Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Metodo immunologiko eta masa espektrometriko berriak AFEX-ekin aurrez tratatutako arto-satean oligosakarido iraunkorren analisi konplexuetarako.Biomasa lignozelulosikoa erregai fosilen alternatiba iraunkorra da eta asko erabiltzen da elikagaiak, pentsuak, erregaiak eta produktu kimikoak bezalako produktuak ekoizteko bioteknologiak garatzeko.Teknologia hauen gakoa landareen hormetan dauden karbohidrato konplexuak glukosa, xilosa eta arabinosa bezalako azukre sinpleetan bihurtzeko kostu-lehiakortasuneko prozesuen garapena da.Biomasa lignozelulosikoa oso egoskorra denez, tratamendu termokimikoak (adibidez, amoniako zuntz esfoliazioa (AFEX), azido diluituak (DA), likido ionikoak (IL)) eta tratamendu biologikoak (adibidez, hidrolisi entzimatikoa eta mikrobio-hartzidura) konbinatuta egin behar zaizkio nahi den produktua lortzeko..Dena den, hidrolisi-prozesuan onddoen entzima komertzialak erabiltzen direnean, eratutako azukre disolbagarrien % 75-85 baino ez dira monosakaridoak, eta gainerako % 15-25 oligosakarido disolbagarriak eta konponezinak dira, mikroorganismoek beti eskura ez dituztenak.Aurretik, oligosakarido burugogor disolbagarriak arrakastaz isolatu eta araztu ditugu karbono eta diatomea-lurraren bereizketa eta tamaina baztertzeko kromatografiaren konbinazioa erabiliz, eta haien entzimaren inhibizio-propietateak ere ikertu ditugu.Azido uroniko metilatuen ordezkapenak polimerizazio-maila altuagoa (DP) duten oligosakaridoak entzima-nahaste komertzialekin prozesatzeko zailagoak direla aurkitu dugu, DP baxua eta oligosakarido neutroak baino.Hemen hainbat metodo osagarriren erabileraren berri ematen dugu, besteak beste, landareen biomasako glikanoentzako antigorputz monoklonalak (mAbs) erabiliz, landare-zelulen hormetako glikano-loturak eta hidrolisatu entzimatikoetako glukano-loturak ezaugarritzeko, matrizeak lagundutako laser-desortzio ionizazioa, hegaldi-denbora-masa-espektrometria..MALDI-TOF-MS) ioi negatiboen, gas-kromatografia eta masa-espektrometria (GC-MS) desintegrazio sekundarioaren ondoren espektroskopia bidez lortutako egitura-informaziozko diagnostiko gailurrak erabiltzen ditu oligosakaridoen loturak deribatuz eta deribaturik gabe karakterizatzeko.Oligosakaridoen (DP 4-20) tamaina txikia dela eta, molekula hauek zailak dira mAb lotzeko eta karakterizatzeko.Arazo hori gainditzeko, biotina konjugazioan oinarritutako oligosakaridoen immobilizazio metodo berri bat aplikatu genuen, mikroplaken gainazalean DP baxuko oligosakarido disolbagarrien gehiengoa arrakastaz etiketatu zuena, eta gero errendimendu handiko mAb sistema batean erabili zen ligazio espezifikoko analisietarako.Metodo berri honek etorkizunean errendimendu handiko glikoma entsegu aurreratuagoak garatzea erraztuko du, biomarkatzaileetan dauden oligosakaridoak isolatu eta karakterizatzeko erabil daitezkeen diagnostiko helburuetarako.
Biomasa lignozelulosikoa, nekazaritza, basogintza, belar eta egurrezko materialez osatua, oinarrizko produktuak ekoizteko balizko lehengaia da, elikagaiak, pentsuak, erregaiak eta aitzindari kimikoak barne balio handiagoko produktuak ekoizteko1.Landareen hormetan dauden karbohidratoak (zelulosa eta hemizelulosa, esaterako) monosakaridoetan despolimerizatu egiten dira prozesamendu kimikoaren eta biotransformazioaren bidez (hidrolisi entzimatikoa eta mikrobioen hartzidura, esaterako).Ohiko aurretratamenduak hauek dira: amoniako zuntz hedapena (AFEX), azido diluitua (DA), likido ionikoa (IL) eta lurrun-leherketa (SE), zeinak produktu kimikoen eta beroaren konbinazioa erabiltzen duten lignozelulosa ekoizpena murrizteko landare-zelulen hormak irekiz3,4.materiaren burugogortasuna, 5. Hidrolisi entzimatikoa solido karga handian egiten da karbohidrato aktibo komertzialak dituzten entzima (CAZymes) eta mikrobioen hartzidura erabiliz, legamia edo bakterio transgenikoak erabiliz, bio-oinarritutako erregaiak eta produktu kimikoak 6 ekoizteko.
