Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद।तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ।उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अपडेट गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)।यस बीचमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट रेन्डर गर्नेछौं।
नयाँ इम्युनोलोजिकल र मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधिहरू AFEX सँग प्रिटिटेड मकैको स्टोभरमा पर्सिस्टेन्ट ओलिगोसाकराइडहरूको जटिल विश्लेषणको लागि।Lignocellulosic बायोमास जीवाश्म ईन्धन को एक दिगो विकल्प हो र व्यापक रूप देखि खाद्य, फीड, ईन्धन र रसायनहरु जस्तै उत्पादनहरु को उत्पादन को लागी जैविक प्रविधिहरु को विकास को लागी प्रयोग गरिन्छ।यी प्रविधिहरूको कुञ्जी भनेको बिरुवाको कोषिका पर्खालहरूमा रहेको जटिल कार्बोहाइड्रेटहरूलाई ग्लुकोज, जाइलोज र अरेबिनोज जस्ता साधारण चिनीहरूमा रूपान्तरण गर्न लागत-प्रतिस्पर्धी प्रक्रियाहरूको विकास हो।किनकी lignocellulosic बायोमास धेरै जिद्दी छ, यो थर्मोकेमिकल उपचार (जस्तै, अमोनिया फाइबर एक्सफोलिएशन (AFEX), पातलो एसिड (DA), आयनिक तरल पदार्थ (IL)) र जैविक उपचार (जस्तै, ईन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस र माइक्रोबियल किण्वन) को लागि इच्छा उत्पादन को संयोजन मा अधीन हुनुपर्छ।।यद्यपि, जब व्यावसायिक फंगल इन्जाइमहरू हाइड्रोलिसिस प्रक्रियामा प्रयोग गरिन्छ, गठन हुने 75-85% मात्र घुलनशील चिनीहरू मोनोस्याकराइडहरू हुन्, र बाँकी 15-25% घुलनशील, असभ्य ओलिगोसाकराइडहरू हुन्, जुन सूक्ष्मजीवहरूमा सधैं उपलब्ध हुँदैनन्।पहिले, हामीले कार्बन र डायटोमेसियस पृथ्वी विभाजन र साइज बहिष्कार क्रोमेटोग्राफीको संयोजन प्रयोग गरी घुलनशील जिद्दी ओलिगोसाकराइडहरूलाई सफलतापूर्वक अलग र शुद्ध गरेका छौं, र तिनीहरूको इन्जाइम अवरोध गर्ने गुणहरूको पनि अनुसन्धान गरेका छौं।हामीले फेला पारेका छौँ कि उच्च स्तरको पोलिमराइजेशन (डीपी) मेथाइलेटेड युरोनिक एसिड प्रतिस्थापन भएका ओलिगोसेकराइडहरू कम डीपी र तटस्थ ओलिगोसेकराइडहरू भन्दा कमर्शियल इन्जाइम मिश्रणहरूसँग प्रशोधन गर्न गाह्रो हुन्छ।यहाँ हामी धेरै अतिरिक्त विधिहरूको प्रयोगको रिपोर्ट गर्छौं, मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू (mAbs) प्लान्टको लागि विशिष्ट बायोमास ग्लाइकान्स प्रयोग गरेर प्लान्ट सेल भित्ताहरू र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसेट्स, म्याट्रिक्स-सहायता लेजर डिसोर्प्शन आयनीकरण, समय-अफ-फ्लाइट मास-स्पेक्ट्रोमेट्रीमा ग्लाइकान बन्डहरू चित्रण गर्नको लागि ग्लाइकान प्रोफाइलिङ सहित।।MALDI-TOF-MS) ले नकारात्मक आयनहरू, ग्यास क्रोमेटोग्राफी र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-MS) को माध्यमिक क्षय पछि स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त संरचना-सूचनात्मक निदान चोटीहरू प्रयोग गर्दछ ओलिगोसेकराइड बन्डहरू डेरिभेटाइजेसन बिना र बिना विशेषता गर्न।oligosaccharides (DP 4-20) को सानो आकारको कारण, यी अणुहरू mAb बाइन्डिङ र चरित्रीकरणको लागि प्रयोग गर्न गाह्रो छ।यस समस्यालाई पार गर्न, हामीले नयाँ बायोटिन कन्जुगेशन-आधारित ओलिगोसाकराइड इमोबिलाइजेशन विधि लागू गर्‍यौं जसले माइक्रोप्लेट सतहमा कम DP घुलनशील ओलिगोसाकराइडहरूको बहुमतलाई सफलतापूर्वक लेबल गर्‍यो, जुन त्यसपछि विशिष्ट लिगेशन विश्लेषणको लागि उच्च थ्रुपुट mAb प्रणालीमा प्रयोग गरिएको थियो।यो नयाँ विधिले भविष्यमा थप उन्नत उच्च थ्रुपुट ग्लाइकोम एसेसको विकासलाई सहज बनाउनेछ जुन डायग्नोस्टिक उद्देश्यका लागि बायोमार्करहरूमा उपस्थित oligosaccharides अलग गर्न र विशेषता गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।
लिग्नोसेल्युलोसिक बायोमास, कृषि, वन, घाँस र काठ सामग्रीहरू मिलेर बनेको, उच्च मूल्यका उत्पादनहरू उत्पादन गर्न खाद्य, दाना, इन्धन र रासायनिक पूर्ववर्तीहरू सहित जैव-आधारित उत्पादनहरूको उत्पादनको लागि सम्भावित फिडस्टक हो।कार्बोहाइड्रेटहरू (जस्तै सेलुलोज र हेमिसेल्युलोज) बिरुवाको कोषका पर्खालहरूमा पाइने रासायनिक प्रशोधन र बायोट्रान्सफर्मेसन (जस्तै एन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिस र माइक्रोबियल किण्वन) द्वारा मोनोसेकराइडहरूमा डिपोलिमराइज गरिन्छ।सामान्य पूर्व-उपचारहरूमा अमोनिया फाइबर विस्तार (AFEX), पातलो एसिड (DA), आयनिक तरल (IL), र स्टीम विस्फोट (SE), जसले बिरुवाको सेल पर्खालहरू खोलेर लिग्नोसेलुलोज उत्पादन कम गर्न रसायन र गर्मीको संयोजन प्रयोग गर्दछ।पदार्थको जिद्दी, 5. इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस उच्च ठोस लोडमा व्यावसायिक सक्रिय कार्बोहाइड्रेट युक्त इन्जाइमहरू (CAZymes) र माइक्रोबियल किण्वन ट्रान्सजेनिक खमीर वा ब्याक्टेरिया प्रयोग गरेर बायो-आधारित इन्धन र रसायनहरू उत्पादन गर्न गरिन्छ।
