Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta CSS ag an leagan brabhsálaí atá in úsáid agat.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, cuirfimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Modhanna imdhíoneolaíocha agus mais-speictriméadracha nua chun anailís chasta a dhéanamh ar olagaishiúicrídí marthanacha i sornán arbhair réamhchóireáilte le AFEX.Is rogha inbhuanaithe é bithmhais lignocellulosic ar bhreoslaí iontaise agus úsáidtear go forleathan é chun biteicneolaíochtaí a fhorbairt le haghaidh táirgeadh táirgí cosúil le bia, beatha, breoslaí agus ceimiceáin.Is í an eochair do na teicneolaíochtaí seo ná próisis atá iomaíoch ó thaobh costais a fhorbairt chun carbaihiodráití casta atá i mballaí cille plandaí a thiontú go siúcraí simplí amhail glúcós, xilós agus araibinóis.Toisc go bhfuil bithmhais lignocellulosic an-stubborn, ní mór é a chur faoi chóireáil teirmeimiceach (m.sh., exfoliation snáithíní amóinia (AFEX), aigéid caolaithe (DA), leachtanna ianach (IL)) agus cóireálacha bitheolaíocha (m.sh., hidrealú einsímeach agus coipeadh miocróbach) i dteannta a chéile chun an táirge atá ag teastáil a fháil..Mar sin féin, nuair a úsáidtear einsímí fungacha tráchtála sa phróiseas hidrealú, níl ach 75-85% de na siúcraí intuaslagtha a fhoirmítear ina monaisiúicrídí, agus tá an 15-25% eile ina n-oligosaccharides intuaslagtha, intractable, nach bhfuil ar fáil i gcónaí do mhiocrorgánaigh.Roimhe seo, d'éirigh linn olagaishiúicrídí stubborn intuaslagtha a leithlisiú agus a íonú trí úsáid a bhaint as meascán de scaradh carbóin agus cré diatomaceous agus crómatagrafaíocht eisiamh méide, agus rinneamar imscrúdú freisin ar a n-airíonna coisctheacha einsímeacha.Fuaireamar amach go bhfuil sé níos deacra olagaishiúicrídí ina bhfuil leibhéal níos airde de pholaiméiriú (DP) d'ionadaigh aigéad urónach meitile a phróiseáil le cumaisc einsímí tráchtála ná olagaishiúicrídí DP íseal agus neodracha.Tuairiscímid anseo úsáid a bhaint as roinnt modhanna breise, lena n-áirítear próifíliú glycan ag baint úsáide as antasubstaintí monaclónacha (mAbs) a bhaineann go sonrach le gliocáin bithmhaise plandaí chun bannaí glycan a shainiú i mballaí cealla plandaí agus hidrealáití einsímeacha, ianú dí-asú léasair le cúnamh maitrís, mais-speictriméadracht am eitilte..Úsáideann MALDI-TOF-MS) beanna diagnóiseacha struchtúr-fhaisnéiseacha a fhaightear trí speictreascópacht tar éis meath tánaisteach ar iain dhiúltacha, crómatagrafaíocht gháis agus mais-speictriméadracht (GC-MS) chun bannaí oligosaccharide a thréithriú le agus gan díorthú.Mar gheall ar mhéid beag na n-oligosaccharides (DP 4-20), tá na móilíní seo deacair a úsáid le haghaidh ceangail agus tréithriú mAb.Chun an fhadhb seo a shárú, chuireamar modh díluailithe oligosaccharide bunaithe ar chomhchuingeach biotin i bhfeidhm a rinne an lipéadú go rathúil ar fhormhór na n-oligosaccharides intuaslagtha DP íseal ar an dromchla micreaphláta, a úsáideadh ansin i gcóras mAb tréchur ard le haghaidh anailíse ligation ar leith.Éascóidh an modh nua seo forbairt ar thástálacha tréchur ard níos airde sa todhchaí ar féidir iad a úsáid chun olagaishiúicrídí atá i láthair i mbithmharcóirí a leithlisiú agus a thréithriú chun críocha diagnóiseacha.
Tá bithmhais lignocellulosic, comhdhéanta d’ábhair thalmhaíochta, fhoraoiseachta, fhéir agus adhmaid, ina stoc cothaithe féideartha chun táirgí bithbhunaithe a tháirgeadh, lena n-áirítear bia, beatha, breosla agus réamhtheachtaithe ceimiceacha chun táirgí ar luach níos airde a tháirgeadh1.Déantar carbaihiodráití (cosúil le ceallalóis agus hemicellulós) atá i mballaí cille plandaí a dhípholaiméiriú isteach i monaisiúicrídí trí phróiseáil cheimiceach agus bith-chlaochlú (cosúil le hidrealú einsímeach agus coipeadh miocróbach).I measc na réamhchóireálacha coitianta tá leathnú snáithíní amóinia (AFEX), aigéad caol (DA), leacht ianach (IL), agus pléascadh gaile (SE), a úsáideann meascán de cheimiceáin agus teasa chun táirgeadh lignocellulose a laghdú trí bhallaí cille plandaí a oscailt3,4.stubbornness an ábhair, 5. Déantar hidrealú einsímeach ar ualach ard solaid ag baint úsáide as einsímí gníomhacha tráchtála a bhfuil carbaihiodráití iontu (CAZymes) agus coipeadh miocróbach ag baint úsáide as giostaí trasgenacha nó baictéir chun breoslaí agus ceimiceáin bithbhunaithe a tháirgeadh 6 .
