Terima kasih telah mengunjungi Alam.com.Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas.Untuk pengalaman terbaik, kami menyarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami akan merender situs tanpa gaya dan JavaScript.
Metode imunologi dan spektrometri massa baru untuk analisis kompleks oligosakarida persisten dalam brangkasan jagung yang diberi perlakuan awal dengan AFEX.Biomassa lignoselulosa adalah alternatif berkelanjutan untuk bahan bakar fosil dan banyak digunakan untuk mengembangkan bioteknologi untuk produksi produk seperti makanan, pakan, bahan bakar, dan bahan kimia.Kunci dari teknologi ini adalah pengembangan proses yang kompetitif untuk mengubah karbohidrat kompleks yang ada di dinding sel tanaman menjadi gula sederhana seperti glukosa, xilosa, dan arabinosa.Karena biomassa lignoselulosa sangat membandel, maka harus dilakukan perlakuan termokimia (misalnya pengelupasan serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL)) dan perlakuan biologis (misalnya hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba) dalam kombinasi untuk mendapatkan produk yang diinginkan..Namun, ketika enzim jamur komersial digunakan dalam proses hidrolisis, hanya 75-85% dari gula larut yang terbentuk adalah monosakarida, dan 15-25% sisanya adalah oligosakarida yang larut dan sulit dicerna, yang tidak selalu tersedia untuk mikroorganisme.Sebelumnya, kami telah berhasil mengisolasi dan memurnikan oligosakarida keras kepala yang larut menggunakan kombinasi karbon dan pemisahan tanah diatom dan kromatografi eksklusi ukuran, dan juga menyelidiki sifat penghambatan enzimnya.Kami telah menemukan bahwa oligosakarida yang mengandung substitusi asam uronat termetilasi tingkat polimerisasi (DP) lebih tinggi lebih sulit untuk diproses dengan campuran enzim komersial daripada DP rendah dan oligosakarida netral.Di sini kami melaporkan penggunaan beberapa metode tambahan, termasuk profil glikan menggunakan antibodi monoklonal (mAbs) khusus untuk menanam glikan biomassa untuk mengkarakterisasi ikatan glikan pada dinding sel tanaman dan hidrolisat enzimatik, ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks, spektrometri massa waktu penerbangan..MALDI-TOF-MS) menggunakan struktur puncak diagnostik informatif yang diperoleh dengan spektroskopi setelah peluruhan sekunder ion negatif, kromatografi gas dan spektrometri massa (GC-MS) untuk mengkarakterisasi ikatan oligosakarida dengan dan tanpa derivatisasi.Karena ukuran oligosakarida yang kecil (DP 4-20), molekul ini sulit digunakan untuk pengikatan dan karakterisasi mAb.Untuk mengatasi masalah ini, kami menerapkan metode imobilisasi oligosakarida berbasis konjugasi biotin baru yang berhasil melabeli mayoritas oligosakarida larut DP rendah pada permukaan pelat mikro, yang kemudian digunakan dalam sistem mAb throughput tinggi untuk analisis ligasi spesifik.Metode baru ini akan memfasilitasi pengembangan pengujian glikoma throughput tinggi yang lebih maju di masa depan yang dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi oligosakarida yang ada dalam biomarker untuk tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, terdiri dari bahan pertanian, kehutanan, rumput dan kayu, merupakan bahan baku potensial untuk produksi produk berbasis bio, termasuk makanan, pakan, bahan bakar dan prekursor kimia untuk menghasilkan produk bernilai lebih tinggi1.Karbohidrat (seperti selulosa dan hemiselulosa) yang ada di dinding sel tanaman didepolimerisasi menjadi monosakarida melalui proses kimia dan biotransformasi (seperti hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba).Pra-perawatan umum termasuk ekspansi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL), dan ledakan uap (SE), yang menggunakan kombinasi bahan kimia dan panas untuk mengurangi produksi lignoselulosa dengan membuka dinding sel tanaman3,4.keras kepala materi, 5. Hidrolisis enzimatik dilakukan pada beban padat tinggi menggunakan enzim komersial yang mengandung karbohidrat aktif (CAZymes) dan fermentasi mikroba menggunakan ragi atau bakteri transgenik untuk menghasilkan bahan bakar dan bahan kimia berbasis bio 6 .
