Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Metode imunologi dan spektrometri massa baru untuk analisis kompleks oligosakarida persisten dalam jerami jagung yang telah diberi perlakuan awal dengan AFEX. Biomassa lignoselulosa merupakan alternatif berkelanjutan untuk bahan bakar fosil dan banyak digunakan untuk mengembangkan bioteknologi untuk produksi produk seperti makanan, pakan, bahan bakar, dan bahan kimia. Kunci dari teknologi ini adalah pengembangan proses yang hemat biaya untuk mengubah karbohidrat kompleks yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan menjadi gula sederhana seperti glukosa, xilosa, dan arabinosa. Karena biomassa lignoselulosa sangat sulit diolah, biomassa tersebut harus diberi perlakuan termokimia (misalnya, eksfoliasi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL)) dan perlakuan biologis (misalnya, hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba) secara kombinasi untuk mendapatkan produk yang diinginkan. Namun, ketika enzim jamur komersial digunakan dalam proses hidrolisis, hanya 75-85% gula larut yang terbentuk adalah monosakarida, dan sisanya 15-25% adalah oligosakarida larut yang sulit diolah, yang tidak selalu tersedia bagi mikroorganisme. Sebelumnya, kami telah berhasil mengisolasi dan memurnikan oligosakarida larut yang sulit diolah menggunakan kombinasi pemisahan karbon dan tanah diatom serta kromatografi eksklusi ukuran, dan juga menyelidiki sifat penghambatan enzimnya. Kami menemukan bahwa oligosakarida yang mengandung substitusi asam uronat termetilasi dengan derajat polimerisasi (DP) yang lebih tinggi lebih sulit diproses dengan campuran enzim komersial daripada oligosakarida DP rendah dan netral. Di sini kami melaporkan penggunaan beberapa metode tambahan, termasuk profil glikan menggunakan antibodi monoklonal (mAb) spesifik untuk glikan biomassa tanaman untuk mengkarakterisasi ikatan glikan dalam dinding sel tanaman dan hidrolisat enzimatik, ionisasi desorpsi laser berbantuan matriks, spektrometri massa waktu terbang. MALDI-TOF-MS menggunakan puncak diagnostik informatif struktur yang diperoleh melalui spektroskopi setelah peluruhan sekunder ion negatif, kromatografi gas dan spektrometri massa (GC-MS) untuk mengkarakterisasi ikatan oligosakarida dengan dan tanpa derivatisasi. Karena ukuran oligosakarida yang kecil (DP 4–20), molekul-molekul ini sulit digunakan untuk pengikatan dan karakterisasi mAb. Untuk mengatasi masalah ini, kami menerapkan metode imobilisasi oligosakarida berbasis konjugasi biotin baru yang berhasil memberi label pada sebagian besar oligosakarida larut dengan DP rendah pada permukaan mikropelat, yang kemudian digunakan dalam sistem mAb berthroughput tinggi untuk analisis ligasi spesifik. Metode baru ini akan memfasilitasi pengembangan uji glikoma berthroughput tinggi yang lebih canggih di masa mendatang yang dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi oligosakarida yang ada dalam biomarker untuk tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, yang terdiri dari bahan pertanian, kehutanan, rumput, dan kayu, merupakan bahan baku potensial untuk produksi produk berbasis bio, termasuk makanan, pakan, bahan bakar, dan prekursor kimia untuk menghasilkan produk bernilai lebih tinggi1. Karbohidrat (seperti selulosa dan hemiselulosa) yang terdapat dalam dinding sel tumbuhan didepolimerisasi menjadi monosakarida melalui pemrosesan kimia dan biotransformasi (seperti hidrolisis enzimatik dan fermentasi mikroba). Perlakuan awal yang umum meliputi ekspansi serat amonia (AFEX), asam encer (DA), cairan ionik (IL), dan ledakan uap (SE), yang menggunakan kombinasi bahan kimia dan panas untuk mengurangi produksi lignoselulosa dengan membuka dinding sel tumbuhan3,4. Hidrolisis enzimatik dilakukan pada beban padatan tinggi menggunakan enzim yang mengandung karbohidrat aktif komersial (CAZymes) dan fermentasi mikroba menggunakan ragi atau bakteri transgenik untuk menghasilkan bahan bakar dan bahan kimia berbasis bio6.
