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Mitwirkende Stella S, Vitale SR, Martorana F, Massimino M, Pavone G, Lanzafame K, Bianca S, Barone C, Gorgone C, Fichera M, Manzella L
Stefania Stella, 1,2 Silvia Rita Vitale, 1,2 Federica Martorana, 1,2 Michele Massimino, 1,2 Giuliana Pavone, 3 Katia Lanzafame, 3 Sebastiano Bianca, 4 Chiara Barone, 5 Cristina Gorgone, 6 Marco Fichera, 6, 7 Livia Manzella1,21 Abteilung für klinische und experimentelle Medizin, Universität von Catania, Catania, 95123, Italien;2 Zentrum für experimentelle Onkologie und Hämatologie, AOU Policlinico „G.Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien; 3 Medizinische Onkologie, AOU Policlinico „G. Rodolico – San Marco“, Catania, 95123, Italien; 4 Medizinische Genetik, ARNAS Garibaldi, Catania, 95123, Italien; 5 Medizinische Genetik, ASP, Syracuse, 96100, Italien; 6 Abteilung für Biomedizinische und Biotechnologische Wissenschaften, Universität Catania, Medizinische Genetik, Catania, Italien, 95123; 7 Oasi Forschungsinstitut-IRCCS, Troina, 94018, Italien Kommunikation: Stefania Stella, Tel. +39 095 378 1946, E-Mail [email protected]; [email protected] Ziel: Keimbahnmutationen in BRCA1 und BRCA2 und etablierter Brustkrebs (BC), Eierstockkrebs (OC) und andere Krebsarten sind mit einem lebenslangen Krebsrisiko verbunden. Die Testung auf das BRCA-Gen ist entscheidend für die Beurteilung des individuellen Risikos sowie für die Entwicklung von Präventionsmethoden bei gesunden Genträgern und die individualisierte Behandlung von Krebspatienten. Die Prävalenz von BRCA1- und BRCA2-Veränderungen variiert stark zwischen verschiedenen geografischen Regionen. Obwohl Daten zu pathogenen BRCA-Varianten in sizilianischen Familien vorliegen, fehlen Studien, die sich speziell auf Populationen in Ostsizilien konzentrieren. Ziel unserer Studie war es, die Inzidenz und Verteilung pathogener BRCA-Keimbahnveränderungen in einer Kohorte von Brustkrebspatientinnen aus Ostsizilien zu untersuchen und deren Zusammenhang mit spezifischen Brustkrebsmerkmalen mittels Next-Generation-Sequenzierung zu bewerten. Das Vorhandensein von Veränderungen korrelierte mit dem Tumorgrad und dem Proliferationsindex. ERGEBNISSE: Insgesamt wiesen 35 Patientinnen (9 %) eine pathogene BRCA-Variante auf, 17 (49 %) in BRCA1 und 18 (51 %) in BRCA2. BRCA2- und BRCA1-Mutationen treten häufig bei Patientinnen mit dreifach negativem Brustkrebs auf, während BRCA2-Mutationen häufiger bei Patientinnen mit luminalem Brustkrebs vorkommen. Im Vergleich zu Nicht-Trägerinnen wiesen Patientinnen mit BRCA1-Varianten einen signifikant höheren Tumorgrad und Proliferationsindex auf. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse liefern einen Überblick über den BRCA-Mutationsstatus bei Brustkrebspatientinnen aus Ostsizilien und bestätigen die Bedeutung der NGS-Analyse für die Identifizierung von Patientinnen mit erblichem Brustkrebs. Insgesamt stimmen diese Daten mit früheren Erkenntnissen überein, die ein BRCA-Screening zur adäquaten Prävention und Behandlung von Krebs bei Mutationsträgerinnen belegen.