CAZymes dalam enzim komersial terdiri dari campuran kompleks enzim yang secara sinergis membelah ikatan karbohidrat-gula kompleks untuk membentuk monosakarida 2,7.Seperti yang kami laporkan sebelumnya, jaringan kompleks polimer aromatik lignin dengan karbohidrat membuat mereka sangat keras, yang menyebabkan konversi gula tidak lengkap, mengakumulasi 15-25% oligosakarida seks yang tidak diproduksi selama hidrolisis enzimatik dari biomassa yang telah diolah sebelumnya.Ini adalah masalah umum dengan berbagai metode pretreatment biomassa.Beberapa alasan untuk kemacetan ini termasuk penghambatan enzim selama hidrolisis, atau tidak adanya atau rendahnya tingkat enzim esensial esensial yang diperlukan untuk memutus ikatan gula dalam biomassa tanaman.Memahami komposisi dan karakteristik struktural gula, seperti ikatan gula dalam oligosakarida, akan membantu kami meningkatkan konversi gula selama hidrolisis, membuat proses bioteknologi bersaing biaya dengan produk turunan minyak bumi.
Menentukan struktur karbohidrat merupakan tantangan dan membutuhkan kombinasi metode seperti kromatografi cair (LC)11,12, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR)13, elektroforesis kapiler (CE)14,15,16 dan spektrometri massa (MS)17.,delapan belas.Metode MS seperti spektrometri massa waktu terbang dengan desorpsi laser dan ionisasi menggunakan matriks (MALDI-TOF-MS) adalah metode serbaguna untuk mengidentifikasi struktur karbohidrat.Baru-baru ini, MS tandem Collision-Induced Dissociation (CID) dari adisi ion natrium telah paling banyak digunakan untuk mengidentifikasi sidik jari yang sesuai dengan posisi perlekatan oligosakarida, konfigurasi anomerik, urutan, dan posisi percabangan 20, 21 .
Analisis Glycan adalah alat yang sangat baik untuk identifikasi mendalam dari ikatan karbohidrat22.Metode ini menggunakan antibodi monoklonal (mAbs) yang diarahkan ke glikan dinding sel tumbuhan sebagai probe untuk memahami keterkaitan karbohidrat kompleks.Lebih dari 250 mAb tersedia di seluruh dunia, dirancang untuk melawan berbagai oligosakarida linier dan bercabang menggunakan berbagai sakarida24.Beberapa mAb telah banyak digunakan untuk mengkarakterisasi struktur, komposisi, dan modifikasi dinding sel tanaman, karena ada perbedaan yang signifikan tergantung pada jenis sel tanaman, organ, umur, tahap perkembangan, dan lingkungan pertumbuhan25,26.Baru-baru ini, metode ini telah digunakan untuk memahami populasi vesikel dalam sistem tumbuhan dan hewan dan perannya masing-masing dalam transportasi glikan sebagaimana ditentukan oleh penanda subseluler, tahap perkembangan, atau rangsangan lingkungan, dan untuk menentukan aktivitas enzimatik.Beberapa struktur glikan dan xilan yang berbeda yang telah diidentifikasi antara lain pektin (P), xilan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) dan arabino-galactan (ArbG)29.
Namun, terlepas dari semua upaya penelitian ini, hanya beberapa penelitian yang berfokus pada sifat akumulasi oligosakarida selama hidrolisis muatan padat (HSL), termasuk pelepasan oligosakarida, perubahan panjang rantai oligomer selama hidrolisis, berbagai polimer DP rendah, dan kurva mereka.distribusi 30,31,32.Sementara itu, meskipun analisis glikan telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis komprehensif struktur glikan, sulit untuk mengevaluasi oligosakarida DP rendah yang larut dalam air menggunakan metode antibodi.Oligosakarida DP yang lebih kecil dengan berat molekul kurang dari 5-10 kDa tidak berikatan dengan pelat ELISA 33, 34 dan hanyut sebelum penambahan antibodi.
Di sini, untuk pertama kalinya, kami mendemonstrasikan uji ELISA pada pelat berlapis avidin menggunakan antibodi monoklonal, menggabungkan prosedur biotinilasi satu langkah untuk oligosakarida refraktori terlarut dengan analisis glikoma.Pendekatan kami terhadap analisis glikoma divalidasi oleh analisis berbasis MALDI-TOF-MS dan GC-MS dari hubungan oligosakarida komplementer menggunakan derivatisasi trimetilsilil (TMS) dari komposisi gula terhidrolisis.Pendekatan inovatif ini dapat dikembangkan sebagai metode throughput tinggi di masa mendatang dan menemukan aplikasi yang lebih luas dalam penelitian biomedis35.
Modifikasi enzim dan antibodi pasca-translasi, seperti glikosilasi,36 memengaruhi aktivitas biologisnya.Misalnya, perubahan glikosilasi protein serum memainkan peran penting dalam radang sendi, dan perubahan glikosilasi digunakan sebagai penanda diagnostik37.Berbagai glikan telah dilaporkan dalam literatur untuk segera muncul dalam berbagai penyakit, termasuk penyakit radang kronis pada saluran pencernaan dan hati, infeksi virus, kanker ovarium, payudara, dan kanker prostat38,39,40.Memahami struktur glikan menggunakan metode ELISA glikan berbasis antibodi akan memberikan kepercayaan tambahan dalam diagnosis penyakit tanpa menggunakan metode MS yang kompleks.
Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa oligosakarida keras kepala tetap tidak terhidrolisis setelah pretreatment dan hidrolisis enzimatik (Gambar 1).Dalam karya kami yang diterbitkan sebelumnya, kami mengembangkan metode ekstraksi fase padat arang aktif untuk mengisolasi oligosakarida dari hidrolisat brangkasan jagung (ACSH) yang telah diolah dengan AFEX8.Setelah ekstraksi awal dan pemisahan, oligosakarida selanjutnya difraksinasi dengan kromatografi eksklusi ukuran (SEC) dan dikumpulkan dalam urutan berat molekul.Monomer gula dan oligomer yang dilepaskan dari berbagai pretreatment dianalisis dengan analisis komposisi gula.Saat membandingkan kandungan oligomer gula yang diperoleh dengan berbagai metode pretreatment, keberadaan oligosakarida yang membandel merupakan masalah umum dalam konversi biomassa menjadi monosakarida dan dapat menyebabkan penurunan hasil gula setidaknya 10-15% bahkan hingga 18%.KITA.Metode ini digunakan untuk produksi fraksi oligosakarida skala besar lebih lanjut.ACH yang dihasilkan dan fraksi selanjutnya dengan berat molekul berbeda digunakan sebagai bahan percobaan untuk karakterisasi oligosakarida dalam penelitian ini.
Setelah pretreatment dan hidrolisis enzimatik, oligosakarida persisten tetap tidak terhidrolisis.Di sini (A) adalah metode pemisahan oligosakarida di mana oligosakarida diisolasi dari hidrolisat brangkasan jagung (ACSH) yang telah diolah AFEX menggunakan hamparan karbon aktif dan tanah diatom;(B) Metode pemisahan oligosakarida.Oligosakarida selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi eksklusi ukuran (SEC);(C) Monomer dan oligomer sakarida dilepaskan dari berbagai perlakuan awal (asam encer: DA, cairan ionik: IL dan AFEX).Kondisi hidrolisis enzimatik: pemuatan padatan tinggi 25% (b/b) (kira-kira 8% pemuatan glukan), hidrolisis 96 jam, pemuatan enzim komersial 20 mg/g (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dan ( D) Monomer gula dan oligomer glukosa, xilosa dan arabinosa dilepaskan dari brangkasan jagung (ACS) pra-perawatan AFEX.
Analisis glikan telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis struktural komprehensif glikan dalam ekstrak yang diisolasi dari residu biomassa padat.Namun, sakarida yang larut dalam air kurang terwakili menggunakan metode tradisional ini41 karena oligosakarida dengan berat molekul rendah sulit untuk diimobilisasi pada pelat ELISA dan dicuci sebelum penambahan antibodi.Oleh karena itu, untuk pengikatan dan karakterisasi antibodi, metode biotinilasi satu langkah digunakan untuk melapisi oligosakarida yang tidak sesuai dan larut pada pelat ELISA berlapis avidin.Metode ini diuji menggunakan ACSH yang diproduksi sebelumnya dan fraksi berdasarkan berat molekulnya (atau tingkat polimerisasi, DP).Biotinilasi satu langkah digunakan untuk meningkatkan afinitas pengikatan oligosakarida dengan menambahkan biotin-LC-hidrazida ke ujung pereduksi karbohidrat (Gbr. 2).Dalam larutan, gugus hemiasetal pada ujung pereduksi bereaksi dengan gugus hidrazida dari biotin-LC-hidrazida untuk membentuk ikatan hidrazon.Dengan adanya agen pereduksi NaCNBH3, ikatan hidrazon direduksi menjadi produk akhir terbiotinilasi yang stabil.Dengan modifikasi ujung pereduksi gula, pengikatan oligosakarida DP rendah ke pelat ELISA menjadi mungkin, dan dalam penelitian kami ini dilakukan pada pelat berlapis avidin menggunakan mAb yang ditargetkan glikan.
Skrining antibodi monoklonal berdasarkan ELISA untuk oligosakarida terbiotinilasi.Di sini (A) menggabungkan biotinilasi oligosakarida dan skrining ELISA berikutnya dengan mAb bertarget glikan pada pelat berlapis NeutrAvidin dan (B) menunjukkan prosedur satu langkah untuk biotinilasi produk reaksi.
Pelat berlapis Avidin dengan antibodi terkonjugasi oligosakarida kemudian ditambahkan ke antibodi primer dan sekunder dan dicuci dalam media peka cahaya dan waktu.Setelah pengikatan antibodi selesai, tambahkan substrat TMB untuk menginkubasi pelat.Reaksi akhirnya dihentikan dengan asam sulfat.Pelat yang diinkubasi dianalisis menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan kekuatan pengikatan masing-masing antibodi untuk mendeteksi ikatan silang spesifik antibodi.Untuk detail dan parameter percobaan, lihat bagian terkait “Bahan dan Metode”.
