Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan təqdim edəcəyik.
AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobasında davamlı oliqosakaridlərin kompleks analizi üçün yeni immunoloji və kütləvi spektrometrik üsullar.Liqnoselülozik biokütlə qalıq yanacaqlara davamlı alternativdir və qida, yem, yanacaq və kimyəvi maddələr kimi məhsulların istehsalı üçün biotexnologiyaların inkişafı üçün geniş istifadə olunur.Bu texnologiyaların açarı bitki hüceyrə divarlarında mövcud olan mürəkkəb karbohidratları qlükoza, ksiloza və arabinoza kimi sadə şəkərlərə çevirmək üçün rəqabətə davamlı proseslərin inkişafıdır.Liqnoselülozik biokütlə çox inadkar olduğundan, istənilən məhsulu əldə etmək üçün kombinasiyada termokimyəvi müalicələrə (məsələn, ammonyak lifinin aşındırılması (AFEX), seyreltilmiş turşular (DA), ion mayeləri (IL)) və bioloji müalicələrə (məsələn, fermentativ hidroliz və mikrob fermentasiyası) məruz qalmalıdır..Bununla belə, hidroliz prosesində kommersiya məqsədli göbələk fermentlərindən istifadə edildikdə, əmələ gələn həll olunan şəkərlərin yalnız 75-85%-i monosaxaridlər, qalan 15-25%-i isə mikroorqanizmlər üçün həmişə mövcud olmayan həll olunan, həll olunmayan oliqosakaridlərdir.Əvvəllər biz karbon və diatomlu torpaq ayrılması və ölçüsünü istisna edən xromatoqrafiyanın birləşməsindən istifadə edərək həll olunan inadkar oliqosakaridləri uğurla təcrid etdik və təmizlədik, həmçinin onların ferment inhibitor xüsusiyyətlərini araşdırdıq.Biz aşkar etdik ki, yüksək dərəcədə polimerləşmə (DP) olan metilləşdirilmiş uron turşusu əvəzediciləri olan oliqosakaridləri kommersiya fermenti qarışıqları ilə emal etmək aşağı DP və neytral oliqosakkaridlərə nisbətən daha çətindir.Burada bitki hüceyrə divarlarında və enzimatik hidrolizatlarda qlikan bağlarını xarakterizə etmək üçün bitki biokütləsi qlikanlarına xas olan monoklonal antikorlardan (mAbs) istifadə edərək qlikan profilinin yaradılması, matris köməyi ilə lazer desorbsiyasının ionlaşması, uçuş vaxtının mass-spektrometriyası da daxil olmaqla bir neçə əlavə metodun istifadəsini bildiririk..MALDI-TOF-MS) törəmə ilə və törəmə olmadan oliqosakarid bağlarını xarakterizə etmək üçün mənfi ionların ikincil parçalanmasından sonra spektroskopiya, qaz xromatoqrafiyası və kütləvi spektrometriya (GC-MS) ilə əldə edilən struktur-informativ diaqnostik zirvələrdən istifadə edir.Oliqosakaridlərin kiçik ölçüsünə görə (DP 4-20), bu molekulların mAb bağlanması və xarakteristikası üçün istifadə etmək çətindir.Bu problemin öhdəsindən gəlmək üçün biz biotin konyuqasiyasına əsaslanan yeni oliqosakarid immobilizasiya metodunu tətbiq etdik ki, bu üsul mikroplitənin səthində aşağı DP-də həll olunan oliqosakkaridlərin əksəriyyətini uğurla etiketlədi, daha sonra xüsusi liqasiya analizi üçün yüksək məhsuldarlıqlı mAb sistemində istifadə edildi.Bu yeni metod gələcəkdə diaqnostik məqsədlər üçün biomarkerlərdə mövcud olan oliqosakkaridləri təcrid etmək və xarakterizə etmək üçün istifadə oluna bilən daha təkmil yüksək məhsuldarlıqlı qlikom analizlərinin işlənib hazırlanmasını asanlaşdıracaq.
Kənd təsərrüfatı, meşə təsərrüfatı, ot və ağac materiallarından ibarət liqnoselüloz biokütləsi bio-əsaslı məhsulların, o cümlədən qida, yem, yanacaq və daha yüksək dəyərli məhsullar istehsal etmək üçün kimyəvi prekursorların istehsalı üçün potensial xammaldır1.Bitki hüceyrə divarlarında mövcud olan karbohidratlar (məsələn, sellüloza və hemiselüloza) kimyəvi emal və biotransformasiya yolu ilə (məsələn, fermentativ hidroliz və mikrob fermentasiyası) monosaxaridlərə depolimerləşdirilir.Ümumi ilkin müalicələrə ammiak lifinin genişlənməsi (AFEX), seyreltilmiş turşu (DA), ion mayesi (IL) və buxar partlayışı (SE) daxildir, bu da bitki hüceyrə divarlarını açaraq liqnoselüloz istehsalını azaltmaq üçün kimyəvi maddələr və istilik birləşməsindən istifadə edir3,4.maddənin inadkarlığı, 5. Enzimatik hidroliz kommersiya aktiv karbohidrat tərkibli fermentlərdən (CAZymes) və bio-əsaslı yanacaq və kimyəvi maddələrin istehsalı üçün transgenik mayalardan və ya bakteriyalardan istifadə edərək mikrob fermentasiyasından istifadə etməklə yüksək bərk maddə yükü ilə həyata keçirilir 6 .
