ar Ki-67 < 25% tika definēti kā “zems Ki-67”, savukārt indivīdi ar vērtībām ≥ 25% tika uzskatīti par “augstu Ki-67”. Būtiskas Ki-67 atšķirības (p<0,01) tika konstatētas starp pacientiem bez GPU un BRCA1 PV nesējiem (5.A att.).
5. attēls. Ki-67 korelācija ar pakāpes sadalījumu krūts vēža sievietēm ar un bez BRCA1 un BRCA2 PV. (A) Kastīšu diagramma, kurā parādītas vidējās Ki-67 vērtības 181 krūts vēža pacientēm bez mutācijas, salīdzinot ar BRCA1 (18) vai BRCA2 (17) PV pacientēm. P vērtības zem 0,5 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām. (B) Histogramma, kas attēlo krūts vēža pacientu iedalījumu histoloģiskās pakāpes grupās (G2 un G3) atbilstoši BRCA1 un BRCA2 mutācijas statusam (WT subjekti, BRCA1 un BRCA2 PV nesēji).
Tāpat mēs pārbaudījām, vai audzēja pakāpe korelē ar BRCA1/2 PV klātbūtni. Tā kā mūsu populācijā G1 BC nebija, mēs pacientus sadalījām divās grupās (G2 vai G3). Saskaņā ar Ki-67 rezultātiem analīze atklāja statistiski nozīmīgu korelāciju starp audzēja pakāpi un BRCA1 mutāciju, un BRCA1 nesējiem bija lielāka G3 audzēju proporcija salīdzinājumā ar nesējiem (p<0,005) (5.B attēls).
DNS sekvencēšanas tehnoloģijas attīstība ir ļāvusi panākt vēl nebijušu progresu BRCA1/2 ģenētiskajā testēšanā, kam ir izšķiroša nozīme pacientiem ar vēža ģimenes anamnēzi. Līdz šim saskaņā ar Amerikas Medicīniskās ģenētikas biedrības35 un ENIGMA sistēmas datiem ir identificēti un klasificēti aptuveni 20 000 BRCA1/2 variantu.35,36 Ir labi zināms, ka BRCA1/2 mutāciju spektrs dažādos ģeogrāfiskajos reģionos ievērojami atšķiras.37 Itālijā BRCA1/2 PV līmenis svārstījās no 8 % līdz 37 %, kas liecina par plašu mainīgumu vienas valsts ietvaros.38,39 Sicīlija, kurā dzīvo gandrīz 5 miljoni iedzīvotāju, ir piektais lielākais reģions Itālijā pēc iedzīvotāju skaita. Lai gan ir dati par BRCA1/2 izplatību Sicīlijas rietumos, nav plašu pierādījumu par salas austrumu daļu.
Mūsu pētījums ir viens no pirmajiem ziņojumiem par BRCA1/2 PV sastopamību krūts vēža pacientiem Sicīlijas austrumos.28 Savā analīzē koncentrējāmies uz krūts vēzi, jo šī ir visizplatītākā slimība mūsu kohortā.
