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Mitwirkende Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Abteilung für klinische und experimentelle Medizin, Universität von Catania, Catania, 95123, Italien;2 Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien; 3 Medizinische Onkologie, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien; 4 Medizinische Genetik, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italien; 5 Medicine Genetics, ASP, Syrakus, 96100, Italien; 6 Department of Biomedical and Biotechnology Sciences, Universität Catania, Medical Genetics, Catania, Italien, 95123; 7Oasi Research Institute-IRCCS, Troina, 94018, Italien Kommunikation: Stefania Stella, Tel. +39 095 378 1946, E-Mail [email protected]; [email protected] Zweck: Keimbahnmutationen in BRCA1 und BRCA2 sowie etablierter Brustkrebs (BC), Eierstockkrebs (OC) und andere Erkrankungen sind mit einem lebenslangen Krebsrisiko verbunden. Die Untersuchung auf das BRCA-Gen ist der Schlüssel zur Beurteilung des individuellen Risikos sowie zur Entwicklung von Präventionsmethoden bei gesunden Trägern und zur Anpassung der Behandlung bei Krebspatienten. Die Prävalenz von BRCA1- und BRCA2-Veränderungen variiert stark in den geografischen Regionen, und obwohl Daten zu pathogenen BRCA-Varianten in sizilianischen Familien vorliegen, fehlen Studien, die sich speziell auf die Bevölkerung in Ostsizilien konzentrieren. Ziel unserer Studie war es, die Inzidenz und Verteilung pathogener BRCA-Keimbahnveränderungen in einer Kohorte von BC-Patienten aus Ostsizilien zu untersuchen und ihren Zusammenhang mit spezifischen BC-Merkmalen mittels Next-Generation-Sequenzierung zu bewerten. Das Vorhandensein von Veränderungen korrelierte mit dem Tumorgrad und dem Proliferationsindex. ERGEBNISSE: Insgesamt wiesen 35 Patienten (9 %) eine pathogene BRCA-Variante auf, 17 (49 %) in BRCA1 und 18 (51 %) in BRCA2.BRCA1-Veränderungen kommen häufig bei Patienten mit dreifach negativem Brustkrebs vor, während BRCA2-Mutationen bei Patienten mit luminalem Brustkrebs häufiger sind. Im Vergleich zu Nicht-Trägern wiesen Personen mit BRCA1-Varianten einen signifikant höheren Tumorgrad und Proliferationsindex auf. Schlussfolgerungen: Unsere Erkenntnisse bieten einen Überblick über den BRCA-Mutationsstatus bei Patienten mit Brustkrebs aus Ostsizilien und bestätigen die Rolle der NGS-Analyse bei der Identifizierung von Patienten mit erblichem Brustkrebs. Insgesamt stehen diese Daten im Einklang mit früheren Erkenntnissen, die ein BRCA-Screening zur angemessenen Prävention und Behandlung von Krebs bei Mutationsträgern unterstützen.
Brustkrebs (BC) ist die weltweit häufigste bösartige Erkrankung und die tödlichste Krebserkrankung bei Frauen.1 Die biologischen Merkmale, die die Prognose und das klinische Verhalten von BC bestimmen, wurden im Laufe der Zeit umfassend untersucht und teilweise geklärt. Tatsächlich werden derzeit mehrere Ersatzmarker verwendet, um BC in verschiedene molekulare Subtypen zu klassifizieren. Diese sind Östrogen- (ER) und/oder Progesteronrezeptor (PgR), Amplifikation des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2), Proliferationsindex Ki-67 und Tumorgrad (G).2 Die Kombination dieser Variablen führte zu den folgenden BC-Kategorien: 1) Luminale Tumoren mit ER- und/oder PgR-Expression machten 75 % der BCs aus. Diese Tumoren wurden weiter unterteilt in Luminal A, wenn Ki-67 unter 20 % lag und HER2-negativ war, und Luminal B, wenn Ki-67 gleich oder über 20 % lag und eine HER2-Amplifikation vorlag, unabhängig vom Proliferationsindex; 2) HER2+-Tumoren, die ER- und PgR-negativ sind, aber eine HER2-Amplifikation aufweisen. Diese Gruppe macht 10 % aller Brusttumore aus; 3) Dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), der weder ER- und PgR-Expression noch HER2-Amplifikation aufweist, macht etwa 15 % aller Brustkrebserkrankungen aus.2-4
Bei diesen BC-Subtypen stellen der Tumorgrad und der Proliferationsindex Querschnittsbiomarker dar, die direkt und unabhängig mit der Tumoraggressivität und Prognose verbunden sind.5,6