Ticarət fermentlərindəki CAZimlər monosaxaridlər əmələ gətirmək üçün kompleks karbohidrat-şəkər bağlarını sinergetik şəkildə parçalayan fermentlərin mürəkkəb qarışığından ibarətdir2,7.Daha əvvəl xəbər verdiyimiz kimi, liqninin karbohidratlarla aromatik polimerlərinin mürəkkəb şəbəkəsi onları yüksək dərəcədə dözülməz edir ki, bu da şəkərin natamam çevrilməsinə gətirib çıxarır, əvvəlcədən təmizlənmiş biokütlənin fermentativ hidrolizi zamanı əmələ gəlməyən cinsi oliqosakkaridlərin 15-25%-ni toplayır.Bu, müxtəlif biokütlənin ilkin təmizlənməsi üsullarında ümumi problemdir.Bu darboğazın bəzi səbəbləri arasında hidroliz zamanı fermentin inhibə edilməsi və ya bitki biokütləsində şəkər bağlarını qırmaq üçün tələb olunan əsas əsas fermentlərin olmaması və ya aşağı səviyyədə olması daxildir.Oliqosakaridlərdəki şəkər bağları kimi şəkərlərin tərkibini və struktur xüsusiyyətlərini başa düşmək bizə hidroliz zamanı şəkərin çevrilməsini yaxşılaşdırmağa kömək edəcək və biotexnoloji prosesləri neftdən əldə edilən məhsullarla rəqabətədavamlı edəcək.
Karbohidratların strukturunun müəyyən edilməsi çətin məsələdir və maye xromatoqrafiyası (LC)11,12, nüvə maqnit rezonans spektroskopiyası (NMR)13, kapilyar elektroforez (CE)14,15,16 və kütlə spektrometriyası (MS)17 kimi metodların birləşməsini tələb edir.,on səkkiz.Bir matris (MALDI-TOF-MS) istifadə edərək lazer desorbsiya və ionlaşma ilə uçuş vaxtı kütlə spektrometriyası kimi MS üsulları karbohidrat strukturlarını müəyyən etmək üçün çox yönlü bir üsuldur.Bu yaxınlarda, natrium ion əlavələrinin toqquşma ilə əlaqəli dissosiasiya (CID) tandem MS oliqosakarid əlavə mövqelərinə, anomerik konfiqurasiyalara, ardıcıllıqlara və budaqlanma mövqelərinə uyğun gələn barmaq izlərini müəyyən etmək üçün ən çox istifadə edilmişdir 20, 21 .
Qlikan analizi karbohidrat bağlarının dərindən müəyyən edilməsi üçün əla vasitədir22.Bu üsul kompleks karbohidrat əlaqələrini anlamaq üçün zondlar kimi bitki hüceyrə divarının qlikana yönəldilmiş monoklonal antikorlardan (mAbs) istifadə edir.Müxtəlif saxaridlərdən istifadə edərək müxtəlif xətti və budaqlanmış oliqosakaridlərə qarşı hazırlanmış 250 mAb-dən çox dünya üzrə mövcuddur24.Bitki hüceyrə divarının strukturunu, tərkibini və modifikasiyalarını xarakterizə etmək üçün bir neçə mAb geniş şəkildə istifadə edilmişdir, çünki bitki hüceyrəsinin növü, orqanı, yaşı, inkişaf mərhələsi və böyümə mühitindən asılı olaraq əhəmiyyətli fərqlər mövcuddur25,26.Son zamanlarda bu üsul bitki və heyvan sistemlərində vezikül populyasiyalarını və onların hüceyrəaltı markerlər, inkişaf mərhələləri və ya ətraf mühit stimulları ilə müəyyən edilən qlikanın daşınmasında müvafiq rollarını anlamaq və fermentativ aktivliyi müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.Müəyyən edilmiş qlikanların və ksilanların bəzi müxtəlif strukturlarına pektin (P), ksilan (X), mannan (M), ksiloglukanlar (XylG), qarışıq bağ qlükanlar (MLG), arabinoksilan (ArbX), qalaktomannan (GalG), qlükuron turşusu-arabinoksilan (ArbX), qlükuron turşusu-arabinoksilan (GAbino) və arab2) daxildir.
Bununla belə, bütün bu tədqiqat səylərinə baxmayaraq, yalnız bir neçə tədqiqat yüksək bərk maddə yükü (HSL) hidrolizi zamanı oliqosakaridlərin yığılmasının təbiətinə, o cümlədən oliqosakaridlərin sərbəst buraxılmasına, hidroliz zamanı oliqomerik zəncir uzunluğunun dəyişməsinə, müxtəlif aşağı DP polimerlərinə və onların əyrilərinə diqqət yetirmişdir.paylamalar 30,31,32.Bununla yanaşı, qlikan analizinin qlikan strukturunun hərtərəfli təhlili üçün faydalı vasitə olduğunu sübut etsə də, antikor metodlarından istifadə edərək suda həll olunan aşağı DP-li oliqosakaridləri qiymətləndirmək çətindir.Molekulyar çəkisi 5-10 kDa-dan az olan daha kiçik DP oliqosakaridləri ELISA plitələri 33, 34 ilə bağlanmır və antikor əlavə edilməzdən əvvəl yuyulur.
Burada, ilk dəfə olaraq, monoklonal antikorlardan istifadə edərək, həll olunan odadavamlı oliqosakkaridlər üçün bir addımlı biotinilasiya prosedurunu qlikom analizi ilə birləşdirən avidinlə örtülmüş lövhələrdə ELISA analizini nümayiş etdiririk.Qlikom analizinə yanaşmamız, hidrolizə edilmiş şəkər kompozisiyalarının trimetilsilil (TMS) törəmələrindən istifadə edərək tamamlayıcı oliqosakarid əlaqələrinin MALDI-TOF-MS və GC-MS əsaslı təhlili ilə təsdiq edilmişdir.Bu innovativ yanaşma gələcəkdə yüksək məhsuldarlıq metodu kimi inkişaf etdirilə və biotibbi tədqiqatlarda daha geniş tətbiq oluna bilər35.