Pārbaudot 389 krūts vēža pacientus, 9% bija BRCA1/2 PV, vienmērīgi sadalot starp BRCA1 un BRCA2. Šie rezultāti atbilst iepriekš ziņotajiem Itālijas populācijā.28 Interesanti, ka 3% (13/389) no mūsu kohortas bija vīrieši. Šis rādītājs ir augstāks nekā paredzēts vīriešu krūts vēža gadījumā (1% no visiem krūts vēža gadījumiem),40 atspoguļojot mūsu populāciju atlasi, pamatojoties uz BRCA1/2 mutāciju risku. Tomēr nevienam no šiem vīriešiem neattīstījās BRCA1/2 PV, tāpēc viņi bija kandidāti tālākai molekulārai analīzei, lai izslēgtu retāk sastopamu mutāciju, piemēram, PALB2, RAD51C un D, ​​klātbūtni. 7% pacientu, kuriem bija redzams BRCA2 VUS, tika atrasti neskaidras nozīmes varianti. Pat šis rezultāts atbilst iepriekš pastāvošiem pierādījumiem.28,41,42
Analizējot BC molekulāro apakštipu sadalījumu sievietēm ar BRCA1/2 mutantiem, mēs apstiprinājām zināmas saistības starp TNBC un BRCA1 PV (58,8%) un starp luminālo B BC un BRCA2 PV (55,6%).16,43 Luminal A un HER2+ audzēji BRCA1 un BRCA2 PV nesējām atbilst esošajiem literatūras datiem.16,43
Pēc tam mēs koncentrējamies uz BRCA1/2 PV veidu un atrašanās vietu. Mūsu kohortā visbiežāk sastopamā BRCA1 PV bija c.5035_5039delCTAAT. Lai gan Incorvaia et al. šo variantu savā Sicīlijas kohortā neaprakstīja, citi autori to ir ziņojuši kā germinālās BRCA1 PV.34 Mūsu kohortā tika atrasti vairāki BRCA1 PV, piemēram, c.181T>G, c.514del, c.3253dupA un c.5266dupC, kas ir novēroti Sicīlijā.28 No tām divas BRCA1 dibinātājmutācijas (c.181T>G un c.5266dupC) bieži ir sastopamas aškenazu ebrejiem Austrumeiropā un Centrāleiropā (Polija, Čehija), Slovēnijā, Austrijā, Ungārijā, Baltkrievijā un Vācijā),44,45 un Amerikas Savienotajās Valstīs un Argentīnā nesen tika definētas kā "recidivējoša germinālās līnijas varianta" Itālijas pacientiem ar krūts vēzi un dzemdes kakla vēzi. 34c.514del variants iepriekš tika identificēts 8 krūts vēža pacientēm no Sicīlijas ziemeļiem Palermo un Mesīnā. Interesanti, ka pat Incorvaia et al. dažās ģimenēs Katānijā tika konstatēts c.3253dupA variants.28 Visreprezentatīvākie BRCA2 PV ir c.428dup, c.5851_5854delAGTT un introniskais variants c.8487+1G>A, par kuriem ir ziņots sīkāk,28 kad pacientei Palermo ar c.428dup c.5851_5854delAGTT PV tika novērots mājsaimniecībās Sicīlijas ziemeļrietumos, galvenokārt Trapani un Palermo reģionos, savukārt c.5851_5854delAGTT PV tika novērots mājsaimniecībās Sicīlijas ziemeļrietumos. 8487+1G>A variants bija biežāk sastopams pacientiem no Mesīnas, Palermo un Kaltanisetas.28 Rebbeck et al. iepriekš aprakstīta c.5851_5854delAGTT izmaiņa Kolumbijā.37 Vēl viena BRCA2 PV, c.631+1G>A, ir atrasta BC un OC pacientiem no Sicīlijas (Agrigento, Sirakūzas un Ragusas).28 Jāatzīmē, ka vienā pacientā mēs novērojām divu BRCA2 variantu (BRCA2 c.631G>A un c.7008-2A>T) līdzāspastāvēšanu, kas, mūsuprāt, ir segregēta cis režīmā, kā jau iepriekš ziņots.34,46 Šīs BRCA2 uble mutācijas patiešām bieži tiek novērotas Itālijas reģionā, un ir konstatēts, ka tās ievieš priekšlaicīgus stopkodonus, ietekmējot ziņneša RNS splaisu un izraisot BRCA2 proteīna atteici.47,48
Mēs arī kartējām BRCA1 un BRCA2 PV iespējamajos OCCR un BCCR reģionos olbaltumvielu domēnos un gēnos. Rebeka et al. šos reģionus aprakstīja kā attiecīgi olnīcu un krūts vēža attīstības riska zonas.49 Tomēr pierādījumi par saistību starp germinālās līnijas variantu atrašanās vietu un krūts vai olnīcu vēža risku joprojām ir pretrunīgi.28,50–52 Mūsu populācijā BRCA1 PV galvenokārt atradās BCCR reģionā, savukārt BRCA2 PV galvenokārt atradās OCCR reģionā. Tomēr mēs nevarējām atrast nekādu saistību starp iespējamajiem OCCR un BCCR reģioniem un BC pazīmēm. Tas varētu būt saistīts ar ierobežoto pacientu skaitu ar BRCA1/2 mutācijām. No olbaltumvielu domēna viedokļa BRCA1 PV ir izplatīti pa visu olbaltumvielu, un BRCA2 izmaiņas galvenokārt ir atrodamas BRC atkārtojuma domēnā.
