Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz.Kullanmakta olduğunuz tarayıcı sürümü sınırlı CSS desteğine sahiptir.En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz.Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan yapacağız.
AFEX ile ön işleme tabi tutulmuş mısır koçanındaki kalıcı oligosakkaritlerin karmaşık analizi için yeni immünolojik ve kütle spektrometrik yöntemler.Lignoselülozik biyokütle, fosil yakıtlara sürdürülebilir bir alternatiftir ve gıda, yem, yakıt ve kimyasallar gibi ürünlerin üretimi için biyoteknolojilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.Bu teknolojilerin anahtarı, bitki hücre duvarlarında bulunan karmaşık karbonhidratları glikoz, ksiloz ve arabinoz gibi basit şekerlere dönüştürmek için maliyet açısından rekabetçi süreçlerin geliştirilmesidir.Lignoselülozik biyokütle çok inatçı olduğundan, istenen ürünü elde etmek için termokimyasal işlemlere (örneğin, amonyak lifi eksfoliyasyonu (AFEX), seyreltik asitler (DA), iyonik sıvılar (IL)) ve biyolojik işlemlere (örneğin, enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon) birlikte tabi tutulmalıdır..Ancak hidroliz işleminde ticari mantar enzimleri kullanıldığında oluşan çözünür şekerlerin sadece %75-85'i monosakkaritler, geri kalan %15-25'i ise mikroorganizmalar için her zaman mevcut olmayan çözünür, inatçı oligosakkaritlerdir.Daha önce, karbon ve iki atomlu toprak ayırma ve boyut dışlama kromatografisinin bir kombinasyonunu kullanarak çözünür inatçı oligosakaritleri başarılı bir şekilde izole edip saflaştırdık ve ayrıca bunların enzim inhibe edici özelliklerini araştırdık.Daha yüksek derecede polimerizasyon (DP) metillenmiş üronik asit ikameleri içeren oligosakkaritlerin, düşük DP ve nötr oligosakkaritlere göre ticari enzim karışımlarıyla işlenmesinin daha zor olduğunu bulduk.Burada, bitki hücre duvarlarındaki ve enzimatik hidrolizatlardaki glikan bağlarını karakterize etmek için bitki biyokütle glikanlarına özgü monoklonal antikorlar (mAb'ler) kullanan glikan profillemesi, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, uçuş süresi kütle spektrometresi dahil olmak üzere birkaç ek yöntemin kullanıldığını bildiriyoruz..MALDI-TOF-MS), negatif iyonların ikincil bozunumundan sonra spektroskopi, gaz kromatografisi ve kütle spektrometrisi (GC-MS) ile türevlendirmeli ve türevlendirmesiz oligosakarit bağlarını karakterize etmek için elde edilen yapı-bilgilendirici teşhis piklerini kullanır.Oligosakkaritlerin küçük boyutları nedeniyle (DP 4-20), bu moleküllerin mAb bağlanması ve karakterizasyonu için kullanılması zordur.Bu sorunun üstesinden gelmek için, mikroplaka yüzeyinde düşük DP çözünür oligosakkaritlerin çoğunu başarıyla etiketleyen ve daha sonra spesifik ligasyon analizi için yüksek verimli bir mAb sisteminde kullanılan yeni bir biyotin konjugasyonuna dayalı oligosakarit immobilizasyon yöntemi uyguladık.Bu yeni yöntem, gelecekte teşhis amacıyla biyobelirteçlerde bulunan oligosakkaritleri izole etmek ve karakterize etmek için kullanılabilecek daha gelişmiş yüksek verimli glikol deneylerinin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
Tarım, ormancılık, çimen ve odunsu malzemelerden oluşan lignoselülozik biyokütle, daha yüksek değerli ürünler üretmek için gıda, yem, yakıt ve kimyasal öncüler dahil olmak üzere biyo-bazlı ürünlerin üretimi için potansiyel bir hammaddedir1.Bitki hücre duvarlarında bulunan karbonhidratlar (selüloz ve hemiselüloz gibi), kimyasal işleme ve biyotransformasyon (enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon gibi) ile monosakkaritlere depolimerize edilir.Yaygın ön işlemler arasında, bitki hücre duvarlarını açarak lignoselüloz üretimini azaltmak için kimyasallar ve ısının bir kombinasyonunu kullanan amonyak lifi genleşmesi (AFEX), seyreltik asit (DA), iyonik sıvı (IL) ve buhar patlaması (SE) yer alır3,4.maddenin inatçılığı, 5. Enzimatik hidroliz, biyo-bazlı yakıtlar ve kimyasallar üretmek için ticari aktif karbonhidrat içeren enzimler (CAZymes) ve transgenik mayalar veya bakteriler kullanılarak mikrobiyal fermantasyon kullanılarak yüksek katı yükünde gerçekleştirilir 6 .
