Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
AFEX ile ön işlem görmüş mısır sapındaki kalıcı oligosakkaritlerin kompleks analizi için yeni immünolojik ve kütle spektrometrik yöntemler. Lignoselülozik biyokütle, fosil yakıtlara sürdürülebilir bir alternatiftir ve gıda, yem, yakıt ve kimyasallar gibi ürünlerin üretimi için biyoteknolojilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknolojilerin anahtarı, bitki hücre duvarlarında bulunan kompleks karbonhidratları glikoz, ksiloz ve arabinoz gibi basit şekerlere dönüştürmek için maliyet açısından rekabetçi süreçlerin geliştirilmesidir. Lignoselülozik biyokütle çok dirençli olduğundan, istenen ürünü elde etmek için termokimyasal işlemlere (örneğin, amonyak lif eksfolyasyonu (AFEX), seyreltik asitler (DA), iyonik sıvılar (IL)) ve biyolojik işlemlere (örneğin, enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon) birlikte tabi tutulmalıdır. Ancak, hidroliz işleminde ticari mantar enzimleri kullanıldığında, oluşan çözünür şekerlerin yalnızca %75-85'i monosakkaritlerdir ve geri kalan %15-25'i çözünür, işlenmesi zor oligosakkaritlerdir ve bunlar her zaman mikroorganizmalar için erişilebilir değildir. Daha önce, karbon ve diyatomlu toprak ayırma ve boyut dışlama kromatografisi kombinasyonunu kullanarak çözünür, inatçı oligosakkaritleri başarıyla izole edip saflaştırdık ve ayrıca enzim inhibitör özelliklerini de araştırdık. Daha yüksek polimerizasyon derecesine (DP) sahip metillenmiş üronik asit ikameleri içeren oligosakkaritlerin, düşük DP'li ve nötr oligosakkaritlere göre ticari enzim karışımlarıyla işlenmesinin daha zor olduğunu bulduk. Burada, bitki hücre duvarlarındaki ve enzimatik hidrolizatlardaki glikan bağlarını karakterize etmek için bitki biyokütle glikanlarına özgü monoklonal antikorlar (mAb'ler) kullanılarak glikan profillemesi, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu, zaman uçuşlu kütle spektrometrisi (MALDI-TOF-MS) ve türevlendirme ile ve türevlendirme olmadan oligosakkarit bağlarını karakterize etmek için gaz kromatografisi ve kütle spektrometrisi (GC-MS) dahil olmak üzere çeşitli ek yöntemlerin kullanımını rapor ediyoruz. Oligosakkaritlerin küçük boyutu (DP 4-20) nedeniyle, bu moleküllerin mAb bağlanması ve karakterizasyonu zordur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, mikroplaka yüzeyinde düşük DP'li çözünür oligosakkaritlerin çoğunu başarıyla etiketleyen yeni bir biyotin konjugasyonuna dayalı oligosakkarit immobilizasyon yöntemi uyguladık ve bu yöntem daha sonra spesifik ligasyon analizi için yüksek verimli bir mAb sisteminde kullanıldı. Bu yeni yöntem, gelecekte tanı amaçlı biyobelirteçlerde bulunan oligosakkaritleri izole etmek ve karakterize etmek için kullanılabilecek daha gelişmiş yüksek verimli glikom analizlerinin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
Tarım, ormancılık, ot ve odunsu malzemelerden oluşan lignoselülozik biyokütle, gıda, yem, yakıt ve daha yüksek değerli ürünler üretmek için kimyasal öncüller de dahil olmak üzere biyobazlı ürünlerin üretimi için potansiyel bir hammaddedir¹. Bitki hücre duvarlarında bulunan karbonhidratlar (selüloz ve hemiselüloz gibi), kimyasal işleme ve biyotransformasyon (enzimatik hidroliz ve mikrobiyal fermantasyon gibi) yoluyla monosakkaritlere depolimerize edilir. Yaygın ön işlemler arasında, bitki hücre duvarlarını açarak lignoselüloz üretimini azaltmak için kimyasallar ve ısı kombinasyonunu kullanan amonyak lif genişletme (AFEX), seyreltik asit (DA), iyonik sıvı (IL) ve buhar patlaması (SE) bulunur³⁻⁴. Maddenin inatçılığı,⁵. Enzimatik hidroliz, ticari aktif karbonhidrat içeren enzimler (CAZymes) kullanılarak yüksek katı madde yükünde gerçekleştirilir ve mikrobiyal fermantasyon, biyobazlı yakıtlar ve kimyasallar üretmek için transgenik mayalar veya bakteriler kullanılarak yapılır⁶.
Ticari enzimlerdeki CAZ enzimleri, karmaşık karbonhidrat-şeker bağlarını sinerjik olarak parçalayarak monosakkaritler oluşturan karmaşık bir enzim karışımından oluşur2,7. Daha önce de belirttiğimiz gibi, lignin ve karbonhidratların aromatik polimerlerinin karmaşık ağı, onları oldukça çözünmez hale getirir ve bu da şeker dönüşümünün eksik kalmasına ve ön işlem görmüş biyokütlenin enzimatik hidrolizi sırasında üretilmeyen %15-25 oranında seks oligosakkaritlerinin birikmesine yol açar. Bu, çeşitli biyokütle ön işlem yöntemlerinde yaygın bir sorundur. Bu darboğazın bazı nedenleri arasında hidroliz sırasında enzim inhibisyonu veya bitki biyokütlesindeki şeker bağlarını kırmak için gerekli olan temel enzimlerin yokluğu veya düşük seviyeleri yer alır. Oligosakkaritlerdeki şeker bağları gibi şekerlerin bileşimini ve yapısal özelliklerini anlamak, hidroliz sırasında şeker dönüşümünü iyileştirmemize ve biyoteknolojik süreçleri petrol türevli ürünlerle maliyet açısından rekabetçi hale getirmemize yardımcı olacaktır.