Tá carbaihiodráití in einsímí tráchtála comhdhéanta de mheascán casta d’einsímí a scoilteann naisc chasta siúcra-carbaihiodráit go sineirgistíoch chun monaisiúicrídí a fhoirmiú2,7.Mar a thuairiscigh muid níos luaithe, déanann an líonra casta de pholaiméirí aramatacha lignin le carbaihiodráití iad an-dochar, rud a fhágann go bhfuil tiontú siúcra neamhiomlán, carnadh 15-25% de olagaishiúicrídí gnéis nach dtáirgtear le linn hidrealú einsímeach ar an bhithmhais réamhchóireáilte.Is fadhb choitianta é seo le modhanna éagsúla réamhchóireála bithmhaise.Áirítear ar roinnt cúiseanna leis an bac seo cosc ​​​​einsímí le linn hidrealú, nó easpa nó leibhéil ísle einsímí riachtanacha riachtanacha a theastaíonn chun bannaí siúcra a bhriseadh i mbithmhais plandaí.Cabhróidh tuiscint ar chomhdhéanamh agus ar shaintréithe struchtúracha siúcraí, mar na bannaí siúcra in olagaishiúicrídí, linn comhshó siúcra a fheabhsú le linn hidrealú, rud a fhágann go mbeidh próisis bhiteicneolaíocha iomaíoch ó thaobh costais de le táirgí díorthaithe peitriliam.
Tá sé dúshlánach struchtúr carbaihiodráití a chinneadh agus teastaíonn meascán de mhodhanna amhail crómatagrafaíocht leachta (LC)11,12, speictreascópacht athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR)13, leictreafóiréis ribeach (CE)14,15,16 agus mais-speictriméadracht (MS)17.,ocht déag.Is modh ilúsáideach iad modhanna MS cosúil le mais-speictriméadracht ama eitilte le dí-asú léasair agus ianú ag baint úsáide as maitrís (MALDI-TOF-MS) chun struchtúir carbaihiodráití a shainaithint.Le déanaí, baineadh úsáid is forleithne as Dissociation Induced-Induced (CID) MS de adducts ian sóidiam chun méarloirg a aithint a fhreagraíonn do shuíomhanna ceangaltáin oligosaccharide, cumraíochtaí ainiméireacha, seichimh, agus suíomhanna brainseach 20, 21 .
Uirlis iontach is ea anailís glycan chun bannaí carbaihiodráití a shainaithint go domhain22.Úsáideann an modh seo antasubstaintí monaclónacha (mAbs) a ordaítear chun gliocán balla cille a phlandáil mar thaiscéalaithe chun naisc chasta carbaihiodráití a thuiscint.Tá níos mó ná 250 mAbs ar fáil ar fud an domhain, deartha in aghaidh olagaishiúicrídí líneacha agus brainseach éagsúla ag baint úsáide as sacairídí éagsúla24.Baineadh úsáid go forleathan as roinnt mABs chun struchtúr, comhdhéanamh agus modhnuithe an bhalla cille plandaí a shaintréithe, toisc go bhfuil difríochtaí suntasacha ann ag brath ar chineál cille plandaí, orgán, aois, céim forbartha, agus timpeallacht fáis25,26.Le déanaí, baineadh úsáid as an modh seo chun tuiscint a fháil ar dhaonraí vesicle i gcórais plandaí agus ainmhithe agus a róil faoi seach in iompar glycan mar a chinntear ag marcóirí fo-cheallacha, céimeanna forbartha, nó spreagthaigh comhshaoil, agus chun gníomhaíocht einsímeach a chinneadh.I measc cuid de na struchtúir éagsúla glycans agus xylans a aithníodh tá peictin (P), xylan (X), mannán (M), xyloglucans (XylG), glúcáin banna measctha (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), aigéad glucuronic-arabinoxylan (GArbino-Gactan) agus arabino.
Mar sin féin, in ainneoin na n-iarrachtaí taighde seo go léir, níor dhírigh ach cúpla staidéar ar nádúr carnadh oligosaccharide le linn hidrealú ualach ard solaid (HSL), lena n-áirítear scaoileadh oligosaccharide, athruithe fad slabhra oligomeric le linn hidrealú, polaiméirí DP íseal éagsúla, agus a gcuar.dáiltí 30,31,32.Idir an dá linn, cé go bhfuil anailís glycan cruthaithe ina uirlis úsáideach le haghaidh anailís chuimsitheach ar struchtúr glycan, tá sé deacair olagaishiúicrídí DP íseal intuaslagtha in uisce a mheas ag baint úsáide as modhanna antasubstainte.Ní cheanglaíonn olagaishiúicrídí DP níos lú a bhfuil meáchan móilíneach níos lú ná 5-10 kDa acu le plátaí ELISA 33, 34 agus nitear iad sula gcuirtear antashubstaint leo.
Anseo, den chéad uair, léirímid measúnacht ELISA ar phlátaí atá brataithe le haifidín ag baint úsáide as antasubstaintí monaclónacha, ag comhcheangal nós imeachta bithtinylation aon-chéim le haghaidh olagaishiúicrídí teasfhulangacha intuaslagtha le hanailís glycome.Rinneadh ár gcur chuige maidir le hanailís glycome a bhailíochtú trí anailís bunaithe ar MALDI-TOF-MS agus GC-MS ar naisc chomhlántacha oligosaccharide ag baint úsáide as díorthú trimethylsilyl (TMS) ar chomhdhéanaimh siúcra hidrealaithe.Is féidir an cur chuige nuálaíoch seo a fhorbairt mar mhodh ard-thréchuir amach anseo agus é a chur i bhfeidhm níos leithne i dtaighde bithleighis35.
Bíonn tionchar ag modhnuithe iar-aistrithe ar einsímí agus ar antasubstaintí, amhail glycosylation,36 ar a ngníomhaíocht bhitheolaíoch.Mar shampla, tá ról tábhachtach ag athruithe ar ghliceasú próitéiní séiream san airtríteas athlastach, agus úsáidtear athruithe ar ghliceasúlú mar mharcóirí diagnóiseacha37.Tá sé tuairiscithe sa litríocht go bhfuil gliocáin éagsúla le feiceáil go héasca i galair éagsúla, lena n-áirítear galair athlastacha ainsealacha an chonair gastrointestinal agus an ae, ionfhabhtuithe víreasacha, ailsí ovártha, chíche agus próstatach38,39,40.Le tuiscint a fháil ar struchtúr glycáin ag baint úsáide as modhanna ELISA glycan-bhunaithe antasubstainte, cuirfear muinín bhreise ar fáil i ndiagnóis galair gan úsáid a bhaint as modhanna casta MS.