Ticari enzimlerdeki CAZimler, monosakkaritler2,7 oluşturmak için karmaşık karbonhidrat-şeker bağlarını sinerjistik olarak parçalayan karmaşık bir enzim karışımından oluşur.Daha önce bildirdiğimiz gibi, ligninin karbonhidratlı aromatik polimerlerinin karmaşık ağı, onları son derece inatçı hale getirir, bu da eksik şeker dönüşümüne yol açar ve ön işleme tabi tutulmuş biyokütlenin enzimatik hidrolizi sırasında üretilmeyen cinsiyet oligosakkaritlerinin %15-25'ini biriktirir.Bu, çeşitli biyokütle ön arıtma yöntemlerinde yaygın bir sorundur.Bu darboğazın bazı nedenleri, hidroliz sırasında enzim inhibisyonunu veya bitki biyokütlesindeki şeker bağlarını kırmak için gerekli olan temel esansiyel enzimlerin yokluğunu veya düşük seviyelerini içerir.Oligosakkaritlerdeki şeker bağları gibi şekerlerin bileşimini ve yapısal özelliklerini anlamak, hidroliz sırasında şeker dönüşümünü iyileştirmemize yardımcı olacak ve petrol türevi ürünlerle biyoteknolojik süreçleri maliyet açısından rekabetçi hale getirecektir.
Karbonhidratların yapısını belirlemek zordur ve sıvı kromatografisi (LC)11,12, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)13, kapiler elektroforez (CE)14,15,16 ve kütle spektrometrisi (MS)17 gibi yöntemlerin bir kombinasyonunu gerektirir.18.Bir matris (MALDI-TOF-MS) kullanan lazer desorpsiyonlu ve iyonizasyonlu uçuş süresi kütle spektrometresi gibi MS yöntemleri, karbonhidrat yapılarını tanımlamak için çok yönlü bir yöntemdir.Son zamanlarda, sodyum iyon eklentilerinin Çarpışmaya Bağlı Ayrışma (CID) tandem MS'si, oligosakarit bağlanma pozisyonlarına, anomerik konfigürasyonlara, sekanslara ve dallanma pozisyonlarına 20, 21 karşılık gelen parmak izlerini tanımlamak için en yaygın şekilde kullanılmıştır.
Glikan analizi, karbonhidrat bağlarının derinlemesine tanımlanması için mükemmel bir araçtır22.Bu yöntem, karmaşık karbonhidrat bağlantılarını anlamak için sondalar olarak bitki hücre duvarı glikanına yönelik monoklonal antikorları (mAb'ler) kullanır.Çeşitli sakkaritler24kullanılarak çeşitli lineer ve dallı oligosakkaritlere karşı tasarlanmış dünya çapında 250'den fazla mAb mevcuttur.Bitki hücre tipi, organ, yaş, gelişim aşaması ve büyüme ortamı25,26bağlı olarak önemli farklılıklar olduğundan, birkaç mAb bitki hücre duvarının yapısını, bileşimini ve modifikasyonlarını karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmıştır.Daha yakın zamanlarda, bu yöntem, bitki ve hayvan sistemlerindeki vezikül popülasyonlarını ve bunların hücre altı belirteçler, gelişim aşamaları veya çevresel uyaranlar tarafından belirlenen glikan taşınmasındaki ilgili rollerini anlamak ve enzimatik aktiviteyi belirlemek için kullanılmıştır.Tanımlanan farklı glikan ve ksilan yapılarından bazıları arasında pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), karışık bağlı glukanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronik asit-arabinoksilan (GArbX) ve arabino-galaktan (ArbG)29 yer alır.
Bununla birlikte, tüm bu araştırma çabalarına rağmen, yalnızca birkaç çalışma, oligosakarit salınımı, hidroliz sırasında oligomerik zincir uzunluğu değişiklikleri, çeşitli düşük DP polimerleri ve bunların eğrileri dahil olmak üzere yüksek katı yüklü (HSL) hidroliz sırasında oligosakarit birikiminin doğasına odaklanmıştır.dağılımlar 30,31,32.Bu arada, glikan analizinin, glikan yapısının kapsamlı bir analizi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmış olsa da, suda çözünür düşük DP'li oligosakkaritleri antikor yöntemleri kullanarak değerlendirmek zordur.Moleküler ağırlığı 5-10 kDa'dan az olan daha küçük DP oligosakkaritler, ELISA plakaları 33, 34'e bağlanmaz ve antikor eklenmeden önce yıkanır.
Burada ilk kez, monoklonal antikorlar kullanılarak avidin kaplı plakalar üzerinde çözülebilir refrakter oligosakkaritler için tek adımlı bir biyotinilasyon prosedürünü glikom analizi ile birleştiren bir ELISA testi gösteriyoruz.Glikoz analizine yaklaşımımız, hidrolize şeker bileşimlerinin trimetilsilil (TMS) türevi kullanılarak tamamlayıcı oligosakarit bağlantılarının MALDI-TOF-MS ve GC-MS bazlı analizi ile doğrulanmıştır.Bu yenilikçi yaklaşım, gelecekte yüksek verimli bir yöntem olarak geliştirilebilir ve biyomedikal araştırmalarda daha geniş uygulama alanı bulabilir35.
Enzimlerin ve antikorların glikosilasyon36 gibi translasyon sonrası modifikasyonları biyolojik aktivitelerini etkiler.Örneğin, serum proteinlerinin glikozilasyonundaki değişiklikler, enflamatuar artritte önemli bir rol oynar ve glikosilasyondaki değişiklikler, tanısal belirteçler olarak kullanılır37.Literatürde çeşitli glikanların, gastrointestinal sistem ve karaciğerin kronik enflamatuar hastalıkları, viral enfeksiyonlar, yumurtalık, meme ve prostat kanserleri38,39,40 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda kolayca ortaya çıktığı bildirilmiştir.Antikor bazlı glikan ELISA yöntemleri kullanılarak glikanların yapısının anlaşılması, karmaşık MS yöntemleri kullanılmadan hastalık teşhisinde ek güven sağlayacaktır.