Karbonhidratların yapısını belirlemek zorlu bir iştir ve sıvı kromatografisi (LC)11,12, nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)13, kapiler elektroforez (CE)14,15,16 ve kütle spektrometrisi (MS)17,18 gibi yöntemlerin bir kombinasyonunu gerektirir. Matris kullanılarak lazer desorpsiyonu ve iyonizasyonlu uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF-MS) gibi MS yöntemleri, karbonhidrat yapılarını tanımlamak için çok yönlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, sodyum iyonu eklentilerinin Çarpışma Kaynaklı Ayrışma (CID) tandem MS'si, oligosakkarit bağlanma pozisyonlarına, anomerik konfigürasyonlara, dizilere ve dallanma pozisyonlarına karşılık gelen parmak izlerini tanımlamak için en yaygın olarak kullanılmaktadır 20, 21.
Glikan analizi, karbonhidrat bağlarının derinlemesine tanımlanması için mükemmel bir araçtır22. Bu yöntem, karmaşık karbonhidrat bağlarını anlamak için bitki hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş monoklonal antikorları (mAb'ler) prob olarak kullanır. Dünya çapında, çeşitli sakkaritler kullanılarak çeşitli doğrusal ve dallı oligosakkaritlere karşı tasarlanmış 250'den fazla mAb mevcuttur24. Bitki hücre duvarının yapısını, bileşimini ve modifikasyonlarını karakterize etmek için çeşitli mAb'ler yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü bitki hücre tipine, organa, yaşa, gelişim evresine ve büyüme ortamına bağlı olarak önemli farklılıklar vardır25,26. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem, bitki ve hayvan sistemlerindeki vezikül popülasyonlarını ve bunların hücre altı belirteçler, gelişim evreleri veya çevresel uyaranlar tarafından belirlenen glikan taşınmasındaki rollerini anlamak ve enzimatik aktiviteyi belirlemek için kullanılmıştır. Tanımlanmış olan glikan ve ksilanların farklı yapılarından bazıları pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), karışık bağ glukanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomannan (GalG), glukuronik asit-arabinoksilan (GArbX) ve arabino-galaktan (ArbG)29'dur.
Ancak, tüm bu araştırma çabalarına rağmen, oligosakkarit salınımı, hidroliz sırasında oligomerik zincir uzunluğu değişiklikleri, çeşitli düşük DP polimerleri ve bunların dağılım eğrileri de dahil olmak üzere, yüksek katı madde yükü (HSL) hidrolizi sırasında oligosakkarit birikiminin doğasına odaklanan sadece birkaç çalışma bulunmaktadır 30,31,32. Bu arada, glikan analizinin glikan yapısının kapsamlı bir analizi için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmış olsa da, antikor yöntemleri kullanılarak suda çözünebilen düşük DP oligosakkaritlerin değerlendirilmesi zordur. Moleküler ağırlığı 5-10 kDa'dan az olan daha küçük DP oligosakkaritler ELISA plakalarına bağlanmaz 33, 34 ve antikor eklenmeden önce yıkanarak uzaklaştırılır.
Burada, ilk defa, çözünür dirençli oligosakkaritler için tek adımlı bir biyotinilasyon prosedürünü glikom analiziyle birleştirerek, monoklonal antikorlar kullanılarak avidin kaplı plakalar üzerinde bir ELISA testi gösteriyoruz. Glikom analizine yönelik yaklaşımımız, hidrolize şeker bileşimlerinin trimetilsilil (TMS) türevlendirilmesi kullanılarak tamamlayıcı oligosakkarit bağlarının MALDI-TOF-MS ve GC-MS tabanlı analizi ile doğrulandı. Bu yenilikçi yaklaşım, gelecekte yüksek verimli bir yöntem olarak geliştirilebilir ve biyomedikal araştırmalarda daha geniş uygulama alanı bulabilir35.
Glikozilasyon gibi enzimlerin ve antikorların translasyon sonrası modifikasyonları, biyolojik aktivitelerini etkiler. Örneğin, serum proteinlerinin glikozilasyonundaki değişiklikler inflamatuar artritte önemli bir rol oynar ve glikozilasyondaki değişiklikler tanısal belirteçler olarak kullanılır. Literatürde, gastrointestinal sistem ve karaciğerin kronik inflamatuar hastalıkları, viral enfeksiyonlar, yumurtalık, meme ve prostat kanserleri dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda kolayca ortaya çıkan çeşitli glikanlar bildirilmiştir. Antikor bazlı glikan ELISA yöntemleri kullanılarak glikanların yapısının anlaşılması, karmaşık MS yöntemleri kullanılmadan hastalık tanısında ek güven sağlayacaktır.