Fermentlərin və anticisimlərin qlikozilləşmə kimi post-translational modifikasiyaları36 onların bioloji aktivliyinə təsir göstərir.Məsələn, iltihablı artritdə zərdab zülallarının qlikosilləşməsinin dəyişməsi mühüm rol oynayır və diaqnostik markerlər kimi qlikozilləşmənin dəyişməsi istifadə olunur37.Ədəbiyyatda müxtəlif qlikanların müxtəlif xəstəliklərdə, o cümlədən mədə-bağırsaq traktının və qaraciyərin xroniki iltihabi xəstəlikləri, viral infeksiyalar, yumurtalıq, süd vəzi və prostat xərçənglərində asanlıqla göründüyü bildirilmişdir38,39,40.Antikor əsaslı qlikan ELISA metodlarından istifadə edərək qlikanların strukturunu anlamaq kompleks MS metodlarından istifadə etmədən xəstəliyin diaqnozunda əlavə inam təmin edəcəkdir.
Əvvəlki araşdırmamız göstərdi ki, inadkar oliqosakaridlər ilkin müalicədən və enzimatik hidrolizdən sonra hidroliz edilməmiş qalırlar (Şəkil 1).Əvvəllər dərc olunmuş işimizdə biz AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobası hidrolizatından (ACSH)8 oliqosakaridləri təcrid etmək üçün aktivləşdirilmiş kömür bərk fazalı ekstraksiya metodunu işləyib hazırladıq.İlkin ekstraksiya və ayrıldıqdan sonra oliqosakkaridlər ölçüdən kənarlaşdırma xromatoqrafiyası (SEC) ilə daha da fraksiyalaşdırıldı və molekulyar çəkiyə görə toplandı.Müxtəlif ilkin müalicələrdən ayrılan şəkər monomerləri və oliqomerləri şəkər tərkibinin təhlili ilə təhlil edilmişdir.Müxtəlif ilkin müalicə üsulları ilə əldə edilən şəkər oliqomerlərinin tərkibini müqayisə edərkən, inadkar oliqosakkaridlərin olması biokütlənin monosaxaridlərə çevrilməsində ümumi problemdir və şəkər məhsuldarlığının ən azı 10-15% və hətta 18% -ə qədər azalmasına səbəb ola bilər.ABŞ.Bu üsul oliqosakarid fraksiyalarının daha geniş miqyaslı istehsalı üçün istifadə olunur.Bu işdə oliqosakaridlərin xarakteristikası üçün eksperimental material kimi əldə edilən ACH və onun müxtəlif molekulyar çəkilərə malik sonrakı fraksiyalarından istifadə edilmişdir.
Əvvəlcədən müalicədən və enzimatik hidrolizdən sonra davamlı oliqosakaridlər hidroliz edilməmiş qaldı.Burada (A) oliqosakaridlərin AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobası hidrolizatından (ACSH) təcrid olunduğu oliqosakaridlərin ayrılması üsuludur;(B) Oliqosakaridlərin ayrılması üsulu.Oliqosakaridlər daha da ölçüsü istisna xromatoqrafiyası (SEC) ilə ayrıldı;(C) Müxtəlif ilkin müalicələrdən ayrılan saxarid monomerləri və oliqomerləri (seyreltilmiş turşu: DA, ion mayesi: IL və AFEX).Enzimatik hidroliz şərtləri: 25% (ağırlıq/ağırlıq) yüksək bərk maddə yüklənməsi (təxminən 8% qlükan yükü), 96 saat hidroliz, 20 mq/q kommersiya fermenti yükü (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 nisbəti) və (D) Şəkər monomerləri və AF-dən ayrılan kortrebinoza və oliqomerlər ACS).
Qlikan analizi bərk biokütlə qalıqlarından təcrid olunmuş ekstraktlardakı qlikanların hərtərəfli struktur analizi üçün faydalı vasitə olduğunu sübut etmişdir.Bununla belə, suda həll olunan saxaridlər bu ənənəvi metoddan istifadə etməklə kifayət qədər təmsil olunur41, çünki aşağı molekulyar çəkili oliqosakaridləri ELISA lövhələrində immobilizasiya etmək çətindir və antikor əlavə edilməzdən əvvəl yuyulur.Buna görə də, antikorların bağlanması və xarakteristikası üçün, həll olunan, uyğun gəlməyən oliqosakaridləri avidinlə örtülmüş ELISA plitələrinə örtmək üçün bir addımlı biotinilasiya üsulundan istifadə edilmişdir.Bu üsul bizim əvvəllər istehsal etdiyimiz ACSH və onun molekulyar çəkisinə (və ya polimerləşmə dərəcəsinə, DP) əsaslanan fraksiyadan istifadə etməklə sınaqdan keçirilmişdir.Karbohidratın azaldıcı ucuna biotin-LC-hidrazid əlavə etməklə oliqosakaridlərin bağlanma yaxınlığını artırmaq üçün bir addımlı biotinilasiyadan istifadə edilmişdir (Şəkil 2).Məhlulda reduksiya ucundakı hemiasetal qrupu biotin-LC-hidrazidin hidrazid qrupu ilə reaksiyaya girərək hidrazon bağı yaradır.NaCNBH3 reduksiya agentinin iştirakı ilə hidrazon bağı stabil biotinləşdirilmiş son məhsula qədər azalır.Şəkər azaldıcı ucun modifikasiyası ilə aşağı DP-li oliqosakaridlərin ELISA plitələrinə bağlanması mümkün oldu və tədqiqatımızda bu, qlikan hədəflənmiş mAb-lardan istifadə edərək avidinlə örtülmüş plitələrdə edildi.
Biotinləşdirilmiş oliqosakaridlər üçün ELISA əsasında monoklonal antikorların skrininqi.Burada (A) NeutrAvidin ilə örtülmüş plitələrdə qlikan hədəflənmiş mAb ilə oliqosakaridlərin kombinə edilmiş biotinilasiyası və sonrakı ELISA skrininqi və (B) reaksiya məhsullarının biotinilasiyası üçün bir addımlı proseduru göstərir.