Kami mendemonstrasikan kegunaan metode yang baru dikembangkan ini untuk aplikasi spesifik dengan mengkarakterisasi oligosakarida terlarut yang ada dalam ACSH serta dalam fraksi oligosakarida mentah dan murni yang diisolasi dari hidrolisat lignoselulosa.Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, xylan tersubstitusi epitop yang paling umum diidentifikasi dalam ACSH menggunakan metode pengujian glikoma terbioasilasi biasanya adalah uronic (U) atau methyluronic (MeU) dan pectic arabinogalactans.Sebagian besar juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya pada analisis glikan padatan yang tidak terhidrolisis (UHS)43.
Deteksi epitop oligosakarida bandel menggunakan antibodi monoklonal yang diarahkan ke glikan dinding sel.Fraksi "netral" adalah fraksi ACN dan fraksi "asam" adalah fraksi FA.Warna merah yang lebih cerah pada peta panas menunjukkan konten epitop yang lebih tinggi, dan warna biru yang lebih cerah menunjukkan latar belakang kosong.Nilai warna pada skala didasarkan pada nilai mentah OD untuk formulasi N=2.Epitop utama yang dikenali oleh antibodi ditunjukkan di sebelah kanan.
Struktur non-selulosa ini tidak dapat dibelah oleh selulase dan hemiselulase yang paling umum dalam campuran enzim komersial yang diuji, yang mencakup enzim komersial yang paling umum digunakan.Oleh karena itu, enzim tambahan baru diperlukan untuk hidrolisisnya.Tanpa enzim aksesori non-selulosa yang diperlukan, ikatan non-selulosa ini mencegah konversi lengkap menjadi monosakarida, bahkan jika polimer gula induknya dihidrolisis secara ekstensif menjadi fragmen yang lebih pendek dan dilarutkan menggunakan campuran enzim komersial.
Studi lebih lanjut tentang distribusi sinyal dan kekuatan pengikatannya menunjukkan bahwa pengikatan epitop lebih rendah pada fraksi gula DP tinggi (A, B, C, DP hingga 20+) dibandingkan pada fraksi DP rendah (D, E, F, DP) dalam dimer) (Gbr. 1).Fragmen asam lebih umum pada epitop non-selulosa daripada fragmen netral.Fenomena ini konsisten dengan pola yang diamati dalam penelitian kami sebelumnya, di mana gugus DP dan asam yang tinggi lebih tahan terhadap hidrolisis enzimatik.Oleh karena itu, keberadaan epitop glikan non-selulosa dan substitusi U dan MeU dapat sangat berkontribusi pada stabilitas oligosakarida.Perlu dicatat bahwa efisiensi pengikatan dan deteksi dapat menjadi masalah untuk oligosakarida DP rendah, terutama jika epitopnya adalah oligosakarida dimerik atau trimerik.Ini dapat diuji menggunakan oligosakarida komersial dengan panjang berbeda, masing-masing hanya berisi satu epitop yang berikatan dengan mAb tertentu.
Dengan demikian, penggunaan antibodi spesifik struktur mengungkapkan jenis ikatan bandel tertentu.Bergantung pada jenis antibodi yang digunakan, pola ligasi yang sesuai, dan kekuatan sinyal yang dihasilkannya (paling banyak dan paling sedikit), enzim baru dapat diidentifikasi dan ditambahkan secara semi-kuantitatif ke dalam campuran enzim untuk konversi glikon yang lebih lengkap.Mengambil analisis oligosakarida ACSH sebagai contoh, kita dapat membuat database ikatan glikan untuk setiap bahan biomassa.Perlu dicatat di sini bahwa afinitas antibodi yang berbeda harus diperhitungkan, dan jika afinitasnya tidak diketahui, ini akan menimbulkan kesulitan tertentu saat membandingkan sinyal dari antibodi yang berbeda.Selain itu, perbandingan ikatan glikan dapat bekerja paling baik di antara sampel untuk antibodi yang sama.Ikatan keras ini kemudian dapat dihubungkan ke database CAZyme, dari mana kita dapat mengidentifikasi enzim, memilih kandidat enzim dan menguji enzim pemecah ikatan, atau mengembangkan sistem mikroba untuk mengekspresikan enzim ini untuk digunakan dalam biorefineries44.