व्यावसायिक इन्जाइमहरूमा CAZymesहरू इन्जाइमहरूको जटिल मिश्रणबाट बनेका हुन्छन् जसले मोनोस्याकराइडहरू 2,7 बनाउनको लागि जटिल कार्बोहाइड्रेट-चिनी बन्धनलाई समन्वयात्मक रूपमा क्लिभ गर्छ।हामीले पहिले रिपोर्ट गरेझैं, कार्बोहाइड्रेटको साथ लिग्निनको सुगन्धित पोलिमरहरूको जटिल नेटवर्कले तिनीहरूलाई अत्यधिक जटिल बनाउँछ, जसले अपूर्ण चिनी रूपान्तरणमा निम्त्याउँछ, 15-25% सेक्स ओलिगोसाकराइडहरू जम्मा गर्छ जुन पूर्व-उपचारित बायोमासको इन्जाइमेटिक हाइड्रोलिसिसको समयमा उत्पादन हुँदैन।यो विभिन्न बायोमास प्रिट्रीटमेन्ट विधिहरूमा एक सामान्य समस्या हो।यस अवरोधका केही कारणहरूमा हाइड्रोलिसिसको क्रममा इन्जाइम अवरोध, वा बिरुवाको बायोमासमा चिनी बन्धन तोड्न आवश्यक पर्ने आवश्यक इन्जाइमहरूको अभाव वा कम स्तर समावेश छ।चिनीको संरचना र संरचनात्मक विशेषताहरू बुझ्दै, जस्तै oligosaccharides मा चिनी बन्ड, हामीलाई हाइड्रोलिसिसको समयमा चिनी रूपान्तरण सुधार गर्न मद्दत गर्नेछ, बायोटेक्नोलोजिकल प्रक्रियाहरू पेट्रोलियम-व्युत्पन्न उत्पादनहरूसँग लागत-प्रतिस्पर्धी बनाउन।
कार्बोहाइड्रेटको संरचना निर्धारण गर्न चुनौतीपूर्ण छ र तरल क्रोमेटोग्राफी (LC) 11,12, परमाणु चुम्बकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (NMR) 13, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस (CE) 14,15,16 र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) 17 जस्ता विधिहरूको संयोजन आवश्यक छ।, अठार।MS विधिहरू जस्तै टाइम-अफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री लेजर डिसोर्प्शन र म्याट्रिक्स (MALDI-TOF-MS) को प्रयोग गरेर आयनीकरण कार्बोहाइड्रेट संरचनाहरू पहिचान गर्न बहुमुखी विधि हो।हालसालै, सोडियम आयन एडक्ट्सको कोलिजन-इन्ड्युस्ड डिसोसिएशन (सीआईडी) टेन्डम एमएस ओलिगोसेकराइड एट्याचमेन्ट पोजिसन, एनोमेरिक कन्फिगरेसन, सिक्वेन्स, र ब्रान्चिङ पोजिसन 20, 21 सँग सम्बन्धित फिंगरप्रिन्टहरू पहिचान गर्न व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ।
ग्लाइकन विश्लेषण कार्बोहाइड्रेट बन्ड22 को गहन पहिचान को लागी एक उत्कृष्ट उपकरण हो।यस विधिले जटिल कार्बोहाइड्रेट लिङ्केजहरू बुझ्नको लागि प्रोबको रूपमा सेल भित्ता ग्लाइकान रोप्न निर्देशित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू (mAbs) प्रयोग गर्दछ।250 mAbs भन्दा बढी विश्वव्यापी उपलब्ध छन्, विभिन्न saccharides24 प्रयोग गरेर विभिन्न रेखीय र शाखादार ओलिगोसाकराइडहरू विरुद्ध डिजाइन गरिएको।बिरुवाको कोशिकाको पर्खालको संरचना, संरचना र परिमार्जनहरू चित्रण गर्न धेरै mAbs को व्यापक रूपमा प्रयोग गरिएको छ, किनकि त्यहाँ बिरुवाको कोषको प्रकार, अंग, उमेर, विकास चरण, र वृद्धिको वातावरणमा आधारित महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू छन्।25,26।हालसालै, यस विधिलाई सबसेलुलर मार्करहरू, विकास चरणहरू, वा वातावरणीय उत्तेजनाहरू द्वारा निर्धारित रूपमा, र इन्जाइम्याटिक गतिविधि निर्धारण गर्न, बोट र पशु प्रणालीहरूमा भेसिकल जनसंख्या र ग्लाइकन यातायातमा तिनीहरूको सम्बन्धित भूमिकाहरू बुझ्न प्रयोग गरिएको छ।glycans र xylans को केहि फरक संरचनाहरु को पहिचान गरिएको छ कि pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), मिश्रित बन्ड glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (Arabinooxylan) र glucuronic acid-Arabinooxylan (Arabinooxylan)।
यद्यपि, यी सबै अनुसन्धान प्रयासहरूको बावजुद, केवल केही अध्ययनहरूले उच्च ठोस लोड (एचएसएल) हाइड्रोलाइसिसको समयमा ओलिगोसेकराइड संचयको प्रकृतिमा केन्द्रित गरेको छ, जसमा ओलिगोसेकराइड रिलीज, हाइड्रोलिसिसको क्रममा ओलिगोमेरिक चेन लम्बाइ परिवर्तनहरू, विभिन्न कम डीपी पोलिमरहरू, र तिनीहरूको वक्रहरू समावेश छन्।वितरण 30,31,32।यसैबीच, यद्यपि ग्लाइकान विश्लेषणले ग्लाइकन संरचनाको व्यापक विश्लेषणको लागि उपयोगी उपकरण साबित भएको छ, एन्टिबडी विधिहरू प्रयोग गरेर पानीमा घुलनशील कम डीपी ओलिगोसाकराइडहरू मूल्याङ्कन गर्न गाह्रो छ।5-10 kDa भन्दा कम आणविक तौल भएका साना DP ओलिगोसाकराइडहरू ELISA प्लेटहरू 33, 34 मा बाँध्दैनन् र एन्टिबडी थप्नु अघि धोइन्छ।
यहाँ, पहिलो पटक, हामीले मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरू प्रयोग गरेर एविडिन-कोटेड प्लेटहरूमा एलिसा परख प्रदर्शन गर्छौं, ग्लाइकोम विश्लेषणको साथ घुलनशील अपवर्तक ओलिगोसाकराइडहरूको लागि एक-चरण बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया संयोजन गर्दै।ग्लाइकोम विश्लेषणको लागि हाम्रो दृष्टिकोण MALDI-TOF-MS र GC-MS मा आधारित पूरक oligosaccharide लिंकेजहरूको विश्लेषण द्वारा ट्राइमेथाइलसिलिल (TMS) हाइड्रोलाइज्ड चिनी रचनाहरूको व्युत्पन्नीकरण प्रयोग गरेर प्रमाणित गरिएको थियो।यो अभिनव दृष्टिकोण भविष्यमा उच्च-थ्रुपुट विधिको रूपमा विकसित गर्न सकिन्छ र बायोमेडिकल अनुसन्धानमा व्यापक अनुप्रयोग फेला पार्न सकिन्छ।