Brustkrebs (BC) ist weltweit die häufigste Krebserkrankung und die tödlichste Krebsart bei Frauen.¹ Die biologischen Merkmale, die die Prognose und das klinische Verhalten von BC bestimmen, wurden im Laufe der Zeit umfassend untersucht und teilweise aufgeklärt. Tatsächlich werden derzeit mehrere Surrogatmarker verwendet, um BC in verschiedene molekulare Subtypen zu klassifizieren. Dazu gehören der Östrogenrezeptor (ER) und/oder der Progesteronrezeptor (PgR), die Amplifikation des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2), der Proliferationsindex Ki-67 und der Tumorgrad (G).² Die Kombination dieser Variablen identifizierte die folgenden BC-Kategorien: 1) Luminale Tumoren, die ER- und/oder PgR-Expression aufweisen, machten 75 % der BCs aus. Diese Tumoren wurden weiter unterteilt in Luminal A, wenn Ki-67 unter 20 % lag und HER2 negativ war, und Luminal B, wenn Ki-67 gleich oder über 20 % lag und eine HER2-Amplifikation vorlag, unabhängig vom Proliferationsindex; 2) HER2-positive Tumoren, die ER- und PgR-negativ sind, aber eine HER2-Amplifikation aufweisen. Diese Gruppe macht 10 % aller Brusttumoren aus; 3) Dreifach negativer Brustkrebs (TNBC), der weder ER- noch PgR-Expression und keine HER2-Amplifikation aufweist, macht etwa 15 % aller Brustkrebsfälle aus.^2–4
Unter diesen BC-Subtypen stellen Tumorgrad und Proliferationsindex Querschnittsbiomarker dar, die direkt und unabhängig mit der Tumoraggressivität und der Prognose assoziiert sind.5,6
Neben den bereits erwähnten biologischen Merkmalen hat die Bedeutung erblicher genetischer Veränderungen, die zur Entstehung von Brustkrebs führen, in den letzten Jahren zunehmend zugenommen.⁷ Etwa jeder zehnte Brusttumor ist erblich bedingt und beruht auf Keimbahnveränderungen in spezifischen Genen.⁸ Zwei große epidemiologische Studien mit über 180.000 Frauen haben kürzlich eine Gruppe von acht Genen (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, CHK2, PALB2, RAD51C und RAD51D) identifiziert, die hauptsächlich für erblichen Brustkrebs verantwortlich sind. Unter diesen Genen zeigten BRCA1 und BRCA2 (im Folgenden BRCA1/2 genannt) die stärkste Korrelation mit der Entstehung von Brusttumoren.^9–12 Tatsächlich erhöhen Keimbahnmutationen in BRCA1/2 das Lebenszeitrisiko für Brustkrebs sowie für andere maligne Erkrankungen, darunter Eierstock-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Darmkrebs und Melanom, signifikant. Die kumulative Inzidenz von Brustkrebs im Alter von 13 bis 80 Jahren beträgt 72 % bei Frauen mit einer pathogenen BRCA1-Variante (PV) und 69 % bei Frauen mit einer pathogenen BRCA2-Variante.14
Eine kürzlich erschienene Publikation legt nahe, dass das Brustkrebsrisiko vom Typ der pathogenen Variante abhängt. Tatsächlich sind auffällige Missense-Varianten, insbesondere im BRCA1-Gen, im Vergleich zu pathogenen trunkierenden Varianten mit einem reduzierten Brustkrebsrisiko verbunden, vor allem bei älteren Frauen.¹⁵
Das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-Mutationen ist mit unterschiedlichen biologischen und klinisch-pathologischen Merkmalen assoziiert.^16,17 BRCA1-assoziierte Mammakarzinome sind tendenziell klinisch aggressiv, schlecht differenziert und hochproliferativ. Diese Tumoren sind meist dreifach negativ und treten in jungen Jahren auf. Tumoren bei Patientinnen mit BRCA2-Mutationen weisen typischerweise einen mäßigen bis guten Differenzierungsgrad und variable Proliferationsindizes auf. Diese Tumoren sind häufiger im Lumen B anzutreffen und betreffen in der Regel ältere Erwachsene.^16–18 Mutationen in BRCA1 und BRCA2 erhöhen die Sensitivität gegenüber spezifischen Therapien, darunter Platinsalze und zielgerichtete Medikamente wie Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren (PARPi).^19,20
In den letzten Jahren hat die Implementierung der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) in der klinischen Praxis es einer zunehmenden Anzahl von Brustkrebspatientinnen ermöglicht, sich molekulargenetisch auf Krebsdispositionssyndrome, einschließlich BRCA1/2, testen zu lassen.²¹ Gleichzeitig wurden Definitionen entwickelt, die auf präzisen Kriterien hinsichtlich Familienanamnese, demografischen und klinisch-pathologischen Merkmalen basieren, um Personen, die für einen BRCA1/2-Test in Frage kommen, besser zu identifizieren.^22,23 In diesem Zusammenhang mehren sich die Erkenntnisse zum BRCA1/2-Screening in spezifischen Bevölkerungsgruppen, wobei Unterschiede zwischen verschiedenen geografischen Regionen deutlich werden.^24–27 Obwohl Berichte über die Brustkrebskohorte in Westsizilien vorliegen, sind weniger Daten zum BRCA1/2-Screening in der Bevölkerung Ostsiziliens verfügbar.^28,29
Wir beschreiben hier die Ergebnisse des Keimbahn-BRCA1/2-Screenings bei Brustkrebspatientinnen aus Ostsizilien und setzen das Vorhandensein von BRCA1- oder BRCA2-Mutationen mit den wichtigsten klinisch-pathologischen Merkmalen dieser Tumore in Zusammenhang.
Eine retrospektive Studie wurde im Zentrum für Experimentelle Onkologie und Hämatologie des Universitätsklinikums Rodolico – San Marco in Catania durchgeführt. Von Januar 2017 bis März 2021 wurden insgesamt 455 Patientinnen und Patienten mit Brust- und Eierstockkrebs, Melanom, Pankreaskrebs oder Prostatakrebs zur BRCA2-Gentestung an unser molekulardiagnostisches Labor überwiesen. Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt, und alle Teilnehmenden gaben vor der molekularen Analyse ihre schriftliche Einwilligung.
Histologische und biologische Merkmale (ER-, PgR-, HER2-Status, Ki-67 und Grad) von Brustkrebs wurden anhand von Stanzbiopsien oder chirurgischen Proben beurteilt, wobei nur aggressive Tumorkomponenten berücksichtigt wurden. Basierend auf diesen Merkmalen wurden Brustkrebsarten wie folgt klassifiziert: luminal A (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67<20%), luminal B (ER+ und/oder PgR+, HER2-, Ki-67≥20%), luminal B-HER2+ (ER und/oder PgR+, HER2+), HER2+ (ER und PgR-, HER2+) oder dreifach negativ (ER und PgR-, HER2-).