Untuk mengevaluasi bagaimana metode imunologi melengkapi metode alternatif untuk mengkarakterisasi oligosakarida dengan berat molekul rendah yang ada dalam hidrolisat lignoselulosa, kami melakukan MALDI (Gbr. 4, S1-S8) dan analisis sakarida turunan TMS berdasarkan GC-MS pada panel yang sama (Gbr. 5) bagian oligosakarida.MALDI digunakan untuk membandingkan apakah distribusi massa molekul oligosakarida sesuai dengan struktur yang diinginkan.Pada ara.4 menunjukkan MC dari komponen netral ACN-A dan ACN-B.Analisis ACN-A mengkonfirmasi kisaran gula pentosa mulai dari DP 4-8 (Gbr. 4) hingga DP 22 (Gbr. S1), yang bobotnya sesuai dengan oligosakarida MeU-xylan.Analisis ACN-B mengkonfirmasi seri pentosa dan glukoksilan dengan DP 8-15.Dalam bahan tambahan seperti Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C menunjukkan kisaran gula pentosa tersubstitusi (Me)U dengan DP 8-15 yang konsisten dengan xilan tersubstitusi yang ditemukan dalam penyaringan mAb berbasis ELISA.Epitopnya konsisten.
Spektrum MALDI-MS dari oligosakarida non-kompatibel yang larut hadir dalam ACS.Di sini, (A) ACN-A fraksi rentang berat rendah yang mengandung asam uronat termetilasi (DP 4-8) menggantikan oligosakarida glukuroksilan dan (B) xilan ACN-B dan oligosakarida asam uronat termetilasi diganti dengan glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glikan dari oligosakarida refraktori.Berikut (A) komposisi sakarida TMS dari berbagai fraksi oligosakarida diperoleh dengan menggunakan analisis GC-MS.(B) Struktur berbagai gula turunan TMS yang ada dalam oligosakarida.ACN – fraksi asetonitril yang mengandung oligosakarida netral dan FA – fraksi asam ferulat yang mengandung oligosakarida asam.
Kesimpulan lain yang menarik diambil dari analisis LC-MS dari fraksi oligosakarida, seperti yang ditunjukkan pada Gambar S9 (metode dapat dilihat pada bahan pelengkap elektronik).Fragmen gugus heksosa dan -OAc berulang kali diamati selama ligasi fraksi ACN-B.Temuan ini tidak hanya menegaskan fragmentasi yang diamati dalam analisis glikoma dan MALDI-TOF, tetapi juga memberikan informasi baru tentang turunan karbohidrat potensial dalam biomassa lignoselulosa yang telah diolah sebelumnya.
Kami juga menganalisis komposisi gula dari fraksi oligosakarida menggunakan derivatisasi gula TMS.Menggunakan GC-MS, kami menentukan komposisi gula saraf (non-turunan) dan asam (GluA dan GalA) dalam fraksi oligosakarida (Gbr. 5).Asam glukuronat ditemukan dalam komponen asam C dan D, sedangkan asam galakturonat ditemukan dalam komponen asam A dan B, keduanya merupakan komponen DP tinggi dari gula asam.Hasil ini tidak hanya mengkonfirmasi data ELISA dan MALDI kami, tetapi juga konsisten dengan penelitian kami sebelumnya tentang akumulasi oligosakarida.Oleh karena itu, kami percaya bahwa metode imunologi modern menggunakan biotinilasi oligosakarida dan skrining ELISA berikutnya cukup untuk mendeteksi oligosakarida bandel yang larut dalam berbagai sampel biologis.
Karena metode skrining mAb berbasis ELISA telah divalidasi oleh beberapa metode berbeda, kami ingin mengeksplorasi lebih lanjut potensi metode kuantitatif baru ini.Dua oligosakarida komersial, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) dan 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), dibeli dan diuji menggunakan pendekatan mAb baru yang menargetkan glikan dinding sel.Gambar 6 menunjukkan korelasi linier antara sinyal pengikat terbiotinilasi dan konsentrasi log konsentrasi oligosakarida, yang menunjukkan kemungkinan model adsorpsi Langmuir.Di antara mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, dan CCRC-M151 berkorelasi dengan XHE, dan CCRC-M108, CCRC-M109, dan LM11 berkorelasi dengan A2XX pada rentang 1 nm hingga 100 nano.Karena ketersediaan antibodi yang terbatas selama percobaan, percobaan terbatas dilakukan dengan masing-masing konsentrasi oligosakarida.Perlu dicatat di sini bahwa beberapa antibodi bereaksi sangat berbeda terhadap oligosakarida yang sama sebagai substrat, mungkin karena mereka berikatan dengan epitop yang sedikit berbeda dan dapat memiliki afinitas pengikatan yang sangat berbeda.Mekanisme dan implikasi dari identifikasi epitop yang akurat akan jauh lebih kompleks ketika pendekatan mAb baru diterapkan pada sampel nyata.
Dua oligosakarida komersial digunakan untuk menentukan jangkauan deteksi berbagai mAb penargetan glikan.Di sini, korelasi linier dengan konsentrasi log konsentrasi oligosakarida menunjukkan pola adsorpsi Langmuir untuk (A) XHE dengan mAb dan (B) A2XX dengan mAb.Epitop yang sesuai menunjukkan struktur oligosakarida komersial yang digunakan sebagai substrat dalam pengujian.