Önceki çalışmamız, inatçı oligosakkaritlerin ön işlemden ve enzimatik hidrolizden sonra hidrolize olmadığını gösterdi (Şekil 1).Daha önce yayınlanan çalışmalarımızda, AFEX ile önceden işlenmiş mısır koçanı hidrolizatından (ACSH)8 oligosakkaritleri izole etmek için aktif kömür katı fazlı ekstraksiyon yöntemi geliştirdik.İlk ekstraksiyon ve ayırma işleminden sonra, oligosakkaritler, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrıca fraksiyonlara ayrıldı ve moleküler ağırlık sırasına göre toplandı.Çeşitli ön işlemlerden salınan şeker monomerleri ve oligomerleri, şeker bileşimi analizi ile analiz edildi.Çeşitli ön arıtma yöntemleriyle elde edilen şeker oligomerlerinin içerikleri karşılaştırıldığında, inatçı oligosakkaritlerin varlığı, biyokütlenin monosakkaritlere dönüştürülmesinde yaygın bir sorundur ve şeker veriminde en az %10-15 ve hatta %18'e varan bir azalmaya yol açabilir.BİZ.Bu yöntem, oligosakarit fraksiyonlarının daha büyük ölçekli üretimi için kullanılır.Elde edilen ACH ve farklı moleküler ağırlıklara sahip müteakip fraksiyonları, bu çalışmada oligosakkaritlerin karakterizasyonu için deneysel materyal olarak kullanıldı.
Ön muamele ve enzimatik hidrolizden sonra, kalıcı oligosakkaritler hidrolize edilmemiş olarak kaldı.Burada (A), bir paketlenmiş aktif karbon ve iki atomlu toprak yatağı kullanılarak AFEX ile önceden işlenmiş mısır koçanı hidrolizatından (ACSH) oligosakkaritlerin izole edildiği bir oligosakarit ayırma yöntemidir;(B) Oligosakkaritlerin ayrılması için yöntem.Oligosakaritler ayrıca boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrıldı;(C) Çeşitli ön işlemlerden salınan sakarit monomerleri ve oligomerleri (seyreltilmiş asit: DA, iyonik sıvı: IL ve AFEX).Enzimatik hidroliz koşulları: %25'lik yüksek katı yükleme (a/a) (yaklaşık %8 glukan yüklemesi), 96 saat hidroliz, 20 mg/g ticari enzim yükleme (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 oranı) ve ( D) AFEX ön işleme tabi tutulmuş mısır koçanından (ACS) salınan glikoz, ksiloz ve arabinozun şeker monomerleri ve oligomerleri.
Glikan analizinin, katı biyokütle kalıntılarından izole edilen ekstraktlardaki glikanların kapsamlı bir yapısal analizi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır.Bununla birlikte, suda çözünür sakkaritler, bu geleneksel yöntem41 kullanılarak yetersiz temsil edilir çünkü düşük moleküler ağırlıklı oligosakkaritlerin ELISA plakaları üzerinde immobilize edilmesi zordur ve antikor eklenmeden önce yıkanır.Bu nedenle, antikor bağlanması ve karakterizasyonu için, avidin kaplı ELISA plakaları üzerinde çözünür, uyumlu olmayan oligosakkaritleri kaplamak için tek adımlı bir biyotinilasyon yöntemi kullanıldı.Bu yöntem, daha önce ürettiğimiz ACSH ve moleküler ağırlığına (veya polimerizasyon derecesine, DP) dayalı bir fraksiyon kullanılarak test edildi.Karbohidratın indirgeyici ucuna biyotin-LC-hidrazit eklenerek oligosakarit bağlanma afinitesini artırmak için tek adımlı biyotinilasyon kullanıldı (Şekil 2).Çözeltide indirgeyici uçtaki hemiasetal grup, bir hidrazon bağı oluşturmak üzere biyotin-LC-hidrazidin hidrazit grubu ile reaksiyona girer.İndirgeyici ajan NaCNBH3'ün varlığında, hidrazon bağı kararlı bir biyotinlenmiş son ürüne indirgenir.Şeker indirgeme ucunun modifikasyonu ile düşük DP'li oligosakkaritlerin ELISA plakalarına bağlanması mümkün hale geldi ve çalışmamızda bu, glikan hedefli mAb'ler kullanılarak avidin kaplı plakalar üzerinde yapıldı.
Biyotinlenmiş oligosakkaritler için ELISA'ya dayalı monoklonal antikorların taranması.Burada (A) oligosakkaritlerin kombine biyotinilasyonu ve ardından NeutrAvidin kaplı plakalar üzerinde glikan hedefli mAb'ler ile ELISA taraması ve (B) reaksiyon ürünlerinin biyotinilasyonu için tek adımlı bir prosedürü gösterir.
Oligosakarit konjuge antikorlara sahip avidin kaplı plakalar daha sonra birincil ve ikincil antikorlara eklendi ve ışığa ve zamana duyarlı bir ortamda yıkandı.Antikor bağlanması tamamlandıktan sonra, plakayı inkübe etmek için TMB substratı ekleyin.Reaksiyon son olarak sülfürik asit ile durduruldu.İnkübe edilen plakalar, antikora özgü çapraz bağlanmayı saptamak için her bir antikorun bağlanma gücünü belirlemek üzere bir ELISA okuyucusu kullanılarak analiz edildi.Deneyin ayrıntıları ve parametreleri için ilgili "Malzemeler ve Yöntemler" bölümüne bakın.