Léirigh ár staidéar roimhe seo gur fhan olagaishiúicrídí stubborn unhydrolyzed tar éis réamhchóireáil agus hidrealú einsímeach (Fíor 1).Inár gcuid oibre a foilsíodh roimhe seo, d’fhorbraíomar modh eastósctha céim-sholaid gualaigh gníomhachtaithe chun olagaishiúicrídí a leithlisiú ó hidrealisáit sornáin arbhair réamhchóireáilte AFEX (ACSH)8.Tar éis eastóscadh agus scaradh tosaigh, rinneadh na oligosaccharides a chodánú tuilleadh de réir crómatagrafaíocht eisiata méide (SEC) agus bailíodh iad in ord meáchain mhóilíneach.Rinne anailís ar chomhdhéanamh siúcra monaiméirí siúcra agus olagaiméirí a scaoileadh ó réamhchóireáil éagsúla.Nuair a dhéantar comparáid idir cion na n-olaigiméirí siúcra a fhaightear trí mhodhanna réamhchóireála éagsúla, is fadhb choitianta é láithreacht olagaishiúicrídí stubborn maidir le bithmhais a thiontú go monaisiúicrídí agus is féidir go dtiocfadh laghdú 10-15% ar a laghad ar an táirgeacht siúcra agus fiú suas le 18%.U.S.Úsáidtear an modh seo chun codáin oligosaccharide a tháirgeadh ar scála mór.Baineadh úsáid as an ACH mar thoradh air agus a chodáin ina dhiaidh sin le meáchain mhóilíneacha éagsúla mar ábhar turgnamhach chun olagaishiúicrídí a thréithriú sa saothar seo.
Tar éis réamhchóireáil agus hidrealú einsímeach, d'fhan olagaishiúicrídí marthanacha neamhhidrealaithe.Anseo (A) tá modh deighilte oligosaccharide ina ndéantar olagaishiúicrídí a leithlisiú ó hidrolysáit sornáin arbhair réamhchóireáilte AFEX (ACSH) ag baint úsáide as leaba pacáilte de charbón gníomhachtaithe agus cré diatómach;(B) Modh chun olagaishiúicrídí a dheighilt.Rinneadh na oligosaccharides a dheighilt tuilleadh le crómatagrafaíocht eisiata méide (SEC);(C) monaiméirí saccharide agus olagaiméirí a scaoiltear ó réamhchóireáil éagsúla (aigéad caolaithe: DA, leacht ianach: IL agus AFEX).Coinníollacha hidrealú einsímeacha: luchtú arda solaid de 25% (w/w) (thart ar 8% luchtú glúcáin), hidrealú 96 uair an chloig, lódáil einsímí tráchtála 20 mg/g (cóimheas Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) agus (D) Monaiméirí siúcra agus oligiméirí glúcóis, xylose-sorbóin a scaoiltear ó shorn réamhchóireáilte xylose agus araexAC (araexacin arna scaoileadh).
Tá sé cruthaithe gur uirlis úsáideach í anailís Glycan chun anailís chuimsitheach struchtúrach a dhéanamh ar ghlocáin i eastóscáin atá scoite amach ó iarmhair soladacha bithmhaise.Mar sin féin, tá tearcionadaíocht á déanamh ar shiúicrídí intuaslagtha in uisce ag baint úsáide as an modh traidisiúnta seo41 toisc go bhfuil sé deacair olagaishiúicrídí ar mheáchan móilíneach íseal a dhíluailithe ar phlátaí ELISA agus go nitear amach iad sula gcuirtear antasubstaintí leo.Dá bhrí sin, le haghaidh ceangailteach agus tréithriú antasubstainte, baineadh úsáid as modh bithtinylation aon-chéim chun olagaishiúicrídí intuaslagtha, neamhchomhlíontacha a chóta ar phlátaí ELISA atá brataithe le avidin.Rinneadh tástáil ar an modh seo ag baint úsáide as ár ACSH a tháirgtear roimhe seo agus codán bunaithe ar a meáchan móilíneach (nó méid polaiméirithe, DP).Baineadh úsáid as biotinylation aon-chéim chun cleamhnas ceangailteach oligosaccharide a mhéadú trí biotin-LC-hydrazide a chur le deireadh laghdaithe an charbaihiodráit (Fíor 2).I dtuaslagán, imoibríonn an grúpa hemiacetal ag an deireadh laghdaitheach leis an ngrúpa hidrazide de biotin-LC-hydrazide chun banna hidrazone a fhoirmiú.I láthair an ghníomhaire laghdaithe NaCNBH3, laghdaítear an banna hidrazone go dtí táirge deiridh biotinylated cobhsaí.Le modhnú an deireadh laghdaithe siúcra, bhí sé indéanta olagaishiúicrídí DP íseal a cheangal le plátaí ELISA, agus inár staidéar rinneadh é seo ar phlátaí brataithe avidin ag baint úsáide as mAbs spriocdhírithe glycan.
Scagadh antasubstaintí monaclónacha bunaithe ar ELISA le haghaidh olagaishiúicrídí biotinylated.Anseo (A) biotinylation comhcheangailte olagaishiúicrídí agus scagadh ELISA ina dhiaidh sin le glycan-spriocdhírithe mAbs ar phlátaí brataithe NeutrAvidin agus (B) taispeánann sé nós imeachta aon-chéim le haghaidh biotinylation táirgí imoibriúcháin.
Ansin cuireadh plátaí brataithe avidin le antasubstaintí comhchuingeacha oligosaccharide le hantasubstaintí príomhúla agus tánaisteacha agus nite i meán éadrom agus íogair ó thaobh ama de.Tar éis an ceangal antashubstainte a bheith críochnaithe, cuir an tsubstráit TMB leis chun an pláta a ghoradh.Stopadh an t-imoibriú le haigéad sulfarach ar deireadh.Rinneadh anailís ar na plátaí gortha ag baint úsáide as léitheoir ELISA chun neart ceangailteach gach antashubstainte a chinneadh chun trasnascadh sainiúil antashubstainte a bhrath.Le haghaidh sonraí agus paraiméadair an turgnaimh, féach an rannán comhfhreagrach “Ábhair agus Modhanna”.