Önceki çalışmamız, inatçı oligosakkaritlerin ön işlem ve enzimatik hidrolizden sonra hidrolize edilmeden kaldığını göstermiştir (Şekil 1). Daha önce yayınladığımız çalışmada, AFEX ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapı hidrolizatından (ACSH)8 oligosakkaritleri izole etmek için aktif kömür katı faz ekstraksiyon yöntemi geliştirdik. İlk ekstraksiyon ve ayırmadan sonra, oligosakkaritler daha sonra boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile fraksiyonlara ayrıldı ve moleküler ağırlık sırasına göre toplandı. Çeşitli ön işlemlerden salınan şeker monomerleri ve oligomerleri, şeker bileşimi analizi ile analiz edildi. Çeşitli ön işlem yöntemleriyle elde edilen şeker oligomerlerinin içeriği karşılaştırıldığında, inatçı oligosakkaritlerin varlığı, biyokütlenin monosakkaritlere dönüştürülmesinde yaygın bir sorundur ve şeker veriminde en az %10-15, hatta %18'e kadar bir azalmaya yol açabilir. Bu yöntem, oligosakkarit fraksiyonlarının daha büyük ölçekli üretimi için kullanılmaktadır. Elde edilen ACH ve farklı molekül ağırlıklarına sahip sonraki fraksiyonları, bu çalışmada oligosakkaritlerin karakterizasyonu için deneysel malzeme olarak kullanılmıştır.
Ön işlem ve enzimatik hidrolizden sonra, kalıcı oligosakkaritler hidrolize edilmeden kaldı. Burada (A), aktif karbon ve diyatomlu topraktan oluşan paketlenmiş bir yatak kullanılarak AFEX ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapı hidrolizatından (ACSH) oligosakkaritlerin izole edildiği bir oligosakkarit ayırma yöntemi; (B) Oligosakkaritlerin ayrılması yöntemi. Oligosakkaritler daha sonra boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ayrıldı; (C) Çeşitli ön işlemlerden (seyreltilmiş asit: DA, iyonik sıvı: IL ve AFEX) salınan sakkarit monomerleri ve oligomerleri. Enzimatik hidroliz koşulları: %25 (a/a) yüksek katı madde yüklemesi (yaklaşık %8 glukan yüklemesi), 96 saat hidroliz, 20 mg/g ticari enzim yüklemesi (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 oranı) ve (D) AFEX ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapından (ACS) salınan glikoz, ksiloz ve arabinozun şeker monomerleri ve oligomerleri.
Glikan analizi, katı biyokütle kalıntılarından izole edilen ekstraktlardaki glikanların kapsamlı yapısal analizi için yararlı bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, düşük molekül ağırlıklı oligosakkaritlerin ELISA plakalarına immobilize edilmesi zor olduğu ve antikor eklenmeden önce yıkandığı için, suda çözünen sakkaritler bu geleneksel yöntem kullanılarak yeterince temsil edilmemektedir41. Bu nedenle, antikor bağlanması ve karakterizasyonu için, çözünür, uyumsuz oligosakkaritleri avidin kaplı ELISA plakalarına kaplamak için tek adımlı bir biyotinilasyon yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntem, daha önce ürettiğimiz ACSH ve molekül ağırlığına (veya polimerizasyon derecesine, DP) dayalı bir fraksiyon kullanılarak test edilmiştir. Tek adımlı biyotinilasyon, karbonhidratın indirgeyici ucuna biotin-LC-hidrazit eklenerek oligosakkarit bağlanma afinitesini artırmak için kullanılmıştır (Şekil 2). Çözeltide, indirgeyici uçtaki hemiasetal grubu, biotin-LC-hidrazitin hidrazit grubu ile reaksiyona girerek bir hidrazon bağı oluşturur. İndirgeyici madde NaCNBH3'ün varlığında, hidrazon bağı stabil bir biyotinlenmiş son ürüne indirgenir. Şeker indirgeyici ucunun modifikasyonu ile düşük DP oligosakkaritlerin ELISA plakalarına bağlanması mümkün hale geldi ve çalışmamızda bu, glikan hedefli mAb'ler kullanılarak avidin kaplı plakalarda gerçekleştirildi.
Biotinlenmiş oligosakkaritler için ELISA'ya dayalı monoklonal antikorların taranması. Burada (A) oligosakkaritlerin birleştirilmiş biotinlenmesi ve ardından NeutrAvidin kaplı plakalarda glikan hedefli mAb'lerle ELISA taraması ve (B) reaksiyon ürünlerinin biotinlenmesi için tek adımlı bir prosedür gösterilmektedir.
Oligosakkarit konjugeli antikorlar içeren avidin kaplı plakalara daha sonra birincil ve ikincil antikorlar eklendi ve ışığa ve zamana duyarlı bir ortamda yıkandı. Antikor bağlanması tamamlandıktan sonra, plakayı inkübe etmek için TMB substratı eklendi. Reaksiyon son olarak sülfürik asit ile durduruldu. İnkübe edilen plakalar, her bir antikorun bağlanma gücünü belirlemek ve antikora özgü çapraz bağlanmayı tespit etmek için bir ELISA okuyucu kullanılarak analiz edildi. Deneyin ayrıntıları ve parametreleri için ilgili "Malzemeler ve Yöntemler" bölümüne bakınız.