Sonra oliqosakaridlə birləşmiş antikorları olan avidinlə örtülmüş lövhələr birincili və ikincili antikorlara əlavə edildi və işığa və zamana həssas mühitdə yuyuldu.Antikor bağlanması tamamlandıqdan sonra lövhəni inkubasiya etmək üçün TMB substratı əlavə edin.Reaksiya nəhayət sulfat turşusu ilə dayandırıldı.İnkubasiya edilmiş plitələr, antikora xas olan çarpaz əlaqəni aşkar etmək üçün hər bir antikorun bağlanma gücünü müəyyən etmək üçün ELISA oxuyucusu istifadə edərək təhlil edildi.Təcrübənin təfərrüatları və parametrləri üçün "Materiallar və Metodlar" bölməsinə baxın.
Biz ACSH-də, eləcə də liqnoselülozik hidrolizatlardan təcrid olunmuş xam və təmizlənmiş oliqosakkarid fraksiyalarında mövcud olan həll olunan oliqosakaridləri xarakterizə etməklə xüsusi tətbiqlər üçün bu yeni işlənmiş metodun faydalılığını nümayiş etdiririk.Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, bioasilləşdirilmiş qlikom analizi üsullarından istifadə etməklə ACSH-də müəyyən edilmiş ən çox yayılmış epitopla əvəz edilmiş ksilanlar adətən uronik (U) və ya metiluronik (MeU) və pektik arabinoqalaktanlardır.Onların əksəriyyəti hidroliz olunmamış bərk cisimlərin qlikanlarının (UHS)43 analizinə dair əvvəlki tədqiqatımızda da aşkar edilmişdir.
Hüceyrə divarı qlikana yönəldilmiş monoklonal antikordan istifadə edərək inadkar oliqosakarid epitoplarının aşkarlanması.“Neytral” fraksiya ACN fraksiyasıdır, “turşu” fraksiya isə FA fraksiyasıdır.İstilik xəritəsində daha parlaq qırmızılar daha yüksək epitop məzmununu, daha parlaq mavilər isə boş fonu göstərir.Şkaladakı rəng dəyərləri N = 2 formulaları üçün xam OD dəyərlərinə əsaslanır.Antikorlar tərəfindən tanınan əsas epitoplar sağda göstərilir.
Bu qeyri-selüloz strukturları, ən çox istifadə edilən kommersiya fermentlərini ehtiva edən sınaqdan keçirilmiş kommersiya fermenti qarışığında ən çox yayılmış sellülazlar və hemiselülazlar tərəfindən parçalana bilmədi.Buna görə də onların hidrolizi üçün yeni köməkçi fermentlər tələb olunur.Zəruri qeyri-selüloz əlavə fermentlər olmadan, bu qeyri-selüloz bağlar monosaxaridlərə tam çevrilmənin qarşısını alır, hətta onların ana şəkər polimerləri daha qısa fraqmentlərə geniş şəkildə hidroliz edilsə və kommersiya ferment qarışıqları ilə həll edilsə belə.
Siqnalın paylanmasının və onun bağlanma gücünün sonrakı tədqiqi göstərdi ki, dimerlərdə aşağı DP fraksiyaları (D, E, F, DP) ilə müqayisədə yüksək DP şəkər fraksiyalarında (A, B, C, DP-yə qədər 20+) bağlayıcı epitoplar aşağıdır) (Şəkil 1).Turşu fraqmentləri qeyri-selüloz epitoplarda neytral fraqmentlərə nisbətən daha çox olur.Bu hadisələr, yüksək DP və turşu hissələrinin fermentativ hidrolizə daha davamlı olduğu əvvəlki tədqiqatımızda müşahidə edilən nümunə ilə uyğundur.Buna görə də qeyri-selüloz qlikan epitoplarının və U və MeU əvəzetmələrinin olması oliqosakaridlərin sabitliyinə böyük töhfə verə bilər.Qeyd etmək lazımdır ki, bağlanma və aşkarlama effektivliyi aşağı DP-li oliqosakaridlər üçün problemli ola bilər, xüsusən də epitop dimerik və ya trimerik oliqosakariddirsə.Bu, hər birində xüsusi mAb ilə bağlanan yalnız bir epitop olan müxtəlif uzunluqlu kommersiya oliqosakaridlərindən istifadə etməklə sınaqdan keçirilə bilər.
Beləliklə, struktura xas antikorların istifadəsi müəyyən növ inkarçı bağları aşkar etdi.İstifadə olunan antikorun növündən, uyğun bağlama modelindən və onun yaratdığı siqnalın gücündən (ən çox və ən az bol) asılı olaraq, daha tam qlikokonversiya üçün ferment qarışığına yarı kəmiyyətcə yeni fermentlər müəyyən edilə və əlavə edilə bilər.Nümunə olaraq ACSH oliqosakaridlərinin təhlilini götürsək, hər bir biokütlə materialı üçün qlikan bağlarının məlumat bazası yarada bilərik.Burada qeyd etmək lazımdır ki, anticisimlərin müxtəlif yaxınlığı nəzərə alınmalıdır və onların yaxınlığı məlum deyilsə, bu, müxtəlif anticisimlərin siqnallarını müqayisə edərkən müəyyən çətinliklər yaradacaqdır.Bundan əlavə, qlikan bağlarının müqayisəsi eyni antikor üçün nümunələr arasında ən yaxşı nəticə verə bilər.Bu inadkar bağlar daha sonra CAZyme verilənlər bazası ilə əlaqələndirilə bilər, ondan biz fermentləri müəyyən edə, namizəd fermentləri seçə və bağ qıran fermentləri sınaya və ya bu fermentləri biorefinerilərdə istifadə üçün ifadə etmək üçün mikrob sistemləri hazırlaya bilərik44.