Zusätzlich zu den bereits erwähnten biologischen Merkmalen hat die Rolle vererbter genetischer Veränderungen, die zur Entwicklung von Brustkrebs führen, in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen.7 Etwa 1 von 10 Brusttumoren wird aufgrund von Keimbahnveränderungen in bestimmten Genen vererbt.8 Zwei große epidemiologische Studien mit mehr als 180.000 Frauen haben kürzlich eine Gruppe von acht Genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C und RAD51D) identifiziert, die hauptsächlich für erblichen Brustkrebs verantwortlich sind. Unter diesen Genen zeigten BRCA1 und BRCA2 (im Folgenden als BRCA1/2 bezeichnet) die stärkste Korrelation mit der Entwicklung von Brusttumoren.9-12 Tatsächlich erhöhen Keimbahnmutationen von BRCA1/2 das Lebenszeitrisiko für Brustkrebs sowie andere bösartige Erkrankungen, darunter Eierstock-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm- und Melanomerkrankungen, erheblich. 72 % bei Frauen mit einer pathogenen BRCA1-Variante (PV) und 69 % bei Frauen mit einer BRCA2-PV.14
Insbesondere deutet eine aktuelle Veröffentlichung darauf hin, dass das BC-Risiko von der Art der PV abhängt. Tatsächlich sind auffällige Missense-Varianten, insbesondere im BRCA1-Gen, im Vergleich zu pathogenen trunkierenden Varianten mit einem geringeren BC-Risiko verbunden, insbesondere bei älteren Frauen.15
Das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-PV war mit verschiedenen biologischen und klinisch-pathologischen Merkmalen verbunden.16,17 BRCA1-assoziierte BCs neigen dazu, klinisch aggressiv, schlecht differenziert und hoch proliferativ zu sein. Diese Tumoren sind normalerweise dreifach negativ und treten früh auf. Tumoren, die bei BRCA2-mutierten Patienten auftreten, weisen typischerweise mittlere bis gut differenzierte Grade und variable Proliferationsindizes auf. Diese Tumoren sind häufiger im Lumen B und treten normalerweise bei älteren Erwachsenen auf.16-18 Insbesondere erhöhen Mutationen in BRCA1 und BRCA2 die Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Behandlungen, einschließlich Platinsalzen und zielgerichteten Medikamenten wie Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren (PARPi).19,20
In den letzten Jahren hat die Implementierung der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) in die klinische Praxis dazu geführt, dass sich immer mehr BC-Patienten molekularen Tests auf Krebsanfälligkeitssyndrome, einschließlich BRCA1/2, unterziehen können.21 Gleichzeitig basieren Definitionen auf präzisen Kriterien hinsichtlich Familienanamnese, demografischer und klinisch-pathologischer Merkmale, um Personen, die für einen BRCA1/2-Test in Frage kommen, besser zu identifizieren.22,23 In diesem Zusammenhang häufen sich die Erkenntnisse zum BRCA1/2-Screening in bestimmten Bevölkerungsgruppen und verdeutlichen die Unterschiede zwischen geografischen Regionen.24–27 Obwohl es Berichte über die BC-Kohorte in Westsizilien gibt, stehen weniger Daten zum BRCA1/2-Screening in der Bevölkerung Ostsiziliens zur Verfügung.28,29
Wir beschreiben hier die Ergebnisse des Keimbahn-BRCA1/2-Screenings bei BC-Patienten aus Ostsizilien und korrelieren das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-Mutationen weiter mit den wichtigsten klinisch-pathologischen Merkmalen dieser Tumoren.
Eine retrospektive Studie wurde am „Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie“ des Policlinico Hospital Rodolico – San Marco in Catania durchgeführt. Von Januar 2017 bis März 2021 wurden insgesamt 455 Patienten mit Brust- und Eierstockkrebs, Melanom, Bauchspeicheldrüsenkrebs oder Prostatakrebs für genetische Tests auf BRCA/2 an unser molekulardiagnostisches Labor überwiesen. Diese Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und alle Teilnehmerinnen gaben vor der molekularen Analyse ihre schriftliche Einverständniserklärung ab.
Die histologischen und biologischen Eigenschaften (ER, PgR, HER2-Status, Ki-67 und Grad) der BC wurden anhand von Kernbiopsien oder chirurgischen Proben beurteilt, wobei nur aggressive Tumorkomponenten berücksichtigt wurden. Basierend auf diesen Eigenschaften wurden die BCs wie folgt klassifiziert: luminal A (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67 < 20 %), luminal B (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67 ≥ 20 %), luminal B-HER2+ (ER und/oder PgR+, HER2+), HER2+ (ER und PgR-, HER2+) oder dreifach negativ (ER und PgR-, HER2-).