Bu yeni geliştirilen yöntemin belirli uygulamalar için kullanışlılığını, ACSH'de bulunan çözünür oligosakkaritlerin yanı sıra lignoselülozik hidrolizatlardan izole edilen ham ve saflaştırılmış oligosakkarit fraksiyonlarını karakterize ederek gösteriyoruz. Şekil 3'te gösterildiği gibi, biyolojik olarak asillenmiş glikom analiz yöntemleri kullanılarak ACSH'de tanımlanan en yaygın epitop ikame edilmiş ksilanlar genellikle üronik (U) veya metilüronik (MeU) ve pektik arabinogalaktanlardır. Bunların çoğu, hidrolize edilmemiş katıların (UHS)43 glikanlarının analizi üzerine önceki çalışmamızda da bulunmuştur.
Hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş monoklonal bir antikor kullanılarak dirençli oligosakkarit epitoplarının tespiti. "Nötr" fraksiyon ACN fraksiyonu, "asidik" fraksiyon ise FA fraksiyonudur. Isı haritasındaki daha parlak kırmızılar daha yüksek epitop içeriğini, daha parlak maviler ise boş bir arka planı gösterir. Ölçekteki renk değerleri, N=2 formülasyonları için ham OD değerlerine dayanmaktadır. Antikorlar tarafından tanınan ana epitoplar sağda gösterilmiştir.
Bu selüloz dışı yapılar, test edilen ticari enzim karışımındaki en yaygın selülazlar ve hemiselülazlar tarafından parçalanamamıştır; bu karışım en yaygın kullanılan ticari enzimleri içermektedir. Bu nedenle, hidrolizleri için yeni yardımcı enzimlere ihtiyaç duyulmaktadır. Gerekli selüloz dışı yardımcı enzimler olmadan, bu selüloz dışı bağlar, ana şeker polimerleri ticari enzim karışımları kullanılarak daha kısa parçalara kapsamlı bir şekilde hidrolize edilip çözülse bile, monosakkaritlere tam dönüşümü engellemektedir.
Sinyal dağılımı ve bağlanma gücünün daha ayrıntılı incelenmesi, bağlanma epitoplarının yüksek DP şeker fraksiyonlarında (A, B, C, DP 20+'ya kadar) düşük DP fraksiyonlarına (D, E, F, DP) göre daha düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Asit parçaları, nötr parçalara göre selüloz dışı epitoplarda daha yaygındır. Bu olgular, yüksek DP ve asit kısımlarının enzimatik hidrolize daha dirençli olduğu önceki çalışmamızda gözlemlenen modelle tutarlıdır. Bu nedenle, selüloz dışı glikan epitoplarının ve U ve MeU ikamelerinin varlığı, oligosakkaritlerin stabilitesine büyük ölçüde katkıda bulunabilir. Özellikle epitop dimerik veya trimerik bir oligosakkarit ise, düşük DP oligosakkaritler için bağlanma ve tespit verimliliğinin sorunlu olabileceği unutulmamalıdır. Bu, her biri belirli bir mAb'ye bağlanan yalnızca bir epitop içeren farklı uzunluklardaki ticari oligosakkaritler kullanılarak test edilebilir.
Böylece, yapıya özgü antikorların kullanımı, belirli türdeki dirençli bağları ortaya çıkardı. Kullanılan antikor türüne, uygun ligasyon modeline ve ürettiği sinyalin gücüne (en çok ve en az miktarda) bağlı olarak, yeni enzimler tanımlanabilir ve daha eksiksiz glikokonversiyon için enzim karışımına yarı kantitatif olarak eklenebilir. ACSH oligosakkaritlerinin analizini örnek alarak, her biyokütle materyali için bir glikan bağı veritabanı oluşturabiliriz. Burada, antikorların farklı afinitelerinin dikkate alınması gerektiği ve afinitelerinin bilinmemesi durumunda, farklı antikorların sinyallerini karşılaştırırken belirli zorluklar yaratacağı belirtilmelidir. Ayrıca, glikan bağlarının karşılaştırılması, aynı antikor için örnekler arasında en iyi sonucu verebilir. Bu inatçı bağlar daha sonra CAZyme veritabanına bağlanabilir; buradan enzimleri tanımlayabilir, aday enzimleri seçebilir ve bağ kırıcı enzimleri test edebilir veya bu enzimleri biyorafinelerde kullanmak üzere mikrobiyal sistemler geliştirebiliriz44.
Lignoselüloz hidrolizatlarında bulunan düşük molekül ağırlıklı oligosakkaritlerin karakterizasyonu için alternatif yöntemlerin immünolojik yöntemlerle nasıl tamamlayıcı olduğunu değerlendirmek amacıyla, aynı paneldeki (Şekil 5) oligosakkarit kısmında MALDI (Şekil 4, S1-S8) ve GC-MS'ye dayalı TMS türevli sakkaritlerin analizini gerçekleştirdik. MALDI, oligosakkarit moleküllerinin kütle dağılımının amaçlanan yapıyla eşleşip eşleşmediğini karşılaştırmak için kullanılır. Şekil 4'te nötr bileşenler ACN-A ve ACN-B'nin MC'si gösterilmektedir. ACN-A analizi, DP 4-8'den (Şekil 4) DP 22'ye (Şekil S1) kadar değişen bir dizi pentoz şekerini doğruladı; bunların ağırlıkları MeU-ksilan oligosakkaritlerine karşılık gelmektedir. ACN-B analizi, DP 8-15'lik pentoz ve glukoksilan serilerini doğruladı. Ek materyallerde, örneğin Şekil S3'te, FA-C asidik kısım kütle dağılım haritaları, ELISA tabanlı mAb taramasında bulunan ikame edilmiş ksilanlarla tutarlı olan, DP'si 8-15 arasında değişen bir dizi (Me)U ikame edilmiş pentoz şekerini göstermektedir. Epitoplar tutarlıdır.