İmmunoloji üsulların lignoselülozik hidrolizatlarda mövcud olan aşağı molekulyar ağırlıqlı oliqosakaridləri xarakterizə etmək üçün alternativ üsulları necə tamamladığını qiymətləndirmək üçün MALDI (Şəkil 4, S1-S8) və eyni paneldə (Şəkil 5) oligoscharide hissəsində GC-MS əsasında TMS-gələn saxaridlərin təhlilini həyata keçirdik.MALDI oliqosakarid molekullarının kütləvi paylanmasının nəzərdə tutulan struktura uyğun olub-olmadığını müqayisə etmək üçün istifadə olunur.Əncirdə.Şəkil 4 ACN-A və ACN-B neytral komponentlərinin MC-sini göstərir.ACN-A analizi çəkiləri MeU-ksilan oliqosakaridlərinə uyğun gələn DP 4-8 (Şəkil 4)-dən DP 22-yə (Şəkil S1) qədər dəyişən bir sıra pentoza şəkərləri təsdiqlədi.ACN-B analizi pentoza və qlükoksilan seriyasını DP 8-15 ilə təsdiqlədi.Şəkil S3 kimi əlavə materialda FA-C turşu hissəsinin kütlə paylanması xəritələri ELISA əsaslı mAb skrininqində tapılan əvəzlənmiş ksilanlara uyğun olan DP-si 8-15 olan bir sıra (Me)U ilə əvəzlənmiş pentoza şəkərləri göstərir.Epitoplar ardıcıldır.
ACS-də mövcud olan həll olunan uyğun gəlməyən oliqosakaridlərin MALDI-MS spektri.Burada (A) ACN-A aşağı çəki diapazonunun tərkibində metilləşdirilmiş urron turşusu (DP 4-8) olan fraksiyalar qlükuroksilan oliqosakkaridləri və (B) ACN-B ksilan və qlükuroksilan (DP 8-15) ilə əvəz edilmiş metilləşdirilmiş uron turşusu oliqosakkaridlərini əvəz etmişdir.
Odadavamlı oliqosakaridlərin qlikan qalığının tərkibinin təhlili.Burada (A) GC-MS analizindən istifadə edərək əldə edilən müxtəlif oliqosakarid fraksiyalarının TMS saxarid tərkibi.(B) Oliqosakaridlərdə mövcud olan müxtəlif TMS mənşəli şəkərlərin strukturları.ACN – tərkibində neytral oliqosakkaridlər olan asetonitril fraksiya və FA – turşu oliqosakaridləri olan ferul turşusu fraksiya.
Şəkil S9-da göstərildiyi kimi oliqosakarid fraksiyasının LC-MS analizindən daha bir maraqlı nəticə çıxarılmışdır (metodları elektron əlavə materialda görmək olar).ACN-B fraksiyasının bağlanması zamanı heksoza və -OAc qruplarının fraqmentləri dəfələrlə müşahidə edilmişdir.Bu tapıntı təkcə qlikom və MALDI-TOF analizində müşahidə olunan parçalanmanı təsdiq etmir, həm də əvvəlcədən işlənmiş liqnoselüloz biokütləsində potensial karbohidrat törəmələri haqqında yeni məlumatlar verir.
TMS şəkər derivatizasiyasından istifadə edərək oliqosakarid fraksiyasının şəkər tərkibini də təhlil etdik.GC-MS-dən istifadə edərək oliqosakarid fraksiyasında sinir (qeyri-törəmə) və turşu şəkərlərin (GluA və GalA) tərkibini təyin etdik (şəkil 5).Qlükuron turşusu C və D asidik komponentlərində, qalakturon turşusu isə turşu şəkərlərin yüksək DP komponentləri olan A və B asidik komponentlərində olur.Bu nəticələr yalnız ELISA və MALDI məlumatlarımızı təsdiqləmir, həm də oliqosakaridlərin yığılması ilə bağlı əvvəlki tədqiqatlarımıza uyğundur.Buna görə də, biz hesab edirik ki, oliqosakaridlərin biotinilasiyası və sonrakı ELISA skrininqindən istifadə edən müasir immunoloji üsullar müxtəlif bioloji nümunələrdə həll olunan rekalsitran oliqosakaridləri aşkar etmək üçün kifayətdir.
ELISA əsaslı mAb skrininq üsulları bir neçə fərqli üsulla təsdiq edildiyi üçün biz bu yeni kəmiyyət metodunun potensialını daha da araşdırmaq istədik.İki kommersiya oliqosakaridləri, ksiloheksakarid oliqosakarid (XHE) və 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX) alınmış və hüceyrə divarı qlikanını hədəf alan yeni mAb yanaşması ilə sınaqdan keçirilmişdir.Şəkil 6, mümkün Langmuir adsorbsiya modelini təklif edən biotinləşdirilmiş bağlama siqnalı ilə oliqosakarid konsentrasiyasının log konsentrasiyası arasında xətti korrelyasiyanı göstərir.mAb-lar arasında CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 və CCRC-M151 XHE ilə korrelyasiya, CCRC-M108, CCRC-M109 və LM11 isə A2XX ilə na10nm arasında korrelyasiya etdi.Təcrübə zamanı antikorların məhdud olması səbəbindən hər bir oliqosakarid konsentrasiyası ilə məhdud təcrübələr aparıldı.Burada qeyd etmək lazımdır ki, bəzi antikorlar substrat kimi eyni oliqosakaridə çox fərqli reaksiya verirlər, ehtimal ki, onlar bir qədər fərqli epitoplarla birləşirlər və çox fərqli bağlanma yaxınlıqlarına malik ola bilərlər.Yeni mAb yanaşması real nümunələrə tətbiq edildikdə, epitopun dəqiq identifikasiyası mexanizmləri və nəticələri daha mürəkkəb olacaq.
Müxtəlif qlikan hədəfləyən mAb-ların aşkarlama diapazonunu müəyyən etmək üçün iki kommersiya oliqosakaridindən istifadə edilmişdir.Burada oliqosakarid konsentrasiyasının log konsentrasiyası ilə xətti korrelyasiya (A) mAb ilə XHE və (B) mAb ilə A2XX üçün Langmuir adsorbsiya nümunələrini göstərir.Müvafiq epitoplar analizdə substrat kimi istifadə olunan kommersiya oliqosakaridlərinin strukturlarını göstərir.
