Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga pūtirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko CSS.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, hei whakarite i te tautoko tonu, ka tukuna e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ko nga tikanga hou mo te whakamaarama mate me te papatipu mo te wetewete uaua o nga oligosaccharides mau tonu i roto i te stover kanga kua oti te rongoa me te AFEX.Ko te Lignoscellulosic biomass he momo tauwhiro ki te kora matatoka me te whakamahi whanui ki te whakawhanake hangarau koiora mo te hanga hua penei i te kai, te kai, te kora me nga matū.Ko te mea nui ki enei hangarau ko te whakawhanaketanga o nga tikanga whakataetae-utu mo te huri i nga warowaiwa uaua kei roto i nga pakitara o te tipu hei huka ngawari penei i te glucose, te xylose me te arabinose.Na te mea he tino pakeke te koiora lignoscellulosic, me tuku ki nga maimoatanga whakamaarama (hei tauira, te haukini muka exfoliation (AFEX), te waikawa waimeha (DA), te wai katote (IL)) me nga maimoatanga koiora (hei tauira, te hauwai enzymatic me te fermentation microbial) i te whakakotahi kia whiwhi ai i te hua e hiahiatia ana..Heoi, ka whakamahia nga whaariki harore arumoni i roto i te tukanga hauwai, ko te 75-85% anake o nga huka wairewa i hanga he monosaccharides, ko te toenga 15-25% he oligosaccharides rewa, karekau e taea te watea ki nga microorganisms.I mua, kua momoho te wehe me te pure i nga oligosaccharides whakakeke wairewa ma te whakamahi i te whakakotahitanga o te waro me te wehenga whenua diatomaceous me te chromatography whakakorenga rahi, me te tirotiro ano hoki i o raatau ahuatanga aukati i te enzyme.Kua kitea e matou ko nga oligosaccharides kei roto i te taumata teitei o te polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions he uaua ake ki te tukatuka me te whakakotahitanga o te enzyme arumoni i te DP iti me te oligosaccharides kore.I konei ka ripoatahia e matou te whakamahi i etahi atu tikanga, tae atu ki te glycan profiling ma te whakamahi i nga antibodies monoclonal (mAbs) motuhake ki te whakato glycans biomass ki te tohu i nga here glycan i roto i nga pakitara tipu me nga hydrolysates enzymatic, te katote-a-whaa-awhi laser desorption ionization, te wa-o-rerenga papatipu- spectrometry..Ko te MALDI-TOF-MS) e whakamahi ana i nga tihi tātaritanga-whakamohiotanga i whiwhihia e te spectroscopy i muri i te pirau tuarua o nga katote kino, te chromatography hau me te spectrometry papatipu (GC-MS) ki te tohu i nga here oligosaccharide me te kore he whakahekenga.Na te iti o te oligosaccharides (DP 4-20), he uaua enei ngota ngota ki te whakamahi mo te herenga mAb me te tohu tohu.Ki te hinga i tenei raru, ka tono matou i tetahi tikanga whakangao oligosaccharide i runga i te whakakotahitanga biotin hou i tohu angitu i te nuinga o nga oligosaccharides wairewa DP iti i runga i te mata microplate, katahi ka whakamahia i roto i te punaha mAb puta teitei mo te tātari herenga motuhake.Ma tenei tikanga hou ka whakahaere i te whakawhanaketanga o nga whakamatautau glycome teitei ake i nga ra kei mua ka taea te whakamahi ki te wehe me te tohu oligosaccharides kei roto i nga tohu koiora mo nga kaupapa tātaritanga.
Ko te koiora Lignoscellulosic, he mea hanga mai i te ahuwhenua, ngaherehere, te tarutaru me te rakau, he kai whangai mo te hanga hua-a-koiora, tae atu ki te kai, te kai, te wahie me nga mea matū hei whakaputa i nga hua teitei ake1.Ko nga warowaihā (pērā i te cellulose me te hemicellulose) kei roto i nga pakitara tipu tipu ka whakakorehia ki roto i te monosaccharides ma te tukatuka matū me te panoni koiora (pērā i te hauwai enzymatic me te fermentation microbial).Ko nga maimoatanga o mua noa ko te roha muka haukini (AFEX), te waikawa waimeha (DA), te wai katote (IL), me te pupuhi mamaoa (SE), e whakamahi ana i te whakakotahitanga o nga matū me te wera hei whakaiti i te hanga lignoscellulose ma te whakatuwhera i nga pakitara tipu tipu3,4.te whakapakeke o te matū, 5. Ka mahia te hauwai enzymatic i runga i te uta totoka nui ma te whakamahi i nga warowaihā kaha whai hua (CAZymes) me te FERMENTATION microbial ma te rewena whakawhiti, huakita ranei hei whakaputa i nga kora me nga matū 6 .
Ko nga CAZymes i roto i nga whākōkī arumoni he mea tito i te ranunga matatini o nga whākōkī e tito ana i nga here warowaihā-huka matatini ki te hanga monosaccharides2,7.Ka rite ki ta matou korero i mua ake nei, ko te whatunga matatini o nga polymers kakara o te lignin me nga warowaiha ka tino kore e taea te mahi, e arai ana ki te huringa huka kore, ka kohia te 15-25% o nga oligosaccharides ira kaore i puta i te wa o te hydrolysis enzymatic o te koiora i mua i te rongoa.He raruraru noa tenei mo nga momo tikanga maimoatanga o mua i te koiora.Ko etahi o nga take mo tenei kohanga ko te aukati i te whaariki i te wa o te hauwai, te kore ranei, te iti ranei o nga taumata o nga whaakiki tino nui e tika ana hei wawahi i nga here huka i roto i te koiora tipu.Ma te mohio ki te hanganga me te hanganga o te huka, penei i nga here huka i roto i te oligosaccharides, ka awhina i a tatou ki te whakapai ake i te huringa o te huka i te wa o te hauwai, kia whakataetae nga tikanga hangarau koiora me nga hua i ahu mai i te hinu.