Léirímid áisiúlacht an mhodha nuafhorbartha seo d’fheidhmchláir shonracha trí shaintréithe a thabhairt do na holaigosiúicrídí intuaslagtha atá i láthair in ACSH agus i gcodáin olagaishiúicríde amh agus íonaithe atá scoite ó hidrealáití lignocellulosic.Mar a léirítear i bhFíor 3, is gnách gurb iad na xylans ionad epitope is coitianta a aithníodh in ACSH ag baint úsáide as modhanna measúnachta glycome bith-acylated ná urónacha (U) nó meitileurónach (MeU) agus arabinogalactans peicteacha.Fuarthas an chuid is mó díobh freisin inár staidéar roimhe seo ar an anailís ar gliocáin de sholaid neamh-hidrealaithe (UHS)43.
Braith epitopes olagaishiúicríd athchomhairlithe ag baint úsáide as antashubstaint mhonaclónach a dhírítear chuig glycan an bhalla cille.Is é an codán “neodrach” an codán ACN agus is é an codán “aigéadach” an codán FA.Léiríonn dearganna níos gile ar an léarscáil teasa go bhfuil níos mó airde epitope ann, agus léiríonn gormacha níos gile cúlra bán.Tá luachanna datha ar an scála bunaithe ar luachanna OD amh le haghaidh foirmlithe N=2.Taispeántar na príomh-eipitíopaí a aithníonn na antasubstaintí ar dheis.
Níorbh fhéidir na ceallalóis agus na hemicelluláis is coitianta sa mheascán einsímí tráchtála a tástáladh, lena n-áirítear na heinsímí tráchtála is coitianta a úsáid, a scoilteadh leis na struchtúir neamh-cheallalóis seo.Dá bhrí sin, tá gá le heinsímí cúnta nua lena hidrealú.Gan na heinsímí cúlpháirtí neamh-cheallalóis riachtanacha, cuireann na bannaí neamh-cheallalóis seo cosc ​​ar chomhshó iomlán go monaisiúicrídí, fiú má dhéantar a gcuid polaiméirí siúcra tuismitheora a hidrealú go forleathan i blúirí níos giorra agus a thuaslagadh ag baint úsáide as meascáin einsímí tráchtála.
Léirigh tuilleadh staidéir ar dháileadh comhartha agus a neart ceangailteach go raibh epitopes ceangailteach níos ísle i gcodáin siúcra ard DP (A, B, C, DP suas go dtí 20 +) ná i gcodáin DP íseal (D, E, F, DP) i dimers) (Fíor 1).Tá blúirí aigéadacha níos coitianta i epitopes neamh-cheallalóis ná blúirí neodracha.Tá na feiniméin seo comhsheasmhach leis an bpatrún a breathnaíodh inár staidéar roimhe seo, áit a raibh leibhéil arda DP agus aigéid níos resistant do hidrealú einsímeach.Dá bhrí sin, is féidir le láithreacht epitopes glycan neamh-cheallan agus ionaid U agus MeU cur go mór le cobhsaíocht na n-oligosaccharides.Ba chóir a thabhairt faoi deara gur féidir le héifeachtúlacht cheangailteach agus braite a bheith ina fhadhb d'oligosaccharides DP íseal, go háirithe má tá an epitope ina oligosaccharide dimeric nó trimeric.Is féidir é seo a thástáil trí úsáid a bhaint as olagaishiúicrídí tráchtála de fhaid éagsúla, gach ceann acu nach bhfuil ach epitope amháin a cheanglaíonn le mAb ar leith.
Mar sin, léirigh úsáid antasubstaintí a bhaineann go sonrach le struchtúir cineálacha áirithe bannaí athréimseach.Ag brath ar an gcineál antasubstainte a úsáidtear, an patrún ligation cuí, agus neart an chomhartha a tháirgeann sé (is mó agus is lú flúirseach), is féidir einsímí nua a aithint agus a chur leis an meascán einsím go leathchainníochtúil le haghaidh glycoconversion níos iomláine.Agus an anailís ar olagaishiúicrídí ACSH mar shampla, is féidir linn bunachar sonraí de bhannaí glycan a chruthú do gach ábhar bithmhaise.Ba chóir a thabhairt faoi deara anseo gur chóir cleamhnas éagsúla antasubstaintí a chur san áireamh, agus mura bhfuil a gcleamhnas anaithnid, cruthóidh sé seo deacrachtaí áirithe nuair a dhéantar comparáid idir comharthaí antasubstaintí éagsúla.Ina theannta sin, d’fhéadfadh go n-oibreodh comparáid idir bannaí glycan is fearr idir samplaí don antashubstaint chéanna.Is féidir na bannaí stubborn sin a nascadh ansin le bunachar sonraí CAZyme, ónar féidir linn einsímí a aithint, einsímí iarrthacha a roghnú agus tástáil le haghaidh einsímí briseadh bannaí, nó córais mhiocróbacha a fhorbairt chun na heinsímí seo a chur in iúl le húsáid i mbithscaglainne44.