Penggunaan antibodi monoklonal bertarget glikan (analisis glikokomik atau skrining mAb berbasis ELISA) adalah alat yang ampuh untuk karakterisasi mendalam dari sebagian besar glikan dinding sel utama yang membentuk biomassa tanaman.Namun, analisis glikan klasik hanya mencirikan glikan dinding sel yang lebih besar, karena sebagian besar oligosakarida tidak diimobilisasi secara efisien pada pelat ELISA.Dalam penelitian ini, brangkasan jagung yang diberi perlakuan AFEX dihidrolisis secara enzimatik pada kandungan padatan yang tinggi.Analisis gula digunakan untuk menentukan komposisi karbohidrat dinding sel rekalsitran dalam hidrolisat.Namun, analisis mAb oligosakarida yang lebih kecil dalam hidrolisat diremehkan, dan alat tambahan diperlukan untuk melumpuhkan oligosakarida secara efektif pada pelat ELISA.
Kami melaporkan di sini metode imobilisasi oligosakarida yang baru dan efisien untuk skrining mAb dengan menggabungkan biotinilasi oligosakarida diikuti dengan skrining ELISA pada pelat berlapis NeutrAvidin™.Oligosakarida biotinilasi amobil menunjukkan afinitas yang cukup untuk antibodi untuk memungkinkan deteksi oligosakarida bandel yang cepat dan efisien.Analisis komposisi oligosakarida membandel ini berdasarkan spektrometri massa mengkonfirmasi hasil dari pendekatan baru untuk imunoskrining ini.Dengan demikian, studi ini menunjukkan bahwa kombinasi biotinilasi oligosakarida dan skrining ELISA dengan antibodi monoklonal bertarget glikan dapat digunakan untuk mendeteksi ikatan silang dalam oligosakarida dan dapat diterapkan secara luas dalam studi biokimia lain yang mencirikan struktur oligosakarida.
Metode profil glikan berbasis biotin ini adalah laporan pertama yang mampu menyelidiki ikatan karbohidrat bandel dari oligosakarida terlarut dalam biomassa tanaman.Ini membantu untuk memahami mengapa beberapa bagian dari biomassa sangat keras kepala dalam hal produksi biofuel.Metode ini mengisi celah penting dalam metode analisis glikoma dan memperluas penerapannya ke berbagai substrat yang lebih luas di luar oligosakarida tanaman.Di masa mendatang, kami dapat menggunakan robotika untuk biotinilasi dan menggunakan metode yang telah kami kembangkan untuk analisis sampel dengan hasil tinggi menggunakan ELISA.
Jerami jagung (CS) yang ditanam dari benih hibrida Pioneer 33A14 dipanen pada tahun 2010 dari Kramer Farms di Ray, Colorado.Dengan izin pemilik lahan, biomassa ini dapat digunakan untuk penelitian. Sampel disimpan kering <6% kelembaban dalam kantong zip-lock dalam suhu kamar. Sampel disimpan kering <6% kelembaban dalam kantong zip-lock dalam suhu kamar. Образцы хранились сухими влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре . Sampel disimpan kering pada kelembaban <6% dalam kantong berritsleting pada suhu kamar.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpan dalam kantong ritsleting pada suhu kamar dengan kelembaban < 6%.Studi ini mematuhi pedoman lokal dan nasional.Analisis komposisi dilakukan dengan menggunakan protokol NREL.Komposisi tersebut ditemukan mengandung glukan 31,4%, xilan 18,7%, arabinan 3,3%, galaktan 1,2%, asetil 2,2%, lignin 14,3%, protein 1,7% dan abu 13,4%.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) adalah campuran kompleks selulase, β-glukosidase dan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) dari Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim pengurai pektin, disumbangkan oleh DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Konsentrasi protein enzim ditentukan dengan memperkirakan kandungan protein (dan mengurangi kontribusi nitrogen non-protein) menggunakan analisis nitrogen Kjeldahl (metode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Tanah diatom 545 dibeli dari EMD Millipore (Billerica, MA).Karbon aktif (DARCO, butiran 100 mesh), Avicel (PH-101), beech xylan, dan semua bahan kimia lainnya dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretreatment AFEX dilakukan di GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Perlakuan awal dilakukan pada 140°C selama 15 menit.46 waktu tinggal pada rasio 1:1 antara amonia anhidrat dengan biomassa pada pemuatan 60% (b/b) dalam reaktor batch benchtop baja tahan karat (Parr Instruments Company).Butuh waktu 30 menit.Reaktor dibawa ke 140°C dan amonia dengan cepat dilepaskan, memungkinkan biomassa dengan cepat kembali ke suhu kamar.Komposisi brangkasan jagung pra-perawatan AFEX (ACS) serupa dengan brangkasan jagung tanpa perlakuan (UT-CS).