Vor der Beurteilung des BRCA1- und BRCA2-Mutationsstatus führte ein multidisziplinäres Team, darunter ein Onkologe, ein Genetiker und ein Psychologe, bei jedem Patienten eine tumorgenetische Beratung durch, um das Vorhandensein von BRCA1 und/oder BRCA1 im BRCA2-Gen zu bestimmen. oder Personen mit einem hohen PV-Risiko im BRCA2-Gen. Die Patientenauswahl erfolgte gemäß den Richtlinien der Italienischen Gesellschaft für Medizinische Onkologie (AIOM) und den lokalen sizilianischen Empfehlungen.30,31 Diese Kriterien umfassen: (i) Familienanamnese bekannter pathogener Varianten in Suszeptibilitätsgenen (z. B. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) Männer mit BC; (iii) Personen mit BC und OC; (iv) Frauen mit BC <36 Jahre, TNBC <60 Jahre oder bilateralem BC <50 Jahre; (v) persönliche Krankengeschichte von BC <50 Jahre und mindestens ein Verwandter ersten Grades: (a) BC < 50 Jahre; (b) nicht-muzinöses und nicht grenzwertiges OC jeden Alters; (c) bilaterales BC; (d) männlicher BC; (e) Bauchspeicheldrüsenkrebs; (f) Prostatakrebs; (vi) zwei oder mehr persönliche Vorgeschichte von BC > 50 Jahre und Familiengeschichte von BC, OC oder Bauchspeicheldrüsenkrebs bei Verwandten, die ersten Grades miteinander verwandt sind (einschließlich Verwandter, mit denen sie ersten Grades verwandt ist); (vii) persönliche Vorgeschichte von OC und mindestens einem Verwandten ersten Grades: (a) BC < 50 Jahre; (b) NOC; (c) bilateraler BC; (d) männlicher BC; (vii) Frau mit hochgradigem serösem OC.
Von jedem Patienten wurde eine 20-ml-Probe peripheren Blutes entnommen und in EDTA-Röhrchen (BD Biosciences) gesammelt. Genomische DNA wurde aus 0,7-ml-Vollblutproben unter Verwendung des QIAsymphony DSP DNA Midi Kit Isolation Kit (QIAGEN, Hilden, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und zur Quantifizierung durch ein Qubit® 3.0-Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) geleitet. Die Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung erfolgt mit dem Oncomine™ BRCA Research Assay Chef. Anschließend kann das Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zur automatisierten Bibliotheksvorbereitung geladen werden. Das Kit enthält zwei Multiplex-PCR-Primerpools, mit denen alle BRCA1- (NM_007300.3) und BRCA2-Gene (NM_000059.3) untersucht werden können. 15 µl jeder verdünnten DNA-Probe (10 ng) wurden zur Bibliotheksvorbereitung auf barcodierte Platten gegeben und alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien auf das Ion Chef™-Gerät geladen. Anschließend erfolgte die automatisierte Bibliotheksvorbereitung und das Pooling der barcodierten Probenbibliotheken auf dem Ion Chef™-Gerät. Die Anzahl der vorbereiteten Bibliotheken wurde anschließend gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ermittelt. Abschließend werden die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnissen kombiniert in Probenröhrchen der Ion Chef™-Bibliothek (Röhrchen mit Barcode) wurden auf das Ion Chef™-Gerät geladen. Die Sequenzierung erfolgte mit einem Ion Torrent S5-Gerät (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung eines Ion 510-Chips (Thermo Fisher Scientific). Die Datenanalyse erfolgte mit Amplicon Suite (SmartSeq srl) und der Ion Reporter-Software.
Die gesamte Variantennomenklatur folgte den aktuellen Richtlinien des Human Genome Variation Consortium, die online verfügbar sind (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Die klinische Bedeutung von BRCA1/2-Varianten wurde anhand der Klassifikation des Internationalen Konsortiums ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) und unter Konsultation verschiedener Datenbanken wie ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD und UMD definiert. Die Klassifikation umfasst fünf verschiedene Risikokategorien: gutartig (Kategorie I), wahrscheinlich gutartig (Kategorie II), Variante mit ungewisser Bedeutung (VUS, Kategorie III), wahrscheinlich pathogen (Kategorie IV) und pathogen (Kategorie V). VarSome analysierte auch die Auswirkungen von Mutationen auf die Struktur und Funktion von Proteinen, ein informatives Tool mit Zugriff auf 30 Datenbanken.32
Um jedem VUS eine potenzielle klinische Bedeutung zuzuweisen, wurden die folgenden rechnergestützten Proteinvorhersagealgorithmen verwendet: MUTATION TASTER, 33 PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) und Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianten der Klasse 1 und 2 wurden als Wildtyp betrachtet.
Die Sanger-Sequenzierung bestätigte das Vorhandensein jeder pathogenen Variante. Kurz gesagt wurde für jede erkannte Variante ein Paar spezifischer Primer entwickelt, indem die Referenzsequenzen der Gene BRCA1 und BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 bzw. NG_012772.3, NM_000059.3) verwendet wurden. Daher wurde eine gezielte PCR durchgeführt, gefolgt von einer Sanger-Sequenzierung.