Vor der Bestimmung des BRCA1- und BRCA2-Mutationsstatus führte ein multidisziplinäres Team, bestehend aus einem Onkologen, einem Genetiker und einem Psychologen, für jeden Patienten eine tumorgenetische Beratung durch, um das Vorliegen von BRCA1- und/oder BRCA2-Mutationen bzw. ein hohes Risiko für eine pathogene Variante (PV) zu ermitteln. Die Patientenauswahl erfolgte gemäß den Leitlinien der Italienischen Gesellschaft für Medizinische Onkologie (AIOM) und den lokalen sizilianischen Empfehlungen.^30,31 Zu diesen Kriterien gehören: (i) familiäre Vorbelastung mit bekannten pathogenen Varianten in Suszeptibilitätsgenen (z. B. BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN); (ii) Männer mit Brustkrebs; (iii) Männer mit Brustkrebs und Eierstockkrebs; (iv) Frauen mit Brustkrebs vor dem 36. Lebensjahr, triple-negativem Brustkrebs vor dem 60. Lebensjahr oder beidseitigem Brustkrebs vor dem 50. Lebensjahr; (v) eigene Vorgeschichte mit Brustkrebs vor dem 50. Lebensjahr und mindestens ein Verwandter ersten Grades mit: (a) Brustkrebs vor dem 50. Lebensjahr; (b) nicht-muzinösem und nicht-borderlinem Eierstockkrebs in jedem Alter; (c) beidseitigem Brustkrebs. (d) männlicher Brustkrebs; (e) Pankreaskrebs; (f) Prostatakrebs; (vi) zwei oder mehr Fälle von Brustkrebs in der persönlichen Vorgeschichte (über 50 Jahre) und familiäre Vorbelastung mit Brustkrebs, Eierstockkrebs oder Pankreaskrebs bei Verwandten ersten Grades (einschließlich Verwandten, mit denen sie selbst Verwandte ersten Grades ist); (vii) Fälle von Eierstockkrebs in der persönlichen Vorgeschichte und mindestens ein Verwandter ersten Grades: (a) Brustkrebs vor dem 50. Lebensjahr; (b) nicht-ovarieller Eierstockkrebs; (c) beidseitiger Brustkrebs; (d) männlicher Brustkrebs; (vii) Frau mit hochgradigem serösem Eierstockkrebs.
Jedem Patienten wurden 20 ml peripheres Blut entnommen und in EDTA-Röhrchen (BD Biosciences) aufgefangen. Die genomische DNA wurde aus 0,7 ml Vollblutproben mit dem QIAsymphony DSP DNA Midi Kit (QIAGEN, Hilden, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und anschließend mit einem Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert. Zielanreicherung und Bibliothekspräparation erfolgen mit dem Oncomine™ BRCA Research Assay Chef. Dieser wird anschließend gemäß den Herstellerangaben in das Ion AmpliSeq™ Chef Reagents DL8 Kit für die automatisierte Bibliothekspräparation geladen. Das Kit enthält zwei Multiplex-PCR-Primerpools zur Untersuchung aller BRCA1- (NM_007300.3) und BRCA2-Gene (NM_000059.3). Kurz gesagt: 15 µL jeder verdünnten Proben-DNA (10 ng) wurden für die Bibliothekspräparation auf barcodierte Platten pipettiert und alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien in das Ion Chef™-Gerät geladen. Die automatisierte Bibliothekspräparation und das Pooling der barcodierten Probenbibliotheken wurden dann auf dem Ion Chef™-Gerät durchgeführt. Die Anzahl der präparierten Bibliotheken wurde anschließend mit einem Qubit® 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß den Herstellerangaben bestimmt. Abschließend werden die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnissen kombiniert. Probenröhrchen für die Ion Chef™-Bibliothek (mit Barcode) wurden in das Ion Chef™-Gerät geladen. Die Sequenzierung erfolgte mit einem Ion Torrent S5-Gerät (Thermo Fisher Scientific) und einem Ion 510 Chip (Thermo Fisher Scientific). Die Datenanalyse wurde mit der Amplicon Suite (SmartSeq srl) und der Ion Reporter Software durchgeführt.
Die Nomenklatur aller Varianten folgte den aktuellen Richtlinien des Human Genome Variation Consortium (HGVS, http://www.hgvs.org/mutnomen). Die klinische Signifikanz der BRCA1/2-Varianten wurde anhand der Klassifikation des International Consortium ENIGMA (Evidence-Based Network for Interpreting Germline Mutant Alleles, https://enigmaconsortium.org/) und unter Einbeziehung verschiedener Datenbanken wie ARUP, BRCAEXCHANGE, ClinVar, IARC_LOVD und UMD bestimmt. Die Klassifikation umfasst fünf Risikokategorien: benigne (Kategorie I), wahrscheinlich benigne (Kategorie II), Variante unklarer Signifikanz (VUS, Kategorie III), wahrscheinlich pathogen (Kategorie IV) und pathogen (Kategorie V). VarSome analysierte zudem die Auswirkungen der Mutationen auf die Proteinstruktur und -funktion – ein aufschlussreiches Instrument mit Zugriff auf 30 Datenbanken.³²
Um jeder Variante unklarer Signifikanz (VUS) eine potenzielle klinische Bedeutung zuzuordnen, wurden die folgenden computergestützten Proteinvorhersagealgorithmen verwendet: MUTATION TASTER, PROVEAN-SIFT (http://provean.jcvi.org/index.php), POLYPHEN-2 (http:// /genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) und Align-GVGD (http://agvgd.hci.utah.edu/agvgd_input.php). Varianten der Klassen 1 und 2 wurden als Wildtyp betrachtet.