Qlikan hədəflənmiş monoklonal antikorların istifadəsi (qlikokomik analiz və ya ELISA əsaslı mAb skrininqi) bitki biokütləsini təşkil edən əsas hüceyrə divarı qlikanlarının əksəriyyətinin dərin xarakteristikası üçün güclü vasitədir.Bununla belə, klassik qlikan analizi yalnız daha böyük hüceyrə divarı qlikanlarını xarakterizə edir, çünki oliqosakaridlərin çoxu ELISA plitələrində effektiv şəkildə immobilizasiya olunmur.Bu tədqiqatda, AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobası yüksək qatı maddələrin tərkibində enzimatik olaraq hidrolizə edilmişdir.Şəkər analizi hidrolizatdakı inadkar hüceyrə divarının karbohidratlarının tərkibini müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.Bununla belə, hidrolizatlarda daha kiçik oliqosakkaridlərin mAb analizi düzgün qiymətləndirilmir və oliqosakaridləri ELISA plitələrində effektiv şəkildə hərəkətsizləşdirmək üçün əlavə vasitələrə ehtiyac var.
Biz burada NeutrAvidin™ ilə örtülmüş plitələrdə oliqosakarid biotinilasiyasını və ardınca ELISA skrininqini birləşdirərək mAb skrininqi üçün yeni və səmərəli oliqosakarid immobilizasiya metodunu təqdim edirik.İmmobilizasiya olunmuş biotinilləşdirilmiş oliqosakkaridlər, inadkar oliqosakaridlərin sürətli və effektiv aşkarlanmasına imkan vermək üçün antikora kifayət qədər yaxınlıq göstərmişdir.Kütləvi spektrometriya əsasında bu inadkar oliqosakaridlərin tərkibinin təhlili immunoskrininq üçün bu yeni yanaşmanın nəticələrini təsdiqlədi.Beləliklə, bu tədqiqatlar göstərir ki, oliqosakaridlərin biotinilasiyası və ELISA skrininqinin qlikana hədəflənmiş monoklonal anticisimlərlə birləşməsi oliqosakaridlərdə çarpaz bağlantıları aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər və oliqosakaridlərin strukturunu xarakterizə edən digər biokimyəvi tədqiqatlarda geniş şəkildə tətbiq oluna bilər.
Bu biotin əsaslı qlikan profilləşdirmə üsulu bitki biokütləsində həll olunan oliqosakaridlərin inadkar karbohidrat bağlarını tədqiq etməyə qadir olan ilk hesabatdır.Bu, bioyanacaq istehsalına gəldikdə biokütlənin bəzi hissələrinin niyə belə inadkar olduğunu anlamağa kömək edir.Bu üsul qlikom analizi metodlarında mühüm boşluğu doldurur və onun tətbiqini bitki oliqosakaridlərindən kənarda daha geniş spektrli substratlara genişləndirir.Gələcəkdə biz biotinilasiya üçün robot texnikasından istifadə edə və ELISA istifadə edərək nümunələrin yüksək məhsuldarlıqlı analizi üçün hazırladığımız metoddan istifadə edə bilərik.
Pioneer 33A14 hibrid toxumlarından yetişdirilən qarğıdalı samanı (CS) 2010-cu ildə Kolorado ştatının Rey şəhərindəki Kramer Farms-dan yığılmışdır.Torpaq sahibinin icazəsi ilə bu biokütlə tədqiqat üçün istifadə oluna bilər. Nümunələr otaq temperaturunda zip-lock torbalarda quru < 6% nəmlikdə saxlanıldı. Nümunələr otaq temperaturunda zip-lock torbalarda quru < 6% nəmlikdə saxlanıldı. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Nümunələr otaq temperaturunda fermuarlı torbalarda <6% rütubətdə quru halda saxlanmışdır.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Nümunələr fermuarlı torbalarda otaq temperaturunda <6% rütubətdə saxlanılır.Tədqiqat yerli və milli qaydalara uyğundur.Kompozisiya analizi NREL protokolundan istifadə etməklə aparılmışdır.Tərkibində 31,4% qlükan, 18,7% ksilan, 3,3% arabinan, 1,2% qalaktan, 2,2% asetil, 14,3% liqnin, 1,7% zülal və 13,4% kül olduğu müəyyən edilmişdir.
Cellic® CTec2 (138 mq protein/ml, lot VCNI 0001) Novozymes (Franklinton, NC, ABŞ) şirkətindən sellülaz, β-qlükozidaza və Cellic® HTec2 (157 mq protein/ml, lot VHN00001) kompleks qarışığıdır.Multifect Pectinase® (72 mq protein/ml), pektin parçalayan fermentlərin kompleks qarışığı DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ABŞ) tərəfindən bağışlanmışdır.Ferment zülalının konsentrasiyaları Kjeldahl azot analizindən (AOAC metodu 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ABŞ) istifadə edərək zülal tərkibinin qiymətləndirilməsi (və qeyri-protein azotunun töhfəsi çıxılması) ilə müəyyən edilmişdir.Diatomlu torpaq 545 EMD Millipore (Billerica, MA) şirkətindən alınıb.Aktivləşdirilmiş karbon (DARCO, 100 mesh qranullar), Avicel (PH-101), fıstıq ksilan və bütün digər kimyəvi maddələr Sigma-Aldrichdən (Sent Louis, MO) alınıb.
AFEX-in ilkin müalicəsi GLBRC-də (Biokütlə Konversiya Tədqiqat Laboratoriyası, MSU, Lansing, MI, ABŞ) aparılmışdır.Əvvəlcədən müalicə 15 dəqiqə ərzində 140° C-də aparılmışdır.46 paslanmayan poladdan hazırlanmış dəzgah üstü partiya reaktorunda (Parr Instruments Company) 60% (ağırlıq/ağırlıq) yüklənmədə susuz ammonyakın biokütləyə 1:1 nisbətində qalma müddəti.30 dəqiqə çəkdi.Reaktor 140°C-yə gətirildi və ammonyak sürətlə sərbəst buraxıldı, bu da biokütlənin tez bir zamanda otaq temperaturuna qayıtmasına imkan verdi.AFEX əvvəlcədən işlənmiş qarğıdalı sobasının (ACS) tərkibi təmizlənməmiş qarğıdalı sobasının (UT-CS) tərkibinə bənzəyirdi.