Bei Patienten mit negativem BRCA1/2-Gentest wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) durchgeführt, um das Vorhandensein großer genomischer Umlagerungen (LGR) festzustellen. Kurz gesagt werden DNA-Proben denaturiert und bis zu 60 BRCA1- und BRCA2-genspezifische Sonden verwendet, die jeweils eine spezifische DNA-Sequenz mit einer Länge von etwa 60 Nukleotiden erkennen. Die aus einem einzigartigen Satz von PCR-Amplifikaten bestehenden Sondenamplifikationsprodukte wurden dann mittels Kapillarelektrophorese und mit der Software Cofalyser.Net in Verbindung mit den entsprechenden chargenspezifischen Cofalyser-Tabellen (www.mrcholland.com) analysiert.
Ausgewählte klinisch-pathologische Variablen (histologischer Grad und Ki-67 %-Proliferationsindex) wurden mit dem Vorhandensein von BRCA1/2-PV in Zusammenhang gebracht und mit der Prism-Software v. 8.4 unter Verwendung des exakten Fisher-Tests berechnet, wobei ein p-Wert <0,05 als signifikant angenommen wurde.
Zwischen Januar 2017 und März 2021 wurden 455 Patienten auf BRCA1/2-Keimbahnmutationen untersucht. Die Mutationstests wurden im Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie des Poliklinikums durchgeführt. Gemäß der sizilianischen Leitlinie (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, Nr. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020), dem Rodolico di Catania – San Marco, erkrankten insgesamt 389 Patienten an Brustkrebs, 37 an Eierstockkrebs, 16 an Bauchspeicheldrüsenkrebs, 8 an Prostatakrebs und 5 an Melanomen. Die Verteilung der Patienten nach Krebsart und Analyseergebnissen ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm, das einen Überblick über die Studie gibt. Patienten mit Brust-, Melanom-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata- oder Eierstocktumoren wurden auf Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 getestet.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; VUS, Variante von ungewisser Bedeutung; WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Wir haben unsere Studien gezielt auf Brustkrebskohorten konzentriert. Die Patienten hatten ein Durchschnittsalter von 49 Jahren (Bereich 23–89) und waren überwiegend weiblich (n = 376 oder 97 %).
Von diesen Personen hatten 64 (17 %) BRCA1/2-Mutationen und waren alle weiblich. 35 (9 %) hatten PV und 29 (7,5 %) hatten VUS. 17 (48,6 %) der 35 pathogenen Varianten traten bei BRCA1 und 18 (51,4 %) bei BRCA2 auf, während 5 VUS bei BRCA1 (17,2 %) und 24 (82,8 %) bei BRCA2 auftraten (Abbildungen 1 und 2). LGR war in der MLPA-Analyse nicht vorhanden.
Abbildung 2. Analyse von BRCA1- und BRCA2-Mutationen bei 389 Brustkrebspatientinnen. (A) Verteilung pathogener Varianten (PV) (rot), Varianten unklarer Signifikanz (VUS) (orange) und WT (blau) bei 389 Brustkrebspatientinnen; (B) 389 Brustkrebspatientinnen. Fünfunddreißig (9 %) hatten pathogene BRCA1/2-Varianten (PVs). Unter ihnen waren 17 (48,6 %) BRCA1-PV-Träger (dunkelrot) und 18 (51,4 %) BRCA2-Träger (hellrot); (C) 29 (7,5 %) der 389 Personen trugen VUS, 5 (17,2 %) BRCA1-Gene (dunkelorange) und 24 (82,8 %) BRCA2-Gene (hellorange).
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; VUS, Variante von ungewisser Bedeutung; WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Als nächstes untersuchten wir die Prävalenz der molekularen BC-Subtypen bei Patienten mit BRCA1/2 PV. Die Verteilung umfasste 2 (5,7 %) Luminal-A-, 15 (42,9 %) Luminal-B-, 3 (8,6 %) Luminal-B-HER2+-, 2 (5,7 %) HER2+- und 13 (37,1 %) TNBC-Patienten. Unter den BRCA1-positiven Patienten hatten 5 (29,4 %) Luminal-B-BC, 2 (11,8 %) eine HER2+-Erkrankung und 10 (58,8 %) TNBC. Tumoren ohne BRCA1-Mutationen waren entweder Luminal-A- oder Luminal-B-HER2+-Tumoren (Abbildung 3). In der BRCA2-positiven Untergruppe waren 10 (55,6 %) Tumoren Luminal B, 3 (16,7 %) Luminal-B-HER2+-Tumoren, 3 (16,7 %) TNBC Luminal A (Abbildung 3). In dieser Gruppe waren keine HER2+-Tumoren vorhanden. Daher sind BRCA1-Mutationen bei TNBC-Patienten weit verbreitet, während BRCA2-Veränderungen bei Personen mit Lumen B vorherrschend sind.