CAZymes dalam enzim komersial terdiri dari campuran kompleks enzim yang secara sinergis memecah ikatan karbohidrat-gula yang kompleks untuk membentuk monosakarida2,7. Seperti yang telah kami laporkan sebelumnya, jaringan kompleks polimer aromatik lignin dengan karbohidrat membuatnya sangat sulit diurai, yang menyebabkan konversi gula yang tidak lengkap, sehingga terakumulasi 15-25% oligosakarida yang tidak dihasilkan selama hidrolisis enzimatik biomassa yang telah diolah sebelumnya. Ini adalah masalah umum pada berbagai metode pengolahan biomassa. Beberapa alasan terjadinya hambatan ini termasuk penghambatan enzim selama hidrolisis, atau tidak adanya atau rendahnya kadar enzim esensial yang diperlukan untuk memecah ikatan gula dalam biomassa tanaman. Memahami komposisi dan karakteristik struktural gula, seperti ikatan gula dalam oligosakarida, akan membantu kita meningkatkan konversi gula selama hidrolisis, sehingga proses bioteknologi menjadi lebih hemat biaya dibandingkan produk turunan minyak bumi.
Menentukan struktur karbohidrat merupakan tantangan dan membutuhkan kombinasi metode seperti kromatografi cair (LC)11,12, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR)13, elektroforesis kapiler (CE)14,15,16 dan spektrometri massa (MS)17,18. Metode MS seperti spektrometri massa waktu terbang dengan desorpsi dan ionisasi laser menggunakan matriks (MALDI-TOF-MS) merupakan metode serbaguna untuk mengidentifikasi struktur karbohidrat. Baru-baru ini, spektrometri massa tandem Collision-Induced Dissociation (CID) dari aduk ion natrium telah paling banyak digunakan untuk mengidentifikasi sidik jari yang sesuai dengan posisi perlekatan oligosakarida, konfigurasi anomerik, urutan, dan posisi percabangan 20, 21.
Analisis glikan merupakan alat yang sangat baik untuk identifikasi mendalam ikatan karbohidrat22. Metode ini menggunakan antibodi monoklonal (mAb) yang diarahkan ke glikan dinding sel tumbuhan sebagai probe untuk memahami ikatan karbohidrat yang kompleks. Lebih dari 250 mAb tersedia di seluruh dunia, dirancang terhadap berbagai oligosakarida linier dan bercabang menggunakan berbagai sakarida24. Beberapa mAb telah banyak digunakan untuk mengkarakterisasi struktur, komposisi, dan modifikasi dinding sel tumbuhan, karena terdapat perbedaan signifikan tergantung pada jenis sel tumbuhan, organ, umur, tahap perkembangan, dan lingkungan pertumbuhan25,26. Baru-baru ini, metode ini telah digunakan untuk memahami populasi vesikel dalam sistem tumbuhan dan hewan serta peran masing-masing dalam transportasi glikan yang ditentukan oleh penanda subseluler, tahap perkembangan, atau rangsangan lingkungan, dan untuk menentukan aktivitas enzimatik. Beberapa struktur glikan dan xilan yang berbeda yang telah diidentifikasi meliputi pektin (P), xilan (X), mannan (M), xiloglukan (XylG), glukan ikatan campuran (MLG), arabinoxilan (ArbX), galaktomannan (GalG), asam glukuronat-arabinoksilan (GArbX) dan arabino-galaktan (ArbG)29.
Namun, terlepas dari semua upaya penelitian ini, hanya sedikit studi yang berfokus pada sifat akumulasi oligosakarida selama hidrolisis beban padatan tinggi (HSL), termasuk pelepasan oligosakarida, perubahan panjang rantai oligomer selama hidrolisis, berbagai polimer DP rendah, dan kurva distribusinya 30,31,32. Sementara itu, meskipun analisis glikan telah terbukti sebagai alat yang berguna untuk analisis komprehensif struktur glikan, sulit untuk mengevaluasi oligosakarida DP rendah yang larut dalam air menggunakan metode antibodi. Oligosakarida DP yang lebih kecil dengan berat molekul kurang dari 5-10 kDa tidak mengikat pelat ELISA 33, 34 dan tercuci sebelum penambahan antibodi.