CAZymes entzima komertzialetan karbohidrato-azukre lotura konplexuak sinergikoki mozten dituzten entzima nahasketa konplexu batez osatuta daude, monosakaridoak sortzeko2,7.Lehenago jakinarazi genuen bezala, karbohidratoekin ligninaren polimero aromatikoen sare konplexuak oso trataezinak bihurtzen ditu, eta horrek azukre bihurketa osatugabea dakar, aurrez tratatutako biomasaren hidrolisi entzimatikoan sortzen ez diren sexu-oligosakaridoen %15-25 pilatuz.Hau biomasa aurretratamendu metodo ezberdinekin ohiko arazoa da.Botil-lepo honen arrazoi batzuk hidrolisian zehar entzimaren inhibizioa edo landare-biomasan azukre-loturak hausteko beharrezkoak diren funtsezko entzima eza edo maila baxua daude.Azukreen osaera eta egitura-ezaugarriak ulertzeak, hala nola, oligosakaridoen azukre-loturak, hidrolisian azukre-bihurketa hobetzen lagunduko digu, prozesu bioteknologikoak petroliotik eratorritako produktuekiko kostu-lehiakortasuna eginez.
Karbohidratoen egitura zehaztea erronka da eta metodoen konbinazioa behar da, hala nola, kromatografia likidoa (LC)11,12, erresonantzia magnetiko nuklearraren espektroskopia (NMR)13, elektroforesi kapilarra (CE)14,15,16 eta masa espektrometria (MS)17.,hamazortzi.MS metodoak, hala nola, hegaldiaren denbora-masa-espektrometria laser desortzioarekin eta matrize baten bidez ionizazioarekin (MALDI-TOF-MS) karbohidratoen egiturak identifikatzeko metodo polifazetikoak dira.Duela gutxi, sodio ioi aduktuen tandem MS (CID) tandem oligosakaridoen atxikitze-posizioei, konfigurazio anomerikoei, sekuentziak eta adarkatze-posizioei dagozkien hatz-markak identifikatzeko erabili izan da 20, 21.
Glikanoen analisia tresna bikaina da karbohidratoen loturak sakon identifikatzeko22.Metodo honek landareen hormako glikanora zuzendutako antigorputz monoklonalak (mAb) erabiltzen ditu zunda gisa karbohidratoen lotura konplexuak ulertzeko.Mundu osoan 250 mAb baino gehiago daude eskuragarri, hainbat oligosakarido lineal eta adarkatuen aurka diseinatutako hainbat sakarido erabiliz24.Hainbat mAb asko erabili dira landare-zelulen hormaren egitura, osaera eta aldaketak ezaugarritzeko, landare-zelulen motaren, organoaren, adinaren, garapen-etaparen eta hazkuntza-ingurunearen arabera desberdintasun handiak baitaude25,26.Duela gutxi, metodo hau landare- eta animalia-sistemetako besikulen populazioak eta dagozkien rolak glikanoen garraioan zelula azpiko markatzaileak, garapen-faseak edo ingurumen-estimuluak zehazten dituena ulertzeko eta jarduera entzimatikoa zehazteko erabili da.Identifikatu diren glikanoen eta xilanen egitura desberdinetako batzuk pektina (P), xilanoa (X), mananoa (M), xiloglukanoak (XylG), lotura mistoko glukanoak (MLG), arabinoxilanoa (ArbX), galaktomannanoa (GalG), azido glukuronikoa-arabinoxilanoa (GArbX) eta arabino-Galactan (ArbX)2 (ArbX)2 (ArbX)2.
Hala ere, ikerketa-ahalegin horiek guztiak izan arren, ikerketa gutxi batzuk baino ez dira solidoen karga handiko hidrolisian (HSL) metaketaren izaeran zentratu, oligosakaridoen askapena, hidrolisian kate oligomerikoen luzera-aldaketak, DP baxuko hainbat polimero eta haien kurbak barne.banaketak 30,31,32.Bien bitartean, glikanoen analisia tresna erabilgarria dela frogatu bada ere glikanen egituraren azterketa integralerako, zaila da ur disolbagarriak diren DP oligosakarido baxuak antigorputz metodoak erabiliz ebaluatzea.5-10 kDa baino gutxiagoko pisu molekularra duten DP oligosakarido txikiagoak ez dira ELISA plakekin lotzen 33, 34 eta antigorputzak gehitu aurretik garbitzen dira.
Hemen, lehen aldiz, ELISA saiakera bat erakusten dugu avidinaz estalitako plaketan antigorputz monoklonalak erabiliz, oligosakarido erregogor disolbagarrietarako urrats bakarreko biotinilazio prozedura bat glikoma analisiarekin konbinatuz.Glikomaren analisirako gure ikuspegia MALDI-TOF-MS eta GC-MS oinarritutako oligosakaridoen lotura osagarrien analisien bidez balioztatu zen, azukre hidrolizatuen konposizioen trimetilsilil (TMS) deribazioa erabiliz.Ikuspegi berritzaile hau errendimendu handiko metodo gisa garatu daiteke etorkizunean eta ikerketa biomedikoan aplikazio zabalagoa aurki daiteke35.
Itzulpen-ondoko entzimen eta antigorputzen aldaketak, hala nola glikosilazioa36, haien jarduera biologikoan eragiten dute.Esaterako, serum-proteinen glikosilazio-aldaketek paper garrantzitsua dute hanturazko artritisean, eta glikosilazio-aldaketak diagnostiko-markatzaile gisa erabiltzen dira37.Literaturan hainbat glikano erraz agertzen dira hainbat gaixotasunetan, besteak beste, traktu gastrointestinaleko eta gibeleko hanturazko gaixotasun kronikoak, infekzio birikoak, obario, bularreko eta prostatako minbiziak38,39,40.Antigorputzetan oinarritutako glikan ELISA metodoak erabiliz glikanen egitura ulertzeak gaixotasunen diagnostikoan konfiantza gehigarria emango du MS metodo konplexurik erabili gabe.