Abbildung 3: Prävalenz von Brustkrebs-Subtypen bei Patienten mit pathogenen Varianten in BRCA1 und BRCA2. Histogramme zeigen die Verteilung von BRCA1- (dunkelrot) und BRCA2- (hellrot) PVs unter den molekularen Subtypen von Brustkrebspatientinnen. Die in jedem Kästchen angegebenen Zahlen stellen den Prozentsatz der Patienten mit BRCA1- und BRCA2-PV für jeden Brustkrebs-Subtyp dar.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; HER2+, humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 positiv; TNBC, dreifach negativer Brustkrebs.
Anschließend untersuchten wir Typ und Genlokalisation der BRCA1- und BRCA2-PVs. Bei den BRCA1-PVs beobachteten wir 7 Einzelnukleotidvarianten (SNVs), 6 Deletionen, 3 Duplikationen und 1 Insertion. Lediglich eine Mutation (c.5522delG) stellt eine Neuentdeckung dar. Die am häufigsten bei beiden Probanden nachgewiesene BRCA1-PV war c.5035_5039delCTAAT. Diese Veränderung beinhaltet eine Deletion von fünf Nukleotiden (CTAAT) im BRCA1-Exon 15, was zum Ersatz der Aminosäure Leucin durch Tyrosin am Codon 1679 führt und aufgrund einer Translations-Frameshift mit einem vorhergesagten alternativen Stopcodon zu einer vorzeitigen Proteinverkürzung führt. Alle anderen Veränderungen wurden nur in einem Fall nachgewiesen. Bemerkenswerterweise befand sich eine der gemeldeten PVs in der Konsensusregion der Spleißstelle (c.4357+1G>T) (Tabelle 1).
Bezüglich BRCA2 PV beobachteten wir sechs Deletionen, sechs SNVs und zwei Duplikationen. Keine der gefundenen Veränderungen ist neuartig. Drei Mutationen traten in unserer Population erneut auf: c.428dup und c.8487+1G>A, die bei drei Probanden beobachtet wurden, gefolgt von c.5851_5854delAGTT, das in zwei Fällen nachgewiesen wurde. Die c.428dup-Mutation beinhaltet eine Wiederholung von C in Exon 5 von BRCA2, das voraussichtlich ein verkürztes, nicht-funktionales Protein kodiert. Die c.8487+1G>A-Mutation tritt im Intronbereich von BRCA2-Intron 19 (± 1,2) auf und beeinflusst die Spleißkonsensussequenz, was zu verändertem Spleißen und damit zu abnormalem oder fehlendem Protein führt. Die pathogene Variante c.5851_5854delAGTT ist auf eine 4-Nukleotid-Deletion an den Nukleotidpositionen 5851 bis 5854 im kodierenden Exon zurückzuführen. 10 des BRCA2-Gens und führt zu einer Translationsleserverschiebung mit einem vorhergesagten alternativen Stopcodon (p.S1951WfsTer). Bemerkenswerterweise wurden, wie bereits berichtet, beide Veränderungen c.631G>A und c.7008-2A>T bei demselben Patienten festgestellt.34 Die erste Mutation beinhaltet den Ersatz von Adenosin (A) im BRCA2-Exon 7 durch ein Guanin (G) enthaltendes Nukleotid, was zu einem Austausch von Valin zu Isoleucin am Codon 211 führt. Isoleucin ist eine Aminosäure mit sehr ähnlichen Eigenschaften. Diese Veränderung beeinträchtigt das normale mRNA-Spleißen. Die zweite Variante befindet sich in einer intronischen Region und führt zu einer doppelten Substitution von A durch Thymin (T) vor Exon 13 des Gens, das BRCA2 kodiert. Die Veränderung c.7008-2A>T kann mehrere Transkripte unterschiedlicher Länge erzeugen. Darüber hinaus sind in der Gruppe der BRCA2-PVs 4 von 18 Die Veränderungen (22,2 %) waren intronenartig.
Anschließend kartierten wir BRCA1/2-schädliche Mutationen in funktionellen Domänen und Proteinbindungsregionen (Abb. 4). Im BRCA1-Gen befanden sich 50 % der PVs in der Brustkrebs-Clusterregion (BCCR), während 22 % der Mutationen in der Eierstockkrebs-Clusterregion (OCCR) lokalisiert waren (Abb. 4A). Bei BRCA2-PV befanden sich 35,7 % der Varianten in der BCCR-Region und 42,8 % der Mutationen in der OCCR (Abb. 4B). Anschließend untersuchten wir die Position der PV innerhalb der BRCA1- und BRCA2-Proteindomänen. Für das BRCA1-Protein fanden wir drei PVs in den Loop- und Coiled-Coil-Domänen sowie zwei Mutationen in der BRCT-Domäne (Abb. 4A). Für das BRCA2-Protein wurden 4 PVs in der BRC-Repeat-Domäne kartiert, während 3 intronische und 3 exonische Veränderungen in der Oligo/Oligosaccharid-Bindungsdomäne nachgewiesen wurden. (OB) und Turmdomänen (T) ( Abbildung 4B).