ACSH'de bulunan çözünür oligosakkaritlerin yanı sıra lignoselülozik hidrolizatlardan izole edilen ham ve saflaştırılmış oligosakkarit fraksiyonlarını karakterize ederek bu yeni geliştirilen yöntemin spesifik uygulamalar için faydasını gösteriyoruz.Şekil 3'te gösterildiği gibi, ACSH'de biyoasillenmiş glikom tahlil yöntemleri kullanılarak tanımlanan en yaygın epitop ikameli ksilanlar genellikle üronik (U) veya metiluronik (MeU) ve pektik arabinogalaktanlardır.Bunların çoğu, hidrolize olmayan katıların (UHS)43 glikanlarının analizine ilişkin önceki çalışmamızda da bulundu.
Hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş bir monoklonal antikor kullanılarak inatçı oligosakarit epitoplarının saptanması."Nötr" fraksiyon ACN fraksiyonudur ve "asidik" fraksiyon FA fraksiyonudur.Isı haritasındaki daha parlak kırmızılar, daha yüksek epitop içeriğini gösterir ve daha parlak maviler, boş bir arka planı gösterir.Ölçekteki renk değerleri, N=2 formülasyonları için ham OD değerlerine dayanmaktadır.Antikorlar tarafından tanınan ana epitoplar sağda gösterilmiştir.
Bu selüloz olmayan yapılar, en yaygın kullanılan ticari enzimleri içeren, test edilen ticari enzim karışımındaki en yaygın selülazlar ve hemiselülazlar tarafından parçalanamadı.Bu nedenle, hidrolizleri için yeni yardımcı enzimlere ihtiyaç vardır.Gerekli selüloz olmayan yardımcı enzimler olmadan, bu selüloz olmayan bağlar, ana şeker polimerleri yoğun bir şekilde daha kısa parçalara hidrolize edilse ve ticari enzim karışımları kullanılarak çözülse bile, monosakkaritlere tam dönüşümü önler.
Sinyal dağılımı ve bağlanma kuvveti ile ilgili daha fazla çalışma, bağlanma epitoplarının, yüksek DP şeker fraksiyonlarında (20+'ye kadar A, B, C, DP), dimerlerde düşük DP fraksiyonlarına (D, E, F, DP) göre daha düşük olduğunu göstermiştir) (Şekil 1).Asit fragmanları, selüloz olmayan epitoplarda nötr fragmanlardan daha yaygındır.Bu fenomen, yüksek DP ve asit kısımlarının enzimatik hidrolize daha dirençli olduğu önceki çalışmamızda gözlemlenen modelle tutarlıdır.Bu nedenle, selüloz olmayan glikan epitoplarının ve U ve MeU ikamelerinin varlığı, oligosakaritlerin stabilitesine büyük ölçüde katkıda bulunabilir.Özellikle epitop bir dimerik veya trimerik oligosakarit ise, düşük DP'li oligosakkaritler için bağlanma ve saptama etkinliğinin sorunlu olabileceğine dikkat edilmelidir.Bu, her biri belirli bir mAb'ye bağlanan yalnızca bir epitop içeren, farklı uzunluklardaki ticari oligosakkaritler kullanılarak test edilebilir.
Bu nedenle, yapıya özgü antikorların kullanımı, belirli inatçı bağ türlerini ortaya çıkardı.Kullanılan antikor tipine, uygun ligasyon modeline ve ürettiği sinyalin gücüne (en çok ve en az bol) bağlı olarak, yeni enzimler tanımlanabilir ve daha eksiksiz glikokonversiyon için enzim karışımına yarı kantitatif olarak eklenebilir.ACSH oligosakkaritlerinin analizini örnek alarak, her bir biyokütle materyali için bir glikan bağı veri tabanı oluşturabiliriz.Burada, antikorların farklı afinitelerinin dikkate alınması gerektiğine dikkat edilmelidir ve eğer afiniteleri bilinmiyorsa, bu, farklı antikorların sinyallerini karşılaştırırken bazı zorluklar yaratacaktır.Ek olarak, glikan bağlarının karşılaştırılması, aynı antikor için numuneler arasında en iyi sonucu verebilir.Bu inatçı bağlar daha sonra, enzimleri tanımlayabildiğimiz, aday enzimleri seçebileceğimiz ve bağ kıran enzimleri test edebileceğimiz veya bu enzimleri biyorafinerilerde kullanmak üzere ifade etmek için mikrobiyal sistemler geliştirebileceğimiz CAZyme veri tabanına bağlanabilir44.
İmmünolojik yöntemlerin, lignoselülozik hidrolizatlarda bulunan düşük moleküler ağırlıklı oligosakkaritleri karakterize etmeye yönelik alternatif yöntemleri nasıl tamamladığını değerlendirmek için, MALDI (Şekil 4, S1-S8) ve aynı panelde (Şekil 5) oligosakarit kısmında GC-MS'ye dayalı TMS-türevli sakkaritlerin analizini gerçekleştirdik.MALDI, oligosakkarit moleküllerinin kütle dağılımının amaçlanan yapıya uyup uymadığını karşılaştırmak için kullanılır.Şek.Şekil 4 nötr bileşenler ACN-A ve ACN-B'nin MC'sini gösterir.ACN-A analizi, ağırlıkları MeU-ksilan oligosakkaritlere karşılık gelen DP 4-8'den (Şekil 4) DP 22'ye (Şekil S1) kadar değişen bir dizi pentoz şekerini doğruladı.ACN-B analizi, DP 8-15 ile pentoz ve glukoksilan serilerini doğruladı.Şekil S3 gibi tamamlayıcı materyallerde, FA-C asidik kısım kütle dağılım haritaları, ELISA tabanlı mAb taramasında bulunan ikame edilmiş ksilanlarla tutarlı olan, DP'si 8-15 olan bir dizi (Me)U ikame edilmiş pentoz şekerini gösterir.Epitoplar tutarlıdır.