Chun meastóireacht a dhéanamh ar an gcaoi a gcomhlánaíonn modhanna imdhíoneolaíocha modhanna malartacha chun olagaishiúicrídí meáchan móilíneach íseal a thréithriú i hidrealasáití lignocellulosic, rinneamar MALDI (Fíor 4, S1-S8) agus anailís ar sacairídí TMS-díorthaithe bunaithe ar GC-MS ar an bpainéal céanna (Fíor 5) cuid oligosaccharide.Úsáidtear MALDI chun comparáid a dhéanamh an bhfuil dáileadh mais na móilíní oligosaccharide ag teacht leis an struchtúr atá beartaithe.Ar fig.Taispeánann 4 MC na gcomhpháirteanna neodracha ACN-A agus ACN-B.Dhearbhaigh anailís ACN-A raon de shiúcraí pentose ó DP 4-8 (Fíor 4) go DP 22 ( Fíor. S1 ), a gcomhfhreagraíonn a gcuid meáchain d'oligosaccharides MeU-xylan.Dhearbhaigh anailís ACN-B an tsraith pentose agus glucoxylan le DP 8-15.In ábhar forlíontach ar nós Fíor S3, taispeánann léarscáileanna dáilte mais aigéadach taise aigéadach FA-C raon de shiúcraí peinteóis ionadacha (Me)U le DP de 8-15 atá comhsheasmhach leis na xylananna ionadacha a aimsítear i scagadh mAb bunaithe ar ELISA.Tá na epitopes comhsheasmhach.
Speictream MALDI-MS de olagaishiúicrídí neamhchomhlíonta intuaslagtha atá i láthair in ACS.Anseo, tá (A) codáin raon meáchain íseal ACN-A ina bhfuil aigéad urónach meitile (DP 4-8) ionadach oligosaccharides glucuroxylan agus (B) xylan ACN-B agus olagaishiúicrídí aigéad urónach meitile curtha in ionad le glucuroxylan (DP 8-15).
Anailís ar chomhdhéanamh an iarmhair glycan de olagaishiúicrídí teasfhulangacha.Anseo (A) comhdhéanamh saccharide TMS de chodáin oligosaccharide éagsúla a fuarthas ag baint úsáide as anailís GC-MS.(B) Struchtúir na siúcraí éagsúla a dhíorthaítear ó TMS atá i láthair in olagaishiúicrídí.ACN – codán aicéataitrile ina bhfuil olagaishiúicrídí neodracha agus FA – codán d’aigéad feiriúil ina bhfuil olagaishiúicrídí aigéid.
Baineadh conclúid suimiúil eile as an anailís LC-MS ar an gcodán oligosaccharide, mar a thaispeántar i bhFíor S9 (is féidir modhanna a fheiceáil san ábhar forlíontach leictreonach).Breathnaíodh blúirí de ghrúpaí heicsóis agus -OAc arís agus arís eile le linn ligation an codán ACN-B.Deimhníonn an toradh seo ní hamháin an ilroinnt a breathnaíodh in anailís glycome agus MALDI-TOF, ach cuireann sé faisnéis nua ar fáil freisin faoi dhíorthaigh ionchasacha carbaihiodráití i mbithmhais lignocellulosic réamhchóireáilte.
Rinneamar anailís freisin ar chomhdhéanamh siúcra an chodáin oligosaccharide ag baint úsáide as díorthú siúcra TMS.Ag baint úsáide as GC-MS, chinneamar comhdhéanamh siúcraí néaracha (neamhdhíorthaigh) agus aigéadacha (GluA agus GalA) sa chodán oligosaccharide (Fíor 5).Tá aigéad glucuronic le fáil i gcomhpháirteanna aigéadacha C agus D, agus tá aigéad galacturonic le fáil i gcomhpháirteanna aigéadacha A agus B, agus is comhpháirteanna DP ard de shiúcraí aigéadacha iad araon.Deimhníonn na torthaí seo ní hamháin ár sonraí ELISA agus MALDI, ach tá siad comhsheasmhach freisin lenár staidéir roimhe seo ar charnadh oligosaccharide.Dá bhrí sin, creidimid gur leor modhanna imdhíoneolaíocha nua-aimseartha a úsáideann biotinylation of oligosaccharides agus scagadh ELISA ina dhiaidh sin chun olagaishiúicrídí intuaslagtha intuaslagtha a bhrath i samplaí bitheolaíocha éagsúla.
Ós rud é go bhfuil modhanna scagthástála mAb bunaithe ar ELISA bailíochtaithe trí mhodhanna éagsúla, bhíomar ag iarraidh iniúchadh breise a dhéanamh ar acmhainneacht an mhodha chainníochtúil nua seo.Ceannaíodh agus tástáladh dhá olagaishiúicrídí tráchtála, oligosaccharide xylohexasaccharide (XHE) agus 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ag baint úsáide as cur chuige nua mAb a dhírigh ar ghliocán an bhalla cille.Taispeánann Figiúr 6 comhghaol líneach idir an comhartha ceangailteach biotinylated agus an tiúchan log de thiúchan oligosaccharide, ag moladh samhail asaithe Langmuir féideartha.I measc na mAbs, bhain CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, agus CCRC-M151 le XHE, agus CCRC-M108, CCRC-M109, agus LM11 chomhghaolú le A2XX thar raon 1 nm go 100 nana.Mar gheall ar infhaighteacht theoranta antasubstaintí le linn an turgnaimh, rinneadh turgnaimh theoranta le gach tiúchan oligosaccharide.Ba chóir a thabhairt faoi deara anseo go n-imoibríonn roinnt antasubstaintí ar bhealach an-difriúil leis an olagaishiúicríd chéanna mar fhoshraith, is dócha toisc go gceanglaíonn siad le epitopes atá beagán difriúil agus go bhféadfadh gaolmhaireachtaí an-difriúla a bheith acu.Beidh meicníochtaí agus impleachtaí sainaitheanta cruinn epitope i bhfad níos casta nuair a chuirtear an cur chuige nua mAb i bhfeidhm ar fhíorshamplaí.
Baineadh úsáid as dhá olagaishiúicrídí tráchtála chun raon braite na mABanna éagsúla a dhírigh ar ghliocáin a chinneadh.Anseo, léiríonn comhghaolta líneacha le tiúchan loga de thiúchan oligosaccharide patrúin asaithe Langmuir do (A) XHE le mAb agus (B) A2XX le mAb.Léiríonn na heipitíopaí comhfhreagracha struchtúir na n-oligosaccharides tráchtála a úsáidtear mar fhoshraitheanna sa mheasúnacht.