Ko te whakatau i te hanganga o nga warowaiha he wero, me te whakakotahi i nga tikanga penei i te chromatography wai (LC)11,12, te tuwha o te resonance autō karihi (NMR)13, te electrophoresis capillary (CE)14,15,16 me te spectrometry papatipu (MS)17., tekau ma waru.Ko nga tikanga MS penei i te wa-of-flight mass spectrometry with laser desorption and ionization using a matrix (MALDI-TOF-MS) he tikanga maha mo te tautuhi i nga hanganga warowaiha.I tata nei, ko te Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS o nga taapiri katote konutai kua tino whakamahia ki te tautuhi i nga tapumati e pa ana ki nga tuunga taapiri oligosaccharide, nga whirihoranga anomeric, nga raupapa, me nga tuunga manga 20, 21.
Ko te tātari Glycan he taputapu pai mo te tautuhi hohonu o nga here warowaiha22.Ka whakamahia e tenei tikanga nga paturopi monoclonal (mAbs) ki te whakato i te glycan pakitara pūtau hei tirotiro ki te mohio ki nga hononga warowaiwa uaua.Neke atu i te 250 mAbs e waatea ana puta noa i te ao, i hangaia ki nga momo oligosaccharides raina me te peka ma te whakamahi i nga momo saccharides24.He maha nga mAb kua whakamahia whanuitia hei tohu i te hanga, te hanganga, me nga whakarereketanga o te pakitara o te tipu, na te mea he nui nga rereketanga i runga i te momo tipu tipu, te okana, te pakeke, te wahanga whanaketanga, me te taiao tipu25,26.Ina tata nei, kua whakamahia tenei tikanga ki te mohio ki nga taupori vesicle i roto i nga punaha tipu me nga kararehe me o raatau mahi i roto i te kawe glycan i whakatauhia e nga tohu subcellular, nga waahanga whanaketanga, nga whakaongaonga taiao ranei, me te whakatau i te mahi enzymatic.Ko etahi o nga hanganga rereke o te glycans me te xylans kua tautuhia ko te pectin (P), te xylan (X), te mannan (M), te xyloglucans (XylG), te whakakotahitanga glucans here (MLG), te arabinoxylan (ArbX), te galactomannan (GalG), te glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) me te arabinoxylan (GArbX) me te arabinoxylan.
Heoi, ahakoa enei mahi rangahau katoa, he torutoru noa nga rangahau i aro ki te ahua o te whakaemi oligosaccharide i te wa o te kawenga totoka teitei (HSL) hydrolysis, tae atu ki te tuku oligosaccharide, te huringa o te roa o nga mekameka oligomeric i te wa o te hauwai, nga momo waerau DP iti, me o ratou pihi.tohatoha 30,31,32.I tenei wa, ahakoa kua kitea he taputapu whai hua te tātaritanga glycan mo te tātaritanga matawhānui o te hanganga glycan, he uaua ki te arotake i nga oligosaccharides DP iti-wairewa ma te whakamahi i nga tikanga antibody.Ko nga oligosaccharides DP iti ake me te taumaha ngota iti iho i te 5-10 kDa kaore e herea ki nga papa ELISA 33, 34 ka horoia i mua i te taapiri antibody.
I konei, mo te wa tuatahi, ka whakaatuhia he whakamatautau ELISA i runga i nga pereti kua pania avidin ma te whakamahi i nga antibodies monoclonal, me te whakakotahi i te tukanga biotinylation kotahi-taahiraa mo te oligosaccharides refractory whakarewa me te tātari glycome.Ko ta matou huarahi ki te tātari glycome i whakamanahia e te MALDI-TOF-MS me te GC-MS i runga i te tātaritanga o nga hononga oligosaccharide taapiri ma te whakamahi i te trimethylsilyl (TMS) derivatization o nga titonga huka hydrolyzed.Ka taea te whakawhanake i tenei huarahi auaha hei tikanga whakaputa nui a muri ake nei, ka kitea te whakamahinga whanui i roto i te rangahau rongoa koiora35.
Ko nga whakarereketanga i muri i te whakamaoritanga o nga enzyme me nga paturopi, penei i te glycosylation,36 ka pa ki a raatau mahi koiora.Hei tauira, ko nga huringa o te glycosylation o nga pūmua serum ka whai waahi nui ki te mate pukupuku mumura, ka whakamahia nga huringa o te glycosylation hei tohu tohu37.He maha nga momo glycans kua korerohia i roto i nga tuhinga ka puta wawe i roto i nga momo mate, tae atu ki nga mate inflammatory tawhito o te kopa me te ate, nga mate viral, ovarian, u, me te mate pukupuku prostate38,39,40.Ma te mohio ki te hanganga o nga glycans e whakamahi ana i nga tikanga glycan ELISA-antibody-based glycan ELISA ka nui ake te maia ki te taatai ​​mate me te kore whakamahi i nga tikanga MS uaua.