इन्जाइमहरू र एन्टिबडीहरू, जस्तै ग्लाइकोसिलेशन, 36 को अनुवाद पछिको परिमार्जनहरूले तिनीहरूको जैविक गतिविधिलाई असर गर्छ।उदाहरणका लागि, सीरम प्रोटीनहरूको ग्लाइकोसिलेशनमा परिवर्तनहरूले सूजन गठियामा महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छ, र ग्लाइकोसिलेशनमा परिवर्तनहरू निदान मार्करहरू 37 को रूपमा प्रयोग गरिन्छ।साहित्यमा विभिन्न प्रकारका ग्लाइकान्सहरू जठरांत्र र कलेजो, भाइरल इन्फेक्सन, डिम्बग्रंथि, स्तन र प्रोस्टेट क्यान्सर ३८,३९,४० को दीर्घकालीन भडकाऊ रोगहरू सहित विभिन्न रोगहरूमा सजिलै देखिन रिपोर्ट गरिएको छ।एन्टिबडी-आधारित ग्लाइकान ELISA विधिहरू प्रयोग गरेर ग्लाइकान्सको संरचना बुझ्नाले जटिल MS विधिहरू प्रयोग नगरी रोग निदानमा थप आत्मविश्वास प्रदान गर्नेछ।
हाम्रो अघिल्लो अध्ययनले देखाएको छ कि जिद्दी ओलिगोसाकराइडहरू प्रीट्रीटमेन्ट र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस (चित्र 1) पछि हाइड्रोलाइज्ड रहन्छन्।हाम्रो अघिल्लो प्रकाशित कार्यमा, हामीले AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) 8 बाट oligosaccharides अलग गर्न एक सक्रिय चारकोल ठोस चरण निकासी विधि विकास गर्यौं।प्रारम्भिक निकासी र विभाजन पछि, oligosaccharides थप आकार बहिष्करण क्रोमेटोग्राफी (SEC) द्वारा विभाजित गरियो र आणविक वजनको क्रममा सङ्कलन गरियो।विभिन्न प्रिट्रीटमेन्टहरूबाट जारी गरिएको सुगर मोनोमर र ओलिगोमरहरू चिनी संरचना विश्लेषणद्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।विभिन्न पूर्व-उपचार विधिहरूद्वारा प्राप्त गरिएको चिनी ओलिगोमरहरूको सामग्रीको तुलना गर्दा, जिद्दी ओलिगोसाकराइडहरूको उपस्थिति बायोमासलाई मोनोसेकराइडमा रूपान्तरणमा एक सामान्य समस्या हो र यसले कम्तिमा 10-15% र 18% सम्म पनि चिनीको उत्पादनमा कमी ल्याउन सक्छ।USयो विधि oligosaccharide अंशहरूको थप ठूलो मात्रामा उत्पादनको लागि प्रयोग गरिन्छ।नतिजा ACH र विभिन्न आणविक तौलहरु संग यसको पछिल्लो अंशहरु लाई यस कार्य मा oligosaccharides को विशेषता को लागी प्रयोगात्मक सामग्री को रूप मा प्रयोग गरिएको थियो।
प्रीट्रीटमेन्ट र इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस पछि, लगातार ओलिगोसाकराइडहरू हाइड्रोलाइज नगरी रह्यो।यहाँ (A) एक oligosaccharides पृथकीकरण विधि हो जसमा oligosaccharides AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) बाट सक्रिय कार्बन र डायटोमेसियस पृथ्वीको प्याक गरिएको बेड प्रयोग गरी अलग गरिन्छ;(B) oligosaccharides को अलग गर्ने विधि।oligosaccharides थप आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (SEC) द्वारा अलग गरिएको थियो;(C) Saccharide monomers र oligomers विभिन्न pretreatments (पतला एसिड: DA, ionic तरल: IL र AFEX) बाट जारी।इन्जाइमेटिक हाइड्रोलिसिस अवस्थाहरू: 25% (w/w) को उच्च ठोस लोडिङ (लगभग 8% ग्लुकान लोड), 96 घण्टा हाइड्रोलिसिस, 20 mg/g कमर्शियल इन्जाइम लोडिङ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 अनुपात) र (D) सुगर र मोनोसेल्युमरोसियोमरोसेएएफबाट जारी गरिएको शुगर एक्सएनयूएमएक्स। EX पूर्व-उपचार गरिएको मकै स्टोभर (ACS)।
ग्लाइकान विश्लेषण ठोस बायोमास अवशेषहरूबाट अलग गरिएका अर्कहरूमा ग्लाइकान्सको विस्तृत संरचनात्मक विश्लेषणको लागि उपयोगी उपकरण साबित भएको छ।जे होस्, पानीमा घुलनशील स्याकराइडहरू यस परम्परागत विधिको प्रयोग गरेर कम प्रतिनिधित्व गरिन्छ41 किनभने कम आणविक तौल ओलिगोसेकराइडहरू ELISA प्लेटहरूमा स्थिर हुन गाह्रो हुन्छ र एन्टिबडी थप्नु अघि धोइन्छ।तसर्थ, एन्टिबडी बाइन्डिङ र विशेषताको लागि, एविडिन-लेपित ELISA प्लेटहरूमा घुलनशील, गैर-अनुपालन ओलिगोसाकराइडहरू कोट गर्न एक-चरण बायोटिनाइलेशन विधि प्रयोग गरिएको थियो।यो विधि हाम्रो पहिले उत्पादन गरिएको ACSH र यसको आणविक वजन (वा पोलिमराइजेशनको डिग्री, DP) मा आधारित एक अंश प्रयोग गरेर परीक्षण गरिएको थियो।कार्बोहाइड्रेटको घटाउने अन्त्यमा बायोटिन-एलसी-हाइड्रजाइड थपेर ओलिगोसेकराइड बाइन्डिङ एफिनिटी बढाउन एक-चरण बायोटिनाइलेशन प्रयोग गरिएको थियो (चित्र 2)।समाधानमा, घटाउने अन्तमा हेमियासेटल समूहले बायोटिन-एलसी-हाइड्रजाइडको हाइड्राजाइड समूहसँग प्रतिक्रिया गरेर हाइड्रोजोन बन्ड बनाउँछ।घटाउने एजेन्ट NaCNBH3 को उपस्थितिमा, हाइड्रोजोन बन्डलाई स्थिर बायोटिनिलेटेड अन्त उत्पादनमा घटाइन्छ।चिनी घटाउने अन्त्यको परिमार्जनको साथ, एलिसा प्लेटहरूमा कम डीपी ओलिगोसाकराइडहरू बाँध्न सम्भव भयो, र हाम्रो अध्ययनमा यो ग्लाइकन-लक्षित mAbs प्रयोग गरेर एविडिन-कोटेड प्लेटहरूमा गरिएको थियो।
बायोटिनाइलेटेड ओलिगोसाकराइड्सका लागि ELISA मा आधारित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरूको स्क्रीनिंग।यहाँ (A) न्यूट्रएभिडिन लेपित प्लेटहरूमा ग्लाइकान-लक्षित mAbs सँग oligosaccharides र त्यसपछि ELISA स्क्रिनिङको संयुक्त बायोटिनाइलेशन र (B) प्रतिक्रिया उत्पादनहरूको बायोटिनाइलेशनको लागि एक-चरण प्रक्रिया देखाउँछ।