ACS'de bulunan çözünür uyumsuz oligosakkaritlerin MALDI-MS spektrumu. Burada, (A) metillenmiş üronik asit (DP 4-8) ile ikame edilmiş glukuroksilan oligosakkaritleri içeren ACN-A düşük ağırlık aralığı fraksiyonları ve (B) glukuroksilan (DP 8-15) ile ikame edilmiş ksilan ve metillenmiş üronik asit oligosakkaritleri içeren ACN-B.
Dirençli oligosakkaritlerin glikan kalıntısının bileşiminin analizi. Burada (A) GC-MS analizi kullanılarak elde edilen çeşitli oligosakkarit fraksiyonlarının TMS sakkarit bileşimi. (B) Oligosakkaritlerde bulunan çeşitli TMS türevli şekerlerin yapıları. ACN – nötr oligosakkaritleri içeren asetonitril fraksiyonu ve FA – asidik oligosakkaritleri içeren ferulik asit fraksiyonu.
Oligosakkarit fraksiyonunun LC-MS analizinden elde edilen bir diğer ilginç sonuç ise Şekil S9'da gösterilmiştir (yöntemler elektronik ek materyalde görülebilir). ACN-B fraksiyonunun bağlanması sırasında heksoz ve -OAc gruplarının parçaları tekrar tekrar gözlemlenmiştir. Bu bulgu, glikom ve MALDI-TOF analizinde gözlemlenen parçalanmayı doğrulamakla kalmayıp, ön işlem görmüş lignoselülozik biyokütlede potansiyel karbonhidrat türevleri hakkında yeni bilgiler de sağlamaktadır.
Ayrıca, TMS şeker türevlendirmesi kullanarak oligosakkarit fraksiyonunun şeker bileşimini de analiz ettik. GC-MS kullanarak, oligosakkarit fraksiyonundaki nöral (türevsiz) ve asidik şekerlerin (GluA ve GalA) bileşimini belirledik (Şekil 5). Glukuronik asit, asidik bileşenler C ve D'de bulunurken, galakturonik asit ise asidik bileşenler A ve B'de bulunur; bunların her ikisi de asidik şekerlerin yüksek DP bileşenleridir. Bu sonuçlar, ELISA ve MALDI verilerimizi doğrulamakla kalmayıp, oligosakkarit birikimi üzerine önceki çalışmalarımızla da tutarlıdır. Bu nedenle, oligosakkaritlerin biyotinilasyonu ve ardından ELISA taraması kullanan modern immünolojik yöntemlerin, çeşitli biyolojik örneklerdeki çözünür dirençli oligosakkaritleri tespit etmek için yeterli olduğuna inanıyoruz.
ELISA tabanlı mAb tarama yöntemleri çeşitli farklı yöntemlerle doğrulandığından, bu yeni kantitatif yöntemin potansiyelini daha fazla araştırmak istedik. İki ticari oligosakkarit, ksiloheksasakkarit oligosakkarit (XHE) ve 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioz (A2XX), hücre duvarı glikanını hedefleyen yeni bir mAb yaklaşımı kullanılarak satın alındı ​​ve test edildi. Şekil 6, biyotinlenmiş bağlanma sinyali ile oligosakkarit konsantrasyonunun logaritmik konsantrasyonu arasında doğrusal bir korelasyon göstermekte olup, olası bir Langmuir adsorpsiyon modelini düşündürmektedir. mAb'ler arasında CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ve CCRC-M151, XHE ile; CCRC-M108, CCRC-M109 ve LM11 ise A2XX ile 1 nm ila 100 nano aralığında korelasyon göstermiştir. Deney sırasında antikorların sınırlı bulunabilirliği nedeniyle, her oligosakkarit konsantrasyonuyla sınırlı sayıda deney yapılmıştır. Burada, bazı antikorların aynı oligosakkarite substrat olarak çok farklı tepkiler verdiğini, muhtemelen biraz farklı epitoplara bağlandıkları ve çok farklı bağlanma afinitelerine sahip olabildikleri için olduğunu belirtmek gerekir. Yeni mAb yaklaşımı gerçek örneklere uygulandığında, doğru epitop tanımlamasının mekanizmaları ve sonuçları çok daha karmaşık olacaktır.
Çeşitli glikan hedefli monoklonal antikorların (mAb) tespit aralığını belirlemek için iki ticari oligosakkarit kullanıldı. Burada, oligosakkarit konsantrasyonunun log konsantrasyonu ile doğrusal korelasyonlar, (A) mAb ile XHE ve (B) mAb ile A2XX için Langmuir adsorpsiyon desenlerini göstermektedir. Karşılık gelen epitoplar, deneyde substrat olarak kullanılan ticari oligosakkaritlerin yapılarını göstermektedir.
Glikana hedefli monoklonal antikorların (glikokomik analiz veya ELISA tabanlı mAb taraması) kullanımı, bitki biyokütlesini oluşturan başlıca hücre duvarı glikanlarının çoğunun derinlemesine karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, klasik glikan analizi yalnızca daha büyük hücre duvarı glikanlarını karakterize eder, çünkü çoğu oligosakkarit ELISA plakalarına etkili bir şekilde immobilize edilemez. Bu çalışmada, AFEX ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapı, yüksek katı madde içeriğinde enzimatik olarak hidrolize edildi. Hidrolizattaki dirençli hücre duvarı karbonhidratlarının bileşimini belirlemek için şeker analizi kullanıldı. Bununla birlikte, hidrolizatlardaki daha küçük oligosakkaritlerin mAb analizi hafife alınmaktadır ve oligosakkaritleri ELISA plakalarına etkili bir şekilde immobilize etmek için ek araçlara ihtiyaç duyulmaktadır.