Gure aurreko ikerketak erakutsi zuen oligosakarido burugogorrak hidrolizatu gabe geratzen zirela aurretratamenduaren eta hidrolisi entzimatikoaren ondoren (1. irudia).Aurretik argitaratutako lanean, ikatz aktibatua fase solidoko erauzketa metodo bat garatu genuen AFEX-ekin aurrez tratatutako arto-hidrolizatutik (ACSH) oligosakaridoak isolatzeko8.Hasierako erauzketa eta banandu ondoren, oligosakaridoak tamaina-esklusio-kromatografiaren (SEC) zatikatu ziren eta pisu molekularraren ordenan bildu ziren.Hainbat aurretratamenduetatik askatzen diren azukre monomeroak eta oligomeroak azukrearen konposizioaren analisiaren bidez aztertu dira.Aurretratamendu-metodo ezberdinen bidez lortutako azukre-oligomeroen edukia alderatzean, oligosakarido egoskorren presentzia ohiko arazoa da biomasa monosakarido bihurtzeko eta azukre-etekinaren murrizketa ekar dezake gutxienez % 10-15eko eta are % 18ra arteko murrizketa.AEB.Metodo hau oligosakaridoen frakzioak eskala handian ekoizteko erabiltzen da.Ondorioz, ACH eta bere ondorengo frakzioak pisu molekular ezberdineko material esperimental gisa erabili dira lan honetan oligosakaridoak karakterizatzeko.
Aurretratamenduaren eta hidrolisi entzimatikoaren ondoren, oligosakarido iraunkorrak hidrolizatu gabe geratu ziren.Hona hemen (A) oligosakaridoak bereizteko metodo bat da, non oligosakaridoak AFEX-en aurretratatutako arto-hidrolizadotik (ACSH) isolatzen diren ikatz aktiboz eta diatomea-lurrez jositako ohe bat erabiliz;(B) Oligosakaridoak bereizteko metodoa.Oligosakaridoak gehiago bereizi ziren tamaina-esklusio-kromatografiaren bidez (SEC);(C) Hainbat aurretratamendutatik askatutako sakarido monomeroak eta oligomeroak (azido diluitua: DA, likido ionikoa: IL eta AFEX).Hidrolisi entzimatikoaren baldintzak: solidoen karga handia % 25 (p/w) (gutxi gorabehera % 8 glukan karga), 96 orduko hidrolisia, 20 mg/g entzimaren karga komertziala (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratioa) eta (D) Azukre-monomeroak eta oligomeroak glukosaren, EX artino stover-etatik askatuta, EX, xylose-ak askatzen dituena.
Glikanoen analisia tresna erabilgarria dela frogatu da biomasa solidoaren hondakinetatik isolatutako extractetan glikanen egitura-analisi integralerako.Hala ere, ur-disolbagarriak diren sakaridoak metodo tradizional hau erabiliz gutxietsita daude41, pisu molekular baxuko oligosakaridoak ELISA plaketan inmobilizatzen zailak direlako eta antigorputzak gehitu aurretik garbitzen direlako.Hori dela eta, antigorputzak lotzeko eta karakterizatzeko, urrats bakarreko biotinilazio-metodo bat erabili zen avidinaz estalitako ELISA plaketan oligosakarido disolbagarriak eta ez-betegarriak estaltzeko.Metodo hau aldez aurretik ekoitzitako ACSH eta bere pisu molekularra (edo polimerizazio maila, DP) oinarritutako frakzio bat erabiliz probatu zen.Urrats bakarreko biotinilazioa oligosakaridoen lotura-afintasuna areagotzeko erabili zen, karbohidratoaren muturrean biotina-LC-hidrazida gehituz (2. irudia).Disoluzioan, muturreko hemiazetal taldeak biotina-LC-hidrazidaren hidrazida taldearekin erreakzionatzen du hidrazona lotura sortzeko.NaCNBH3 agente erreduktorearen aurrean, hidrazonaren lotura amaierako produktu biotinilatu egonkor batera murrizten da.Azukre murrizteko muturra aldatzearekin batera, DP baxuko oligosakaridoak ELISA plakekin lotzea posible egin zen, eta gure ikerketan hau avidinaz estalitako plaketan egin zen glikanoa zuzendutako mAbs erabiliz.
ELISAn oinarritutako antigorputz monoklonalen baheketa, oligosakarido biotinilatuetarako.Hona hemen (A) oligosakaridoen biotinilazio konbinatua eta ondorengo ELISA baheketa, glikanoa zuzendutako mAbekin NeutrAvidin estalitako plaketan eta (B) erreakzio produktuen biotinilaziorako urrats bakarreko prozedura erakusten du.
Ondoren, oligosakaridoekin konjugatutako antigorputzekin avidinaz estalitako plakak antigorputz primarioei eta sekundarioei gehitu zitzaizkien eta argiari eta denborari sentikorra den medio batean garbitu ziren.Antigorputzak lotu ondoren, gehitu TMB substratua plaka inkubatzeko.Azkenean erreakzioa azido sulfurikoarekin gelditu zen.Inkubatutako plakak ELISA irakurgailu baten bidez aztertu ziren, antigorputz bakoitzaren lotura-indarra zehazteko, antigorputz espezifikoen gurutzaketa detektatzeko.Esperimentuaren xehetasunak eta parametroak ikusteko, ikusi dagokion atala "Materialak eta metodoak".