oligosaccharide-conjugated एन्टिबडीहरूको साथ Avidin-लेपित प्लेटहरू त्यसपछि प्राथमिक र माध्यमिक एन्टिबडीहरूमा थपियो र हल्का र समय-संवेदनशील माध्यममा धोइयो।एन्टिबडी बाइन्डिङ पूरा भएपछि, प्लेट इनक्यूबेट गर्न TMB सब्सट्रेट थप्नुहोस्।प्रतिक्रिया अन्ततः सल्फ्यूरिक एसिड संग रोकियो।एन्टिबडी-विशिष्ट क्रस-लिङ्किङ पत्ता लगाउन प्रत्येक एन्टिबडीको बाध्यकारी शक्ति निर्धारण गर्न एलिसा रिडर प्रयोग गरेर इन्क्युबेटेड प्लेटहरू विश्लेषण गरियो।प्रयोगको विवरण र मापदण्डहरूका लागि, सम्बन्धित खण्ड "सामग्री र विधिहरू" हेर्नुहोस्।
हामी ACSH मा उपस्थित घुलनशील ओलिगोसेकराइडहरू साथै लिग्नोसेलुलोसिक हाइड्रोलाइसेट्सबाट पृथक कच्चा र शुद्ध ओलिगोसाकराइड अंशहरूमा विशेष अनुप्रयोगहरूको लागि यो नयाँ विकसित विधिको उपयोगिता प्रदर्शन गर्दछौं।चित्र 3 मा देखाइए अनुसार, बायोएसाइलेटेड ग्लाइकोम परख विधिहरू प्रयोग गरेर ACSH मा पहिचान गरिएको सबैभन्दा सामान्य एपिटोप-प्रतिस्थापित xylans सामान्यतया uronic (U) वा methyluronic (MeU) र pectic arabinogalactans हुन्।तीमध्ये अधिकांश गैर-हाइड्रोलाइज्ड ठोस (UHS) 43 को ग्लाइकान्सको विश्लेषणमा हाम्रो अघिल्लो अध्ययनमा पनि फेला परेका थिए।
कोशिका भित्ता ग्लाइकानमा निर्देशित मोनोक्लोनल एन्टिबडी प्रयोग गरेर रिक्लसिट्रान्ट ओलिगोसेकराइड एपिटोपहरूको पहिचान।"तटस्थ" अंश ACN अंश हो र "अम्लीय" अंश FA अंश हो।हिटम्यापमा उज्यालो रातोले उच्च एपिटोप सामग्रीलाई संकेत गर्दछ, र उज्यालो ब्लुजले खाली पृष्ठभूमिलाई संकेत गर्दछ।स्केलमा रङ मानहरू सूत्रहरू N=2 को लागि कच्चा OD मानहरूमा आधारित छन्।एन्टिबडीहरू द्वारा पहिचान गरिएका मुख्य एपिटोपहरू दायाँमा देखाइएका छन्।
यी गैर-सेलुलोज संरचनाहरू परीक्षण गरिएको व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रणमा सबैभन्दा सामान्य सेल्युलासेस र हेमिसेल्युलासेसहरूद्वारा क्लीभ गर्न सकिँदैन, जसमा सबैभन्दा सामान्य रूपमा प्रयोग हुने व्यावसायिक इन्जाइमहरू समावेश छन्।त्यसकारण, तिनीहरूको हाइड्रोलिसिसको लागि नयाँ सहायक इन्जाइमहरू आवश्यक छन्।आवश्यक गैर-सेल्युलोज सहायक इन्जाइमहरू बिना, यी गैर-सेल्युलोज बन्डहरूले मोनोसेकराइडहरूमा पूर्ण रूपान्तरणलाई रोक्छन्, भले पनि तिनीहरूको अभिभावक चिनी पोलिमरहरू छोटो टुक्राहरूमा ठूलो रूपमा हाइड्रोलाइज गरिएको छ र व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रणहरू प्रयोग गरेर विघटन गरिएको छ।
सिग्नल वितरण र यसको बाध्यकारी शक्तिको थप अध्ययनले देखाएको छ कि बाइन्डिङ एपिटोपहरू उच्च DP चिनी अंशहरूमा कम थिए (A, B, C, DP 20+ सम्म) कम DP fractions (D, E, F, DP) dimers मा) (चित्र 1)।एसिड टुक्राहरू तटस्थ टुक्राहरू भन्दा गैर-सेलुलोज एपिटोपहरूमा बढी सामान्य हुन्छन्।यी घटनाहरू हाम्रो अघिल्लो अध्ययनमा अवलोकन गरिएको ढाँचासँग मिल्दोजुल्दो छन्, जहाँ उच्च डीपी र एसिड मोइटीहरू इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलिसिसको लागि बढी प्रतिरोधी थिए।तसर्थ, गैर-सेल्युलोज ग्लाइकन एपिटोप्स र U र MeU प्रतिस्थापनहरूको उपस्थितिले ओलिगोसाकराइड्सको स्थिरतामा ठूलो योगदान दिन सक्छ।यो ध्यान दिनुपर्छ कि कम DP ओलिगोसेकराइडहरूका लागि बाध्यकारी र पत्ता लगाउने दक्षता समस्याग्रस्त हुन सक्छ, विशेष गरी यदि एपिटोप डाइमेरिक वा ट्रिमरिक ओलिगोसाकराइड हो।यो बिभिन्न लम्बाइको व्यावसायिक oligosaccharides प्रयोग गरेर परीक्षण गर्न सकिन्छ, प्रत्येकमा एउटा मात्र एपिटोप हुन्छ जुन एक विशिष्ट mAb मा बाँधिन्छ।
यसरी, संरचना-विशिष्ट एन्टिबडीहरूको प्रयोगले निश्चित प्रकारका रिक्लसिट्रान्ट बन्डहरू प्रकट गर्यो।प्रयोग गरिएको एन्टिबडीको प्रकार, उपयुक्त लिगेशन ढाँचा, र यसले उत्पादन गर्ने संकेतको बल (सबैभन्दा कम र कम मात्रामा) को आधारमा नयाँ इन्जाइमहरू पहिचान गर्न सकिन्छ र थप पूर्ण ग्लाइकोकन्भर्सनको लागि इन्जाइम मिश्रणमा अर्ध-परिमाणात्मक रूपमा थप्न सकिन्छ।ACSH oligosaccharides को विश्लेषणलाई उदाहरणको रूपमा लिएर, हामी प्रत्येक बायोमास सामग्रीको लागि ग्लाइकन बन्डहरूको डाटाबेस सिर्जना गर्न सक्छौं।यहाँ यो ध्यान दिनु पर्छ कि एन्टिबडीहरूको विभिन्न आत्मीयतालाई ध्यानमा राख्नुपर्छ, र यदि तिनीहरूको सम्बन्ध अज्ञात छ भने, यसले विभिन्न एन्टिबडीहरूको संकेतहरू तुलना गर्दा केही कठिनाइहरू सिर्जना गर्नेछ।थप रूपमा, ग्लाइकन बन्डहरूको तुलना एउटै एन्टिबडीको लागि नमूनाहरू बीच राम्रो काम गर्न सक्छ।यी जिद्दी बन्डहरू त्यसपछि CAZyme डाटाबेसमा लिङ्क गर्न सकिन्छ, जसबाट हामी इन्जाइमहरू पहिचान गर्न सक्छौं, उम्मेदवार इन्जाइमहरू चयन गर्न र बन्ड तोड्ने इन्जाइमहरूको लागि परीक्षण गर्न सक्छौं, वा बायोरिफाइनरीहरूमा प्रयोगको लागि यी इन्जाइमहरू व्यक्त गर्न माइक्रोबियल प्रणालीहरू विकास गर्न सक्छौं।
इम्युनोलोजिकल विधिहरूले lignocellulosic hydrolysates मा उपस्थित कम आणविक तौल oligosaccharides को विशेषता को लागी वैकल्पिक विधिहरु को पूरक कसरी मूल्यांकन गर्न को लागी, हामीले MALDI (चित्र 4, S1-S8) र एउटै प्यानल मा GC-MS मा आधारित TMS-व्युत्पन्न saccharides को विश्लेषण (Fig.5) भाग।MALDI को तुलना गर्न प्रयोग गरिन्छ कि oligosaccharide अणुहरूको सामूहिक वितरण उद्देश्य संरचनासँग मेल खान्छ।अंजीर मा।4 ले तटस्थ घटक ACN-A र ACN-B को MC देखाउँछ।ACN-A विश्लेषणले DP 4-8 (Fig. 4) देखि DP 22 (Fig. S1) सम्मको पेन्टोज शर्कराको दायरा पुष्टि गर्‍यो, जसको तौल MeU-xylan oligosaccharides सँग मेल खान्छ।ACN-B विश्लेषणले DP 8-15 सँग पेन्टोज र ग्लुकोक्सिलन श्रृंखला पुष्टि गर्‍यो।Figure S3 जस्ता पूरक सामाग्रीमा, FA-C एसिडिक मोइटी मास डिस्ट्रिब्युसन नक्साले (Me)U प्रतिस्थापित पेन्टोज सुगरको दायरा 8-15 को DP सँग देखाउँदछ जुन ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंगमा फेला परेको प्रतिस्थापित xylans सँग मेल खान्छ।Epitopes संगत छन्।