ACS'de bulunan çözünür uyumlu olmayan oligosakkaritlerin MALDI-MS spektrumu.Burada, (A) metillenmiş üronik asit (DP 4-8) ikame edilmiş glukuroksilan oligosakkaritleri ve (B) ACN-B ksilan ve glukuroksilan (DP 8-15) ile ikame edilmiş metillenmiş üronik asit oligosakkaritleri içeren ACN-A düşük ağırlık aralığı fraksiyonları.
Dirençli oligosakkaritlerin glikan kalıntısının bileşiminin analizi.Burada (A) GC-MS analizi kullanılarak elde edilen çeşitli oligosakkarit fraksiyonlarının TMS sakarit bileşimi.(B) Oligosakkaritlerde bulunan çeşitli TMS türevli şekerlerin yapıları.ACN – nötr oligosakkaritler içeren asetonitril fraksiyonu ve FA – asit oligosakkaritler içeren ferulik asit fraksiyonu.
Şekil S9'da gösterildiği gibi, oligosakarit fraksiyonunun LC-MS analizinden bir başka ilginç sonuç çıkarıldı (yöntemler elektronik ek materyalde görülebilir).ACN-B fraksiyonunun ligasyonu sırasında heksoz ve -OAc gruplarının fragmanları tekrar tekrar gözlendi.Bu bulgu sadece glikom ve MALDI-TOF analizinde gözlemlenen parçalanmayı doğrulamakla kalmaz, aynı zamanda önceden işlenmiş lignoselülozik biyokütledeki potansiyel karbonhidrat türevleri hakkında yeni bilgiler sağlar.
Ayrıca TMS şeker türevi kullanarak oligosakarit fraksiyonunun şeker bileşimini de analiz ettik.GC-MS kullanarak, oligosakarit fraksiyonundaki nöral (türev olmayan) ve asidik şekerlerin (GluA ve GalA) bileşimini belirledik (Şekil 5).Glukuronik asit asidik bileşenler C ve D'de bulunurken galakturonik asit, her ikisi de asidik şekerlerin yüksek DP bileşenleri olan asidik bileşenler A ve B'de bulunur.Bu sonuçlar sadece ELISA ve MALDI verilerimizi doğrulamakla kalmaz, aynı zamanda önceki oligosakarit birikimi çalışmalarımızla da tutarlıdır.Bu nedenle, oligosakkaritlerin biyotinilasyonunu ve sonraki ELISA taramasını kullanan modern immünolojik yöntemlerin, çeşitli biyolojik numunelerde çözünür dirençli oligosakkaritleri saptamak için yeterli olduğuna inanıyoruz.
ELISA tabanlı mAb tarama yöntemleri birkaç farklı yöntemle doğrulandığından, bu yeni kantitatif yöntemin potansiyelini daha fazla araştırmak istedik.İki ticari oligosakkarit, ksiloheksasakkarit oligosakarit (XHE) ve 23-aL-arabinofuranosil-ksilotrioz (A2XX) satın alındı ​​ve hücre duvarı glikanını hedefleyen yeni bir mAb yaklaşımı kullanılarak test edildi.Şekil 6, olası bir Langmuir adsorpsiyon modelini düşündüren, biyotinile edilmiş bağlanma sinyali ile oligosakarit konsantrasyonunun log konsantrasyonu arasındaki doğrusal bir korelasyonu göstermektedir.mAb'ler arasında CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ve CCRC-M151, XHE ile ilişkilidir ve CCRC-M108, CCRC-M109 ve LM11, 1 nm ila 100 nano aralığında A2XX ile ilişkilidir.Deney sırasında antikorların sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, her bir oligosakarit konsantrasyonuyla sınırlı deneyler yapıldı.Burada, bazı antikorların, muhtemelen biraz farklı epitoplara bağlandıkları ve çok farklı bağlanma afinitelerine sahip olabildikleri için, bir substrat olarak aynı oligosakarite çok farklı tepki verdiğine dikkat edilmelidir.Doğru epitop tanımlamasının mekanizmaları ve etkileri, yeni mAb yaklaşımı gerçek örneklere uygulandığında çok daha karmaşık olacaktır.
Çeşitli glikan hedefli mAb'lerin tespit aralığını belirlemek için iki ticari oligosakkarit kullanıldı.Burada, oligosakarit konsantrasyonunun log konsantrasyonu ile lineer korelasyonlar, mAb ile (A) XHE ve mAb ile (B) A2XX için Langmuir adsorpsiyon modellerini gösterir.Karşılık gelen epitoplar, analizde substrat olarak kullanılan ticari oligosakaritlerin yapılarını gösterir.