Di sini, untuk pertama kalinya, kami mendemonstrasikan uji ELISA pada pelat berlapis avidin menggunakan antibodi monoklonal, menggabungkan prosedur biotinilasi satu langkah untuk oligosakarida refraktori terlarut dengan analisis glikoma. Pendekatan kami terhadap analisis glikoma divalidasi oleh analisis berbasis MALDI-TOF-MS dan GC-MS dari ikatan oligosakarida komplementer menggunakan derivatisasi trimetilsilil (TMS) dari komposisi gula terhidrolisis. Pendekatan inovatif ini dapat dikembangkan sebagai metode berkecepatan tinggi di masa depan dan menemukan aplikasi yang lebih luas dalam penelitian biomedis35.
Modifikasi pasca-translasi enzim dan antibodi, seperti glikosilasi,36 memengaruhi aktivitas biologisnya. Misalnya, perubahan glikosilasi protein serum memainkan peran penting dalam artritis inflamasi, dan perubahan glikosilasi digunakan sebagai penanda diagnostik37. Berbagai glikan telah dilaporkan dalam literatur mudah muncul dalam berbagai penyakit, termasuk penyakit inflamasi kronis pada saluran pencernaan dan hati, infeksi virus, kanker ovarium, payudara, dan prostat38,39,40. Memahami struktur glikan menggunakan metode ELISA glikan berbasis antibodi akan memberikan kepercayaan tambahan dalam diagnosis penyakit tanpa menggunakan metode MS yang kompleks.
Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa oligosakarida yang membandel tetap tidak terhidrolisis setelah perlakuan awal dan hidrolisis enzimatik (Gambar 1). Dalam karya kami yang telah dipublikasikan sebelumnya, kami mengembangkan metode ekstraksi fase padat arang aktif untuk mengisolasi oligosakarida dari hidrolisat jerami jagung yang telah diberi perlakuan awal AFEX (ACSH)8. Setelah ekstraksi dan pemisahan awal, oligosakarida selanjutnya difraksinasi dengan kromatografi eksklusi ukuran (SEC) dan dikumpulkan berdasarkan urutan berat molekul. Monomer dan oligomer gula yang dilepaskan dari berbagai perlakuan awal dianalisis dengan analisis komposisi gula. Ketika membandingkan kandungan oligomer gula yang diperoleh dengan berbagai metode perlakuan awal, keberadaan oligosakarida yang membandel merupakan masalah umum dalam konversi biomassa menjadi monosakarida dan dapat menyebabkan penurunan hasil gula setidaknya 10-15% dan bahkan hingga 18%. Metode ini digunakan untuk produksi fraksi oligosakarida skala besar lebih lanjut. ACH yang dihasilkan dan fraksi-fraksi selanjutnya dengan berat molekul yang berbeda digunakan sebagai bahan percobaan untuk karakterisasi oligosakarida dalam penelitian ini.
Setelah perlakuan awal dan hidrolisis enzimatik, oligosakarida persisten tetap tidak terhidrolisis. Berikut ini (A) adalah metode pemisahan oligosakarida di mana oligosakarida diisolasi dari hidrolisat jerami jagung yang telah diberi perlakuan awal AFEX (ACSH) menggunakan lapisan karbon aktif dan tanah diatom; (B) Metode untuk pemisahan oligosakarida. Oligosakarida selanjutnya dipisahkan dengan kromatografi eksklusi ukuran (SEC); (C) Monomer dan oligomer sakarida yang dilepaskan dari berbagai perlakuan awal (asam encer: DA, cairan ionik: IL dan AFEX). Kondisi hidrolisis enzimatik: pemuatan padatan tinggi 25% (w/w) (sekitar 8% pemuatan glukan), hidrolisis 96 jam, pemuatan enzim komersial 20 mg/g (rasio Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dan ( D) Monomer dan oligomer gula glukosa, xilosa dan arabinosa yang dilepaskan dari jerami jagung yang telah diberi perlakuan awal AFEX (ACS).