Uirlis chumhachtach is ea úsáid antasubstaintí monaclónacha spriocdhírithe glycan (anailís glycanómach nó scagadh mAb bunaithe ar ELISA) chun tréithriú domhain a dhéanamh ar an gcuid is mó de na glicíní balla cille móra a chomhdhéanann bithmhais plandaí.Mar sin féin, ní shainíonn anailís chlasaiceach glycan ach gliocáin balla cille níos mó, toisc nach bhfuil an chuid is mó de oligosaccharides díluailithe go héifeachtach ar phlátaí ELISA.Sa staidéar seo, rinneadh sornán arbhair réamhchóireáilte AFEX a hidrealú go heinsímeach ag cion ard solaid.Baineadh úsáid as anailís siúcra chun comhdhéanamh carbaihiodráití balla cille athréimseach sa hidrolysáit a chinneadh.Mar sin féin, ní dhéantar anailís mAb ar olagaishiúicrídí níos lú i hidrealáití, agus tá gá le huirlisí breise chun olagaishiúicrídí a dhíluail go héifeachtach ar phlátaí ELISA.
Tuairiscímid anseo modh díluailithe olagaishiúicríd úrnua agus éifeachtach le haghaidh scagadh mAb trí bhiotineálú oligosaccharide a chomhcheangal agus scagadh ELISA ina dhiaidh sin ar phlátaí brataithe NeutrAvidin™.Léirigh na holagaishiúicrídí biotinylated díluailithe cleamhnas leordhóthanach don antashubstaint chun gur féidir olagaishiúicrídí athriallacha a bhrath go tapa agus go héifeachtach.Dhearbhaigh anailís ar chomhdhéanamh na n-oligosaccharides stubborn seo bunaithe ar mais-speictriméadracht torthaí an chur chuige nua seo maidir le himdhíon-scagadh.Mar sin, léiríonn na staidéir seo gur féidir an meascán de bhitinylation oligosaccharide agus scagadh ELISA le antasubstaintí monaclónacha spriocdhírithe glycan a úsáid chun trasnaisc in olagaishiúicrídí a bhrath agus is féidir a chur i bhfeidhm go forleathan i staidéir bithcheimiceach eile arb iad is sainairíonna struchtúr olagaishiúicrídí.
Is é an modh próifílithe glycan seo atá bunaithe ar bhiotín an chéad tuarascáil atá in ann imscrúdú a dhéanamh ar bhannaí ath-chailitheacha carbaihiodráití olagaishiúicrídí intuaslagtha i mbithmhais plandaí.Cuidíonn sé seo le tuiscint a fháil ar an bhfáth go bhfuil codanna áirithe den bhithmhais chomh doiléir maidir le táirgeadh bithbhreosla.Líonann an modh seo bearna thábhachtach i modhanna anailíse glycome agus leathnaíonn sé a chur i bhfeidhm chuig raon níos leithne foshraitheanna thar olagaishiúicrídí plandaí.Sa todhchaí, féadfaimid róbataic a úsáid le haghaidh bithtinylation agus úsáid a bhaint as an modh atá forbartha againn le haghaidh anailíse ard-tréchur ar shamplaí ag baint úsáide as ELISA.
Baineadh tuí arbhair (CS) ó shíolta hibrideacha Pioneer 33A14 in 2010 ó Kramer Farms i Ray, Colorado.Le cead ón úinéir talún, is féidir an bhithmhais seo a úsáid le haghaidh taighde. Stóráladh na samplaí tirim < 6% de thaise i málaí zip-glas ag teocht an tseomra. Stóráladh na samplaí tirim < 6% de thaise i málaí zip-glas ag teocht an tseomra. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa phacáiste с застежкой-mолнией при комнатной темеу. Stóráladh samplaí tirim ag taise <6% i málaí zippered ag teocht an tseomra.样品在室温下以干燥<6%的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Breac síos sa phacastáin sa mhargadh-molнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Stóráiltear samplaí i málaí zipper ag teocht an tseomra le taise <6%.Chloígh an staidéar le treoirlínte áitiúla agus náisiúnta.Rinneadh anailís ar chomhdhéanamh agus úsáid á baint as prótacal NREL.Fuarthas go raibh 31.4% glúcán sa chomhdhéanamh, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% aicéitil, 14.3% lignin, próitéin 1.7% agus 13. 4% fuinseog.
Is meascán casta de cheallalíse, β-glucosidase agus Cellic® HTec2 (157 mg próitéin/ml, lot VHN00001) ó Novozymes (Franklinton, NC, USA) é Cellic® CTec2 (138 mg próitéin/ml, lot VCNI 0001).Bhronn DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA), Multifect Pectinase® (72 mg próitéin/mL), meascán casta d’einsímí táireach peictin.Cinneadh tiúchan próitéin einsímí trí ábhar próitéin a mheas (agus ranníocaíocht nítrigine neamhphróitéine a dhealú) ag baint úsáide as anailís nítrigine Kjeldahl (modh AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ceannaíodh cré diatomaceous 545 ó EMD Millipore (Billerica, MA).Ceannaíodh carbón gníomhachtaithe (DARCO, 100 gráinníní mogall), Avicel (PH-101), xylan feá, agus gach ceimiceán eile ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Rinneadh réamhchóireáil AFEX ag GLBRC (Saotharlann Taighde Tiontú Bithmhais, MSU, Lansing, MI, SAM).Rinneadh réamhchóireáil ag 140 ° C. ar feadh 15 nóiméad.46 am cónaithe ag cóimheas 1:1 idir amóinia ainhidriúil agus bithmhais ag 60% (w/w) á luchtú in imoibreoir bhaisc benchtop cruach dhosmálta (Parr Instruments Company).Thóg sé 30 nóiméad.Tugadh an t-imoibreoir go 140 °C agus scaoileadh an amóinia go tapa, rud a chuir ar chumas an bhithmhais filleadh go tapa ar theocht an tseomra.Bhí comhdhéanamh sornóra arbhair réamhchóireáilte AFEX (ACS) cosúil leis an sornóir arbhair neamhchóireáilte (UT-CS).