ACS मा उपस्थित घुलनशील गैर-अनुपालक ओलिगोसाकराइडहरूको MALDI-MS स्पेक्ट्रम।यहाँ, (A) ACN-A कम तौल दायराका अंशहरू जसमा मिथाइलेटेड युरोनिक एसिड (DP 4-8) प्रतिस्थापित ग्लुकुरोक्सिलान ओलिगोसेकराइडहरू र (B) ACN-B xylan र methylated uronic एसिड oligosaccharides glucuroxylan (DP 8-15) को साथ प्रतिस्थापित गरियो।
दुर्दम्य oligosaccharides को glycan अवशेष को संरचना को विश्लेषण।यहाँ (A) GC-MS विश्लेषण प्रयोग गरेर प्राप्त विभिन्न oligosaccharide अंशहरूको TMS saccharide रचना।(B) विभिन्न TMS-व्युत्पन्न चिनीहरूको संरचनाहरू oligosaccharides मा उपस्थित।ACN - acetonitrile अंश जसमा तटस्थ oligosaccharides र FA - एसिड oligosaccharides युक्त फेरुलिक एसिड अंश।
अर्को चाखलाग्दो निष्कर्ष oligosaccharide अंशको LC-MS विश्लेषणबाट निकालिएको थियो, जस्तै चित्र S9 मा देखाइएको छ (विद्युतीय पूरक सामग्रीमा विधिहरू देख्न सकिन्छ)।हेक्सोज र -OAc समूहका टुक्राहरू ACN-B अंशको ligation को समयमा बारम्बार अवलोकन गरियो।यो खोजले ग्लाइकोम र MALDI-TOF विश्लेषणमा अवलोकन गरिएको खण्डीकरणको पुष्टि मात्र गर्दैन, तर पूर्व-उपचारित लिग्नोसेलुलोसिक बायोमासमा सम्भावित कार्बोहाइड्रेट डेरिभेटिभहरूको बारेमा नयाँ जानकारी पनि प्रदान गर्दछ।
हामीले TMS चिनी डेरिभेटिजेसन प्रयोग गरेर ओलिगोसेकराइड अंशको चिनी संरचनाको पनि विश्लेषण गर्यौं।GC-MS को प्रयोग गरेर, हामीले oligosaccharide fraction (Fig. 5) मा न्यूरल (गैर-व्युत्पन्न) र अम्लीय शर्करा (GluA र GalA) को संरचना निर्धारण गर्यौं।ग्लुकुरोनिक एसिड अम्लीय घटक C र D मा पाइन्छ, जबकि ग्यालेक्टोरोनिक एसिड अम्लीय घटक A र B मा पाइन्छ, जुन दुबै एसिडिक चिनीको उच्च डीपी घटक हुन्।यी नतिजाहरूले हाम्रो ELISA र MALDI डेटा मात्र पुष्टि गर्दैन, तर oligosaccharide संचयको हाम्रो अघिल्लो अध्ययनहरूसँग पनि एकरूप छन्।त्यसकारण, हामी विश्वास गर्छौं कि oligosaccharides को बायोटिनाइलेशन र त्यसपछि ELISA स्क्रिनिङ प्रयोग गरी आधुनिक इम्युनोलोजिकल विधिहरू विभिन्न जैविक नमूनाहरूमा घुलनशील रिक्लसिट्रान्ट ओलिगोसाकराइडहरू पत्ता लगाउन पर्याप्त छन्।
ELISA-आधारित mAb स्क्रिनिङ विधिहरू धेरै फरक विधिहरूद्वारा मान्य भएको हुनाले, हामी यस नयाँ मात्रात्मक विधिको सम्भावनालाई थप अन्वेषण गर्न चाहन्थ्यौं।दुई व्यावसायिक oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) र 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), खरिद गरिएको थियो र सेल भित्ता ग्लाइकन लक्षित नयाँ mAb दृष्टिकोण प्रयोग गरेर परीक्षण गरियो।चित्र 6 ले बायोटिनाइलेटेड बाइन्डिङ सिग्नल र ओलिगोसाकराइड एकाग्रताको लग एकाग्रता बीचको रैखिक सम्बन्ध देखाउँछ, सम्भावित Langmuir सोखना मोडेलको सुझाव दिन्छ।mAbs मध्ये, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, र CCRC-M151 XHE सँग सम्बन्धित छन्, र CCRC-M108, CCRC-M109, र LM11 01 देखि 01 मिनेटको दायरामा A2XX सँग सम्बन्धित छन्।प्रयोगको क्रममा एन्टिबडीहरूको सीमित उपलब्धताको कारण, प्रत्येक ओलिगोसाकराइड एकाग्रतासँग सीमित प्रयोगहरू प्रदर्शन गरियो।यहाँ ध्यान दिनुपर्छ कि केही एन्टिबडीहरूले एउटै ओलिगोसेकराइडलाई सब्सट्रेटको रूपमा धेरै फरक प्रतिक्रिया दिन्छ, सम्भवतः किनभने तिनीहरू थोरै फरक एपिटोपहरूमा बाँध्छन् र धेरै फरक बाध्यकारी सम्बन्धहरू हुन सक्छन्।नयाँ mAb दृष्टिकोण वास्तविक नमूनाहरूमा लागू गर्दा सही एपिटोप पहिचानको संयन्त्र र प्रभावहरू धेरै जटिल हुनेछन्।
दुई व्यावसायिक oligosaccharides विभिन्न glycan-लक्ष्यीकरण mAbs को पत्ता लगाउन दायरा निर्धारण गर्न प्रयोग गरिएको थियो।यहाँ, oligosaccharide एकाग्रता को लग एकाग्रता संग रैखिक सहसंबंध (A) mAb संग XHE र mAb संग A2XX को लागी Langmuir सोखना पैटर्न को संकेत गर्दछ।सम्बन्धित एपिटोपहरूले परखमा सब्सट्रेटको रूपमा प्रयोग हुने व्यावसायिक ओलिगोसाकराइडहरूको संरचनालाई संकेत गर्दछ।
ग्लाइकान-लक्षित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरूको प्रयोग (ग्लाइकोकोमिक विश्लेषण वा ELISA-आधारित mAb स्क्रीनिंग) बिरुवाको बायोमास बनाउने अधिकांश प्रमुख सेल पर्खाल ग्लाइकान्सहरूको गहिरो विशेषताको लागि एक शक्तिशाली उपकरण हो।यद्यपि, शास्त्रीय ग्लाइकान विश्लेषणले ठूला सेल भित्ता ग्लाइकान्सलाई मात्र चित्रण गर्दछ, किनकि धेरैजसो ओलिगोसाकराइडहरू ELISA प्लेटहरूमा प्रभावकारी रूपमा स्थिर हुँदैनन्।यस अध्ययनमा, AFEX-pretreated मकई स्टोभर उच्च ठोस सामग्रीमा इन्जाइमेटिक रूपमा हाइड्रोलाइज गरिएको थियो।चिनी विश्लेषण हाइड्रोलाइजेट मा recalcitrant सेल पर्खाल कार्बोहाइड्रेट को संरचना निर्धारण गर्न को लागी प्रयोग गरिएको थियो।यद्यपि, हाइड्रोलाइसेट्समा साना ओलिगोसाकराइडहरूको mAb विश्लेषणलाई कम अनुमान गरिएको छैन, र ELISA प्लेटहरूमा ओलिगोसाकराइडहरूलाई प्रभावकारी रूपमा स्थिर गर्न थप उपकरणहरू आवश्यक पर्दछ।