Burada, oligosakkarit biyotinilasyonunu takiben NeutrAvidin™ kaplı plakalar üzerinde ELISA taraması ile birleştirilmiş, monoklonal antikor (mAb) taraması için yeni ve etkili bir oligosakkarit immobilizasyon yöntemi sunuyoruz. İmmobilize edilmiş biyotinlenmiş oligosakkaritler, dirençli oligosakkaritlerin hızlı ve etkili bir şekilde tespit edilmesini sağlayacak yeterli antikor afinitesi göstermiştir. Kütle spektrometresi temelinde bu inatçı oligosakkaritlerin bileşiminin analizi, immünotaramaya yönelik bu yeni yaklaşımın sonuçlarını doğrulamıştır. Bu nedenle, bu çalışmalar, oligosakkarit biyotinilasyonu ve glikan hedefli monoklonal antikorlarla ELISA taramasının kombinasyonunun, oligosakkaritlerdeki çapraz bağları tespit etmek için kullanılabileceğini ve oligosakkaritlerin yapısını karakterize eden diğer biyokimyasal çalışmalarda yaygın olarak uygulanabileceğini göstermektedir.
Bu biyotin bazlı glikan profilleme yöntemi, bitki biyokütlesindeki çözünür oligosakkaritlerin dirençli karbonhidrat bağlarını inceleyebilen ilk çalışmadır. Bu, biyokütlenin bazı kısımlarının biyoyakıt üretimi söz konusu olduğunda neden bu kadar dirençli olduğunu anlamaya yardımcı olur. Bu yöntem, glikom analiz yöntemlerindeki önemli bir boşluğu doldurur ve uygulamasını bitki oligosakkaritlerinin ötesinde daha geniş bir substrat yelpazesine genişletir. Gelecekte, biyotinilasyon için robotik kullanabilir ve geliştirdiğimiz yöntemi ELISA kullanarak numunelerin yüksek verimli analizi için kullanabiliriz.
Pioneer 33A14 hibrit tohumlarından yetiştirilen mısır sapı (CS), 2010 yılında Colorado, Ray'deki Kramer Çiftliği'nden hasat edilmiştir. Arazi sahibinin izniyle, bu biyokütle araştırma amaçlı kullanılabilir. Numuneler oda sıcaklığında, nem oranı %6'nın altında olan kuru poşetlerde saklandı. Numuneler oda sıcaklığında, nem oranı %6'nın altında olan kuru poşetlerde saklandı. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в застежкой-молнией при комнатной температуре. Numuneler, oda sıcaklığında, fermuarlı poşetlerde %6'dan düşük nem oranında kuru olarak saklandı.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной sıcaklık с влажностью < 6%. Numuneler, oda sıcaklığında ve %6'dan düşük nem oranında fermuarlı poşetlerde saklanır.Çalışma, yerel ve ulusal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bileşim analizi, NREL protokolü kullanılarak yapılmıştır. Bileşimin %31,4 glukan, %18,7 ksilan, %3,3 arabinan, %1,2 galaktan, %2,2 asetil, %14,3 lignin, %1,7 protein ve %13,4 kül içerdiği bulunmuştur.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, parti VCNI 0001), Novozymes'ten (Franklinton, NC, ABD) temin edilen selülaz, β-glukozidaz ve Cellic® HTec2'nin (157 mg protein/ml, parti VHN00001) kompleks bir karışımıdır. Pektin parçalayıcı enzimlerin kompleks bir karışımı olan Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABD) tarafından bağışlanmıştır. Enzim protein konsantrasyonları, Kjeldahl azot analizi (AOAC yöntemi 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABD) kullanılarak protein içeriğinin tahmin edilmesi (ve protein olmayan azotun katkısının çıkarılması) yoluyla belirlenmiştir. Diatomlu toprak 545, EMD Millipore'dan (Billerica, MA) satın alınmıştır. Aktif karbon (DARCO, 100 mesh granül), Avicel (PH-101), kayın ksilanı ve diğer tüm kimyasallar Sigma-Aldrich'ten (St. Louis, MO) satın alındı.
AFEX ön işlemi, GLBRC'de (Biyokütle Dönüşüm Araştırma Laboratuvarı, MSU, Lansing, MI, ABD) gerçekleştirildi. Ön işlem, 140°C'de 15 dakika süreyle, susuz amonyağın biyokütleye oranı 1:1 olacak şekilde ve %60 (a/a) yükleme ile paslanmaz çelik tezgah üstü toplu reaktörde (Parr Instruments Company) 46 dakika süreyle gerçekleştirildi. Bu işlem 30 dakika sürdü. Reaktör 140°C'ye getirildi ve amonyak hızla salınarak biyokütlenin hızla oda sıcaklığına dönmesi sağlandı. AFEX ön işlemine tabi tutulmuş mısır sapının (ACS) bileşimi, işlem görmemiş mısır sapının (UT-CS) bileşimine benzerdi.