Padatan tinggi ACSH 25% (b/b) (sekitar 8% pemuatan dekstran) disiapkan sebagai bahan awal untuk produksi oligosakarida skala besar.Hidrolisis enzimatik ACS dilakukan menggunakan campuran enzim komersial termasuk Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (dalam biomassa yang telah diolah sebelumnya), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan, dan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protein/g dekstran.Hidrolisis enzimatis dilakukan dalam bioreaktor 5 liter dengan volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50°C dan 250 rpm.Setelah hidrolisis selama 96 jam, hidrolisat dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 menit dan kemudian pada 14000 rpm selama 30 menit untuk menghilangkan padatan yang tidak terhidrolisis.Hidrolisat kemudian dilakukan penyaringan steril melalui gelas kimia penyaring 0,22 mm.Hidrolisat yang disaring disimpan dalam botol steril pada suhu 4°C dan kemudian difraksinasi pada karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa berbasis ekstrak menurut prosedur analisis laboratorium NREL: penyiapan sampel untuk analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) dan penentuan struktur karbohidrat dan lignin dalam biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida dari aliran hidrolisat dilakukan pada skala 2 ml menggunakan metode hidrolisis asam berbasis autoklaf.Campurkan sampel hidrolisat dengan 69,7 µl asam sulfat 72% dalam tabung biakan bertutup ulir 10 ml dan inkubasi selama 1 jam di atas meja pada suhu 121 °C, dinginkan di atas es dan saring ke dalam vial kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).Konsentrasi oligosakarida ditentukan dengan mengurangkan konsentrasi monosakarida dalam sampel yang tidak dihidrolisis dari konsentrasi gula total dalam sampel yang dihidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, dan arabinosa dalam biomassa terhidrolisis asam dianalisis menggunakan sistem HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan autosampler, pemanas kolom, pompa isokratik, dan detektor indeks bias pada kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolom dipertahankan pada 50°C dan dielusi dengan 0,6 ml/menit 5 mM H2SO4 dalam air.mengalir.
Supernatan hidrolisat diencerkan dan dianalisis kandungan monomer dan oligosakarida.Gula monomer yang diperoleh setelah hidrolisis enzimatik dianalisis dengan HPLC yang dilengkapi dengan kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dan kolom pelindung abu.Temperatur kolom dipertahankan pada 80°C, air digunakan sebagai fase gerak dengan laju alir 0,6 ml/menit.Oligosakarida ditentukan dengan hidrolisis dalam asam encer pada 121 ° C sesuai dengan metode yang dijelaskan dalam referensi.41, 48, 49.
Analisis sakarida dilakukan pada mentah, AFEX pra-perawatan dan semua residu biomassa yang tidak terhidrolisis (termasuk produksi ekstrak dinding sel serial dan penyaringan mAb mereka) menggunakan prosedur yang dijelaskan sebelumnya 27, 43, 50, 51 .Untuk analisis glikoma, residu bahan dinding sel tanaman yang tidak larut alkohol dibuat dari residu biomassa dan mengalami ekstraksi serial dengan reagen yang semakin agresif seperti amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM dan 0,5% b/v), CON.(1M dan 4M, keduanya dengan 1% b/v natrium borohidrida) dan asam klorit seperti yang dijelaskan sebelumnya52,53.Ekstrak kemudian dikenai ELISA terhadap panel kompleks mAb50 yang diarahkan ke glikan dinding sel, dan reaksi pengikatan mAb disajikan sebagai peta panas.mAb yang menargetkan glikan dinding sel tanaman dibeli dari stok laboratorium (seri CCRC, JIM dan MAC).
Biotinilasi satu langkah oligosakarida.Konjugasi karbohidrat dengan biotin-LC-hidrazida dilakukan dengan menggunakan prosedur berikut.Biotin-LC-hidrazida (4,6 mg/12 µmol) dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, 70 µl) dengan pengadukan kuat dan pemanasan pada 65°C selama 1 menit.Asam asetat glasial (30 µl) ditambahkan dan campuran dituangkan ke dalam natrium sianoborohidrida (6,4 mg/100 µmol) dan larut sempurna setelah pemanasan pada 65°C selama sekitar 1 menit.Kemudian, dari 5 hingga 8 μl campuran reaksi ditambahkan ke oligosakarida kering (1-100 nmol) untuk mendapatkan kelebihan molar 10 kali lipat atau lebih dari label pada ujung pereduksi.Reaksi dilakukan pada suhu 65°C selama 2 jam, setelah itu sampel segera dimurnikan.Tidak ada natrium sianoborohidrida yang digunakan dalam percobaan pelabelan tanpa reduksi, dan sampel direaksikan pada 65°C selama 2,5 jam.