Glikan hedefli monoklonal antikorların kullanımı (glikokomik analiz veya ELISA tabanlı mAb taraması), bitki biyokütlesini oluşturan ana hücre duvarı glikanlarının çoğunun derinlemesine karakterizasyonu için güçlü bir araçtır.Bununla birlikte, klasik glikan analizi yalnızca daha büyük hücre duvarı glikanlarını karakterize eder, çünkü çoğu oligosakarit ELISA plakaları üzerinde verimli bir şekilde immobilize edilmez.Bu çalışmada, AFEX ile önceden işlenmiş mısır koçanı, yüksek katı içeriğiyle enzimatik olarak hidrolize edildi.Hidrolizattaki dirençli hücre duvarı karbonhidratlarının bileşimini belirlemek için şeker analizi kullanıldı.Bununla birlikte, hidrolizatlardaki daha küçük oligosakkaritlerin mAb analizi hafife alınır ve oligosakkaritleri ELISA plakaları üzerinde etkili bir şekilde hareketsiz hale getirmek için ek araçlara ihtiyaç vardır.
Burada, NeutrAvidin™ kaplı plakalar üzerinde oligosakarit biyotinilasyonunu ve ardından ELISA taramasını birleştirerek mAb taraması için yeni ve etkili bir oligosakarit immobilizasyon yöntemini rapor ediyoruz.İmmobilize edilmiş biyotinlenmiş oligosakkaritler, inatçı oligosakkaritlerin hızlı ve verimli bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için antikor için yeterli afinite gösterdi.Kütle spektrometresine dayanan bu inatçı oligosakkaritlerin bileşiminin analizi, immün taramaya yönelik bu yeni yaklaşımın sonuçlarını doğruladı.Dolayısıyla bu çalışmalar, glikan hedefli monoklonal antikorlarla oligosakarit biyotinilasyon ve ELISA taramasının kombinasyonunun, oligosakkaritlerdeki çapraz bağları tespit etmek için kullanılabileceğini ve oligosakkaritlerin yapısını karakterize eden diğer biyokimyasal çalışmalarda yaygın olarak uygulanabileceğini göstermektedir.
Bu biyotin bazlı glikan profilleme yöntemi, bitki biyokütlesindeki çözünür oligosakkaritlerin dirençli karbonhidrat bağlarını araştırabilen ilk rapordur.Bu, biyoyakıt üretimi söz konusu olduğunda, biyokütlenin bazı bölümlerinin neden bu kadar inatçı olduğunu anlamaya yardımcı olur.Bu yöntem, glikom analiz yöntemlerinde önemli bir boşluğu doldurur ve uygulamasını bitki oligosakkaritlerinin ötesinde daha geniş bir substrat yelpazesine genişletir.Gelecekte, biyotinilasyon için robotları kullanabilir ve ELISA kullanarak numunelerin yüksek verimli analizi için geliştirdiğimiz yöntemi kullanabiliriz.
Pioneer 33A14 hibrit tohumlarından yetiştirilen mısır samanı (CS), 2010 yılında Ray, Colorado'daki Kramer Farms'tan hasat edilmiştir.Arazi sahibinin izni ile bu biyokütle araştırma için kullanılabilir. Numuneler, oda sıcaklığında fermuarlı torbalarda kuru < %6 nem oranında saklandı. Numuneler, oda sıcaklığında fermuarlı torbalarda kuru < %6 nem oranında saklandı. Образцы хранились сухими при влажности < 6% from the застежкой-молнией при комнатной температуре. Numuneler, oda sıcaklığında fermuarlı torbalarda <%6 nemde kuru olarak saklandı.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% % 6'dan daha düşük bir oranda, aşırı sıcak hava koşullarından kaynaklanan aşırı ısınma oranı. Numuneler, < %6 nem ile oda sıcaklığında fermuarlı torbalarda saklanır.Çalışma yerel ve ulusal yönergelere uygundur.Bileşim analizi, NREL protokolü kullanılarak yapıldı.Bileşimin %31.4 glukan, %18.7 ksilan, %3.3 arabinan, %1.2 galaktan, %2.2 asetil, %14.3 lignin, %1.7 protein ve %13.4 kül içerdiği bulundu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001), Novozymes'ten (Franklinton, NC, ABD) selülaz, p-glukosidaz ve Cellic® HTec2'nin (157 mg protein/ml, lot VHN00001) kompleks bir karışımıdır.Pektin parçalayıcı enzimlerin karmaşık bir karışımı olan Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABD) tarafından bağışlanmıştır.Enzim protein konsantrasyonları, Kjeldahl nitrojen analizi (AOAC yöntemi 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABD) kullanılarak protein içeriği tahmin edilerek (ve protein olmayan nitrojenin katkısı çıkarılarak) belirlendi.Diyatomlu toprak 545, EMD Millipore'dan (Billerica, MA) satın alındı.Aktif karbon (DARCO, 100 gözenekli granüller), Avicel (PH-101), kayın ksilan ve diğer tüm kimyasallar Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO) satın alınmıştır.
AFEX ön işlemi GLBRC'de (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ABD) yapıldı.Ön muamele 140°C'de 15 dakika süreyle gerçekleştirildi.46 paslanmaz çelik tezgah üstü kesikli reaktörde (Parr Instruments Company) %60 (ağırlık/ağırlık) yüklemede susuz amonyağın biyokütleye 1:1 oranında kalma süresi.30 dakika sürdü.Reaktör 140°C'ye getirildi ve amonyak hızla salınarak biyokütlenin hızla oda sıcaklığına dönmesi sağlandı.AFEX ile önceden işlenmiş mısır koçanı (ACS) bileşimi, işlenmemiş mısır koçanı (UT-CS) ile benzerdi.