I kitea e ta maatau rangahau o mua ko te oligosaccharides pakeke i noho kore i te wai i muri i te maimoatanga o mua me te hauwai enzymatic (Whakaahua 1).I roto i a maatau mahi i whakaputaina i mua ake nei, i whakawhanakehia e matou he tikanga tangohanga waro-waa-waa whakahohe hei wehe i te oligosaccharides mai i te AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Whai muri i te tangohanga tuatahi me te wehenga, ka wehewehea ano nga oligosaccharides e te rahi o te chromatography whakakorenga (SEC) ka kohia i runga i te raupapa o te taumaha ngota.Ko nga monomers huka me nga oligomers i tukuna mai i nga momo maimoatanga o mua i tātarihia e te tātari hanganga huka.I te whakatairite i nga ihirangi o nga oligomers huka e whiwhi ana i nga momo tikanga o mua, ko te noho o te oligosaccharides pakeke he raruraru noa i te huringa o te koiora ki te monosaccharides ka taea te whakaheke i te hua o te huka i te iti rawa 10-15% tae atu ki te 18%.US.Ka whakamahia tenei tikanga mo te hanga nui atu o nga hautau oligosaccharide.Ko te hua o te ACH me ona hautau o muri mai me nga taumahatanga ngota rereke i whakamahia hei taonga whakamatautau mo te tohu oligosaccharides i roto i tenei mahi.
Whai muri i te maimoatanga o mua me te hauwai enzymatic, ka mau tonu te oligosaccharides kaore i te wai.Anei (A) he tikanga wehewehe oligosaccharide e wehea ai te oligosaccharides mai i te AFEX-pretreated stover hydrolyzate (ACSH) ma te whakamahi i te moenga kiki o te waro whakahohe me te whenua diatomaceous;(B) Tikanga mo te wehewehenga oligosaccharides.I wehea ano nga oligosaccharides e te rahi o te chromatography whakakorenga (SEC);(C) Saccharide monomers me oligomers i tukuna mai i nga momo maimoatanga o mua (waikawa waimeha: DA, wai katote: IL me AFEX).Nga tikanga hauwai enzymatic: te uta totoka tiketike o te 25% (w/w) (tata ki te 8% te uta glucan), 96 haora te hauwai, 20 mg/g te utaina enzyme arumoni (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) me te (D) Sugar monomers me te oligomers o te glucose, xylose me te arabinose i tukuna mai i te AFEX presttreated AFEX corn.
Ko te tātari Glycan he taputapu whai hua mo te tātari hanganga matawhānui o nga glycans i roto i nga tangohanga kua wehea mai i nga toenga koiora totoka.Heoi ano, he iti te tohu o te saccharides wairewa-wai ma te whakamahi i tenei tikanga tuku iho41 na te mea he uaua te oligosaccharides te taumaha ngota ngota iti ki te whakakorikori i runga i nga pereti ELISA ka horoia i mua i te taapiri antibody.No reira, mo te herenga antibody me te tohu tohu, i whakamahia he tikanga biotinylation kotahi-taahiraa ki te whakakakahu i nga oligosaccharides wairewa, kore e tutuki i runga i nga pereti ELISA kua pania avidin.I whakamatauria tenei tikanga ma te whakamahi i to maatau ACSH i hangaia i mua me te hautanga i runga i tona taumaha ngota (te tohu polymerization ranei, DP).I whakamahia te biotinylation kotahi-taahiraa ki te whakanui ake i te hononga here oligosaccharide ma te taapiri i te biotin-LC-hydrazide ki te pito whakaheke o te warowaihā (Fig. 2).I roto i te otinga, ka tauhohe te roopu hemiacetal i te pito whakaheke ki te roopu hydrazide o te biotin-LC-hydrazide ki te hanga i te here hydrazone.I te aroaro o te kaihoko whakaheke NaCNBH3, ka whakahekehia te here hydrazone ki te hua mutunga biotinylated pumau.Na te whakarereketanga o te mutunga o te whakaheke huka, ka taea te here o nga oligosaccharides DP iti ki nga papa ELISA, a, i roto i ta maatau rangahau i mahia tenei i runga i nga papaa avidin ma te whakamahi i nga mAb kua tohua ki te glycan.
Te tirotiro i nga antibodies monoclonal i runga i te ELISA mo te oligosaccharides biotinylated.I konei (A) te whakakotahitanga koiora o te oligosaccharides me te tirotiro ELISA o muri mai me nga mAbs e whai ana ki te glycan i runga i nga pereti whakakikoruatia a NeutrAvidin me te (B) e whakaatu ana i te tikanga kotahi-taahiraa mo te whakakoioratanga o nga hua tauhohenga.
Ko nga papaariki kua whakakikoruatia ki a Avidin me te oligosaccharide-conjugated antibodies ka taapirihia ki nga antibodies tuatahi me te tuarua, ka horoia ki te waahi marama me te wa-tairongo.Ka mutu te herenga antibody, taapirihia te tïpako TMB hei whakamomi i te pereti.Ka mutu te tauhohenga ki te waikawa pungatara.I tātarihia nga papa incubated ma te whakamahi i te kaipanui ELISA hei whakatau i te kaha here o ia antibody ki te kite i te hononga-whakawhitinga-a-antibody.Mo nga taipitopito me nga tawhā o te whakamatautau, tirohia te waahanga e rite ana "Nga Rawa me nga Tikanga".