Die Sanger-Sequenzierung bestätigte das Vorhandensein jeder pathogenen Variante. Kurz gesagt, wurde für jede detektierte Variante ein spezifisches Primerpaar unter Verwendung der Referenzsequenzen der Gene BRCA1 und BRCA2 (NG_005905.2, NM_007294.3 bzw. NG_012772.3, NM_000059.3) entworfen. Anschließend wurde eine gezielte PCR mit nachfolgender Sanger-Sequenzierung durchgeführt.
Patienten mit negativem BRCA1/2-Gentest wurden gemäß den Herstellerangaben mittels multiplexer ligationsabhängiger Sondenamplifikation (MLPA) auf das Vorliegen großer genomischer Rearrangements (LGR) untersucht. Kurz gesagt: Die DNA-Proben werden denaturiert und bis zu 60 BRCA1- und BRCA2-genspezifische Sonden verwendet, die jeweils eine spezifische DNA-Sequenz von etwa 60 Nukleotiden Länge detektieren. Die Sondenamplifikationsprodukte, bestehend aus einem einzigartigen Satz von PCR-Amplifikaten, wurden anschließend mittels Kapillarelektrophorese und mit der Software Cofalyser.Net in Verbindung mit den entsprechenden chargenspezifischen Cofalyser-Tabellen (www.mrcholland.com) analysiert.
Ausgewählte klinisch-pathologische Variablen (histologischer Grad und Ki-67%-Proliferationsindex) wurden mit dem Vorhandensein von BRCA1/2 PV in Zusammenhang gebracht. Die Berechnung erfolgte mit der Software Prism v. 8.4 unter Verwendung des Fisher-Exakt-Tests, wobei ein p-Wert <0,05 als signifikant angenommen wurde.
Zwischen Januar 2017 und März 2021 wurden 455 Patientinnen auf Keimbahnmutationen in den BRCA1/2-Genen untersucht. Die Mutationsanalysen wurden im Zentrum für Experimentelle Onkologie und Hämatologie des Policlinico-Krankenhauses durchgeführt. Gemäß der sizilianischen Leitlinie (http://www.gurs.regione.sicilia.it/Indicep1.htm, Nr. 02-Venerdì 10 Gennaio 2020) wurden im Rodolico de Catania – San Marco insgesamt 389 Patientinnen untersucht. Davon litten 37 an Brustkrebs, 37 an Eierstockkrebs, 16 an Bauchspeicheldrüsenkrebs, 8 an Prostatakrebs und 5 an Melanomen. Die Verteilung der Patientinnen nach Krebsart und die Analyseergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm mit einem Überblick über die Studie. Patienten mit Brust-, Melanom-, Pankreas-, Prostata- oder Eierstocktumoren wurden auf Mutationen in den BRCA1- und BRCA2-Genen getestet.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; VUS, Variante unklarer Signifikanz; WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Wir konzentrierten uns in unseren Studien gezielt auf Brustkrebskohorten. Das mittlere Alter der Patientinnen betrug 49 Jahre (Spanne 23-89 Jahre), und sie waren überwiegend weiblich (n=376 bzw. 97%).
Von diesen Probandinnen wiesen 64 (17 %) BRCA1/2-Mutationen auf. 35 (9 %) hatten eine pathogene Variante (PV) und 29 (7,5 %) eine Variante unklarer Signifikanz (VUS). 17 (48,6 %) der 35 pathogenen Varianten traten in BRCA1 und 18 (51,4 %) in BRCA2 auf, während 5 VUS in BRCA1 (17,2 %) und 24 (82,8 %) in BRCA2 vorkamen (Abbildungen 1 und 2). LGR war in der MLPA-Analyse nicht nachweisbar.
Abbildung 2. Analyse von BRCA1- und BRCA2-Mutationen bei 389 Brustkrebspatientinnen. (A) Verteilung pathogener Varianten (PV) (rot), Varianten unklarer Signifikanz (VUS) (orange) und Wildtyp (WT) (blau) bei 389 Brustkrebspatientinnen; (B) 35 (9 %) der 389 Brustkrebspatientinnen wiesen pathogene BRCA1/2-Varianten (PV) auf. Davon waren 17 (48,6 %) BRCA1-PV-Träger (dunkelrot) und 18 (51,4 %) BRCA2-PV-Träger (hellrot); (C) 29 (7,5 %) der 389 Patientinnen wiesen VUS auf, davon 5 (17,2 %) im BRCA1-Gen (dunkelorange) und 24 (82,8 %) im BRCA2-Gen (hellorange).