Yüksek katı içerikli ACSH %25 (w/w) (yaklaşık %8 dekstran yüklemesi), büyük ölçekli oligosakarit üretimi için bir başlangıç ​​malzemesi olarak hazırlandı.ACS'nin enzimatik hidrolizi, Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (önceden işlenmiş biyokütlede), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan ve Multifect Pectinase (Genencor Inc, ABD) dahil olmak üzere ticari bir enzim karışımı kullanılarak gerçekleştirildi.).), 5 mg protein/g dekstran.Enzimatik hidroliz 5 litrelik biyoreaktörde 3 litre çalışma hacmi, pH 4.8, 50°C ve 250 rpm'de gerçekleştirildi.96 saat hidrolizden sonra hidrolizat, hidrolize olmamış katıları çıkarmak için 6000 rpm'de 30 dakika ve ardından 14000 rpm'de 30 dakika santrifüjleme yoluyla toplandı.Hidrolizat daha sonra 0.22 mm'lik bir filtre kabı içinden steril filtrasyona tabi tutuldu.Süzülen hidrolizat, 4°C'de steril şişelerde saklandı ve daha sonra karbon üzerinde fraksiyonlara ayrıldı.
Ekstrakt bazlı biyokütle numunelerinin kompozisyonunun NREL laboratuvar analiz prosedürlerine göre analizi: numunelerin kompozisyon analizi için hazırlanması (NREL/TP-510-42620) ve biyokütlede yapısal karbonhidratların ve ligninin belirlenmesi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizat akışının oligosakarit analizi, otoklav bazlı bir asit hidroliz yöntemi kullanılarak 2 ml'lik bir ölçekte gerçekleştirildi.Hidrolizat numunesini 69,7 µl %72 sülfürik asit ile 10 ml'lik vidalı kapaklı bir kültür tüpünde karıştırın ve 121 °C'de bir tezgah üzerinde 1 saat inkübe edin, buz üzerinde soğutun ve yüksek performanslı bir sıvı kromatografi (HPLC) şişesine süzün.Oligosakkaritlerin konsantrasyonu, asitle hidrolize edilmiş numunedeki toplam şeker konsantrasyonundan hidrolize edilmemiş numunedeki monosakkaritlerin konsantrasyonunun çıkarılmasıyla belirlendi.
Asitle hidrolize edilmiş biyokütledeki glikoz, ksiloz ve arabinoz konsantrasyonları, bir Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonunda bir otomatik numune alıcı, kolon ısıtıcısı, izokratik pompa ve kırılma indisi detektörü ile donatılmış bir Shimadzu HPLC sistemi kullanılarak analiz edildi.Sütun, 50°C'de tutuldu ve su içinde 0.6 ml/dk 5 mM H2S04 ile yıkandı.akış.
Hidrolizat süpernatanı seyreltildi ve monomer ve oligosakarit içeriği açısından analiz edildi.Enzimatik hidrolizden sonra elde edilen monomerik şekerler, bir Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonu ve bir kül koruma kolonu ile donatılmış HPLC ile analiz edildi.Kolon sıcaklığı 80°C'de tutuldu, mobil faz olarak 0.6 ml/dakika akış hızıyla su kullanıldı.Oligosakkaritler, refs.41, 48, 49.
Sakarit analizi, önceden tarif edilen prosedürler 27, 43, 50, 51 kullanılarak ham, AFEX ile önceden işlenmiş ve tüm hidrolize edilmemiş biyokütle kalıntıları (seri hücre duvarı özütlerinin üretimi ve bunların mAb taraması dahil) üzerinde gerçekleştirildi.Glikoz analizi için, bitki hücre duvarı malzemesinin alkolde çözünmeyen kalıntıları, biyokütle kalıntılarından hazırlanır ve amonyum oksalat (50 mM), sodyum karbonat (50 mM ve %0.5 w/v), CON gibi giderek agresif reaktiflerle seri ekstraksiyona tabi tutulur.(İM ve 4M, her ikisi de %1 a/h sodyum borohidrit ile) ve daha önce açıklandığı gibi asit klorit52,53.Ekstreler daha sonra hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş karmaşık bir mAb50 paneline karşı ELISA'ya tabi tutuldu ve mAb bağlanma reaksiyonları bir ısı haritası olarak sunuldu.Bitki hücre duvarı glikanını hedefleyen mAb'ler, laboratuvar stoklarından (CCRC, JIM ve MAC serisi) satın alınmıştır.
Oligosakkaritlerin tek adımlı biyotinilasyonu.Karbohidratların biyotin-LC-hidrazid ile konjugasyonu aşağıdaki prosedür kullanılarak gerçekleştirildi.Biotin-LC-hidrazid (4.6 mg/12 umol), dimetil sülfoksit (DMSO, 70 ul) içinde kuvvetlice karıştırılarak ve 65°C'de 1 dakika ısıtılarak çözüldü.Buzlu asetik asit (30 ul) ilave edildi ve karışım, sodyum siyanoborohidrid (6.4 mg/100 umol) üzerine döküldü ve 65°C'de yaklaşık 1 dakika ısıtıldıktan sonra tamamen çözüldü.Daha sonra, indirgeyici uca göre 10 kat veya daha fazla molar bir etiket fazlalığı elde etmek için kurutulmuş oligosakarite (1-100 nmol) 5 ila 8 ul reaksiyon karışımı ilave edildi.Reaksiyon, 65°C'de 2 saat süreyle gerçekleştirildi, ardından numuneler hemen saflaştırıldı.İşaretleme deneylerinde indirgenmeden sodyum siyanoborohidrit kullanılmadı ve numuneler 65°C'de 2.5 saat reaksiyona sokuldu.