Ka whakaatuhia e matou te whaipainga o tenei tikanga hou i whakawhanakehia mo nga tono motuhake ma te tohu i nga oligosaccharides wairewa kei roto i te ACSH tae atu ki nga hautau oligosaccharide parakore me te parakore kua wehea mai i te lignoscellulosic hydrolysates.E whakaatu ana i te Whakaahua 3, ko nga xylans whakakapi-epitope e kitea ana i roto i te ACSH ma te whakamahi i nga tikanga whakamatautau glycome bioacylated ko te nuinga o te uronic (U) me te methyluronic (MeU) me te pectic arabinogalactans.I kitea ano te nuinga o ratou i roto i ta maatau rangahau o mua mo te tātaritanga o nga glycans o te totoka kore-hydrolyzed (UHS)43.
Te kitenga o nga epitope oligosaccharide recalcitrant ma te whakamahi i te antibody monoclonal i tukuna ki te glycan pakitara pūtau.Ko te hautau “kūpapa” ko te hautau ACN me te hautau “waikawa” ko te hautau FA.Ko nga whero kanapa i runga i te mapi wera e tohu ana i nga ihirangi epitope teitei ake, me nga puru kanapa e tohu ana he papamuri tuwhera.Ko nga uara tae i runga i te tauine ka ahu mai i nga uara OD mata mo nga hanganga N=2.Ko nga epitopes matua e mohiotia ana e nga antibodies ka whakaatuhia ki te taha matau.
Ko enei hanganga kore-cellulose e kore e taea te wawahi e nga cellulases me te hemicellulases tino noa i roto i te ranunga whākōkī arumoni kua whakamatauria, kei roto ko nga whākōkī arumoni e whakamahia nuitia ana.No reira, e hiahiatia ana nga whaariki awhina hou mo to ratou hauwai.Ki te kore e tika ana nga whaariki whakauru-kore-cellulose, ka aukati enei here-kore-cellulose ki te huri katoa ki te monosaccharides, ahakoa he nui te hauwai o o ratou matua polymers huka ki nga kongakonga poto ake ka rewa ma te whakamahi i nga ranunga whaariki arumoni.
Ko etahi atu rangahau mo te tohatoha tohu me tona kaha here i whakaatu he iti ake nga epitopes here i roto i nga hautau huka DP teitei (A, B, C, DP ki te 20+) i nga hautau iti DP (D, E, F, DP) i roto i nga dimer) (Fig. 1).He maha ake nga kongakonga waikawa i roto i nga epitopes kore-cellulose i nga kongakonga kore.Ko enei ahuatanga e rite ana ki te tauira i kitea i roto i ta maatau rangahau o mua, i te mea he nui ake te DP me te waikawa waikawa i te atete ki te hauwai enzymatic.Na reira, ko te noho o nga epitope glycan kore-cellulose me nga whakakapinga U me MeU ka tino whai hua ki te pumau o nga oligosaccharides.Me tohu ko te pai o te here me te rapunga ka raru pea mo te iti o te DP oligosaccharides, ina koa ko te epitope he oligosaccharide dimeric, trimeric ranei.Ka taea te whakamatautau ma te whakamahi i nga oligosaccharides arumoni he rereke te roa, kei roto i ia waahanga kotahi anake te epitope e hono ana ki tetahi mAb.
No reira, na te whakamahi i nga momo paturopi-a-hanganga i kitea etahi momo here whakakeke.I runga i te momo o te antibody e whakamahia ana, te tauira herenga e tika ana, me te kaha o te tohu ka puta mai (te nuinga me te iti rawa), ka taea te tautuhi i nga whaariki hou me te taapiri i te ahua-a-ira ki te ranunga o te whanaki kia pai ake te huringa glycoconversion.Ko te tātaritanga o te ACSH oligosaccharides hei tauira, ka taea e tatou te hanga i te papaaarangi o nga here glycan mo ia rawa koiora.Me tohu i konei me whai whakaaro ki nga hononga rereke o nga paturopi, a, ki te kore e mohiotia o raatau hononga, ka puta etahi uaua ka whakatauritehia nga tohu o nga momo paturopi rereke.I tua atu, ka pai ake pea te whakataurite o nga here glycan i waenga i nga tauira mo te paturopi kotahi.Ka taea te hono atu enei here pakeke ki te paataka raraunga CAZyme, mai reira ka taea e tatou te tautuhi i nga enzymes, te kowhiri i nga enzymes kaitono me te whakamatautau mo nga enzymes wawahi here, te whakawhanake ranei i nga punaha microbial ki te whakaatu i enei enzymes hei whakamahi i roto i te koiora44.
Ki te arotake me pehea nga tikanga immunological ki te whakakii i nga tikanga rereke mo te tohu oligosaccharides iti ngota i roto i te lignoscellulosic hydrolysates, i mahia e matou te MALDI (Fig. 4, S1-S8) me te tātaritanga o nga saccharides i ahu mai i te TMS i runga i te GC-MS i runga i te papa kotahi (Fig. 5) waahanga oligosaccharide.Ka whakamahia te MALDI ki te whakatairite mena ka rite te tohatoha papatipu o nga ngota ngota oligosaccharide ki te hanganga kua whakaritea.I te piki.Ko te 4 e whakaatu ana i te MC o nga waahanga koretake ACN-A me ACN-B.I whakapumauhia e te ACN-A te waahanga o nga huka pentose mai i te DP 4-8 (Fig. 4) ki te DP 22 (Fig. S1), ko ona taumaha e rite ana ki te MeU-xylan oligosaccharides.I whakapumautia e te ACN-B te raupapa pentose me te glucoxylan me te DP 8-15.I roto i nga mea taapiri penei i te Whakaahua S3, ko nga mapi tohatoha papatipu waikawa FA-C e whakaatu ana i te whānuitanga o nga huka pentose whakakapi (Me)U me te DP o te 8-15 e rite ana ki nga xylans whakakapi i kitea i roto i te tirotiro mAb i runga i te ELISA.He rite tonu nga epitope.