Solaid arda Ullmhaíodh ACSH 25% (w/w) (thart ar 8% de lódáil dextran) mar ábhar tosaigh le haghaidh táirgeadh olagaishiúicrídí ar scála mór.Rinneadh hidrealú einsímeach ar ACS ag baint úsáide as meascán einsímí tráchtála lena n-áirítear próitéin Cellic® Ctec2 10 mg / g glúcán (i mbithmhais réamhchóireáilte), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), próitéin 5 mg / g glúcán, agus Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg próitéin/g dextran.Rinneadh hidrealú einsímeach i mbith-imoibreoir 5-lítear le toirt oibre de 3 lítear, pH 4.8, 50 ° C agus 250 rpm.Tar éis hidrealú ar feadh 96 uair an chloig, bailíodh an hidrolysáit trí lártheifneoiriú ag 6000 rpm ar feadh 30 nóiméad agus ansin ag 14000 rpm ar feadh 30 nóiméad chun solaid neamhhidrealaithe a bhaint.Ansin cuireadh an hidrolysáit faoi scagachán steiriúil trí scag eascra 0.22 mm.Stóráladh an hidrolysáit scagtha i mbuidéil steiriúla ag 4° C. agus ansin codánaíodh é ar charbón.
Anailís ar chomhdhéanamh samplaí bithmhaise bunaithe ar eastóscadh de réir nósanna imeachta anailíse saotharlainne NREL: samplaí a ullmhú le haghaidh anailíse ar chomhdhéanamh (NREL/TP-510-42620) agus carbaihiodráití struchtúracha agus lignin i mbithmhais a chinneadh (NREL/TP-510 – 42618)47.
Rinneadh anailís oligosaccharide ar an sruth hidrolysáit ar scála 2 ml ag baint úsáide as modh hidrealú aigéad-bhunaithe uathchláiv.Measc an sampla hidrolysáit le 69.7 µl d’aigéad sulfarach 72% i bhfeadán saothraithe caipín scriú 10 ml agus gor ar feadh 1 h ar bhinse ag 121 °C, fuaraigh ar an oighear agus scag isteach i vial crómatagrafaíocht leachta ardfheidhmíochta (HPLC).Rinneadh tiúchan na n-oligosaccharides a chinneadh trí thiúchan na monaisiúicrídí sa sampla neamh-hidrealaithe a dhealú ón tiúchan iomlán siúcra sa sampla aigéad-hidrealaithe.
Rinneadh anailís ar thiúchan glúcóis, xylose, agus arabinóis sa bhithmhais hidrealaithe aigéid ag baint úsáide as córas Shimadzu HPLC atá feistithe le autosampler, téitheoir colún, caidéal isocratach, agus brathadóir innéacs athraonta ar cholún Bith-Rad Aminex HPX-87H.Coinníodh an colún ag 50 ° C agus eluted le 0.6 ml/nóiméad 5 mM H2SO4 in uisce.sreabhadh.
Caolaíodh an forshuiteán hidrolysáit agus rinneadh anailís air le haghaidh ábhar monaiméir agus olagaishiúicríde.Rinne HPLC anailís ar shiúcraí monaiméireacha a fuarthas tar éis hidrealú einsímeach a bhí feistithe le colún Aminex HPX-87P Bith-Rad (Hercules, CA) agus colún garda fuinseoige.Coinníodh teocht an cholúin ag 80 ° C, baineadh úsáid as uisce mar chéim shoghluaiste le ráta sreafa 0.6 ml / min.Rinneadh olagaishiúicrídí a chinneadh trí hidrealú in aigéad caol ag 121 °C de réir na modhanna a bhfuil cur síos orthu i refs.41, 48, 49 .
Rinneadh anailís saccharide ar iarmhar bithmhaise amh, réamhchóireáilte AFEX agus gach iarmhar bithmhaise neamhhidrealaithe (lena n-áirítear sleachta sraitheach balla cille a tháirgeadh agus a scagadh mAb) ag baint úsáide as nósanna imeachta a thuairiscítear roimhe seo 27, 43, 50, 51 .Le haghaidh anailíse glycome, ullmhaítear iarmhair d’ábhar balla cealla plandaí dothuaslagtha le halcól ó iarmhair bithmhaise agus déantar iad a eastóscadh sraitheach le himoibrithe atá ag éirí níos ionsaithí amhail oxalate amóiniam (50 mM), carbónáit sóidiam (50 mM agus 0.5% w/v), CON.(1M agus 4M, an dá cheann le 1% w/v bóiríd sóidiam) agus clóirít aigéad mar a thuairiscítear roimhe seo52,53.Cuireadh na sleachta faoi réir ELISA ansin i gcoinne painéal casta de mAb50s a bhí dírithe ar an glycan balla cille, agus cuireadh imoibrithe ceangailteach an mAb i láthair mar léarscáil teasa.Ceannaíodh MBanna a dhírigh ar ghliocán balla cille plandaí ó stoic saotharlainne (sraith CCRC, JIM agus MAC).
Bithtinylation aon-chéim ar olagaishiúicrídí.Baineadh úsáid as an nós imeachta seo a leanas le comhchuingeach carbaihiodráití le biotin-LC-hydrazide.Rinneadh Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) a thuaslagadh i sulfocsaíd démheitiol (DMSO, 70 μl) trí chorraí bríomhar agus téite ag 65 ° C. ar feadh 1 nóiméad.Cuireadh aigéad aicéiteach oighreach (30 µl) leis agus doirteadh an meascán ar chianabróhidríd sóidiam (6.4 mg/100 µmol) agus tuaslagtha go hiomlán tar éis é a théamh ag 65 ° C ar feadh thart ar 1 nóiméad.Ansin, cuireadh ó 5 go 8 μl den mheascán imoibrithe leis an oligosaccharide triomaithe (1-100 nmol) chun farasbarr molar 10-huaire nó níos mó den lipéad a fháil thar an deireadh laghdaitheora.Rinneadh an t-imoibriú ag 65 ° C ar feadh 2 h, agus ina dhiaidh sin glanadh na samplaí láithreach.Níor úsáideadh aon chianabórhidríd sóidiam sna turgnaimh lipéadaithe gan laghdú, agus rinneadh imoibriú ar na samplaí ag 65 ° C. ar feadh 2.5 uair an chloig.