Yüksək bərk ACSH 25% (ağırlıq/ağırlıq) (təxminən 8% dekstran yükləmə) oliqosakaridlərin geniş miqyaslı istehsalı üçün başlanğıc material kimi hazırlanmışdır.ACS-nin enzimatik hidrolizi Cellic® Ctec2 10 mq protein/q qlükan (əvvəlcədən işlənmiş biokütlədə), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mq protein/q qlükan və Multifekt Pektinaz (Genencor Inc, ABŞ) daxil olmaqla, kommersiya ferment qarışığından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.).), 5 mq protein/q dekstran.Enzimatik hidroliz iş həcmi 3 litr, pH 4,8, 50°C və 250 dövr/dəq olan 5 litrlik bioreaktorda aparılmışdır.96 saat ərzində hidrolizdən sonra hidrolizat 6000 rpm-də 30 dəqiqə, sonra isə 30 dəqiqə ərzində 14000 rpm-də hidrolizə olunmamış bərk maddələri çıxarmaq üçün sentrifuqa ilə toplandı.Daha sonra hidrolizat 0,22 mm-lik filtr şüşəsi vasitəsilə steril filtrasiyaya məruz qaldı.Süzülmüş hidrolizat steril şüşələrdə 4°C-də saxlanıldı və sonra karbon üzərində fraksiyalaşdırıldı.
NREL laboratoriya analizi prosedurlarına uyğun olaraq ekstrakt əsaslı biokütlə nümunələrinin tərkibinin təhlili: nümunələrin tərkibi təhlili üçün hazırlanması (NREL/TP-510-42620) və biokütlədə struktur karbohidratların və liqninin təyini (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizat axınının oliqosakarid analizi avtoklav əsaslı turşu hidroliz üsulu ilə 2 ml miqyasda aparılmışdır.Hidrolizat nümunəsini 69,7 µl 72% sulfat turşusu ilə 10 ml vida qapaqlı kultura borusunda qarışdırın və 121 °C-də dəzgahda 1 saat inkubasiya edin, buz üzərində soyudun və yüksək performanslı maye xromatoqrafiya (HPLC) flakonuna süzün.Oliqosakaridlərin konsentrasiyası, turşu hidrolizə edilmiş nümunədəki ümumi şəkər konsentrasiyasından hidroliz olunmamış nümunədəki monosaxaridlərin konsentrasiyasını çıxmaqla müəyyən edilmişdir.
Turşu hidrolizə edilmiş biokütlədəki qlükoza, ksiloza və arabinoza konsentrasiyaları Bio-Rad Aminex HPX-87H sütununda avtomatik nümunə götürən, sütun qızdırıcısı, izokratik nasos və sındırma indeksi detektoru ilə təchiz edilmiş Shimadzu HPLC sistemindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir.Sütun 50°C-də saxlanıldı və suda 0,6 ml/dəq 5 mM H2SO4 ilə yuyuldu.axın.
Hidrolizat supernatantı seyreltildi və monomer və oliqosakarid tərkibinə görə təhlil edildi.Enzimatik hidrolizdən sonra əldə edilən monomerik şəkərlər Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P sütunu və kül qoruyucu sütunu ilə təchiz edilmiş HPLC tərəfindən təhlil edilmişdir.Sütun temperaturu 80 ° C-də saxlanıldı, su 0,6 ml/dəq axını ilə mobil faza kimi istifadə edildi.Oliqosakkaridlər referanslarda təsvir edilən üsullara uyğun olaraq 121°C-də seyreltilmiş turşuda hidroliz yolu ilə təyin edilmişdir.41, 48, 49.
Saxarid analizi əvvəllər təsvir edilmiş 27, 43, 50, 51 prosedurlarından istifadə edərək xam, AFEX ilə əvvəlcədən işlənmiş və bütün hidrolizə olunmamış biokütlə qalıqları (seriyalı hüceyrə divarı ekstraktlarının istehsalı və onların mAb skrininqi daxil olmaqla) üzərində aparılmışdır.Qlikom analizi üçün bitki hüceyrə divarı materialının spirtdə həll olunmayan qalıqları biokütlə qalıqlarından hazırlanır və ammonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM və 0,5% w/v), CON kimi getdikcə artan aqressiv reagentlərlə ardıcıl ekstraksiyaya məruz qalır.(1M və 4M, hər ikisi 1% natrium borhidrid ilə) və əvvəllər təsvir edildiyi kimi turşu xlorit52,53.Daha sonra ekstraktlar hüceyrə divarı qlikana yönəldilmiş mAb50s kompleks panelinə qarşı ELISA-ya məruz qaldı və mAb bağlama reaksiyaları istilik xəritəsi kimi təqdim edildi.Bitki hüceyrə divarının qlikanını hədəf alan mAb-lar laboratoriya ehtiyatlarından (CCRC, JIM və MAC seriyaları) alınmışdır.
Oliqosakaridlərin bir addımlı biotinilasiyası.Karbohidratların biotin-LC-hidrazid ilə konjuqasiyası aşağıdakı prosedurdan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.Biotin-LC-hidrazid (4.6 mg/12 μmol) dimetil sulfoksiddə (DMSO, 70 μl) güclü qarışdırma və 65° C-də 1 dəqiqə qızdırmaqla həll edildi.Buzlu sirkə turşusu (30 µl) əlavə edildi və qarışıq natrium siyanoborohidridin (6,4 mq/100 µmol) üzərinə töküldü və 65°C-də təxminən 1 dəqiqə qızdırıldıqdan sonra tamamilə həll edildi.Daha sonra, azaldıcı ucun üzərində etiketin 10 qat və ya daha çox molar artıqlığını əldə etmək üçün qurudulmuş oliqosakaridə (1-100 nmol) 5 ilə 8 μl reaksiya qarışığı əlavə edildi.Reaksiya 65°C-də 2 saat ərzində aparıldı, bundan sonra nümunələr dərhal təmizləndi.Reduksiya edilmədən etiketləmə təcrübələrində heç bir natrium siyanoborohidrid istifadə edilməmişdir və nümunələr 2,5 saat ərzində 65°C-də reaksiyaya verilmişdir.