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; VUS, Variante unklarer Signifikanz; WT, Wildtyp-BRCA1/2-Sequenz.
Anschließend untersuchten wir die Prävalenz der molekularen Subtypen von Brustkrebs bei Patientinnen mit BRCA1/2-Mutation. Die Verteilung umfasste 2 (5,7 %) luminale A-, 15 (42,9 %) luminale B-, 3 (8,6 %) luminale B-HER2+-, 2 (5,7 %) HER2+- und 13 (37,1 %) TNBC-Patientinnen. Unter den BRCA1-positiven Patientinnen hatten 5 (29,4 %) einen luminalen B-Brustkrebs, 2 (11,8 %) einen HER2+-Tumor und 10 (58,8 %) einen TNBC. Tumoren ohne BRCA1-Mutationen waren entweder luminal A oder luminal B-HER2+ (Abbildung 3). In der BRCA2-positiven Subgruppe waren 10 (55,6 %) Tumoren luminal B, 3 (16,7 %) luminal B-HER2+, 3 (16,7 %) TNBC und 2 (11,1 %) Luminal A (Abbildung 3). In dieser Gruppe traten keine HER2+-Tumoren auf. Demnach sind BRCA1-Mutationen bei TNBC-Patientinnen weit verbreitet, während BRCA2-Veränderungen bei Luminal-B-Patientinnen vorherrschen.
Abbildung 3: Prävalenz von Brustkrebs-Subtypen bei Patientinnen mit pathogenen Varianten in BRCA1 und BRCA2. Histogramme zeigen die Verteilung von BRCA1- (dunkelrot) und BRCA2- (hellrot) pathogenen Varianten auf die molekularen Subtypen von Brustkrebspatientinnen. Die Zahlen in den einzelnen Kästchen geben den prozentualen Anteil der Patientinnen mit BRCA1- bzw. BRCA2-Varianten für den jeweiligen Brustkrebs-Subtyp an.
Abkürzungen: PVs, pathogene Variante; HER2+, humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 positiv; TNBC, dreifach negativer Brustkrebs.
Anschließend untersuchten wir Art und Genlokalisation der BRCA1- und BRCA2-PVs. Bei den BRCA1-PVs beobachteten wir 7 Einzelnukleotidvarianten (SNVs): 6 Deletionen, 3 Duplikationen und 1 Insertion. Nur eine Mutation (c.5522delG) stellt eine Neuentdeckung dar. Die häufigste BRCA1-PV, die bei beiden Probanden nachgewiesen wurde, war c.5035_5039delCTAAT. Diese Veränderung beinhaltet eine Deletion von fünf Nukleotiden (CTAAT) in Exon 15 des BRCA1-Gens, was zum Austausch der Aminosäure Leucin durch Tyrosin an Codon 1679 führt. Aufgrund einer Leserasterverschiebung mit einem vorhergesagten alternativen Stoppcodon kommt es zu einer vorzeitigen Proteinverkürzung. Alle anderen Veränderungen wurden nur in einem Fall nachgewiesen. Bemerkenswerterweise befand sich eine der beschriebenen PVs in der Konsensusregion der Spleißstelle (c.4357+1G>T) (Tabelle 1).
Bezüglich der pathogenen BRCA2-Variante beobachteten wir 6 Deletionen, 6 SNVs und 2 Duplikationen. Keine der gefundenen Veränderungen ist neu. Drei Mutationen traten in unserer Population wiederholt auf: c.428dup und c.8487+1G>A wurden bei 3 Probanden beobachtet, gefolgt von c.5851_5854delAGTT, das in zwei Fällen gefunden wurde. Die Veränderung c.428dup betrifft eine C-Wiederholung in Exon 5 von BRCA2 und kodiert voraussichtlich für ein verkürztes, nicht-funktionales Protein. Die Mutation c.8487+1G>A tritt in der intronischen Region von BRCA2-Intron 19 (± 1,2) auf und beeinflusst die Spleißkonsensussequenz, was zu verändertem Spleißen und somit zu einem abnormalen oder fehlenden Protein führt. Die pathogene Variante c.5851_5854delAGTT beruht auf einer Deletion von 4 Nukleotiden an den Positionen 5851 bis 5854 im kodierenden Exon. 10 des BRCA2-Gens und führt zu einer Leserasterverschiebung mit einem vorhergesagten alternativen Stoppcodon (p.S1951WfsTer). Wie bereits berichtet, wurden beide Veränderungen c.631G>A und c.7008-2A>T bei derselben Patientin nachgewiesen.³⁴ Die erste Mutation beinhaltet den Austausch von Adenosin (A) in Exon 7 des BRCA2-Gens durch ein Guanin (G), was zu einem Austausch von Valin gegen Isoleucin an Codon 211 führt. Isoleucin ist eine Aminosäure mit sehr ähnlichen Eigenschaften. Diese Veränderung beeinträchtigt das normale mRNA-Splicing. Die zweite Variante befindet sich in einer intronischen Region und führt zu einer doppelten A-zu-Thymin (T)-Substitution vor Exon 13 des BRCA2-Gens. Die Veränderung c.7008-2A>T kann mehrere Transkripte unterschiedlicher Länge erzeugen. Darüber hinaus wurden in der Gruppe der BRCA2-PVs 4 von 18 Die Veränderungen (22,2 %) waren intronischer Natur.