Garatu berri den metodo honen erabilgarritasuna aplikazio zehatzetarako frogatzen dugu ACSH-n dauden oligosakarido disolbagarriak zein hidrolizato lignozelulosikoetatik isolatutako oligosakarido-frakzio gordin eta araztuetan ezaugarrituz.3. Irudian ikusten den bezala, ACSH-n identifikatutako xilano ohikoenak glikoma bioazilatutako saiakuntza metodoak erabiliz uronikoak (U) edo metiluronikoak (MeU) eta arabinogalaktano pektikoak izan ohi dira.Horietako gehienak solido ez-hidrolizatuen glikanoen (UHS) analisiari buruzko gure aurreko ikerketan ere aurkitu ziren43.
Oligosakaridoen epitopo errecalcitrantak detektatzea zelula hormako glikanora zuzendutako antigorputz monoklonal baten bidez.Zatiki “neutroa” ACN frakzioa da eta frakzio “azidoa” FA frakzioa.Bero-mapako gorri distiratsuek epitopo-eduki handiagoa adierazten dute, eta urdin distiratsuek atzealde hutsa adierazten dute.Eskalan kolore-balioak N=2 formulazioetarako OD balio gordinetan oinarritzen dira.Eskuinean antigorputzak ezagutzen dituen epitopo nagusiak ageri dira.
Egitura ez-zelulosa hauek ezin izan dituzte zelulasa eta hemizelulasa ohikoenek zatitu probatutako entzima komertzialen nahasketan, gehien erabiltzen diren entzima komertzialak biltzen dituena.Hori dela eta, entzima laguntzaile berriak behar dira haien hidrolisirako.Zelulosaz kanpoko entzima osagarririk gabe, zelulosaz kanpoko lotura hauek monosakarido bihurtzea eragozten dute, nahiz eta haien guraso azukre-polimeroak zati laburragoetan hidrolizatzen diren eta entzima-nahaste komertzialen bidez disolbatzen diren.
Seinalearen banaketaren eta bere lotze-indarraren azterketa gehiago ikusi zuten epitopo lotzaileak baxuagoak zirela DP altuko azukre-frakzioetan (A, B, C, DP 20+ arte) DP baxuko frakzioetan (D, E, F, DP) dimeroetan baino) (1. irudia).Azido zatiak ohikoagoak dira zelulosakoak ez diren epitopoetan zati neutroak baino.Fenomeno hauek gure aurreko ikerketan ikusitako ereduarekin bat datoz, non DP eta azido zati handiak hidrolisi entzimatikoarekiko erresistenteagoak ziren.Hori dela eta, zelulosa ez diren glikanen epitopoen eta U eta MeU ordezkapenen presentziak asko lagundu dezake oligosakaridoen egonkortasunean.Kontuan izan behar da lotura- eta detekzio-eraginkortasuna DP baxuko oligosakaridoentzat problematikoa izan daitekeela, batez ere epitopoa oligosakarido dimeriko edo trimeriko bat bada.Luzera ezberdinetako oligosakarido komertzialak erabiliz probatu daiteke, bakoitzak mAb zehatz bati lotzen zaion epitopo bakarra duelarik.
Horrela, egitura-espezifikoak diren antigorputzak erabiltzeak lotura errecalcitrant mota batzuk agerian utzi zituen.Erabilitako antigorputz motaren, lotura-eredu egokiaren eta sortzen duen seinalearen indarraren arabera (gehiena eta gutxien ugariena), entzima berriak identifikatu eta erdi-kuantitatiboki gehitu daitezke entzima-nahasteari, glikokonbertsio osoago izateko.ACSH oligosakaridoen analisia adibidetzat hartuta, biomasa-material bakoitzerako glikano-loturen datu-base bat sor dezakegu.Kontuan izan behar da hemen antigorputzen afinitate desberdinak kontuan hartu behar direla, eta haien afinitatea ezezaguna bada, horrek zenbait zailtasun sortuko ditu antigorputz ezberdinen seinaleak alderatzean.Gainera, antigorputz beraren laginen artean ondoen funtziona dezake glikanoen loturen konparaketak.Lotura egoskor hauek CAZyme datu-basearekin lotu daitezke gero, eta bertatik entzimak identifikatu, entzima hautagaiak hautatu eta lotura hausten duten entzimak probatu ditzakegu, edo entzima horiek adierazteko mikrobiarren sistemak garatu biofindegietan erabiltzeko44.
Metodo immunologikoak hidrolizato lignozelulosikoetan dauden pisu molekular baxuko oligosakaridoak karakterizatzeko metodo alternatiboak nola osatzen dituzten ebaluatzeko, MALDI (4. irud., S1-S8) eta GC-MSn oinarritutako TMStik eratorritako sakaridoen azterketa egin genuen panel berean (5. irudia) oligosakaridoen zati batean.MALDI erabiltzen da oligosakaridoen molekulen masa-banaketa aurreikusitako egiturarekin bat datorren ala ez alderatzeko.irudian.4. irudiak ACN-A eta ACN-B osagai neutroen MC erakusten du.ACN-A analisiak DP 4-8 (4. irud.) eta DP 22 (S1. irudia) bitarteko pentosa azukre sorta bat baieztatu zuen, zeinen pisuak MeU-xylan oligosakaridoei dagozkie.ACN-B analisiak pentosa eta glukoxilanen seriea baieztatu zuen DP 8-15arekin.S3 irudia bezalako material osagarrian, FA-C zati azidoen masa-banaketaren mapek (Me)U ordezkaturiko pentosa azukre sorta bat erakusten dute, 8-15 DP-a dutenak, ELISAn oinarritutako mAb baheketan aurkitutako ordezkatutako xilanekin bat datozenak.Epitopoak koherenteak dira.