Visbeidzot, mēs korelējām BC klīniski patoloģiskās pazīmes ar BRCA1/2 PV. Ierobežotā pacientu skaita dēļ mēs atradām būtisku korelāciju tikai starp Ki-67 un audzēja pakāpi. Lai gan Ki-67 novērtējums un interpretācija joprojām ir nedaudz pretrunīga, ir skaidrs, ka augsts proliferācijas līmenis ir saistīts ar paaugstinātu slimības recidīva risku un samazinātu izdzīvošanu. Līdz šim robežvērtība, lai atšķirtu “augstu” un “zemu” Ki-67 līmeni, ir 20%. Tomēr šis slieksnis neattiecas uz mūsu BRCA1/2 mutācijas pacientu populāciju, kuras vidējā Ki-67 vērtība ir 25%. Šo augsto Ki-67 rādītāju tendenci var izskaidrot ar izplatību mūsu luminālajā B un TNBC kohortās, kurās bija maz luminālā A audzēja. Tomēr daži pierādījumi liecina, ka augstāka Ki-67 robežvērtība (25–30%) varētu labāk stratificēt pacientus atbilstoši viņu prognozei.53,54 No mūsu analīzes rezultātiem nozīmīga korelācija nav pārsteidzoša. Pastāv starp augstu Ki-67 līmeni un pakāpēm, kā arī BRCA1 PV klātbūtni. Patiesībā, Ar BRCA1 saistīti audzēji ir tipiski TNBC un tiem piemīt agresīvākas pazīmes.16,17
Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums sniedz ziņojumu par BRCA1/2 mutāciju statusu krūts vēža kohortā no Sicīlijas austrumu daļas. Kopumā mūsu atklājumi atbilst jau esošajiem pierādījumiem gan mutāciju izplatības, gan klīniski patoloģisko pazīmju ziņā krūts vēža gadījumā. Lai novērtētu atšķirīgu un retāk sastopamu PV klātbūtni nekā BRCA1/2, ir nepieciešami vairāk pētījumu lielākās BRCA1/2 mutantu krūts vēža pacientu populācijās, piemēram, izmantojot daudzgenomu paplašinātu mutāciju analīzi. Tas ļaus identificēt un pareizi ārstēt pieaugošo to pacientu skaitu, kuriem ir paaugstināts vēža risks ģenētisku mutāciju dēļ.
Mēs apstiprinājām, ka pacienti parakstīja informētu piekrišanu anonīmi izpaust savus audzēja paraugus pētniecības nolūkos. Visi pacienti parakstīja rakstisku informētu piekrišanu saskaņā ar Helsinku deklarāciju. Saskaņā ar AOU poliklīnikas “G.Rodolico – S.Marco” politiku šis pētījums tika atbrīvots no ētikas pārskatīšanas, jo BRCA1/2 analīze tika veikta saskaņā ar klīnisko praksi un visi pacienti sniedza rakstisku informētu piekrišanu. Pacienti arī piekrīt savu datu izmantošanai pētniecības nolūkos.
Mēs pateicamies profesoram Paolo Vigneri par viņa sniegto palīdzību krūts vēža pacientu aprūpē pēc ētikas komitejas pieprasījuma.
Federika Martorana ziņo par honorāriem no Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis un Pfizer. Pārējie autori paziņo, ka viņiem nav interešu konflikta šajā darbā.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL u.c. Globālā vēža statistika 2020: GLOBOCAN aplēses par 36 vēža veidu saslimstību un mirstību 185 pasaules valstīs. CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660