Pelapisan ELISA dan pencucian sampel oligosakarida terbiotinilasi.25 μl sampel terbiotinilasi (100 μl dari setiap sampel pekat yang diencerkan dalam 5 ml larutan buffer Tris (TBS) 0,1 M) ditambahkan ke setiap sumur pelat berlapis avidin.Sumur kontrol dilapisi dengan 50 μl biotin pada konsentrasi 10 μg/ml dalam 0,1 M TBS.Air deionisasi digunakan sebagai pelapis untuk pengukuran blanko.Tablet diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar di tempat gelap.Cuci piring 3 kali dengan susu skim 0,1% dalam 0,1 M TBS menggunakan program no.11 untuk Grenier flat 3A.
Penambahan dan pencucian antibodi primer.Tambahkan 40 µl antibodi primer ke setiap lubang.Inkubasi lempeng mikro selama 1 jam pada suhu kamar dalam gelap.Pelat kemudian dicuci 3 kali dengan 0,1% susu dalam 0,1M TBS menggunakan program pencucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambahkan antibodi sekunder dan cuci.Tambahkan 50 µl antibodi sekunder mencit/tikus (diencerkan 1:5000 dalam 0,1% susu dalam 0,1 M TBS) ke setiap lubang.Inkubasi lempeng mikro selama 1 jam pada suhu kamar dalam gelap.Pelat mikro kemudian dicuci 5 kali dengan 0,1% susu dalam TBS 0,1 M menggunakan program pencucian pelat Grenier Flat 5A #12.
Menambahkan substrat.Tambahkan 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ke substrat dasar (dengan menambahkan 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogen peroksida ke dalam 15 ml air deionisasi).Siapkan substrat TMB.dan vortex sebelum digunakan).Inkubasi lempeng mikro pada suhu kamar selama 30 menit.Dalam gelap.
Selesaikan langkahnya dan baca tabletnya.Tambahkan 50 µl asam sulfat 1 N ke masing-masing sumur dan catat absorbansi dari 450 hingga 655 nm menggunakan ELISA reader.
Siapkan 1 mg/ml larutan analit ini dalam air deionisasi: arabinosa, rhamnose, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmanosamin (manNAc), N-asetilglukosamin .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standar internal).Dua standar dibuat dengan menambahkan 1 mg/mL larutan gula yang ditunjukkan pada Tabel 1. Sampel dibekukan dan diliofilisasi pada -80°C sampai semua air dihilangkan (biasanya sekitar 12-18 jam).
Tambahkan 100–500 µg sampel ke tabung tutup ulir pada timbangan analitik.Catat jumlah yang ditambahkan.Yang terbaik adalah melarutkan sampel dalam konsentrasi pelarut tertentu dan menambahkannya ke dalam tabung sebagai alikuot cair.Gunakan 20 µl inositol 1 mg/ml sebagai standar internal untuk setiap tabung sampel.Jumlah standar internal yang ditambahkan ke sampel harus sama dengan jumlah standar internal yang ditambahkan ke tabung standar.
Tambahkan 8 ml metanol anhidrat ke botol bertutup ulir.Kemudian 4 ml larutan HCl metanol 3 N., ditutup dan dikocok.Proses ini tidak menggunakan air.
Tambahkan 500 µl larutan metanol HCl 1 M ke sampel oligosakarida dan tabung TMS standar.Sampel diinkubasi semalam (168 jam) pada 80°C dalam blok termal.Keringkan produk metanolisis pada suhu kamar menggunakan pengering manifold.Tambahkan 200 µl MeOH dan keringkan kembali.Proses ini diulang dua kali.Tambahkan 200 µl metanol, 100 µl piridin dan 100 µl anhidrida asetat ke dalam sampel dan aduk rata.Sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit.dan dikeringkan.Tambahkan 200 µl metanol dan keringkan kembali.
Tambahkan 200 µl Tri-Sil dan panaskan tabung tertutup selama 20 menit.80°C, lalu didinginkan hingga suhu kamar.Gunakan manifold pengering untuk mengeringkan sampel lebih lanjut hingga volume sekitar 50 µl.Penting untuk dicatat bahwa kami tidak membiarkan sampel mengering sepenuhnya.
Tambahkan 2 ml heksana dan aduk rata dengan vorteks.Isi ujung pipet Pasteur (5-8 mm) dengan sepotong wol kaca dengan memasukkan wol kaca di atas pipet berdiameter 5-3/4 inci.Sampel disentrifugasi pada 3000 g selama 2 menit.Setiap residu yang tidak larut diendapkan.Keringkan sampel hingga 100-150 µl.Volume sekitar 1 μl disuntikkan ke dalam GC-MS pada suhu awal 80 °C dan waktu awal 2,0 menit (Tabel 2).