Abbildung 4: Schematische Darstellung der BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und Lokalisierung pathogener Varianten. Diese Abbildung zeigt die Verteilung der pathogenen BRCA1- (A) und BRCA2-Varianten (B) bei Brustkrebspatientinnen. Exonmutationen sind blau, intronenartige Varianten orange dargestellt. Die Balkenhöhe stellt die Anzahl der Fälle dar. Die BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und ihre funktionellen Domänen werden dargestellt. (A) Das BRCA1-Protein enthält eine Loop-Domäne (RING) und eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), eine Coiled-Coil-Domäne, eine SQ/TQ-Clusterdomäne (SCD) und eine BRCA1-C-terminale Domäne (BRCT). (B) Das BRCA2-Protein enthält acht BRC-Wiederholungen, eine DNA-Bindungsdomäne mit einer helikalen Domäne (Helical), drei Oligonukleotid-/Oligosaccharid-Bindungsfalten (OB), eine Tower-Domäne (T) und eine NLS auf der C-Seite. Bereiche, die als Brustkrebs-Clusterregion (BCCR) und Eierstockkrebs-Clusterregion bezeichnet werden (OCCR) werden unten angezeigt. *Stellt Mutationen dar, die Stopcodons bestimmen.
Anschließend untersuchten wir die klinisch-pathologischen Merkmale von BC, die mit dem Vorhandensein von BRCA1/2-PV korrelieren könnten. Vollständige klinische Aufzeichnungen lagen für 181 BRCA1/2-negative Patienten (Nicht-Träger) und alle Träger (n = 35) vor. Es gab eine Korrelation zwischen Tumorproliferationsrate und -grad.
Wir haben die Verteilung von Ki-67 basierend auf dem Median unserer Kohorte (25 %, Bereich < 10–90 %) berechnet. Personen mit Ki-67 < 25 % wurden als „niedriges Ki-67“ definiert, während Personen mit Werten ≥ 25 % als „hohes Ki-67“ galten. Es wurden signifikante Ki-67-Unterschiede (p < 0,01) zwischen Nicht-Trägern und BRCA1-PV-Trägern festgestellt (Abb. 5A).
Abbildung 5: Korrelation von Ki-67 mit der Gradverteilung bei Brustkrebspatientinnen mit und ohne BRCA1- und BRCA2-PVs. (A) Boxplot, das die mittleren Ki-67-Werte bei 181 Brustkrebspatientinnen ohne Trägerschaft im Vergleich zu BRCA1- (18) oder BRCA2- (17) PV-Patientinnen zeigt. P-Werte unter 0,5 wurden als statistisch signifikant angesehen. (B) Histogramm, das die Einteilung der Brustkrebspatientinnen in histologische Gradgruppen (G2 und G3) entsprechend dem BRCA1- und BRCA2-Mutationsstatus (WT-Personen, BRCA1- und BRCA2-PV-Trägerinnen) darstellt.
Ebenso untersuchten wir, ob der Tumorgrad mit dem Vorhandensein von BRCA1/2 PV korrelierte. Da G1 BC in unserer Population nicht vorkam, teilten wir die Patienten in zwei Gruppen (G2 oder G3) ein. In Übereinstimmung mit den Ki-67-Ergebnissen ergab die Analyse eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Tumorgrad und BRCA1-Mutation, mit einem höheren Anteil von G3-Tumoren bei BRCA1-Trägern als bei Nicht-Trägern (p < 0,005) (Abbildung 5B).
Fortschritte in der DNA-Sequenzierungstechnologie haben beispiellose Fortschritte bei genetischen Tests auf BRCA1/2 ermöglicht, mit entscheidenden Auswirkungen für Patienten mit Krebs in der Familienanamnese. Bisher wurden ungefähr 20.000 BRCA1/2-Varianten identifiziert und gemäß der American Society of Medical Genetics 35 und dem ENIGMA-System klassifiziert.35,36 Es ist bekannt, dass das BRCA1/2-Mutationsspektrum je nach geografischer Region stark variiert.37 Innerhalb Italiens variierte die Rate der BRCA1/2-PVs zwischen 8 % und 37 %, was auf eine große Variabilität innerhalb des Landes hinweist.38,39 Mit fast 5 Millionen Einwohnern ist Sizilien gemessen an der Einwohnerzahl die fünftgrößte Region Italiens. Obwohl Daten zur Verbreitung von BRCA1/2 im Westen Siziliens vorliegen, gibt es im östlichen Teil der Insel keine umfassenden Belege.