ELISA örtüyü və biotinləşdirilmiş oliqosakaridlərin nümunələrinin yuyulması.25 μl biotinləşdirilmiş nümunələr (5 ml 0,1 M Tris tampon məhlulunda (TBS) seyreltilmiş hər konsentratlaşdırılmış nümunədən 100 μl) avidinlə örtülmüş boşqabın hər quyusuna əlavə edilmişdir.Nəzarət quyuları 0,1 M TBS-də 10 μg/ml konsentrasiyada 50 μl biotinlə örtülmüşdür.Deionlaşdırılmış su boş ölçmələr üçün örtük kimi istifadə edilmişdir.Tablet qaranlıqda otaq temperaturunda 2 saat inkubasiya edildi.Plitəni 3 dəfə 0,1 M TBS-də 0,1% yağsız südlə yuyun.Grenier mənzil 3A üçün 11.
Birincil antikorların əlavə edilməsi və yuyulması.Hər quyuya 40 µl əsas antikor əlavə edin.Mikroplitəni qaranlıqda otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edin.Sonra boşqablar Grenier Flat 3A üçün №11 yuma proqramı ilə 0,1M TBS-də 0,1% süd ilə 3 dəfə yuyuldu.
İkinci antikor əlavə edin və yuyun.Hər quyuya 50 µl siçan/siçovul ikincil antikor (0,1 M TBS-də 0,1% süddə 1:5000 nisbətində seyreltilmiş) əlavə edin.Mikroplitəni qaranlıqda otaq temperaturunda 1 saat inkubasiya edin.Daha sonra mikroplitələr Grenier Flat 5A boşqab yuma proqramı #12 istifadə edərək 0,1 M TBS-də 0,1% süd ilə 5 dəfə yuyuldu.
Substrat əlavə etmək.Əsas substrata 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) əlavə edin (15 ml deionlaşdırılmış suya 2 damcı bufer, 3 damcı TMB, 2 damcı hidrogen peroksid əlavə etməklə).TMB substratını hazırlayın.və istifadə etməzdən əvvəl burulğan).Mikroplitəni otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edin.Qaranlıqda.
Addımı tamamlayın və planşeti oxuyun.Hər quyuya 50 µl 1 N sulfat turşusu əlavə edin və ELISA oxuyucusu ilə 450-dən 655 nm-ə qədər absorbans qeyd edin.
Bu analitlərin 1 mq/ml deionlaşdırılmış suda məhlullarını hazırlayın: arabinoza, ramnoz, fukoza, ksiloza, qalakturon turşusu (GalA), qlükuron turşusu (GlcA), mannoza, qlükoza, qalaktoza, laktoza, N-asetilmannosamin (manNAclukozamin), N-asetil.(glcNAc), N-asetilqalaktosamin (galNAc), inositol (daxili standart).Cədvəl 1-də göstərilən 1 mq/ml şəkər məhlulları əlavə edilməklə iki standart hazırlanmışdır. Nümunələr bütün su çıxarılana qədər (adətən təxminən 12-18 saat) -80°C-də dondurulur və liofilizasiya edilir.
Analitik tarazlıqda qapaqlı boruları vidalamaq üçün 100-500 µg nümunə əlavə edin.Əlavə edilmiş məbləği qeyd edin.Nümunəni həlledicinin müəyyən bir konsentrasiyasında həll etmək və maye alikvotu kimi boruya əlavə etmək yaxşıdır.Hər nümunə borusu üçün daxili standart olaraq 20 µl 1 mq/ml inozitol istifadə edin.Nümunəyə əlavə edilən daxili standartın miqdarı standart boruya əlavə edilən daxili standartın miqdarı ilə eyni olmalıdır.
Vidalı qapaqlı flakona 8 ml susuz metanol əlavə edin.Sonra 4 ml 3 N. metanolic HCl məhlulu, qapaqla örtülmüş və çalxalanmışdır.Bu proses su istifadə etmir.
Oliqosakarid nümunələrinə və standart TMS borularına 500 µl 1 M HCl metanol məhlulu əlavə edin.Nümunələr bir gecədə (168 saat) 80° C-də istilik blokunda inkubasiya edilmişdir.Metanoliz məhsulunu qurutma manifoldundan istifadə edərək otaq temperaturunda qurutun.200 µl MeOH əlavə edin və yenidən qurudun.Bu proses iki dəfə təkrarlanır.Nümunəyə 200 µl metanol, 100 µl piridin və 100 µl sirkə anhidrid əlavə edin və yaxşı qarışdırın.Nümunələr otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edildi.və qurudulur.200 µl metanol əlavə edin və yenidən qurudun.
200 µl Tri-Sil əlavə edin və qapaqlı borunu 20 dəqiqə qızdırın.80 ° C, sonra otaq temperaturuna qədər soyudulur.Nümunəni təxminən 50 µl həcmdə daha da qurutmaq üçün qurutma manifoldundan istifadə edin.Nümunələrin tam qurumasına icazə vermədiyimizi qeyd etmək vacibdir.
2 ml heksan əlavə edin və vortekslə yaxşıca qarışdırın.Pasteur pipetlərinin (5-8 mm) uclarını 5-3/4 düym diametrli pipetin üzərinə şüşə yunu daxil edərək şüşə yun parçası ilə doldurun.Nümunələr 3000 q-da 2 dəqiqə sentrifuqa edilmişdir.Hər hansı həll olunmayan qalıqlar çökür.Nümunəni 100-150 µl qurudun.GC-MS-ə 80 °C ilkin temperaturda və 2,0 dəqiqəlik ilkin vaxtda təxminən 1 μl həcmində yeridildi (Cədvəl 2).