Anschließend kartierten wir schädliche BRCA1/2-Mutationen in funktionellen Domänen und Proteinbindungsregionen (Abb. 4). Im BRCA1-Gen befanden sich 50 % der Varianten in der Brustkrebs-Clusterregion (BCCR), während 22 % der Mutationen in der Eierstockkrebs-Clusterregion (OCCR) lokalisiert waren (Abb. 4A). Im BRCA2-Gen lagen 35,7 % der Varianten in der BCCR-Region und 42,8 % der Mutationen in der OCCR-Region (Abb. 4B). Im nächsten Schritt untersuchten wir die Lage der Varianten innerhalb der BRCA1- und BRCA2-Proteindomänen. Im BRCA1-Protein fanden wir drei Varianten in den Loop- und Coiled-Coil-Domänen sowie zwei Mutationen in der BRCT-Domäne (Abb. 4A). Im BRCA2-Protein wurden vier Varianten in der BRC-Repeat-Domäne kartiert, während drei intronische und drei exonische Veränderungen in der Oligo-/Oligosaccharid-Bindungsdomäne nachgewiesen wurden. (OB)- und Turm-(T)-Domänen ( Abbildung 4B ).
Abbildung 4 Schematische Darstellung der BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und der Lokalisation pathogener Varianten. Diese Abbildung zeigt die Verteilung pathogener BRCA1- (A) und BRCA2-Varianten (B) bei Brustkrebspatientinnen. Exonische Mutationen sind blau, intronische Varianten orange dargestellt. Die Balkenhöhe repräsentiert die Anzahl der Fälle. Die BRCA1- und BRCA2-Proteine ​​und ihre funktionellen Domänen sind dargestellt. (A) Das BRCA1-Protein enthält eine Schleifendomäne (RING), eine Kernlokalisierungssequenz (NLS), eine Coiled-Coil-Domäne, eine SQ/TQ-Clusterdomäne (SCD) und eine C-terminale BRCA1-Domäne (BRCT). (B) Das BRCA2-Protein enthält acht BRC-Repeats, eine DNA-Bindungsdomäne mit einer helikalen Domäne (Helical), drei Oligonukleotid-/Oligosaccharid-Bindungsdomänen (OB), eine Turmdomäne (T) und eine NLS auf der C-terminalen Seite. Bereiche werden als Brustkrebs-Clusterregion (BCCR) und Eierstockkrebs-Clusterregion bezeichnet. (OCCR) werden unten angezeigt.*Stellt Mutationen dar, die Stoppcodons bestimmen.
Anschließend untersuchten wir klinisch-pathologische Merkmale von Brustkrebs, die mit dem Vorhandensein von BRCA1/2-Mutationen korrelieren könnten. Vollständige klinische Daten lagen für 181 BRCA1/2-negative Patientinnen (Nicht-Trägerinnen) und alle Trägerinnen (n = 35) vor. Es zeigte sich eine Korrelation zwischen der Proliferationsrate des Tumors und seinem Grad.
Wir berechneten die Verteilung von Ki-67 anhand des Medians unserer Kohorte (25 %, Bereich <10–90 %). Probanden mit einem Ki-67-Wert < 25 % wurden als „niedriger Ki-67-Wert“ definiert, während Personen mit Werten ≥ 25 % als „hoher Ki-67-Wert“ galten. Signifikante Unterschiede im Ki-67-Wert (p < 0,01) wurden zwischen Nicht-Trägern und BRCA1-PV-Trägern festgestellt (Abb. 5A).
Abbildung 5: Korrelation von Ki-67 mit der Gradverteilung bei Brustkrebspatientinnen mit und ohne BRCA1- und BRCA2-Varianten. (A) Boxplot mit den Medianwerten von Ki-67 bei 181 Brustkrebspatientinnen ohne BRCA1-Varianten im Vergleich zu Patientinnen mit BRCA1- (18) oder BRCA2-Varianten (17). p-Werte unter 0,5 wurden als statistisch signifikant betrachtet. (B) Histogramm zur Einteilung der Brustkrebspatientinnen in histologische Gradgruppen (G2 und G3) gemäß dem BRCA1- und BRCA2-Mutationsstatus (Wildtyp, BRCA1- und BRCA2-Variantenträgerinnen).
Ebenso untersuchten wir, ob der Tumorgrad mit dem Vorhandensein von BRCA1/2-PV korrelierte. Da G1-Brustkrebs in unserer Population nicht vorkam, teilten wir die Patientinnen in zwei Gruppen ein (G2 oder G3). Übereinstimmend mit den Ki-67-Ergebnissen zeigte die Analyse eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Tumorgrad und BRCA1-Mutation, wobei bei BRCA1-Trägerinnen ein höherer Anteil an G3-Tumoren vorlag als bei Nicht-Trägerinnen (p<0,005) (Abbildung 5B).