MALDI-MS tūāwhiorangi o oligosaccharides kore-tautukunga whakarewa kei roto i te ACS.I konei, (A) ACN-A hautau awhe taumaha iti kei roto te waikawa uronic methylated (DP 4-8) ka whakakapihia te glucuroxylan oligosaccharides me te (B) ACN-B xylan me te methylated uronic acid oligosaccharides i whakakapi ki te glucuroxylan (DP 8-15).
Te tātaritanga o te hanganga o te toenga glycan o te oligosaccharides refractory.Anei (A) TMS saccharide hanganga o nga momo hautau oligosaccharide i whiwhi ma te whakamahi i te tātaritanga GC-MS.(B) Nga hanganga o nga momo huka i ahu mai i te TMS kei roto i te oligosaccharides.ACN – hautau acetonitrile kei roto he oligosaccharides kūpapa me te FA – hautau waikawa ferulic kei roto oligosaccharides waikawa.
Ko tetahi atu whakatau pai i puta mai i te tātaritanga LC-MS o te hautanga oligosaccharide, e whakaatuhia ana i te Whakaahua S9 (ka kitea nga tikanga i roto i nga rauemi taapiri hiko).Ko nga kongakonga o nga roopu hexose me -OAc i kitea tonu i te wa e herea ana te hautau ACN-B.Ehara tenei kitenga i te whakapumau i te wehewehenga i kitea i roto i te glycome me te MALDI-TOF tātaritanga, engari he korero hou mo nga warowaiwaa pea kei roto i te koiora lignoscellulosic kua oti te rongoa.
I wetewetehia ano te hanganga huka o te hautanga oligosaccharide ma te whakamahi i te whakaputanga huka TMS.Ma te whakamahi i te GC-MS, i whakatauhia e matou te hanganga o te neural (kore-whakapapa) me te huka waikawa (GluA me GalA) i roto i te hautanga oligosaccharide (Fig. 5).Ka kitea te waikawa Glucuronic i roto i nga waahanga waikawa C me D, i te wa e kitea ana te waikawa galacturonic i roto i nga waahanga waikawa A me te B, he waahanga DP teitei o te huka waikawa.Ko enei hua kaore i te whakapumau i o maatau raraunga ELISA me MALDI, engari he rite ano ki o maatau rangahau o mua mo te kohinga oligosaccharide.Na reira, e whakapono ana matou he ranea nga tikanga immunological hou ma te whakamahi i te biotinylation o te oligosaccharides me te tirotiro ELISA o muri mai hei kite i nga oligosaccharides recalcitrant rewa i roto i nga momo tauira koiora.
I te mea kua whakamanahia nga tikanga tirotiro mAb i runga i te ELISA e etahi tikanga rereke, i hiahia matou ki te torotoro haere i te kaha o tenei tikanga ine hou.E rua nga oligosaccharides arumoni, te xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) me te 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), i hokona me te whakamatautau ma te whakamahi i te huarahi mAb hou e aro ana ki te glycan pakitara pūtau.Ko te Whakaaturanga 6 e whakaatu ana i te hononga raina i waenga i te tohu herenga koiora me te kukū o te porowhita o te kukū oligosaccharide, e tohu ana i te tauira whakauru Langmuir.I roto i nga mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, me CCRC-M151 e hono ana ki te XHE, me te CCRC-M108, CCRC-M109, me te LM11 e hono ana ki te A2XX i runga i te awhe o te 1 nm ki te 100 nano.Na te iti o te waatea o nga antibodies i te wa o te whakamatautau, he iti nga whakamatautau i mahia ki ia kukū oligosaccharide.Me tohu i konei he tino rerekee te tauhohenga o etahi paturopi ki te oligosaccharide ano hei tïpako, i te mea pea na te mea ka herea ki nga epitopes paku rereke, a he rereke nga hononga here.Ko nga tikanga me nga paanga o te tautuhi epitope tika ka nui ake te uaua ina whakamahia te huarahi mAb hou ki nga tauira tuuturu.
E rua nga oligosaccharides arumoni i whakamahia hei whakatau i te awhe whakakitenga o nga momo mAbs glycan-targeting.I konei, ko nga hononga raina me te kukū o te porowhita o te oligosaccharide e tohu ana i nga tauira whakauru a Langmuir mo te (A) XHE me te mAb me te (B) A2XX me te mAb.Ko nga epitope e rite ana e tohu ana i nga hanganga o nga oligosaccharides arumoni e whakamahia ana hei taputapu i roto i te whakamatautau.