ACSn dauden oligosakarido ez-konformeen MALDI-MS espektroa.Hemen, (A) ACN-A azido uroniko metilatua (DP 4-8) glukuroxilano oligosakaridoak ordezkatu dituzte eta (B) ACN-B xilanoa eta azido uroniko metilatua glukuroxilanoarekin ordezkatuta (DP 8-15).
Oligosakarido erregogorren glikano-hondakinaren konposizioaren analisia.Hona hemen (A) GC-MS analisia erabiliz lortutako hainbat oligosakarido-frakzioen TMS sakaridoen konposizioa.(B) Oligosakaridoetan dauden TMStik eratorritako hainbat azukreren egiturak.ACN – oligosakarido neutroak dituen azetonitrilo frakzioa eta FA – oligosakarido azidoak dituen azido feruliko frakzioa.
Oligosakarido-frakzioaren LC-MS analisitik beste ondorio interesgarri bat atera zen, S9 irudian ikusten den moduan (metodoak material osagarri elektronikoan ikus daitezke).Hexosa eta -OAc taldeen zatiak behin eta berriz behatu ziren ACN-B frakzioaren ligatzean.Aurkikuntza honek glikoma eta MALDI-TOF analisian ikusitako zatiketa berresteaz gain, aurrez tratatutako biomasa lignozelulosikoko karbohidrato-deribatu potentzialen inguruko informazio berria ere ematen du.
Oligosakarido-frakzioaren azukre-konposizioa ere aztertu dugu TMS azukre-derrivatizazioa erabiliz.GC-MS erabiliz, azukre neural (ez-eratorriak) eta azidoen (GluA eta GalA) konposizioa zehaztu dugu oligosakaridoen frakzioan (5. irudia).Azido glukuronikoa C eta D osagai azidoetan aurkitzen da, eta azido galakturonikoa, berriz, A eta B osagai azidoetan, biak azukre azidoen DP handiko osagaiak.Emaitza hauek gure ELISA eta MALDI datuak berresteaz gain, aurreko oligosakaridoen metaketari buruzko ikerketekin bat datoz.Hori dela eta, uste dugu oligosakaridoen biotinilazioa eta ondorengo ELISA baheketa erabiliz metodo immunologiko modernoak nahikoak direla hainbat lagin biologikotan oligosakarido errekalzitrante disolbagarriak detektatzeko.
ELISAn oinarritutako mAb baheketa metodoak hainbat metodo ezberdinen bidez balioztatu direnez, metodo kuantitatibo berri honen potentziala gehiago aztertu nahi izan dugu.Bi oligosakarido komertzial, xilohexasakarido oligosakaridoa (XHE) eta 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), erosi eta probatu ziren zelula horma glikanora zuzendutako mAb ikuspegi berri bat erabiliz.6. irudiak lotura-seinale biotinilatuaren eta oligosakaridoen kontzentrazio logikoaren arteko korrelazio lineala erakusten du, Langmuir-en adsortzio-eredu posible bat iradokiz.MAb-en artean, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 eta CCRC-M151 XHErekin erlazionatuta, eta CCRC-M108, CCRC-M109 eta LM11 A2XXrekin 1 nm-tik 100 nano-tarte batean erlazionatuta.Esperimentuan zehar antigorputzen erabilgarritasun mugatua denez, esperimentu mugatuak egin ziren oligosakaridoen kontzentrazio bakoitzarekin.Kontuan izan behar da hemen antigorputz batzuek substratu baten oligosakarido beraren aurrean oso modu ezberdinean erreakzionatzen dutela, ustez epitopo apur bat desberdinekin lotzen direlako eta lotura-afinitate oso desberdinak izan ditzaketelako.Epitopoen identifikazio zehatzaren mekanismoak eta ondorioak askoz konplexuagoak izango dira mAb ikuspegi berria benetako laginetan aplikatzen denean.
Bi oligosakarido komertzial erabili ziren glikanen xede diren hainbat mAb detekzio-eremua zehazteko.Hemen, oligosakaridoen kontzentrazio logikoen korrelazio linealek Langmuir-en adsortzio-ereduak adierazten dituzte (A) XHE mAb-ekin eta (B) A2XX mAb-ekin.Dagokion epitopoek saiakuntzan substratu gisa erabilitako oligosakarido komertzialen egiturak adierazten dituzte.
Glukanen xede diren antigorputz monoklonalen erabilera (analisi glikokomikoa edo ELISAn oinarritutako mAb baheketa) tresna indartsua da landareen biomasa osatzen duten zelula-hormako glikano nagusi gehienen karakterizazio sakona egiteko.Hala ere, glikanoen analisi klasikoak zelula hormako glikano handiagoak baino ez ditu ezaugarritzen, oligosakarido gehienak ez baitira modu eraginkorrean inmobilizatu ELISA plaketan.Azterketa honetan, AFEX-ek aurretratatutako artoa entzimatikoki hidrolizatu zen solido-eduki handian.Azukrearen analisia erabili zen hidrolizatuan dauden zelula-horma errekalzitratuen karbohidratoen konposizioa zehazteko.Hala ere, hidrolisatuetan oligosakarido txikiagoen mAb analisia gutxiesten da, eta tresna osagarriak behar dira ELISA plaketan oligosakaridoak modu eraginkorrean immobilizatzeko.