Analisis glikan telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk analisis struktural komprehensif glikan dalam ekstrak yang diisolasi dari residu biomassa padat. Namun, sakarida yang larut dalam air kurang terwakili menggunakan metode tradisional ini41 karena oligosakarida dengan berat molekul rendah sulit diimobilisasi pada pelat ELISA dan tercuci sebelum penambahan antibodi. Oleh karena itu, untuk pengikatan dan karakterisasi antibodi, metode biotinilasi satu langkah digunakan untuk melapisi oligosakarida yang larut dan tidak lentur pada pelat ELISA yang dilapisi avidin. Metode ini diuji menggunakan ACSH yang telah kami produksi sebelumnya dan fraksi berdasarkan berat molekulnya (atau derajat polimerisasi, DP). Biotinilasi satu langkah digunakan untuk meningkatkan afinitas pengikatan oligosakarida dengan menambahkan biotin-LC-hidrazida ke ujung pereduksi karbohidrat (Gambar 2). Dalam larutan, gugus hemiasetal pada ujung pereduksi bereaksi dengan gugus hidrazida dari biotin-LC-hidrazida untuk membentuk ikatan hidrazon. Dengan adanya agen pereduksi NaCNBH3, ikatan hidrazon direduksi menjadi produk akhir biotinilasi yang stabil. Dengan modifikasi ujung pereduksi gula, pengikatan oligosakarida DP rendah ke pelat ELISA menjadi mungkin, dan dalam penelitian kami hal ini dilakukan pada pelat berlapis avidin menggunakan mAb yang menargetkan glikan.
Penyaringan antibodi monoklonal berdasarkan ELISA untuk oligosakarida terbiotinilasi. Di sini (A) kombinasi biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA selanjutnya dengan mAb yang ditargetkan pada glikan pada pelat berlapis NeutrAvidin dan (B) menunjukkan prosedur satu langkah untuk biotinilasi produk reaksi.
Pelat berlapis avidin dengan antibodi terkonjugasi oligosakarida kemudian ditambahkan antibodi primer dan sekunder dan dicuci dalam medium yang sensitif terhadap cahaya dan waktu. Setelah pengikatan antibodi selesai, tambahkan substrat TMB untuk menginkubasi pelat. Reaksi akhirnya dihentikan dengan asam sulfat. Pelat yang telah diinkubasi dianalisis menggunakan pembaca ELISA untuk menentukan kekuatan pengikatan masing-masing antibodi untuk mendeteksi ikatan silang spesifik antibodi. Untuk detail dan parameter percobaan, lihat bagian yang sesuai “Bahan dan Metode”.
Kami mendemonstrasikan kegunaan metode yang baru dikembangkan ini untuk aplikasi spesifik dengan mengkarakterisasi oligosakarida terlarut yang terdapat dalam ACSH serta dalam fraksi oligosakarida mentah dan murni yang diisolasi dari hidrolisat lignoselulosa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, xilan tersubstitusi epitop yang paling umum diidentifikasi dalam ACSH menggunakan metode uji glikoma bioasilasi biasanya adalah arabinogalaktan uronik (U) atau metiluronat (MeU) dan pektin. Sebagian besar juga ditemukan dalam penelitian kami sebelumnya tentang analisis glikan padatan yang tidak terhidrolisis (UHS)43.
Deteksi epitop oligosakarida yang sulit dideteksi menggunakan antibodi monoklonal yang diarahkan ke glikan dinding sel. Fraksi "netral" adalah fraksi ACN dan fraksi "asam" adalah fraksi FA. Warna merah yang lebih terang pada peta panas menunjukkan kandungan epitop yang lebih tinggi, dan warna biru yang lebih terang menunjukkan latar belakang kosong. Nilai warna pada skala didasarkan pada nilai OD mentah untuk formulasi N=2. Epitop utama yang dikenali oleh antibodi ditunjukkan di sebelah kanan.
Struktur non-selulosa ini tidak dapat dipecah oleh selulase dan hemiselulase yang paling umum dalam campuran enzim komersial yang diuji, yang mencakup enzim komersial yang paling umum digunakan. Oleh karena itu, enzim tambahan baru diperlukan untuk hidrolisisnya. Tanpa enzim tambahan non-selulosa yang diperlukan, ikatan non-selulosa ini mencegah konversi lengkap menjadi monosakarida, bahkan jika polimer gula induknya dihidrolisis secara ekstensif menjadi fragmen yang lebih pendek dan dilarutkan menggunakan campuran enzim komersial.