Unsere Studie ist einer der ersten Berichte über die Häufigkeit von BRCA1/2-PV bei BC-Patienten in Ostsizilien.28 Wir haben unsere Analyse auf BC konzentriert, da dies die bei weitem häufigste Krankheit in unserer Kohorte ist.
Bei der Untersuchung von 389 Brustkrebspatienten wiesen 9 % BRCA1/2-PVs auf, die gleichmäßig zwischen BRCA1 und BRCA2 verteilt waren. Diese Ergebnisse stimmen mit den zuvor in der italienischen Bevölkerung berichteten Ergebnissen überein.28 Interessanterweise waren 3 % (13/389) unserer Kohorte männlich. Diese Rate ist höher als für männlichen Brustkrebs erwartet (1 % aller Brustkrebspatienten),40 was unsere Auswahl der Populationen auf Grundlage des BRCA1/2-Mutationsrisikos widerspiegelt. Allerdings entwickelte keiner dieser Männer eine BRCA1/2-PV, sodass sie Kandidaten für weitere molekulare Analysen waren, um das Vorhandensein weniger häufiger Mutationen wie PALB2, RAD51C und D u. a. auszuschließen. Varianten von unklarer Signifikanz wurden bei 7 % der Probanden gefunden, bei denen BRCA2-VUS nachweisbar war. Auch dieses Ergebnis steht im Einklang mit bereits vorhandenen Beweisen.28,41,42
Bei der Analyse der Verteilung der molekularen BC-Subtypen bei Frauen mit BRCA1/2-Mutation bestätigten sich bekannte Assoziationen zwischen TNBC und BRCA1-PV (58,8 %) sowie zwischen luminalem B BC und BRCA2-PV (55,6 %).16,43 Die luminalen A- und HER2+-Tumoren bei Trägerinnen von BRCA1- und BRCA2-PV stimmen mit den vorhandenen Literaturdaten überein.16,43
Wir konzentrieren uns dann auf den Typ und den Ort des BRCA1/2-PV. In unserer Kohorte war das häufigste BRCA1-PV c.5035_5039delCTAAT. Obwohl Incorvaia et al. haben diese Variante in ihrer sizilianischen Kohorte nicht beschrieben, andere Autoren haben sie als Keimbahn-BRCA1-PV gemeldet.34 In unserer Kohorte wurden mehrere BRCA1-PVs gefunden – z. B. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA und c.5266dupC –, die in Sizilien beobachtet wurden.28 Von diesen kommen zwei BRCA1-Gründermutationen (c.181T>G und c.5266dupC) häufig bei aschkenasischen Juden in Ost- und Mitteleuropa (Polen, Tschechien), Slowenien, Österreich, Ungarn, Weißrussland und Deutschland vor), 44,45 und wurden in den Vereinigten Staaten und Argentinien kürzlich als „rezidivierende Keimbahnvariante“ bei italienischen Patienten mit BC und OC definiert. Die Variante 34c.514del wurde zuvor bei 8 Brustkrebspatientinnen in Palermo und Messina im Norden Siziliens identifiziert. Interessanterweise haben sogar Incorvaia et al. fanden die Variante c.3253dupA in einigen Familien in Catania.28 Die repräsentativsten BRCA2-PVs sind c.428dup, c.5851_5854delAGTT und die intronenartige Variante c.8487+1G>A, über die ausführlicher berichtet wurde 28 bei einem Patienten in Palermo mit c.428dup, c.5851_5854delAGTT PV wurde in Haushalten im Nordwesten Siziliens beobachtet, hauptsächlich in den Regionen Trapani und Palermo, während c.5851_5854delAGTT PV in Haushalten im Nordwesten Siziliens beobachtet wurde. Die Variante 8487+1G>A war bei Personen aus Messina, Palermo und Caltanissetta häufiger.28 Rebbeck et al. wurde zuvor die Veränderung c.5851_5854delAGTT in Kolumbien beschrieben.37 Ein weiterer BRCA2-PV, c.631+1G>A, wurde bei BC- und OC-Patienten aus Sizilien (Agrigento, Syrakus und Ragusa) gefunden.28 Bemerkenswerterweise beobachteten wir die Koexistenz zweier BRCA2-Varianten (BRCA2 c.631G>A und c.7008-2A>T) bei derselben Patientin, von denen wir annahmen, dass sie im cis-Modus getrennt sind, wie dies bereits zuvor berichtet wurde.34,46 Diese BRCA2-Doppelmutationen werden in der italienischen Region tatsächlich häufig beobachtet und führen nachweislich zu vorzeitigen Stopcodons, die das Spleißen der Messenger-RNA beeinträchtigen und zum Versagen des BRCA2-Proteins führen.47,48
Wir haben außerdem BRCA1- und BRCA2-PVs in mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen von Proteindomänen und Genen kartiert. Diese Regionen wurden von Rebbeck et al. als Risikobereiche für die Entwicklung von Eierstock- bzw. Brustkrebs beschrieben.49 Allerdings bleiben die Beweise für den Zusammenhang zwischen der Lokalisierung von Keimbahnvarianten und dem Brust- oder Eierstockkrebsrisiko umstritten.28,50-52 In unserer Population waren BRCA1-PVs überwiegend in der BCCR-Region lokalisiert, während BRCA2-PVs überwiegend in der OCCR-Region lokalisiert waren. Wir konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen und BC-Merkmalen feststellen. Dies kann an der begrenzten Anzahl von Patienten mit BRCA1/2-Mutationen liegen. Aus Sicht der Proteindomäne sind BRCA1-PVs über das gesamte Protein verteilt, und BRCA2-Veränderungen finden sich bevorzugt in der BRC-Wiederholungsdomäne.