Hemen mAb baheketarako oligosakaridoen inmobilizazio metodo berri eta eraginkor baten berri ematen dugu, oligosakaridoen biotinilazioa eta, ondoren, NeutrAvidin™ estalitako plaketan ELISA emanaldia konbinatuz.Inmobilizatutako biotinilatutako oligosakaridoek nahikoa afinitate erakutsi zuten antigorputzarekiko oligosakarido errekalzitranteak azkar eta eraginkor detektatzeko.Masa espektrometrian oinarritutako oligosakarido burugogor hauen konposizioaren analisiak immunoscreeningaren ikuspegi berri honen emaitzak berretsi zituen.Horrela, ikerketa hauek frogatzen dute oligosakaridoen biotinilazioaren eta ELISA baheketaren konbinazioa glikanoari zuzendutako antigorputz monoklonalekin konbinatuta oligosakaridoetan lotura gurutzatuak detektatzeko erabil daitekeela eta oligosakaridoen egitura ezaugarritzen duten beste ikerketa biokimiko batzuetan oso zabalduta aplika daitekeela.
Biotinan oinarritutako glikanen profila metodo hau landare-biomasan oligosakarido disolbagarrien karbohidrato-lotura errecalcitrantak ikertzeko gai den lehen txostena da.Horrek biomasaren zati batzuk zergatik diren hain burugogorrak ulertzen laguntzen du bioerregaien ekoizpenari dagokionez.Metodo honek hutsune garrantzitsu bat betetzen du glikoma analisi metodoetan eta landareen oligosakaridoetatik haratago substratu sorta zabalago batera zabaltzen du bere aplikazioa.Etorkizunean, biotinilaziorako robotika erabil dezakegu eta ELISA erabiliz laginen errendimendu handiko analisirako garatu dugun metodoa erabiliko dugu.
Pioneer 33A14 hazi hibridoetatik hazitako arto lastoa (CS) 2010ean bildu zen Ray, Coloradoko Kramer Farms-en.Lur-jabearen baimenarekin, biomasa hori ikerketarako erabil daiteke. Laginak zip-lock-poltsetan gorde ziren lehorrean <% 6ko hezetasuna giro-tenperaturan. Laginak zip-lock-poltsetan gorde ziren lehorrean <% 6ko hezetasuna giro-tenperaturan. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнап. Laginak lehorrean gorde ziren % 6ko hezetasunarekin kremaileradun poltsetan giro-tenperaturan.样品在室温下以干燥<% 6 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥<% 6 Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < %6. Laginak kremailera-poltsetan gordetzen dira giro-tenperaturan, hezetasuna % 6 baino gutxiagorekin.Azterketak tokiko eta estatuko jarraibideekin bat egin zuen.Konposizio-analisia NREL protokoloa erabiliz egin da.Konposizioak % 31,4 glukanoa, % 18,7 xilanoa, % 3,3 arabinana, % 1,2 galactanoa, % 2,2 azetiloa, % 14,3 lignina, % 1,7 proteina eta % 13,4 errautsak ditu.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, VCNI 0001 lotea) Novozymes-eko (Franklinton, NC, AEB) zelulasa, β-glukosidasa eta Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, VHN00001 lotea) nahasketa konplexua da).Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), pektina degradatzen duten entzimen nahasketa konplexua, DuPont Industrial Biosciences-ek (Palo Alto, CA, AEB) eman zuen.Proteinen entzimaren kontzentrazioa proteina-edukia kalkulatuz (eta nitrogeno ez-proteinikoaren ekarpena kenduz) Kjeldahl nitrogenoaren analisia erabiliz (AOAC metodoa 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, AEB).Diatomea 545 EMD Millipore-ri (Billerica, MA) erosi zitzaion.Ikatz aktibatua (DARCO, 100 sareko granulak), Avicel (PH-101), pago xilanoa eta gainerako produktu kimiko guztiak Sigma-Aldrich-en (St. Louis, MO) erosi ziren.
AFEX aurretratamendua GLBRCn (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, AEB) egin zen.Aurretratamendua 140° C-tan egin zen 15 minutuz.46 egonaldi-denbora amoniako anhidroaren eta biomasaren proportzioan 1:1 altzairu herdoilgaitzezko mahai-erreaktore batean (Parr Instruments Company) % 60 (p/w) kargatuta.30 minutu behar izan zituen.Erreaktorea 140 °C-ra eraman zen eta amoniakoa azkar askatu zen, biomasa giro-tenperaturara azkar itzultzeko aukera emanez.AFEX aldez aurretik tratatutako arto-sukaldearen (ACS) osaera tratatu gabeko arto-sukaldearen (UT-CS) antzekoa zen.