Oligosakkaritlerin büyük ölçekli üretimi için başlangıç ​​maddesi olarak %25 (a/a) yüksek katı içerikli ACSH (yaklaşık %8 dekstran yüklemesi) hazırlandı. ACSH'nin enzimatik hidrolizi, Cellic® Ctec2 (10 mg protein/g glukan (ön işlem görmüş biyokütlede)), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan ve Multifect Pectinase (Genencor Inc, ABD) içeren ticari bir enzim karışımı kullanılarak gerçekleştirildi. Enzimatik hidroliz, 3 litre çalışma hacmine sahip, pH 4,8, 50°C ve 250 rpm'de çalışan 5 litrelik bir biyoreaktörde yapıldı. 96 saatlik hidrolizden sonra, hidrolizat, hidrolize olmamış katıları uzaklaştırmak için 30 dakika boyunca 6000 rpm'de ve ardından 30 dakika boyunca 14000 rpm'de santrifüj edilerek toplandı. Hidrolizat daha sonra 0,22 mm'lik bir filtre kabından steril filtrasyona tabi tutuldu. Filtrelenmiş hidrolizat steril şişelerde 4°C'de saklandı ve ardından karbon üzerinde fraksiyonlandı.
NREL laboratuvar analiz prosedürlerine göre ekstrakt bazlı biyokütle örneklerinin bileşiminin analizi: bileşim analizi için örneklerin hazırlanması (NREL/TP-510-42620) ve biyokütlede yapısal karbonhidratların ve ligninlerin belirlenmesi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizat akışının oligosakkarit analizi, otoklav bazlı asit hidroliz yöntemi kullanılarak 2 ml ölçekte gerçekleştirildi. Hidrolizat örneği, 10 ml'lik vidalı kapaklı bir kültür tüpünde 69,7 µl %72'lik sülfürik asit ile karıştırıldı ve tezgah üzerinde 121 °C'de 1 saat inkübe edildi, buz üzerinde soğutuldu ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şişesine süzüldü. Oligosakkarit konsantrasyonu, hidrolize edilmemiş örnekteki monosakkarit konsantrasyonunun, asit hidrolize edilmiş örnekteki toplam şeker konsantrasyonundan çıkarılmasıyla belirlendi.
Asit hidrolizli biyokütledeki glikoz, ksiloz ve arabinoz konsantrasyonları, otomatik örnekleyici, kolon ısıtıcısı, izokratik pompa ve kırılma indisi dedektörü ile donatılmış bir Shimadzu HPLC sistemi kullanılarak Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonunda analiz edildi. Kolon 50°C'de tutuldu ve 0,6 ml/dakika akış hızında 5 mM H2SO4 içeren su ile elüsyon gerçekleştirildi.
Hidrolizat süpernatantı seyreltildi ve monomer ve oligosakkarit içeriği açısından analiz edildi. Enzimatik hidrolizden sonra elde edilen monomerik şekerler, Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonu ve kül koruma kolonu ile donatılmış bir HPLC ile analiz edildi. Kolon sıcaklığı 80°C'de sabit tutuldu, hareketli faz olarak su kullanıldı ve akış hızı 0,6 ml/dk idi. Oligosakkaritler, 41, 48, 49 numaralı referanslarda açıklanan yöntemlere göre 121°C'de seyreltik asitte hidroliz yoluyla belirlendi.
Daha önce açıklanan prosedürler 27, 43, 50, 51 kullanılarak ham, AFEX ön işlemine tabi tutulmuş ve hidrolize edilmemiş tüm biyokütle kalıntıları (seri hücre duvarı özütlerinin üretimi ve mAb taraması dahil) üzerinde sakkarit analizi yapıldı. Glikom analizi için, bitki hücre duvarı materyalinin alkolde çözünmeyen kalıntıları biyokütle kalıntılarından hazırlandı ve daha önce açıklandığı gibi amonyum oksalat (50 mM), sodyum karbonat (50 mM ve %0,5 a/h), CON (1M ve 4M, her ikisi de %1 a/h sodyum borhidrit ile) ve asit klorit gibi giderek daha agresif reaktiflerle seri ekstraksiyona tabi tutuldu52,53. Özütler daha sonra hücre duvarı glikanına yönlendirilmiş bir mAb50'ler kompleksi paneline karşı ELISA'ya tabi tutuldu ve mAb bağlanma reaksiyonları bir ısı haritası olarak sunuldu. Bitki hücre duvarı glikanını hedefleyen mAb'ler laboratuvar stoklarından (CCRC, JIM ve MAC serisi) satın alındı.
Oligosakkaritlerin tek aşamalı biyotinilasyonu. Karbonhidratların biyotin-LC-hidrazit ile konjugasyonu aşağıdaki prosedür kullanılarak gerçekleştirildi. Biyotin-LC-hidrazit (4,6 mg/12 μmol), dimetil sülfoksit (DMSO, 70 μl) içinde kuvvetli karıştırma ve 65°C'de 1 dakika ısıtma ile çözüldü. Buzlu asetik asit (30 µl) eklendi ve karışım sodyum siyanoborohidrit (6,4 mg/100 µmol) üzerine döküldü ve 65°C'de yaklaşık 1 dakika ısıtıldıktan sonra tamamen çözüldü. Daha sonra, reaksiyon karışımından 5 ila 8 μl, kurutulmuş oligosakkarite (1-100 nmol) eklenerek indirgeyici uca göre 10 kat veya daha fazla molar fazlalıkta etiket elde edildi. Reaksiyon 65°C'de 2 saat süreyle gerçekleştirildi, ardından numuneler hemen saflaştırıldı. İndirgeme yapılmayan etiketleme deneylerinde sodyum siyanoborohidrit kullanılmamış ve numuneler 65°C'de 2,5 saat süreyle reaksiyona sokulmuştur.