Studi lebih lanjut tentang distribusi sinyal dan kekuatan ikatannya menunjukkan bahwa epitop pengikatan lebih rendah pada fraksi gula DP tinggi (A, B, C, DP hingga 20+) daripada pada fraksi DP rendah (D, E, F, DP dalam dimer) (Gambar 1). Fragmen asam lebih umum pada epitop non-selulosa daripada fragmen netral. Fenomena ini konsisten dengan pola yang diamati dalam penelitian kami sebelumnya, di mana DP tinggi dan gugus asam lebih tahan terhadap hidrolisis enzimatik. Oleh karena itu, keberadaan epitop glikan non-selulosa dan substitusi U dan MeU dapat sangat berkontribusi pada stabilitas oligosakarida. Perlu dicatat bahwa efisiensi pengikatan dan deteksi dapat menjadi masalah untuk oligosakarida DP rendah, terutama jika epitopnya adalah oligosakarida dimerik atau trimerik. Hal ini dapat diuji menggunakan oligosakarida komersial dengan panjang yang berbeda, masing-masing hanya mengandung satu epitop yang mengikat mAb spesifik.
Dengan demikian, penggunaan antibodi spesifik struktur mengungkapkan beberapa jenis ikatan yang sulit diuraikan. Tergantung pada jenis antibodi yang digunakan, pola ligasi yang sesuai, dan kekuatan sinyal yang dihasilkannya (paling banyak dan paling sedikit), enzim baru dapat diidentifikasi dan ditambahkan secara semi-kuantitatif ke dalam campuran enzim untuk konversi glikoprotein yang lebih lengkap. Mengambil analisis oligosakarida ACSH sebagai contoh, kita dapat membuat basis data ikatan glikan untuk setiap bahan biomassa. Perlu dicatat di sini bahwa afinitas antibodi yang berbeda harus diperhitungkan, dan jika afinitasnya tidak diketahui, ini akan menimbulkan kesulitan tertentu ketika membandingkan sinyal dari antibodi yang berbeda. Selain itu, perbandingan ikatan glikan mungkin paling baik dilakukan antar sampel untuk antibodi yang sama. Ikatan yang sulit diuraikan ini kemudian dapat dihubungkan ke basis data CAZyme, dari mana kita dapat mengidentifikasi enzim, memilih enzim kandidat dan menguji enzim pemutus ikatan, atau mengembangkan sistem mikroba untuk mengekspresikan enzim ini untuk digunakan dalam biorefinery44.
Untuk mengevaluasi bagaimana metode imunologi melengkapi metode alternatif untuk mengkarakterisasi oligosakarida berbobot molekul rendah yang terdapat dalam hidrolisat lignoselulosa, kami melakukan MALDI (Gambar 4, S1-S8) dan analisis sakarida turunan TMS berdasarkan GC-MS pada panel yang sama (Gambar 5) bagian oligosakarida. MALDI digunakan untuk membandingkan apakah distribusi massa molekul oligosakarida sesuai dengan struktur yang dimaksud. Pada Gambar 4 menunjukkan MC dari komponen netral ACN-A dan ACN-B. Analisis ACN-A mengkonfirmasi berbagai gula pentosa mulai dari DP 4–8 (Gambar 4) hingga DP 22 (Gambar S1), yang bobotnya sesuai dengan oligosakarida MeU-xilan. Analisis ACN-B mengkonfirmasi seri pentosa dan glukoksilan dengan DP 8-15. Dalam materi tambahan seperti Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C menunjukkan berbagai gula pentosa tersubstitusi (Me)U dengan DP 8-15 yang konsisten dengan xilan tersubstitusi yang ditemukan dalam penyaringan mAb berbasis ELISA. Epitopnya konsisten.
Spektrum MALDI-MS dari oligosakarida non-komplian terlarut yang terdapat dalam ACS. Di sini, (A) Fraksi rentang berat molekul rendah ACN-A yang mengandung oligosakarida glukuroksilan tersubstitusi asam uronat termetilasi (DP 4-8) dan (B) Oligosakarida xilan dan asam uronat termetilasi ACN-B yang tersubstitusi dengan glukuroksilan (DP 8-15).
Analisis komposisi residu glikan dari oligosakarida refraktori. Di sini (A) Komposisi sakarida TMS dari berbagai fraksi oligosakarida yang diperoleh menggunakan analisis GC-MS. (B) Struktur berbagai gula turunan TMS yang terdapat dalam oligosakarida. ACN – fraksi asetonitril yang mengandung oligosakarida netral dan FA – fraksi asam ferulat yang mengandung oligosakarida asam.
Kesimpulan menarik lainnya diperoleh dari analisis LC-MS fraksi oligosakarida, seperti yang ditunjukkan pada Gambar S9 (metode dapat dilihat pada materi tambahan elektronik). Fragmen heksosa dan gugus -OAc berulang kali diamati selama ligasi fraksi ACN-B. Temuan ini tidak hanya mengkonfirmasi fragmentasi yang diamati dalam analisis glikoma dan MALDI-TOF, tetapi juga memberikan informasi baru tentang potensi turunan karbohidrat dalam biomassa lignoselulosa yang telah diolah sebelumnya.