Solido altuak ACSH % 25 (p/w) (gutxi gorabehera % 8 dextran karga) oligosakaridoen eskala handian ekoizteko hasierako material gisa prestatu zen.ACS-ren hidrolisi entzimatikoa entzima-nahasketa komertzial bat erabiliz egin zen Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukan (pretratatutako biomasan), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukan eta Multifect Pectinase (Genencor Inc, AEB).).), 5 mg proteina/g dextrano.Hidrolisi entzimatikoa 5 litroko bioerreaktore batean egin da, 3 litroko lan-bolumena, pH 4,8, 50 °C eta 250 rpm-koa.96 orduz hidrolisi ondoren, hidrolizatua zentrifugatuz bildu zen 6000 rpm-an 30 minutuz eta ondoren 14000 rpm-an 30 minutuz hidrolizatu gabeko solidoak kentzeko.Ondoren, hidrolizatua iragazketa esterila jarri zitzaion 0,22 mm-ko iragazki-ontzi baten bidez.Iragazitako hidrolizatua botila esteriletan gorde zen 4° C-tan eta gero karbonoan zatitu zen.
Estraktu bidezko biomasa laginen konposizioaren analisia NREL laborategiko analisi-prozeduren arabera: konposizio-analisirako laginak prestatzea (NREL/TP-510-42620) eta egiturazko karbohidratoak eta lignina biomasan zehaztea (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizatuaren korrontearen oligosakaridoen analisia 2 ml-ko eskalan egin zen, autoklabean oinarritutako hidrolisi azidoaren metodoa erabiliz.Nahastu hidrolizatuaren lagina % 72ko azido sulfurikoko 69,7 µl-rekin 10 ml-ko torloju-tapoiaren kultura-hodi batean eta inkubatu ordubete mahai gainean 121 °C-tan, hoztu izotzean eta iragazi errendimendu handiko kromatografia likidoko (HPLC) ontzi batean.Hidrolisatutako laginaren monosakaridoen kontzentrazioa azidoz hidrolizatutako laginaren azukre-kontzentrazio osotik kenduz zehaztu zen oligosakaridoen kontzentrazioa.
Hidrolisatutako biomasa azidoan glukosa, xilosa eta arabinosaren kontzentrazioa laginketa automatikoarekin, zutabe-berogailuarekin, ponpa isokratikoarekin eta errefrakzio-indize detektagailuarekin hornitutako Shimadzu HPLC sistema batekin aztertu ziren Bio-Rad Aminex HPX-87H zutabe batean.Zutabea 50 °C-tan mantendu zen eta 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 uretan eluatu zen.fluxua.
Hidrolizatuaren gainditzailea diluitu eta monomero eta oligosakaridoen edukia aztertu zen.Hidrolisi entzimatikoaren ondoren lortutako azukre monomerikoak Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P zutabe batekin eta errauts babesteko zutabe batekin hornitutako HPLC bidez aztertu ziren.Zutabearen tenperatura 80 °C-tan mantendu zen, ura erabili zen fase mugikor gisa 0,6 ml/min-ko emariarekin.Oligosakaridoak azido diluitu batean hidrolisi bidez zehazten ziren 121 °C-tan, erreferentzian deskribatutako metodoen arabera.41, 48, 49.
Sakaridoen analisia biomasa-hondakin gordinak, AFEX-a aurrez tratatutakoak eta hidrolizatu gabeko biomasa-hondakin guztietan (serie zelulen horma-estraktuen ekoizpena eta haien mAb baheketa barne) egin ziren, aurretik deskribatutako prozedurak erabiliz 27, 43, 50, 51.Glikoma analisirako, landare-zelulen horma-materialaren alkoholean disolbaezinak diren hondakinak biomasa-hondakinetatik prestatzen dira eta serieko erauzketan jartzen dira gero eta erasokorragoak diren erreaktiboekin, hala nola amonio oxalatoa (50 mM), sodio karbonatoa (50 mM eta %0,5 p/v), CON.(1M eta 4M, biak %1 p/v sodio borohidruroarekin) eta azido kloritoa lehen azaldu bezala52,53.Ondoren, laburpenak ELISA egin zituzten zelula-hormako glikanora zuzendutako mAb50-en panel konplexu baten aurka, eta mAb-en lotura-erreakzioak bero-mapa gisa aurkeztu ziren.Landare-zelulen horma glikanorako mAbak laborategiko izakinetatik erosi ziren (CCRC, JIM eta MAC serieak).
Oligosakaridoen biotinilazioa urrats bakarrean.Karbohidratoak biotina-LC-hidrazidarekin konjugatzea ondorengo prozeduraren bidez egin zen.Biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dimetil sulfoxidoan (DMSO, 70 μl) disolbatu zen indartsu irabiatuz eta 65° C-tan berotuz 1 min.Azido azetiko glaziala (30 µl) gehitu zen eta nahasketa sodio zianoborohidrurora (6,4 mg/100 µmol) isuri eta guztiz disolbatu zen 65 º C-tan minutu 1 inguruz berotu ondoren.Ondoren, erreakzio-nahastearen 5 eta 8 μl-ra gehitu ziren oligosakarido lehorra (1-100 nmol) etiketa-muturretik 10 aldiz edo gehiago molar bat lortzeko.Erreakzioa 65 °C-tan egin zen 2 orduz, eta ondoren laginak berehala araztu ziren.Etiketatze-esperimentuetan ez zen sodio zianoborohidrurorik erabili murrizketarik gabe, eta laginak 65° C-tan erreakzionatu ziren 2,5 orduz.