Ko te whakamahi i nga antibodies monoclonal e whai ana ki te glycan (te tātari glycocomic, te tirotiro mAb-a-ELISA ranei) he taputapu kaha mo te tohu hohonu o te nuinga o nga glycans pakitara nui e hanga ana i te koiora tipu.Heoi ano, ko te tātaritanga glycan puāwaitanga e tohu ana i nga glycans pakitara nui ake, i te mea kaore te nuinga o nga oligosaccharides e kore e taea te whakakorikori i runga i nga papa ELISA.I roto i tenei rangahau, ko te AFEX-pretreated stover kanga i whakawaiwai i te enzymatically ki te ihirangi totoka tiketike.I whakamahia te tātari huka ki te whakatau i te hanganga o nga warowaiha o te pakitara o nga pūtau i roto i te hydrolyzate.Heoi, ko te tātaritanga mAb o nga oligosaccharides iti i roto i te hydrolysates ka iti te whakaaro, me etahi atu taputapu e hiahiatia ana kia pai te whakakore i nga oligosaccharides i runga i nga papa ELISA.
Ka ripoatahia e matou i konei tetahi tikanga whakamaoritanga oligosaccharide tino pai mo te tirotiro mAb ma te whakakotahi i te koiora oligosaccharide whai muri i te tirotiro ELISA i runga i nga pereti pani NeutrAvidin™.Ko nga oligosaccharides biotinylated immobilized i whakaatu i te tino hononga mo te antibody kia taea ai te kite tere me te pai o nga oligosaccharides recalcitrant.Ko te tātaritanga o te hanganga o enei oligosaccharides pakeke i runga i te papatipu hiringa i whakapumau i nga hua o tenei huarahi hou ki te tirotiro mate.Na, ko enei rangahau e whakaatu ana ko te whakakotahitanga o te oligosaccharide biotinylation me te tirotiro ELISA me te glycan-targeted monoclonal antibodies ka taea te whakamahi ki te kite i nga hononga whakawhiti i roto i te oligosaccharides ka taea te whakamahi whanui i roto i etahi atu rangahau koiora e tohu ana i te hanganga o te oligosaccharides.
Ko tenei tikanga tohu glycan-a-koiora ko te purongo tuatahi e ahei ana ki te tirotiro i nga here warowaiwa whakakeke o te oligosaccharides wairewa i roto i te koiora tipu.Ka awhina tenei ki te mohio he aha etahi o nga wahanga o te biomass e tino pakeke ana i te wa e pa ana ki te hanga koiora.Ka whakakiia e tenei tikanga tetahi waahi nui i roto i nga tikanga tātari glycome me te whakawhānui i tana tono ki te whānuitanga o nga taputapu i tua atu i te oligosaccharides tipu.I te wa kei te heke mai, ka whakamahi pea tatou i nga robotics mo te biotinylation me te whakamahi i te tikanga i whakawhanakehia e maatau mo te tātaritanga teitei o nga tauira ma te whakamahi i te ELISA.
Ko te kakau witi (CS) i tupu mai i nga kakano ranu Pioneer 33A14 i hauhake i te tau 2010 mai i nga Pamu o Kramer i Ray, Colorado.I runga i te whakaaetanga o te rangatira whenua, ka taea te whakamahi i tenei koiora mo te rangahau. Ko nga tauira i rongoa kia maroke <6% makuku i roto i nga peke-rakau ki roto i te pāmahana rūma. Ko nga tauira i rongoa kia maroke <6% makuku i roto i nga peke-rakau ki roto i te pāmahana rūma. Образцы хранились сухими при влажности < 6% ki te пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. I penapena nga tauira kia maroke i te <6% haumākū i roto i nga peke kutumau i te pāmahana rūma.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ka penapena nga tauira ki roto i nga putea kumemau i te pāmahana rūma me te haumākū <6%.I ū te rangahau ki ngā aratohu ā-rohe, ā-motu hoki.I mahia te tātari tito ma te whakamahi i te kawa NREL.Ko te hanganga i kitea he 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% pūmua me te 13. 4% pungarehu.
Ko te Cellic® CTec2 (138 mg pūmua / ml, rota VCNI 0001) he ranunga matatini o te cellulase, β-glucosidase me Cellic® HTec2 (157 mg pūmua / ml, rota VHN00001) mai i Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg pūmua/mL), he ranunga matatini o te pectin degrading enzymes, i kohaina e DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).I whakatauhia nga kuhanga pūmua pūmua mā te whakatau tata i te ihirangi pūmua (me te tango i te takoha o te hauota pūmua-kore) mā te tātari hauota Kjeldahl (tikanga AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ko te whenua Diatomaceous 545 i hokona mai i EMD Millipore (Billerica, MA).Ko te waro whakahohe (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, me era atu matū katoa i hokona mai i Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
I mahia te AFEX pretreatment i GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).I whakahaerehia te maimoatanga i mua i te 140 ° C. mo te 15 meneti.46 te wa noho i te 1:1 ōwehenga o te haukini waikore ki te koiora i te 60% (w/w) e utaina ana i roto i te reactor puranga kowiri tira (Parr Instruments Company).30 meneti te roa.I kawea mai te reactor ki te 140°C ka tere te tukunga o te haukini, kia tere te hokinga mai o te koiora ki te pāmahana rūma.Ko te hanganga o te AFEX i mua i te maimoatanga o te witi (ACS) he rite ki te ahua o te witi kaore i mahia (UT-CS).