Biyotinlenmiş oligosakkarit örneklerinin ELISA ile kaplanması ve yıkanması.Avidin kaplı plakanın her bir oyuğuna 25 ul biyotinlenmiş numuneler (5 ml 0.1 M Tris tampon çözeltisi (TBS) içinde seyreltilmiş her konsantre numuneden 100 ul) ilave edildi.Kontrol oyukları, 0.1 M TBS içinde 10 ug/ml konsantrasyonda 50 ul biotin ile kaplandı.Kör ölçümler için kaplama olarak deiyonize su kullanıldı.Tablet, karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat inkübe edildi.Plakayı 3 kez 0,1 M TBS'de %0,1 yağsız sütle program no.Grenier düz 3A için 11.
Birincil antikorların eklenmesi ve yıkanması.Her kuyucuğa 40 µl birincil antikor ekleyin.Mikroplakayı oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin.Plakalar daha sonra Grenier Flat 3A için yıkama programı #11 kullanılarak 0.1M TBS içinde %0.1 sütle 3 kez yıkandı.
İkincil antikor ekleyin ve yıkayın.Her kuyuya 50 µl fare/sıçan sekonder antikoru (0,1 M TBS'de %0,1 sütte 1:5000 oranında seyreltilmiş) ekleyin.Mikroplakayı oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin.Mikroplakalar daha sonra Grenier Flat 5A plaka yıkama programı #12 kullanılarak 0.1 M TBS içinde %0.1 sütle 5 kez yıkandı.
Substrat ekleme.Baz substrata 50 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) ekleyin (15 ml deiyonize suya 2 damla tampon, 3 damla TMB, 2 damla hidrojen peroksit ekleyerek).TMB substratını hazırlayın.ve kullanmadan önce girdap).Mikroplakayı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Karanlıkta.
Adımı tamamlayın ve tableti okuyun.Her kuyucuğa 50 µl 1 N sülfürik asit ekleyin ve bir ELISA okuyucu kullanarak 450 ila 655 nm arasındaki absorbansı kaydedin.
Deiyonize suda bu analitlerin 1 mg/ml çözeltilerini hazırlayın: arabinoz, ramnoz, fukoz, ksiloz, galakturonik asit (GalA), glukuronik asit (GlcA), mannoz, glikoz, galaktoz, laktoz, N-asetilmannozamin (manNAc), N-asetilglukosamin.(glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inositol (dahili standart).Tablo l'de gösterilen 1 mg/mL şeker çözeltileri ilave edilerek iki standart hazırlandı. Numuneler donduruldu ve tüm su çıkana kadar (genellikle yaklaşık 12-18 saat) -80°C'de liyofilize edildi.
Analitik terazide vidalı kapaklı tüplere 100–500 µg numune ekleyin.Eklenen miktarı kaydedin.Numuneyi belirli bir çözücü konsantrasyonunda çözmek ve sıvı bir kısım olarak tüpe eklemek en iyisidir.Her numune tüpü için dahili standart olarak 20 µl 1 mg/ml inositol kullanın.Numuneye eklenen iç standart miktarı, standart tüpe eklenen iç standart miktarı ile aynı olmalıdır.
Vidalı kapaklı bir şişeye 8 ml susuz metanol ekleyin.Daha sonra 4 ml 3 N. metanolik HCI çözeltisi, ağzı kapatılır ve çalkalanır.Bu işlem su kullanmaz.
Oligosakarit örneklerine ve standart TMS tüplerine 500 ul 1 M HCI metanol solüsyonu ekleyin.Numuneler, bir termal blok içinde 80°C'de gece boyunca (168 saat) inkübe edildi.Metanoliz ürününü bir kurutma manifoldu kullanarak oda sıcaklığında kurutun.200 ul MeOH ekleyin ve tekrar kurutun.Bu işlem iki kez tekrarlanır.Numuneye 200 µl metanol, 100 µl piridin ve 100 µl asetik anhidrit ekleyin ve iyice karıştırın.Numuneler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi.ve kurutulur.200 µl metanol ekleyin ve tekrar kurutun.
200 µl Tri-Sil ekleyin ve tüpü 20 dakika ısıtın.80°C, daha sonra oda sıcaklığına soğutulur.Numuneyi yaklaşık 50 µl'lik bir hacme daha fazla kurutmak için bir kurutma manifoldu kullanın.Numunelerin tamamen kurumasına izin vermediğimize dikkat etmek önemlidir.
2 ml hekzan ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın.Pasteur pipetlerinin uçlarını (5-8 mm) bir parça cam yünü ile 5-3/4 inç çaplı bir pipetin üstüne cam yünü koyarak doldurun.Numuneler 3000 g'de 2 dakika santrifüjlendi.Herhangi bir çözünmeyen kalıntı çökeltilir.Örneği 100-150 µl'ye kadar kurutun.GC-MS'ye 80 °C'lik bir başlangıç ​​sıcaklığında ve 2.0 dakikalık bir başlangıç ​​süresinde yaklaşık 1 ul'lik bir hacim enjekte edildi (Tablo 2).