ELISA estaldura eta oligosakarido biotinilatuen laginen garbiketa.25 μl lagin biotinilatuak (100 μl lagin kontzentratu bakoitzaren 5 ml 0,1 M Tris tampon-disoluzio (TBS)) gehitu ziren abidinaz estalitako plakaren putzu bakoitzean.Kontrol-hobiak 50 μl biotinaz estali ziren 10 μg/ml-ko kontzentrazioan 0,1 M TBSn.Neurketa hutsetarako estaldura gisa ura deionizatua erabili zen.Tableta 2 orduz inkubatu zen giro-tenperaturan iluntasunean.Garbitu plaka 3 aldiz % 0,1eko esne gaingabetuarekin 0,1 M TBStan, programa zk.11 Grenier pisurako 3A.
Antigorputz primarioak gehitzea eta garbitzea.Gehitu 40 µl antigorputz primario putzu bakoitzean.Inkubatu mikroplaka ordubetez giro-tenperaturan ilunpetan.Ondoren, plakak 3 aldiz garbitu ziren % 0,1eko esnearekin 0,1 M TBS-n, Grenier Flat 3Arako #11 garbiketa-programa erabiliz.
Gehitu bigarren mailako antigorputzak eta garbitu.Gehitu 50 µl saguaren/arratoiaren bigarren mailako antigorputz (1:5000 diluitua % 0,1eko esnetan 0,1 M TBStan) putzu bakoitzean.Inkubatu mikroplaka ordubetez giro-tenperaturan ilunpetan.Ondoren, mikroplakak 5 aldiz garbitu ziren % 0,1eko esnearekin 0,1 M TBSn Grenier Flat 5A plaka garbitzeko #12 programa erabiliz.
Substratua gehitzea.Gehitu 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) oinarriko substratuari (2 tanta buffer, 3 tanta TMB, 2 tanta hidrogeno peroxido 15 ml ur desionizatutan gehituz).Prestatu TMB substratua.eta erabili aurretik zurrunbiloa).Inkubatu mikroplaka giro-tenperaturan 30 minutuz.Ilunpetan.
Osatu urratsa eta irakurri tableta.Gehitu 1 N azido sulfuriko 50 µl putzu bakoitzean eta erregistratu 450-655 nm-ko absorbantzia ELISA irakurgailu baten bidez.
Prestatu analito hauen 1 mg/ml disoluzioa ur deionizatuan: arabinosa, ramnosa, fukosa, xilosa, azido galakturonikoa (GalA), azido glukuronikoa (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-acetilmanosamina (manNAc), N-acetilglukosamina.(glcNAc), N-acetilgalaktosamina (galNAc), inositol (barne estandarra).Bi estandar prestatu ziren 1. taulan agertzen diren 1 mg/mL azukre-soluzioak gehituz. Laginak izoztu eta liofilizatu egiten dira -80° C-tan, ur guztia kendu arte (normalean 12-18 ordu inguru).
Gehitu 100-500 µg lagin torlojudun hodietan balantza analitiko batean.Grabatu gehitutako zenbatekoa.Hobe da lagina disolbatzaile kontzentrazio zehatz batean disolbatzea eta hodiari alikuota likido gisa gehitzea.Erabili 1 mg/ml inositol 20 µl barne estandar gisa lagin-hodi bakoitzeko.Laginari gehitzen zaion barne estandarraren kantitatea hodi estandarrari gehitutako barne estandarraren kopuruaren berdina izan behar du.
Gehitu 8 ml metanol anhidro torlojudun ontzi batean.Ondoren, 3 N. HCl metanolaren disoluzio 4 ml, tapatu eta astindu.Prozesu honek ez du urik erabiltzen.
Gehitu 1 M HCl metanol disoluzio 500 µl oligosakaridoen laginei eta TMS hodi estandarrei.Laginak gau osoan (168 ordu) inkubatu ziren 80° C-tan bloke termiko batean.Lehortu metanolisi-produktua giro-tenperaturan lehortze-kolektiboa erabiliz.Gehitu 200 µl MeOH eta lehortu berriro.Prozesu hau bi aldiz errepikatzen da.Gehitu 200 µl metanol, 100 µl piridina eta 100 µl anhidrido azetiko laginari eta ondo nahastu.Laginak giro-tenperaturan inkubatu ziren 30 minutuz.eta lehortu.Gehitu 200 µl metanol eta lehortu berriro.
Gehitu 200 µl Tri-Sil eta berotu estalitako hodia 20 minutuz.80 °C, gero giro-tenperaturara hoztu.Erabili lehorgailu bat lagina gehiago lehortzeko, gutxi gorabehera 50 µl-ko bolumenera.Garrantzitsua da kontuan izan ez genuela laginak guztiz lehortzen utzi.
Gehitu 2 ml hexano eta ondo nahastu zurrunbiloarekin.Bete Pasteur pipeten (5-8 mm) puntak beirazko artile puska batekin, kristalezko artilea 5-3/4 hazbeteko diametroko pipeta baten gainean sartuz.Laginak 3000 g-tan zentrifugatu ziren 2 minutuz.Hondakin disolbaezinak hauspeatzen dira.Lehortu lagina 100-150 µl-ra.Gutxi gorabehera 1 μl-ko bolumena injektatu zen GC-MSra 80 °C-ko hasierako tenperaturan eta 2,0 minutuko hasierako denboran (2. taula).