Biotinlenmiş oligosakkarit örneklerinin ELISA kaplaması ve yıkanması. Avidin kaplı plakanın her bir kuyucuğuna 25 μl biotinlenmiş örnek (her bir konsantre örneğin 100 μl'si 5 ml 0,1 M Tris tampon çözeltisinde (TBS) seyreltilmiş) eklendi. Kontrol kuyucukları, 0,1 M TBS içinde 10 μg/ml konsantrasyonunda 50 μl biotin ile kaplandı. Boş ölçümler için kaplama olarak deiyonize su kullanıldı. Tablet, oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat inkübe edildi. Plaka, Grenier düz 3A için 11 numaralı program kullanılarak 0,1 M TBS içinde %0,1 yağsız süt ile 3 kez yıkandı.
Primer antikorların eklenmesi ve yıkanması. Her bir kuyuya 40 µl primer antikor ekleyin. Mikroplakayı oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin. Daha sonra plakalar, Grenier Flat 3A için 11 numaralı yıkama programı kullanılarak 0,1 M TBS içinde %0,1 süt ile 3 kez yıkandı.
İkincil antikor ekleyin ve yıkayın. Her bir kuyuya 50 µl fare/sıçan ikincil antikoru (0,1 M TBS içinde %0,1 süt ile 1:5000 oranında seyreltilmiş) ekleyin. Mikroplakayı oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat inkübe edin. Daha sonra mikroplaklar, Grenier Flat 5A plaka yıkama programı #12 kullanılarak 0,1 M TBS içinde %0,1 süt ile 5 kez yıkandı.
Substrat ekleme. Baz substrata (15 ml deiyonize suya 2 damla tampon, 3 damla TMB, 2 damla hidrojen peroksit ekleyerek) 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) ekleyin. TMB substratını hazırlayın ve kullanmadan önce vorteksleyin. Mikroplakayı oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta inkübe edin.
Adımı tamamlayın ve tableti okuyun. Her bir kuyuya 50 µl 1 N sülfürik asit ekleyin ve ELISA okuyucu kullanarak 450 ila 655 nm aralığında absorbansı kaydedin.
Bu analitlerin 1 mg/ml'lik çözeltilerini deiyonize suda hazırlayın: arabinoz, ramnoz, fukoz, ksiloz, galakturonik asit (GalA), glukuronik asit (GlcA), mannoz, glikoz, galaktoz, laktoz, N-asetilmannozamin (manNAc), N-asetilglukozamin (glcNAc), N-asetilgalaktozamin (galNAc), inositol (dahili standart). Tablo 1'de gösterilen 1 mg/ml'lik şeker çözeltileri eklenerek iki standart hazırlandı. Numuneler dondurulur ve tüm su uzaklaştırılana kadar (genellikle yaklaşık 12-18 saat) -80°C'de liyofilize edilir.
Analitik terazi üzerinde vidalı kapaklı tüplere 100–500 µg numune ekleyin. Eklenen miktarı kaydedin. Numuneyi belirli bir konsantrasyonda çözücüde çözüp tüpe sıvı halde eklemek en iyisidir. Her numune tüpü için 20 µl 1 mg/ml inositol iç standart olarak kullanın. Numuneye eklenen iç standart miktarı, standart tüpe eklenen iç standart miktarıyla aynı olmalıdır.
Vidalı kapaklı bir şişeye 8 ml susuz metanol ekleyin. Ardından 4 ml 3 N metanolik HCl çözeltisi ekleyin, kapağını kapatın ve çalkalayın. Bu işlemde su kullanılmaz.
Oligosakkarit örneklerine ve standart TMS tüplerine 500 µl 1 M HCl metanol çözeltisi ekleyin. Örnekler, termal blokta 80°C'de gece boyunca (168 saat) inkübe edildi. Metanoliz ürünü, kurutma manifoldu kullanılarak oda sıcaklığında kurutuldu. 200 µl metanol ekleyin ve tekrar kurutun. Bu işlem iki kez tekrarlandı. Örneğe 200 µl metanol, 100 µl piridin ve 100 µl asetik anhidrit ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekler oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi ve kurutuldu. 200 µl metanol ekleyin ve tekrar kurutun.
200 µl Tri-Sil ekleyin ve tüpü 20 dakika boyunca 80°C'de ısıtın, ardından oda sıcaklığına soğutun. Numuneyi yaklaşık 50 µl hacme kadar kurutmak için bir kurutma düzeneği kullanın. Numunelerin tamamen kurumasına izin vermediğimizi belirtmek önemlidir.
2 ml hekzan ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın. 5-3/4 inç çapındaki bir pipetin ucuna cam yünü yerleştirerek Pasteur pipetlerinin (5-8 mm) uçlarını cam yünü ile doldurun. Numuneler 2 dakika boyunca 3000 g'de santrifüjlendi. Çözünmeyen kalıntılar çöktürüldü. Numuneyi 100-150 µl'ye kadar kurutun. Yaklaşık 1 µl hacmindeki numune, 80 °C başlangıç ​​sıcaklığında ve 2,0 dakika başlangıç ​​süresinde GC-MS'ye enjekte edildi (Tablo 2).