हामी यहाँ न्यूट्रएभिडिन ™ लेपित प्लेटहरूमा oligosaccharide बायोटिनाइलेशन संयोजन गरेर एमएबी स्क्रीनिंगको लागि एक उपन्यास र कुशल oligosaccharide immobilization विधि रिपोर्ट गर्छौं।स्थिर बायोटिनाइलेटेड ओलिगोसाकराइड्सले एन्टिबडीको लागि पर्याप्त आत्मीयता देखाएको छ र रिक्लसिट्रान्ट ओलिगोसाकराइडहरूको द्रुत र कुशल पहिचान सक्षम गर्न।मास स्पेक्ट्रोमेट्रीमा आधारित यी जिद्दी ओलिगोसाकराइडहरूको संरचनाको विश्लेषणले इम्युनोस्क्रिनिङको लागि यो नयाँ दृष्टिकोणको नतिजा पुष्टि गर्‍यो।तसर्थ, यी अध्ययनहरूले देखाउँछन् कि oligosaccharide biotinylation र Glycan-लक्षित मोनोक्लोनल एन्टिबडीहरूसँग ELISA स्क्रिनिङको संयोजन oligosaccharides मा क्रसलिङ्कहरू पत्ता लगाउन प्रयोग गर्न सकिन्छ र oligosaccharides को संरचना विशेषता अन्य बायोकेमिकल अध्ययनहरूमा व्यापक रूपमा लागू गर्न सकिन्छ।
यो बायोटिन-आधारित ग्लाइकन प्रोफाइलिङ विधि बिरुवाको बायोमासमा घुलनशील ओलिगोसाकराइड्सको रिक्लसिट्रान्ट कार्बोहाइड्रेट बन्डहरू अनुसन्धान गर्न सक्षम पहिलो रिपोर्ट हो।यसले बायोमासका केही भागहरू जैव इन्धन उत्पादनमा किन जिद्दी हुन्छन् भनेर बुझ्न मद्दत गर्छ।यो विधिले ग्लाइकोम विश्लेषण विधिहरूमा महत्त्वपूर्ण खाडल भर्छ र यसको प्रयोगलाई बिरुवाको ओलिगोसाकराइडभन्दा बाहिरको सब्सट्रेटहरूको फराकिलो दायरामा विस्तार गर्दछ।भविष्यमा, हामी बायोटिनाइलेसनको लागि रोबोटिक्स प्रयोग गर्न सक्छौं र ELISA प्रयोग गरेर नमूनाहरूको उच्च-थ्रुपुट विश्लेषणको लागि हामीले विकास गरेको विधि प्रयोग गर्न सक्छौं।
पायोनियर 33A14 हाइब्रिड बीउबाट उब्जाइएको मकैको पराल (CS) कोलोराडोको रेको क्रेमर फार्मबाट २०१० मा काटिएको थियो।जग्गाधनीको अनुमति लिएर यो बायोमास अनुसन्धानका लागि प्रयोग गर्न सकिन्छ। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिप-लक झोलाहरूमा 6% भन्दा कम नमीमा भण्डारण गरिएको थियो। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिप-लक झोलाहरूमा 6% भन्दा कम नमीमा भण्डारण गरिएको थियो। Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре। नमूनाहरू कोठाको तापक्रममा जिपर गरिएका झोलाहरूमा <6% आर्द्रतामा सुक्खा भण्डारण गरिएको थियो।样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中।样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%। नमूनाहरू 6% भन्दा कम आर्द्रताको साथ कोठाको तापक्रममा जिपर झोलाहरूमा भण्डारण गरिन्छ।अध्ययनले स्थानीय र राष्ट्रिय दिशानिर्देशहरूको पालना गर्‍यो।संरचनात्मक विश्लेषण NREL प्रोटोकल प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो।संरचनामा ३१.४% ग्लुकान, १८.७% जाइलान, ३.३% अरबिनान, १.२% ग्यालेक्टान, २.२% एसिटाइल, १४.३% लिग्निन, १.७% प्रोटिन र १३.४% खरानी रहेको पाइएको थियो।
Cellic® CTec2 (138 mg प्रोटीन/ml, lot VCNI 0001) cellulase, β-glucosidase र Cellic® HTec2 (157 mg प्रोटीन/ml, lot VHN00001) Novozymes (Franklinton, NC, USA) को जटिल मिश्रण हो।Multifect Pectinase® (72 mg प्रोटीन/mL), पेक्टिन डिग्रेडिङ इन्जाइमहरूको एक जटिल मिश्रण, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) द्वारा दान गरिएको थियो।इन्जाइम प्रोटीन सांद्रताहरू प्रोटिन सामग्री अनुमान गरेर (र गैर-प्रोटीन नाइट्रोजनको योगदान घटाएर) Kjeldahl नाइट्रोजन विश्लेषण (AOAC विधि 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) प्रयोग गरेर निर्धारण गरिएको थियो।Diatomaceous Earth 545 EMD Millipore (Billerica, MA) बाट खरिद गरिएको थियो।सक्रिय कार्बन (DARCO, 100 जाल ग्रेन्युल), Avicel (PH-101), बिच xylan, र अन्य सबै रसायनहरू सिग्मा-एल्ड्रिच (सेन्ट लुइस, MO) बाट खरिद गरिएको थियो।
AFEX pretreatment GLBRC (बायोमास रूपान्तरण अनुसन्धान प्रयोगशाला, MSU, Lansing, MI, USA) मा प्रदर्शन गरिएको थियो।पूर्व-उपचार 140 डिग्री सेल्सियसमा 15 मिनेटको लागि गरिएको थियो।46 स्टेनलेस स्टिल बेन्चटप ब्याच रिएक्टर (Parr Instruments Company) मा 60% (w/w) लोडिङमा निर्जल अमोनिया र बायोमासको 1:1 अनुपातमा निवास समय।यसले 30 मिनेट लियो।रिएक्टरलाई 140 डिग्री सेल्सियसमा ल्याइयो र अमोनिया द्रुत रूपमा रिलिज गरियो, बायोमासलाई चाँडै कोठाको तापक्रममा फर्कन अनुमति दिईयो।AFEX पूर्व-उपचार गरिएको मकै स्टोभर (ACS) को संरचना अनुपचारित मकै स्टोभर (UT-CS) को जस्तै थियो।