Kami juga menganalisis komposisi gula fraksi oligosakarida menggunakan derivatisasi gula TMS. Dengan menggunakan GC-MS, kami menentukan komposisi gula netral (non-derivatif) dan gula asam (GluA dan GalA) dalam fraksi oligosakarida (Gambar 5). Asam glukuronat ditemukan dalam komponen asam C dan D, sedangkan asam galakturonat ditemukan dalam komponen asam A dan B, yang keduanya merupakan komponen DP tinggi dari gula asam. Hasil ini tidak hanya mengkonfirmasi data ELISA dan MALDI kami, tetapi juga konsisten dengan penelitian kami sebelumnya tentang akumulasi oligosakarida. Oleh karena itu, kami percaya bahwa metode imunologi modern menggunakan biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA selanjutnya cukup untuk mendeteksi oligosakarida recalcitrant yang larut dalam berbagai sampel biologis.
Karena metode skrining mAb berbasis ELISA telah divalidasi oleh beberapa metode berbeda, kami ingin mengeksplorasi lebih lanjut potensi metode kuantitatif baru ini. Dua oligosakarida komersial, oligosakarida xiloheksasakarida (XHE) dan 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), dibeli dan diuji menggunakan pendekatan mAb baru yang menargetkan glikan dinding sel. Gambar 6 menunjukkan korelasi linier antara sinyal pengikatan berbiotin dan log konsentrasi oligosakarida, yang menunjukkan kemungkinan model adsorpsi Langmuir. Di antara mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, dan CCRC-M151 berkorelasi dengan XHE, dan CCRC-M108, CCRC-M109, dan LM11 berkorelasi dengan A2XX pada rentang 1 nm hingga 100 nano. Karena ketersediaan antibodi yang terbatas selama percobaan, hanya sedikit percobaan yang dilakukan dengan setiap konsentrasi oligosakarida. Perlu dicatat di sini bahwa beberapa antibodi bereaksi sangat berbeda terhadap oligosakarida yang sama sebagai substrat, mungkin karena mereka berikatan dengan epitop yang sedikit berbeda dan dapat memiliki afinitas pengikatan yang sangat berbeda. Mekanisme dan implikasi identifikasi epitop yang akurat akan jauh lebih kompleks ketika pendekatan mAb baru diterapkan pada sampel nyata.
Dua oligosakarida komersial digunakan untuk menentukan rentang deteksi berbagai mAb yang menargetkan glikan. Di sini, korelasi linier dengan log konsentrasi oligosakarida menunjukkan pola adsorpsi Langmuir untuk (A) XHE dengan mAb dan (B) A2XX dengan mAb. Epitop yang sesuai menunjukkan struktur oligosakarida komersial yang digunakan sebagai substrat dalam pengujian.
Penggunaan antibodi monoklonal yang ditargetkan pada glikan (analisis glikokomik atau skrining mAb berbasis ELISA) merupakan alat yang ampuh untuk karakterisasi mendalam sebagian besar glikan dinding sel utama yang membentuk biomassa tanaman. Namun, analisis glikan klasik hanya mengkarakterisasi glikan dinding sel yang lebih besar, karena sebagian besar oligosakarida tidak diimobilisasi secara efisien pada pelat ELISA. Dalam penelitian ini, jerami jagung yang telah diberi perlakuan AFEX dihidrolisis secara enzimatik pada kandungan padatan yang tinggi. Analisis gula digunakan untuk menentukan komposisi karbohidrat dinding sel yang sulit diurai dalam hidrolisat. Namun, analisis mAb terhadap oligosakarida yang lebih kecil dalam hidrolisat masih kurang diperhatikan, dan diperlukan alat tambahan untuk mengimobilisasi oligosakarida secara efektif pada pelat ELISA.