Schließlich korrelierten wir die klinisch-pathologischen Merkmale von BC mit BRCA1/2-PV. Aufgrund der begrenzten Anzahl eingeschlossener Patienten fanden wir nur eine signifikante Korrelation zwischen Ki-67 und dem Tumorgrad. Obwohl die Bewertung und Interpretation von Ki-67 etwas umstritten bleibt, ist es sicher, dass hohe proliferative Raten mit einem erhöhten Risiko eines Krankheitsrückfalls und einer verringerten Überlebensrate verbunden sind. Bislang liegt der Grenzwert zur Unterscheidung zwischen „hohem“ und „niedrigem“ Ki-67 bei 20 %. Dieser Schwellenwert gilt jedoch nicht für unsere Patientenpopulation mit BRCA1/2-Mutation, deren medianer Ki-67-Wert 25 % beträgt. Dieser Trend zu hohen Ki-67-Raten lässt sich durch die Prävalenz in unseren Luminal-B- und TNBC-Kohorten erklären, in denen nur wenige Luminal-A-Tumoren vorhanden waren. Einige Hinweise scheinen jedoch darauf hinzudeuten, dass ein höherer Ki-67-Grenzwert (25–30 %) die Patienten entsprechend ihrer Prognose besser stratifizieren könnte.53,54 Aus den Ergebnissen unserer Analyse geht keine signifikante Korrelation hervor überraschend. Tritt zwischen hohen Ki-67- und Graden und dem Vorhandensein von BRCA1 PV auf. Tatsächlich sind BRCA1-assoziierte Tumoren typisch für TNBC und weisen aggressivere Merkmale auf.16,17
Zusammenfassend liefert diese Studie einen Bericht über den Mutationsstatus von BRCA1/2 in einer BC-Kohorte aus Ostsizilien. Insgesamt stehen unsere Erkenntnisse im Einklang mit bereits vorhandenen Erkenntnissen, sowohl hinsichtlich der Mutationsprävalenz als auch der klinisch-pathologischen Merkmale bei BC. Weitere Studien an größeren Populationen von BC-Patienten mit BRCA1/2-Mutation, beispielsweise mithilfe einer erweiterten multigenomischen Mutationsanalyse, sind erforderlich, um das Vorhandensein von PVs zu beurteilen, die sich von BRCA1/2 unterscheiden und seltener auftreten. Dadurch können die zunehmende Zahl von Personen mit erhöhtem Krebsrisiko aufgrund genetischer Mutationen identifiziert und angemessen behandelt werden.
Wir haben bestätigt, dass die Patienten eine Einverständniserklärung zur anonymen Freigabe ihrer Tumorproben für Forschungszwecke unterzeichnet haben. Alle Patienten haben eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Deklaration von Helsinki unterzeichnet. Gemäß der Richtlinie der AOU Policlinico „G.Rodolico – S.Marco“ wurde diese Studie von der ethischen Überprüfung ausgenommen, da die BRCA1/2-Analyse gemäß der klinischen Praxis durchgeführt wurde und alle Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben haben. Die Patienten stimmen außerdem der Verwendung ihrer Daten für Forschungszwecke zu.
Wir danken Prof. Paolo Vigneri für seine Unterstützung bei der Betreuung von Brustkrebspatientinnen, wie von der Ethikkommission gefordert.
Federica Martorana berichtet über Honorare von Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis und Pfizer. Die anderen Autoren erklären, dass in dieser Arbeit keine Interessenkonflikte bestehen.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al.Globale Krebsstatistik 2020: GLOBOCAN schätzt die Inzidenz und Mortalität von 36 Krebsarten in 185 Ländern weltweit.CA Cancer J Clin.2021;71(3):209-249.doi: 10.3322/caac.21660