उच्च ठोस ACSH 25% (w/w) (लगभग 8% dextran लोडिङ) oligosaccharides को ठूलो मात्रामा उत्पादनको लागि एक प्रारम्भिक सामग्रीको रूपमा तयार गरिएको थियो।ACS को Enzymatic hydrolysis Cellic® Ctec2 10 mg प्रोटीन/g glucan (pretreated biomass मा), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg प्रोटीन/g glucan, र Multifect Pectinase (Gencor Inc, USA) सहित व्यावसायिक इन्जाइम मिश्रण प्रयोग गरी प्रदर्शन गरिएको थियो।)।), 5 मिलीग्राम प्रोटीन/जी डेक्सट्रान।इन्जाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस 5-लिटर बायोरिएक्टरमा 3 लिटर, pH 4.8, 50°C र 250 rpm को कार्य भोल्युमको साथ गरिएको थियो।९६ घण्टासम्म हाइड्रोलाइसिस गरिसकेपछि ३० मिनेटको लागि ६००० आरपीएममा सेन्ट्रीफ्युगेशनद्वारा र त्यसपछि १४००० आरपीएममा ३० मिनेटसम्म हाइड्रोलाइसेज नगरिएको ठोस पदार्थ हटाउन हाइड्रोलाइजेट संकलन गरिएको थियो।त्यसपछि हाइड्रोलाइजेटलाई ०.२२ मिमी फिल्टर बीकर मार्फत बाँझ फिल्टर गरिएको थियो।फिल्टर गरिएको हाइड्रोलाइजेटलाई 4 डिग्री सेल्सियसमा बाँझ बोतलहरूमा भण्डार गरिएको थियो र त्यसपछि कार्बनमा विभाजन गरिएको थियो।
NREL प्रयोगशाला विश्लेषण प्रक्रियाहरू अनुसार एक्स्ट्र्याक्ट-आधारित बायोमास नमूनाहरूको संरचनाको विश्लेषण: संरचना विश्लेषणको लागि नमूनाहरूको तयारी (NREL/TP-510-42620) र बायोमासमा संरचनात्मक कार्बोहाइड्रेट र लिग्निनको निर्धारण (NREL/TP-510 - 42610)।
हाइड्रोलाइजेट स्ट्रिमको ओलिगोसेकराइड विश्लेषण अटोक्लेभ-आधारित एसिड हाइड्रोलिसिस विधि प्रयोग गरेर 2 एमएल स्केलमा प्रदर्शन गरिएको थियो।10 एमएल स्क्रू क्याप कल्चर ट्यूबमा 69.7 μl 72% सल्फ्यूरिक एसिडको साथ हाइड्रोलाइजेट नमूना मिलाउनुहोस् र 121 डिग्री सेल्सियसमा बेन्चटपमा 1 घन्टा इन्क्युबेट गर्नुहोस्, बरफमा चिसो गर्नुहोस् र उच्च प्रदर्शन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (HPLC) शीशीमा फिल्टर गर्नुहोस्।oligosaccharides को एकाग्रता एसिड-hydrolyzed नमूना मा कुल चीनी एकाग्रता देखि गैर-हाइड्रोलाइज्ड नमूना मा monosaccharides को एकाग्रता घटाएर निर्धारित गरिएको थियो।
एसिड हाइड्रोलाइज्ड बायोमासमा ग्लुकोज, जाइलोज, र एराबिनोज सांद्रतालाई बायो-राड एमिनेक्स HPX-87H स्तम्भमा अटोसेम्पलर, स्तम्भ हीटर, आइसोक्रेटिक पम्प, र अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टरले सुसज्जित शिमाडजु HPLC प्रणाली प्रयोग गरेर विश्लेषण गरियो।स्तम्भलाई ५० डिग्री सेल्सियसमा राखिएको थियो र पानीमा ०.६ मिलिलिटर/मिनेट ५ एमएम H2SO4 राखिएको थियो।प्रवाह।
हाइड्रोलाइजेट सुपरनेटान्टलाई मोनोमर र ओलिगोसेकराइड सामग्रीको लागि पातलो र विश्लेषण गरिएको थियो।एंजाइम्याटिक हाइड्रोलाइसिस पछि प्राप्त मोनोमेरिक शर्कराहरू बायो-रेड (हर्कुलस, CA) एमिनेक्स HPX-87P स्तम्भ र एश गार्ड स्तम्भसँग सुसज्जित HPLC द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।स्तम्भको तापमान 80 डिग्री सेल्सियसमा राखिएको थियो, पानी 0.6 ml/min को प्रवाह दरको साथ मोबाइल चरणको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।ओलिगोसेकराइडहरू रेफहरूमा वर्णन गरिएका विधिहरू अनुसार १२१ डिग्री सेल्सियसमा पातलो एसिडमा हाइड्रोलिसिसद्वारा निर्धारण गरिएको थियो।४१, ४८, ४९।
Saccharide विश्लेषण कच्चा, AFEX पूर्व-उपचार र सबै गैर-हाइड्रोलाइज्ड बायोमास अवशेषहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो (सिरियल सेल भित्ता अर्कहरूको उत्पादन र तिनीहरूको mAb स्क्रीनिंग सहित) पहिले वर्णन गरिएको प्रक्रियाहरू 27, 43, 50, 51 प्रयोग गरेर।ग्लाइकोम विश्लेषणको लागि, बिरुवाको सेल पर्खाल सामग्रीको अल्कोहल-अघुलनशील अवशेषहरू बायोमास अवशेषहरूबाट तयार गरिन्छ र अमोनियम अक्सालेट (50 एमएम), सोडियम कार्बोनेट (50 एमएम र 0.5% w/v), CON जस्ता बढ्दो आक्रामक अभिकर्मकहरूसँग क्रमिक निकासीको अधीनमा हुन्छन्।(1M र 4M, दुबै 1% w/v सोडियम बोरोहाइड्राइड) र एसिड क्लोराइट पहिले वर्णन गरिए अनुसार 52,53।त्यसपछि अर्कहरूलाई सेल भित्ता ग्लाइकनमा निर्देशित mAb50s को जटिल प्यानलको विरुद्धमा ELISA को अधीनमा राखिएको थियो, र mAb बाध्यकारी प्रतिक्रियाहरूलाई तातो नक्शाको रूपमा प्रस्तुत गरियो।प्लान्ट सेल वाल ग्लाइकन लक्षित mAbs प्रयोगशाला स्टकहरू (CCRC, JIM र MAC श्रृंखला) बाट खरिद गरिएको थियो।
oligosaccharides को एक-चरण बायोटिनाइलेशन।बायोटिन-एलसी-हाइड्राजाइडको साथ कार्बोहाइड्रेटको संयोजन निम्न प्रक्रिया प्रयोग गरेर प्रदर्शन गरिएको थियो।बायोटिन-एलसी-हाइड्रजाइड (4.6 mg/12 μmol) लाई डायमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO, 70 μl) मा 1 मिनेटको लागि 65° C. मा बलियो हलचल र तताएर भंग गरियो।ग्लेशियल एसिटिक एसिड (30 μl) थपियो र मिश्रणलाई सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (6.4 mg/100 μmol) मा खन्याइयो र लगभग 1 मिनेटको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा तताएर पूर्ण रूपमा भंग गरियो।त्यसपछि, 5 देखि 8 μl सम्म प्रतिक्रिया मिश्रण सुकेको ओलिगोसेकराइड (1-100 nmol) मा थपिएको थियो लेबलको 10-गुना वा बढी दाल कम गर्ने अन्तमा प्राप्त गर्न।प्रतिक्रिया 2 घण्टाको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा गरिएको थियो, त्यसपछि नमूनाहरू तुरुन्तै शुद्ध गरियो।कुनै पनि सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड लेबलिङ प्रयोगहरूमा कमी बिना प्रयोग गरिएको थिएन, र नमूनाहरू 2.5 घण्टाको लागि 65 डिग्री सेल्सियसमा प्रतिक्रिया गरियो।