Fortschritte in der DNA-Sequenzierungstechnologie haben beispiellose Fortschritte bei BRCA1/2-Gentests ermöglicht, was für Patientinnen und Patienten mit familiärer Krebsbelastung von entscheidender Bedeutung ist. Bislang wurden etwa 20.000 BRCA1/2-Varianten identifiziert und gemäß den Richtlinien der American Society of Medical Genetics³⁵ und dem ENIGMA-System^35,36 klassifiziert. Es ist bekannt, dass das Mutationsspektrum von BRCA1/2 regional stark variiert.³⁷ Innerhalb Italiens lag die Prävalenz von BRCA1/2-Varianten zwischen 8 % und 37 %, was eine große Variabilität innerhalb des Landes belegt.^38,39 Mit fast 5 Millionen Einwohnern ist Sizilien die fünftgrößte Region Italiens. Obwohl Daten zur Verteilung von BRCA1/2 in Westsizilien vorliegen, gibt es im Osten der Insel keine umfassenden Daten.
Unsere Studie ist einer der ersten Berichte über das Auftreten von BRCA1/2-PV bei Brustkrebspatientinnen im Osten Siziliens.28 Wir konzentrierten uns in unserer Analyse auf Brustkrebs, da dies mit Abstand die häufigste Erkrankung in unserer Kohorte ist.
Bei der Untersuchung von 389 Brustkrebspatientinnen wiesen 9 % BRCA1/2-Varianten auf, die gleichmäßig auf BRCA1 und BRCA2 verteilt waren. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten aus der italienischen Bevölkerung überein.²⁸ Interessanterweise waren 3 % (13/389) unserer Kohorte männlich. Diese Rate ist höher als für männlichen Brustkrebs erwartet (1 % aller Brustkrebsfälle)⁴⁰, was unsere Auswahl der Populationen anhand des BRCA1/2-Mutationsrisikos widerspiegelt. Keiner dieser Männer entwickelte jedoch eine BRCA1/2-Variante, sodass sie für weitere molekulare Analysen in Frage kamen, um das Vorliegen seltener Mutationen wie z. B. PALB2, RAD51C und D auszuschließen. Varianten unklarer Signifikanz (VUS) wurden bei 7 % der Probandinnen gefunden, bei denen BRCA2-VUS nachweisbar waren. Auch dieses Ergebnis steht im Einklang mit bestehenden Erkenntnissen.^28,41,42
Bei der Analyse der Verteilung molekularer Subtypen von Brustkrebs bei Frauen mit BRCA1/2-Mutationen bestätigten wir bekannte Zusammenhänge zwischen TNBC und BRCA1-PV (58,8 %) sowie zwischen luminalem B-Brustkrebs und BRCA2-PV (55,6 %).^16,43 Die luminalen A- und HER2+-Tumoren bei BRCA1- und BRCA2-PV-Trägerinnen stimmen mit den Daten aus der bestehenden Literatur überein.^16,43
Anschließend konzentrieren wir uns auf Art und Lage der BRCA1/2-Mutation. In unserer Kohorte war die häufigste BRCA1-Mutation c.5035_5039delCTAAT. Obwohl Incorvaia et al. Obwohl diese Variante in ihrer sizilianischen Kohorte nicht beschrieben wurde, haben andere Autoren sie als Keimbahn-BRCA1-PV beschrieben.³⁴ In unserer Kohorte wurden mehrere BRCA1-PVs gefunden – z. B. c.181T>G, c.514del, c.3253dupA und c.5266dupC –, die auch in Sizilien beobachtet wurden.²⁸ Zwei dieser BRCA1-Gründermutationen (c.181T>G und c.5266dupC) kommen häufig bei aschkenasischen Juden in Ost- und Mitteleuropa (Polen, Tschechien), Slowenien, Österreich, Ungarn, Belarus und Deutschland vor.^44,45 In den Vereinigten Staaten und Argentinien wurde sie kürzlich als „rezidivierende Keimbahnvariante“ bei italienischen Patientinnen mit Brust- und Eierstockkrebs definiert. Die Variante c.514del wurde zuvor bei acht Brustkrebspatientinnen aus Palermo und Messina im Norden Siziliens identifiziert. Interessanterweise berichteten sogar Incorvaia et al. Die Variante c.3253dupA wurde in einigen Familien in Catania gefunden.²⁸ Die häufigsten BRCA2-Varianten sind c.428dup, c.5851_5854delAGTT und die intronische Variante c.8487+1G>A, die bei einem Patienten in Palermo detaillierter beschrieben wurden.²⁸ Die Variante c.428dup wurde in Haushalten im Nordwesten Siziliens, hauptsächlich in den Regionen Trapani und Palermo, beobachtet. Die Variante c.5851_5854delAGTT trat häufiger bei Personen aus Messina, Palermo und Caltanissetta auf.²⁸ Rebbeck et al. Die Veränderung c.5851_5854delAGTT wurde bereits in Kolumbien beschrieben.³⁷ Eine weitere BRCA2-Variante, c.631+1G>A, wurde bei Patientinnen mit Brust- und Eierstockkrebs aus Sizilien (Agrigent, Syrakus und Ragusa) gefunden.²⁸ Bemerkenswerterweise beobachteten wir das gleichzeitige Auftreten zweier BRCA2-Varianten (BRCA2 c.631G>A und c.7008-2A>T) bei derselben Patientin, die wir, wie bereits beschrieben, als cis-segregierend ansehen.^34,46 Diese BRCA2-Mutationen treten in Italien häufig auf und führen zu vorzeitigen Stoppcodons, was das Spleißen der mRNA beeinträchtigt und zum Ausfall des BRCA2-Proteins führt.^47,48
Wir kartierten außerdem BRCA1- und BRCA2-PVs in mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen von Proteindomänen und Genen. Diese Regionen wurden von Rebbeck et al. als Risikobereiche für die Entwicklung von Eierstock- bzw. Brustkrebs beschrieben.⁴⁹ Die Evidenz bezüglich des Zusammenhangs zwischen der Lage von Keimbahnvarianten und dem Risiko für Brust- oder Eierstockkrebs ist jedoch weiterhin umstritten.^28,50–52 In unserer Population befanden sich BRCA1-PVs überwiegend in der BCCR-Region, während BRCA2-PVs überwiegend in der OCCR-Region lokalisiert waren. Wir konnten jedoch keinen Zusammenhang zwischen mutmaßlichen OCCR- und BCCR-Regionen und Brustkrebsmerkmalen feststellen. Dies könnte auf die geringe Anzahl von Patientinnen mit BRCA1/2-Mutationen zurückzuführen sein. Aus Sicht der Proteindomänen sind BRCA1-PVs über das gesamte Protein verteilt, während BRCA2-Veränderungen bevorzugt in der BRC-Repeat-Domäne auftreten.