Kami melaporkan di sini metode imobilisasi oligosakarida baru dan efisien untuk penyaringan mAb dengan menggabungkan biotinilasi oligosakarida diikuti dengan penyaringan ELISA pada pelat berlapis NeutrAvidin™. Oligosakarida terbiotinilasi yang diimobilisasi menunjukkan afinitas yang cukup terhadap antibodi untuk memungkinkan deteksi oligosakarida yang sulit dideteksi secara cepat dan efisien. Analisis komposisi oligosakarida yang membandel ini berdasarkan spektrometri massa mengkonfirmasi hasil pendekatan baru ini untuk imunoskrining. Dengan demikian, penelitian ini menunjukkan bahwa kombinasi biotinilasi oligosakarida dan penyaringan ELISA dengan antibodi monoklonal yang ditargetkan pada glikan dapat digunakan untuk mendeteksi ikatan silang dalam oligosakarida dan dapat diterapkan secara luas dalam studi biokimia lainnya yang mengkarakterisasi struktur oligosakarida.
Metode profil glikan berbasis biotin ini merupakan laporan pertama yang mampu menyelidiki ikatan karbohidrat yang sulit diuraikan dari oligosakarida terlarut dalam biomassa tanaman. Hal ini membantu memahami mengapa beberapa bagian biomassa sangat sulit diolah untuk produksi biofuel. Metode ini mengisi celah penting dalam metode analisis glikoma dan memperluas aplikasinya ke berbagai substrat yang lebih luas di luar oligosakarida tanaman. Di masa mendatang, kita mungkin akan menggunakan robotika untuk biotinilasi dan menggunakan metode yang telah kita kembangkan untuk analisis sampel berkecepatan tinggi menggunakan ELISA.
Jerami jagung (CS) yang ditanam dari benih hibrida Pioneer 33A14 dipanen pada tahun 2010 dari Kramer Farms di Ray, Colorado. Dengan izin dari pemilik lahan, biomassa ini dapat digunakan untuk penelitian. Sampel disimpan dalam kondisi kering (< 6% kelembapan) di dalam kantong kedap udara pada suhu ruangan. Sampel disimpan dalam kondisi kering (< 6% kelembapan) di dalam kantong kedap udara pada suhu ruangan. Jumlah Pinjaman yang Dibayar untuk Pembayaran < 6% dalam Paket с застежкой-молнией при комнатной suhu. Sampel disimpan dalam kondisi kering dengan kelembapan <6% di dalam kantong berresleting pada suhu ruangan.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。foto < 6% Nilai tukar yang melebihi batas suhu < 6%. Sampel disimpan dalam kantong berresleting pada suhu ruangan dengan kelembapan < 6%.Penelitian ini mematuhi pedoman lokal dan nasional. Analisis komposisi dilakukan menggunakan protokol NREL. Komposisi tersebut ditemukan mengandung 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protein, dan 13,4% abu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) adalah campuran kompleks selulase, β-glukosidase, dan Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) dari Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), campuran kompleks enzim pengurai pektin, disumbangkan oleh DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA). Konsentrasi protein enzim ditentukan dengan memperkirakan kandungan protein (dan mengurangi kontribusi nitrogen non-protein) menggunakan analisis nitrogen Kjeldahl (metode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA). Tanah diatom 545 dibeli dari EMD Millipore (Billerica, MA). Karbon aktif (DARCO, butiran 100 mesh), Avicel (PH-101), xilan kayu beech, dan semua bahan kimia lainnya dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pra-perlakuan AFEX dilakukan di GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Pra-perlakuan dilakukan pada suhu 140°C selama 15 menit dengan waktu tinggal 46 menit pada rasio 1:1 antara amonia anhidrat dan biomassa dengan beban 60% (w/w) dalam reaktor batch benchtop stainless steel (Parr Instruments Company). Proses ini memakan waktu 30 menit. Reaktor dipanaskan hingga 140°C dan amonia dilepaskan dengan cepat, memungkinkan biomassa untuk segera kembali ke suhu ruangan. Komposisi jerami jagung yang telah diberi pra-perlakuan AFEX (ACS) serupa dengan jerami jagung yang tidak diberi perlakuan (UT-CS).
ACSH dengan kandungan padatan tinggi 25% (w/w) (sekitar 8% pemuatan dekstran) disiapkan sebagai bahan awal untuk produksi oligosakarida skala besar. Hidrolisis enzimatik ACS dilakukan menggunakan campuran enzim komersial termasuk Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glukan (dalam biomassa yang telah diolah sebelumnya), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glukan, dan Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). Hidrolisis enzimatik dilakukan dalam bioreaktor 5 liter dengan volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50°C dan 250 rpm. Setelah hidrolisis selama 96 jam, hidrolisat dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 6000 rpm selama 30 menit dan kemudian pada 14000 rpm selama 30 menit untuk menghilangkan padatan yang tidak terhidrolisis. Hidrolisat tersebut kemudian disaring secara steril menggunakan gelas beker penyaring 0,22 mm. Hidrolisat yang telah disaring disimpan dalam botol steril pada suhu 4°C dan kemudian difraksinasi menggunakan karbon aktif.