Ko nga totoka teitei ACSH 25% (w/w) (tata ki te 8% te uta dextran) i whakaritea hei rauemi timatanga mo te hanga nui o te oligosaccharides.I mahia te hauwai enzymatic o ACS ma te whakamahi i te ranunga enzyme arumoni tae atu ki te Cellic® Ctec2 10 mg pūmua/g glucan (i roto i te biomass pretreated), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg pūmua/g glucan, me Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg pūmua/g dextran.I mahia te hauwai enzymatic i roto i te 5-rita bioreactor me te 3 rita te rahinga mahi, te pH 4.8, te 50°C me te 250 rpm.I muri i te hauwai mo te 96 haora, ka kohia te hydrolyzate ma te centrifugation i te 6000 rpm mo te 30 meneti ka i te 14000 rpm mo te 30 meneti hei tango i nga totoka korewaiwai.Ka tukuna te hydrolyzate ki te tātari parakore na roto i te ipurau tātari 0.22 mm.Ko te hydrolyzate kua tātarihia he mea rongoa ki roto i nga ipu parakore i te 4° C. katahi ka wehewehea ki te waro.
Te tātari i te hanganga o nga tauira koiora i runga i te tangohanga i runga i nga tikanga tātaritanga taiwhanga NREL: te whakarite i nga tauira mo te tātari hanganga (NREL/TP-510-42620) me te whakatau i nga warowaiha hanganga me te lignin i roto i te koiora (NREL / TP-510 - 42618)47.
Ko te tātari oligosaccharide o te awa hydrolyzate i mahia i runga i te tauine 2 ml ma te whakamahi i te tikanga waikawa waikawa-a-autoclave.Whakaranuhia te tauira hydrolyzate ki te 69.7 µl o te 72% waikawa pungatara i roto i te ngongo ahurea potae 10 ml ka whakakororia mo te 1 haora i runga i te turanga i te 121 °C, whakamatao ki te hukapapa ka tātari ki roto i te ipu wai chromatography (HPLC) teitei.I whakatauhia te kukū o te oligosaccharides ma te tango i te kukū o te monosaccharides i roto i te tauira kore-hydrolyzed mai i te kohinga huka katoa i roto i te tauira waikawa-hydrolyzed.
I tātarihia te kukū o te huka, te xylose, me te arabinose i roto i te waikawa hauwai papatipuhia ma te whakamahi i te punaha Shimadzu HPLC kua whakauruhia ki te autosampler, te whakamahana o te pou, te papu isocratic, me te kaitirotiro tohu tohu whakaata i runga i te waahanga Bio-Rad Aminex HPX-87H.I mau tonu te poupou ki te 50°C me te 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 ki te wai.rere.
Ko te supernatant hydrolyzate i diluted ka tātarihia mo te ihirangi monomer me te oligosaccharide.Ko nga huka Monomeric i whiwhi i muri i te hauwai enzymatic i tātarihia e te HPLC me te waahanga Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P me te pou tiaki pungarehu.I mau tonu te pāmahana o te pou ki te 80 ° C, i whakamahia te wai hei waahanga waea me te tere rere o te 0.6 ml / min.Ko nga oligosaccharides i whakatauhia e te hydrolysis i roto i te waikawa dilute i te 121 ° C i runga i nga tikanga e whakaahuahia ana i roto i nga refs.41, 48, 49.
I mahia te tātari Saccharide i runga i te mata, i te AFEX i mua i te maimoatanga me nga toenga koiora kore-hydrolysed katoa (tae atu ki te hanga o nga tangohanga pakitara rangatū me o raatau mAb) ma te whakamahi i nga tikanga kua whakaahuahia i mua 27, 43, 50, 51.Mo te tātaritanga glycome, ko nga toenga waipiro-kore o nga papanga pakitara tipu tipu kua rite mai i nga toenga koiora ka tukuna ki te tangohanga rangatū me nga reagents kaha te kaha penei i te ammonium oxalate (50 mM), konutai warowaiha (50 mM me 0.5% w/v), CON.(1M me te 4M, e rua me te 1% w/v konutai borohydride) me te waikawa pūhaumāota pera i whakaahuatia i mua52,53.Ko nga tangohanga ka tukuna ki te ELISA ki te roopu matatini o nga mAb50s i tukuna ki te glycan pakitara pūtau, a ko nga tauhohenga herenga mAb i whakaatuhia hei mahere wera.Ko nga mAbs e aro ana ki te glycan pakitara tipu i hokona mai i nga rakau taiwhanga (CCRC, JIM me MAC raupapa).
Kotahi-taahiraa biotinylation o oligosaccharides.Ko te whakakotahitanga o nga warowaiha me te biotin-LC-hydrazide i mahia ma te whakamahi i nga tikanga e whai ake nei.Ko te Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) i whakakorehia i roto i te dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) na roto i te whakaoho kaha me te whakamahana i te 65 ° C. mo te 1 min.Ka tāpirihia te waikawa acetic glacial (30 µl) ka ringihia te ranunga ki runga konutai cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) ka rewa katoa i muri i te whakamahana i te 65° C. mo te 1 meneti pea.Na, mai i te 5 ki te 8 μl o te ranunga tauhohenga ka taapirihia ki te oligosaccharide maroke (1-100 nmol) kia whiwhi i te taikaha molar 10 neke atu ranei o te tapanga i runga i te pito whakaheke.I mahia te tauhohenga i te 65°C mo te 2 haora, i muri iho ka purea tonu nga tauira.Karekau he konutai cyanoborohydride i whakamahia i roto i nga whakamatautau tapanga me te kore e whakahekehia, a ka tauhohe nga tauira i te 65° C. mo te 2.5 haora.