ELISA कोटिंग र बायोटिनाइलेटेड ओलिगोसाकराइड्सको नमूनाहरू धुने।25 μl बायोटिनिलेटेड नमूनाहरू (प्रत्येक केन्द्रित नमूनाको 100 μl 0.1 एम ट्रिस बफर समाधान (TBS) को 5 मिलीलीटरमा पातलो गरिएको) एविडिन-लेपित प्लेटको प्रत्येक इनारमा थपियो।नियन्त्रण कुवाहरू 0.1 M TBS मा 10 μg/ml को एकाग्रतामा 50 μl बायोटिनको साथ लेपित थिए।डियोनाइज्ड पानी खाली मापनको लागि कोटिंगको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो।ट्याब्लेट अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा २ घण्टासम्म इन्क्युबेटेड थियो।कार्यक्रम नम्बर प्रयोग गरी ०.१ एम टीबीएसमा ०.१% स्किम्ड दूधले प्लेट ३ पटक धुनुहोस्।ग्रेनियर फ्लैट 3A को लागी 11।
प्राथमिक एन्टिबडीहरू थप्ने र धुने।प्रत्येक कुवामा 40 μl प्राथमिक एन्टिबडी थप्नुहोस्।अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि माइक्रोप्लेट इन्क्युब्याट गर्नुहोस्।त्यसपछि ग्रेनियर फ्ल्याट 3A को लागि वॉश प्रोग्राम #11 प्रयोग गरेर ०.१ एम टीबीएसमा ०.१% दूधले प्लेटहरू ३ पटक धोइयो।
माध्यमिक एन्टिबडी थप्नुहोस् र धुनुहोस्।प्रत्येक इनारमा 50 μl माउस/मुसाको माध्यमिक एन्टिबडी (0.1% दूधमा 0.1 M TBS मा 1:5000 पातलो गरिएको) थप्नुहोस्।अँध्यारोमा कोठाको तापक्रममा १ घण्टाको लागि माइक्रोप्लेट इन्क्युब्याट गर्नुहोस्।ग्रेनियर फ्ल्याट 5A प्लेट वाश प्रोग्राम #12 को प्रयोग गरेर माइक्रोप्लेटहरूलाई ०.१ एम टीबीएसमा ०.१% दूधले ५ पटक धोइयो।
सब्सट्रेट थप्दै।आधार सब्सट्रेटमा 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) को 50 µl थप्नुहोस् (बफरको 2 थोपा, TMB को 3 थोपा, 15 मिलीलीटर विआयनीकृत पानीमा हाइड्रोजन पेरोक्साइडको 2 थोपा थपेर)।TMB सब्सट्रेट तयार गर्नुहोस्।र प्रयोग गर्नु अघि भोर्टेक्स)।माइक्रोप्लेटलाई कोठाको तापक्रममा ३० मिनेटसम्म इन्क्युब गर्नुहोस्।अँध्यारोमा।
चरण पूरा गर्नुहोस् र ट्याब्लेट पढ्नुहोस्।प्रत्येक इनारमा 50 μl 1 N सल्फ्यूरिक एसिड थप्नुहोस् र ELISA रिडर प्रयोग गरी 450 देखि 655 nm सम्मको अवशोषण रेकर्ड गर्नुहोस्।
डियोनाइज्ड पानीमा यी विश्लेषकहरूको 1 mg/ml समाधानहरू तयार गर्नुहोस्: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, ग्लुकोज, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (mantynaglucosamine),।(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (आंतरिक मानक)।तालिका 1 मा देखाइएको 1 mg/mL चिनी समाधानहरू थपेर दुई मापदण्डहरू तयार गरिएको थियो। नमूनाहरू जम्मा हुन्छन् र -80° C. मा सबै पानी नहटिएसम्म (सामान्यतया लगभग 12-18 घण्टा)।
विश्लेषणात्मक ब्यालेन्समा स्क्रू क्याप ट्युबहरूमा नमूनाको 100-500 µg थप्नुहोस्।थपिएको रकम रेकर्ड गर्नुहोस्।नमूनालाई विलायकको विशिष्ट एकाग्रतामा विघटन गर्नु र यसलाई तरल अलिकटको रूपमा ट्यूबमा थप्नु उत्तम हुन्छ।प्रत्येक नमूना ट्यूबको लागि आन्तरिक मानकको रूपमा 1 mg/ml inositol को 20 μl प्रयोग गर्नुहोस्।नमूनामा थपिएको आन्तरिक मानकको मात्रा मानक ट्यूबमा थपिएको आन्तरिक मानकको मात्रा जस्तै हुनुपर्छ।
स्क्रू टोपीको शीशीमा 8 मिलीलीटर निर्जल मेथानोल थप्नुहोस्।त्यसपछि 4 मिलीलीटर 3 एन मिथेनोलिक एचसीएल घोल, क्याप र हल्लाउनुहोस्।यो प्रक्रिया पानी प्रयोग गर्दैन।
oligosaccharide नमूनाहरू र मानक TMS ट्यूबहरूमा 500 μl 1 M HCl methanol समाधान थप्नुहोस्।थर्मल ब्लकमा नमूनाहरू रातभर (१६८ घण्टा) ८० डिग्री सेल्सियसमा इन्क्युबेटेड गरियो।सुकाउने मेनिफोल्ड प्रयोग गरेर कोठाको तापक्रममा मिथेनोलिसिस उत्पादन सुकाउनुहोस्।200 μl MeOH थप्नुहोस् र फेरि सुकाउनुहोस्।यो प्रक्रिया दुई पटक दोहोर्याइएको छ।नमूनामा 200 µl मिथानोल, 100 µl पाइरिडाइन र 100 µl एसिटिक एनहाइड्राइड थप्नुहोस् र राम्ररी मिश्रण गर्नुहोस्।नमूनाहरू 30 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेटेड थिए।र सुकेको।200 μl मिथानोल थप्नुहोस् र फेरि सुकाउनुहोस्।
200 μl Tri-Sil थप्नुहोस् र 20 मिनेटको लागि तातो क्याप गरिएको ट्यूब।80 डिग्री सेल्सियस, त्यसपछि कोठाको तापमानमा चिसो।नमूनालाई लगभग 50 μl को भोल्युममा थप सुकाउनको लागि सुकाउने मेनिफोल्ड प्रयोग गर्नुहोस्।यो नोट गर्न महत्त्वपूर्ण छ कि हामीले नमूनाहरू पूर्ण रूपमा सुक्न अनुमति दिएनौं।
2 मिलीलीटर हेक्सेन थप्नुहोस् र भर्टेक्सिङ गरेर राम्ररी मिलाउनुहोस्।5-3/4 इन्च व्यासको पिपेटको माथि गिलासको ऊन घुसाएर काँचको ऊनको टुक्राले पाश्चर पिपेट्स (5-8 मिमी) को टिपहरू भर्नुहोस्।नमूनाहरू 2 मिनेटको लागि 3000 ग्राम मा केन्द्रित गरियो।कुनै पनि अघुलनशील अवशेषहरू अवक्षेपित हुन्छन्।नमूनालाई 100-150 μl मा सुकाउनुहोस्।लगभग 1 μl को भोल्युम GC-MS मा 80 °C को प्रारम्भिक तापमान र 2.0 मिनेटको प्रारम्भिक समय (तालिका 2) मा इंजेक्शन गरिएको थियो।