Schließlich korrelierten wir die klinisch-pathologischen Merkmale des Mammakarzinoms mit der BRCA1/2-Proliferationsrate. Aufgrund der geringen Patientenzahl fanden wir lediglich eine signifikante Korrelation zwischen Ki-67 und dem Tumorgrad. Obwohl die Beurteilung und Interpretation von Ki-67 weiterhin kontrovers diskutiert wird, ist sicher, dass hohe Proliferationsraten mit einem erhöhten Risiko für ein Krankheitsrezidiv und einer verringerten Überlebensrate einhergehen. Derzeit liegt der Grenzwert zur Unterscheidung zwischen „hohem“ und „niedrigem“ Ki-67 bei 20 %. Dieser Schwellenwert ist jedoch für unsere Patientenpopulation mit BRCA1/2-Mutation nicht anwendbar, da der mediane Ki-67-Wert bei 25 % liegt. Dieser Trend zu hohen Ki-67-Werten lässt sich durch die Prävalenz in unseren Kohorten mit luminalem B- und TNBC erklären, in denen nur wenige luminale A-Tumoren vorhanden waren. Einige Hinweise deuten jedoch darauf hin, dass ein höherer Ki-67-Grenzwert (25–30 %) eine bessere Stratifizierung der Patienten hinsichtlich ihrer Prognose ermöglichen könnte.^53,54 Aus den Ergebnissen unserer Analyse geht nicht hervor, dass eine signifikante Korrelation besteht. Überraschenderweise tritt dies bei hohen Ki-67-Werten und Graden sowie dem Vorhandensein einer BRCA1-Mutation auf. Tatsächlich sind BRCA1-assoziierte Tumoren typisch für TNBC und weisen aggressivere Merkmale auf.^16,17
Zusammenfassend liefert diese Studie einen Bericht zum Mutationsstatus von BRCA1/2 in einer Brustkrebskohorte aus Ostsizilien. Insgesamt stimmen unsere Ergebnisse mit bisherigen Erkenntnissen überein, sowohl hinsichtlich der Mutationshäufigkeit als auch der klinisch-pathologischen Merkmale bei Brustkrebs. Weitere Studien an größeren Populationen von BRCA1/2-mutierten Brustkrebspatientinnen, beispielsweise mittels erweiterter multigenomischer Mutationsanalyse, sind erforderlich, um das Vorhandensein von Varianten zu untersuchen, die sich von BRCA1/2 unterscheiden und seltener auftreten. Dies ermöglicht die Identifizierung und angemessene Behandlung der wachsenden Zahl von Personen mit erhöhtem Krebsrisiko aufgrund genetischer Mutationen.
Wir haben bestätigt, dass die Patientinnen und Patienten eine Einverständniserklärung zur anonymen Freigabe ihrer Tumorgewebeproben für Forschungszwecke unterzeichnet haben. Alle Patientinnen und Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung gemäß der Deklaration von Helsinki. Gemäß den Richtlinien des Universitätsklinikums „G. Rodolico – S. Marco“ war diese Studie von der Ethikprüfung befreit, da die BRCA1/2-Analyse gemäß klinischer Praxis durchgeführt wurde und alle Patientinnen und Patienten ihre schriftliche Einwilligung gaben. Die Patientinnen und Patienten willigten außerdem in die Verwendung ihrer Daten für Forschungszwecke ein.
Wir danken Prof. Paolo Vigneri für seine Unterstützung bei der Betreuung von Brustkrebspatientinnen, wie vom Ethikkomitee gewünscht.
Federica Martorana gibt an, Honorare vom Istituto Gentili, Eli Lilly, Novartis und Pfizer erhalten zu haben. Die anderen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit bestehen.
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Globale Krebsstatistik 2020: GLOBOCAN schätzt die Inzidenz und Mortalität von 36 Krebsarten in 185 Ländern weltweit. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi: 10.3322/caac.21660