Bratú ELISA agus níochán samplaí de olagaishiúicrídí biotinylated.Cuireadh 25 μl de shamplaí biotinylated (100 μl de gach sampla tiubhaithe caolaithe i 5 ml de thuaslagán maolánach Tris 0.1 M (TBS)) le gach tobar den phláta atá brataithe le avidin.Brataíodh toibreacha rialaithe le 50 μl biotin ag tiúchan 10 μg/ml i 0.1 M TBS.Baineadh úsáid as uisce dí-ianaithe mar bhratú do thomhais bhána.Goradh an táibléad ar feadh 2 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas.Nigh an pláta 3 huaire le 0.1% bainne bearrtha i 0.1 M TBS ag baint úsáide as clár uimh.11 le haghaidh árasán Grenier 3A.
Suimiú agus níochán antasubstaintí príomhúla.Cuir 40 µl d'antasubstaint phríomhúil le gach tobar.Gorradh an microplate ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas.Ansin nite na plátaí 3 huaire le 0.1% bainne i 0.1M TBS ag baint úsáide as clár níocháin #11 do Grenier Flat 3A.
Cuir antasubstaint tánaisteach leis agus nigh.Cuir 50 µl antashubstaint thánaisteach luch/rann (caolaithe 1:5000 i 0.1% bainne i 0.1 M TBS) le gach tobar.Gorradh an microplate ar feadh 1 uair an chloig ag teocht an tseomra sa dorchadas.Ansin nite na micreaphlátaí 5 huaire le 0.1% bainne i 0.1 M TBS ag baint úsáide as clár níocháin pláta Grenier Flat 5A #12.
Ag cur foshraith.Cuir 50 µl de 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) leis an mbunsubstráit (trí 2 bhraoin de mhaolán, 3 thiteann TMB, 2 bhraoin sárocsaíd hidrigine le 15 ml d'uisce dí-ianaithe).Ullmhaigh an tsubstráit TMB.agus vortex roimh úsáid).Gorradh an micreaphláta ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad.Sa dorchadas.
Críochnaigh an chéim agus léigh an tablet.Cuir 50 µl d’aigéad sulfarach 1 N le gach tobar agus taifead an t-ionsúiteán ó 450 go 655 nm ag baint úsáide as léitheoir ELISA.
Ullmhaigh tuaslagáin 1 mg/ml de na hanailítí seo in uisce dí-ianaithe: arabinóis, rhamnose, fucós, xylose, aigéad galactúrónach (GalA), aigéad glucuronic (GlcA), mannós, glúcós, galactós, lachtós, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-aicéitilgalactosamine (galNAc), inositol (caighdeán inmheánach).Ullmhaíodh dhá chaighdeán trí na tuaslagáin siúcra 1 mg/ml a thaispeántar i dTábla 1 a chur leis. Déantar samplaí a reoite agus a lyophilized ag -80 ° C. go dtí go mbaintear an t-uisce go léir (thart ar 12-18 uair an chloig de ghnáth).
Cuir 100–500 µg den sampla le feadáin caipín scriú ar chothromaíocht anailíseach.Taifead an méid a cuireadh leis.Is fearr an sampla a thuaslagadh i dtiúchan sonrach tuaslagóir agus é a chur leis an bhfeadán mar aliquot leachtach.Úsáid 20 µl inositol 1 mg/ml mar chaighdeán inmheánach do gach feadán samplach.Caithfidh an méid caighdeánach inmheánach a chuirtear leis an sampla a bheith mar an gcéanna leis an méid caighdeánach inmheánach a chuirtear leis an bhfeadán caighdeánach.
Cuir 8 ml de mheatánól ainhidriúil le vial scriúchaipín.Ansin 4 ml de thuaslagán HCl meatánólach 3 N, é a theipeann agus a chroitheadh.Ní úsáideann an próiseas seo uisce.
Cuir 500 µl de thuaslagán meatánóil 1 M HCl leis na samplaí olagasiúicríde agus feadáin chaighdeánacha TMS.Goradh samplaí thar oíche (168 uair) ag 80° C. i mbloc teirmeach.Triomaigh an táirge meatánalaithe ag teocht an tseomra ag baint úsáide as iomadúil triomúcháin.Cuir 200 µl MeOH leis agus triomaigh arís.Déantar an próiseas seo arís agus arís eile faoi dhó.Cuir 200 µl meatánóil, 100 µl piridín agus 100 µl d’ainhidríd aicéiteach leis an sampla agus measc go maith.Goradh samplaí ag teocht an tseomra ar feadh 30 nóiméad.agus triomaithe.Cuir 200 µl meatánóil leis agus triomaigh arís.
Cuir 200 µl Tri-Sil leis agus teas an fheadán caipín ar feadh 20 nóiméad.80°C, ansin fuaraithe go teocht an tseomra.Bain úsáid as iomadúil thriomú chun an sampla a thriomú tuilleadh go dtí toirt thart ar 50 µl.Tá sé tábhachtach a thabhairt faoi deara nár cheadaigh muid na samplaí a thriomú go hiomlán.
Cuir 2 ml heacsán leis agus measc go maith trí vortexing.Líon na leideanna de phípéid Pasteur (5-8 mm) le píosa olann ghloine tríd an olann ghloine a chur isteach ar bharr pípéad trastomhas 5-3/4 orlach.Lártheifníodh samplaí ag 3000 g ar feadh 2 nóiméad.Tá aon iarmhar dothuaslagtha deasctha.Triomaigh an sampla go 100-150 µl.Instealladh toirt thart ar 1 μl isteach sa GC-MS ag teocht tosaigh 80 °C agus am tosaigh de 2.0 nóiméad (Tábla 2).