Ko te paninga ELISA me te horoi o nga tauira o te oligosaccharides biotinylated.25 μl o nga tauira biotinylated (100 μl o ia tauira kukū kua waimeha ki te 5 ml o te 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) i taapirihia ki ia puna o te pereti pania avidin.I pania nga puna whakahaere ki te 50 μl o te biotin i te kukū o te 10 μg/ml i te 0.1 M TBS.I whakamahia te wai kua whakakorehia hei paninga mo nga inenga patea.Ko te papa i whakamakuku mo te 2 haora i te pāmahana rūma i roto i te pouri.Horoihia te pereti kia toru nga wa ki te 0.1% miraka reiti ki te 0.1 M TBS ma te whakamahi i te kaupapa no.11 mo Grenier flat 3A.
Te taapiri me te horoi o nga paturopi tuatahi.Tāpirihia te 40 µl o te antibody tuatahi ki ia puna.Whakanuia te microplate mo te 1 haora i te pāmahana rūma i roto i te pouri.Ka horoia nga pereti 3 wa ki te 0.1% miraka i te 0.1M TBS ma te whakamahi i te kaupapa horoi #11 mo Grenier Flat 3A.
Tāpirihia te antibody tuarua ka horoi.Taapirihia te 50 µl o te kiore/kiore antibody tuarua (kua waimeha 1:5000 ki te 0.1% miraka i te 0.1 M TBS) ki ia puna.Whakanuia te microplate mo te 1 haora i te pāmahana rūma i roto i te pouri.Ka horoia nga pereti moroiti kia 5 nga wa ki te 0.1% miraka i te 0.1 M TBS ma te whakamahi i te kaupapa horoi pereti 5A Grenier Flat #12.
Te taapiri i te tïpako.Taapirihia te 50 µl o te 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ki te tïpako turanga (ma te tapiri 2 pata o te parepare, 3 topata TMB, 2 topata hauwai ki te 15 ml o te wai whakaheke).Whakapaia te tïpako TMB.me te vortex i mua i te whakamahinga).Whakanuia te pereti moroiti i te pāmahana rūma mo te 30 meneti.I roto i te pouri.
Whakaotia te taahiraa me te panui i te papa.Taapirihia te 50 µl o te 1 N waikawa pungatara ki ia puna ka tuhi i te whakaurunga mai i te 450 ki te 655 nm ma te whakamahi i te panui ELISA.
Whakapaia 1 mg/ml wairewa o enei tātari i roto i te wai whakaheke: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, waikawa galacturonic (GalA), waikawa glucuronic (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (paerewa o roto).E rua nga paerewa i whakaritea ma te taapiri i nga wairewa huka 1 mg/mL e whakaatuhia ana i te Ripanga 1. Ka tio nga tauira me te lyophilized i te -80° C. tae noa ki te tango i nga wai katoa (te nuinga o te 12-18 haora).
Tāpirihia he 100–500 µg o te tauira ki te wiriwiri i nga ngongo potae ki runga i te toenga tātari.Tuhia te moni kua tapiritia.He pai ake te whakakore i te tauira i roto i te kukū motuhake o te whakarewa me te tapiri atu ki te ngongo hei aliquot wai.Whakamahia te 20 µl o te 1 mg/ml inositol hei paerewa o roto mo ia ngongo tauira.Ko te nui o te paerewa o roto e tapirihia ana ki te tauira me rite ki te nui o te paerewa o roto ka tapirihia ki te ngongo paerewa.
Taapirihia te 8 ml o te mewaro anhydrous ki roto i te ipu potae wiri.Katahi ka 4 ml o te wairewa HCl methanolic 3 N., ka kapi, ka ruia.Kaore tenei tukanga e whakamahi i te wai.
Taapirihia te 500 µl o te wairewa methanol 1 M HCl ki nga tauira oligosaccharide me nga ngongo TMS paerewa.I whakakororiahia nga tauira mo te po (168 haora) i te 80° C. i roto i te poraka waiariki.Me whakamaroke te hua methanolysis i te pāmahana rūma ma te whakamahi i te tini whakamaroke.Taapirihia te 200 µl MeOH ka whakamaroke ano.Ka tuaruatia tenei tukanga.Tāpirihia te 200 µl o te mewaro, 100 µl o te pyridine me te 100 µl o te acetic anhydride ki te tauira ka uru pai.I whakakororiahia nga tauira ki te pāmahana rūma mo te 30 meneti.ka maroke.Taapirihia te 200 µl o te mewaro ka whakamaroke ano.
Taapirihia te 200 µl o Tri-Sil me te ngongo whakamahana mo te 20 meneti.80°C, ka whakamatao ki te pāmahana rūma.Whakamahia he manifold whakamaroke hei whakamaroke ano i te tauira ki te 50 µl te rahi.He mea nui kia mahara kaore matou i whakaae kia maroke katoa nga tauira.
Tāpirihia te 2 ml o te hexane ka uru pai ma te vortexing.Whakakiia nga pito o nga pipettes Pasteur (5-8 mm) ki tetahi wahi o te wūru karaehe ma te whakauru i te wūru karaehe ki runga ake o te pipette 5-3/4 inihi te diameter.I centrifuge nga tauira ki te 3000 g mo te 2 meneti.Ko nga toenga karekau e rewa ka totohu.Me whakamaroke te tauira ki te 100-150 µl.He rōrahi o te āhua 1 μl i werohia ki te GC-MS i te pāmahana tuatahi o te 80 °C me te wa tuatahi o te 2.0 meneti (Ripanga 2).