Analisis komposisi sampel biomassa berbasis ekstrak menurut prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel untuk analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) dan penentuan karbohidrat struktural dan lignin dalam biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida dari aliran hidrolisat dilakukan dalam skala 2 ml menggunakan metode hidrolisis asam berbasis autoklaf. Campurkan sampel hidrolisat dengan 69,7 µl asam sulfat 72% dalam tabung kultur berpenutup ulir 10 ml dan inkubasi selama 1 jam di atas meja pada suhu 121 °C, dinginkan di atas es, dan saring ke dalam vial kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Konsentrasi oligosakarida ditentukan dengan mengurangi konsentrasi monosakarida dalam sampel yang tidak dihidrolisis dari konsentrasi total gula dalam sampel yang dihidrolisis asam.
Konsentrasi glukosa, xilosa, dan arabinosa dalam biomassa yang dihidrolisis asam dianalisis menggunakan sistem HPLC Shimadzu yang dilengkapi dengan autosampler, pemanas kolom, pompa isokratik, dan detektor indeks bias pada kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolom dipertahankan pada suhu 50°C dan dielusi dengan 0,6 ml/menit 5 mM H2SO4 dalam air.
Supernatan hidrolisat diencerkan dan dianalisis kandungan monomer dan oligosakaridanya. Gula monomerik yang diperoleh setelah hidrolisis enzimatik dianalisis dengan HPLC yang dilengkapi dengan kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dan kolom pelindung abu. Suhu kolom dipertahankan pada 80°C, air digunakan sebagai fase gerak dengan laju alir 0,6 ml/menit. Oligosakarida ditentukan dengan hidrolisis dalam asam encer pada 121°C sesuai dengan metode yang dijelaskan dalam referensi 41, 48, 49.
Analisis sakarida dilakukan pada residu biomassa mentah, yang telah diberi perlakuan awal AFEX, dan semua residu biomassa yang tidak dihidrolisis (termasuk produksi ekstrak dinding sel serial dan penyaringan mAb-nya) menggunakan prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya 27, 43, 50, 51. Untuk analisis glikoma, residu bahan dinding sel tumbuhan yang tidak larut dalam alkohol disiapkan dari residu biomassa dan diekstraksi secara serial dengan reagen yang semakin agresif seperti amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM dan 0,5% b/v), CON. (1M dan 4M, keduanya dengan 1% b/v natrium borohidrida) dan klorit asam seperti yang telah dijelaskan sebelumnya52,53. Ekstrak tersebut kemudian diuji dengan ELISA terhadap panel kompleks mAb50 yang diarahkan ke glikan dinding sel, dan reaksi pengikatan mAb disajikan sebagai peta panas. mAb yang menargetkan glikan dinding sel tumbuhan dibeli dari stok laboratorium (seri CCRC, JIM, dan MAC).
Biotinilasi oligosakarida satu langkah. Konjugasi karbohidrat dengan biotin-LC-hidrazida dilakukan menggunakan prosedur berikut. Biotin-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO, 70 μl) dengan pengadukan kuat dan pemanasan pada suhu 65°C selama 1 menit. Asam asetat glasial (30 µl) ditambahkan dan campuran dituangkan ke atas natrium sianoborohidrida (6,4 mg/100 µmol) dan dilarutkan sepenuhnya setelah dipanaskan pada suhu 65°C selama sekitar 1 menit. Kemudian, 5 hingga 8 μl campuran reaksi ditambahkan ke oligosakarida kering (1-100 nmol) untuk mendapatkan kelebihan molar label 10 kali lipat atau lebih dibandingkan ujung pereduksi. Reaksi dilakukan pada suhu 65°C selama 2 jam, setelah itu sampel segera dimurnikan. Tidak ada natrium sianoborohidrida yang digunakan dalam percobaan pelabelan tanpa reduksi, dan sampel direaksikan pada suhu 65°C selama 2,5 jam.
Pelapisan dan pencucian sampel oligosakarida berbiotinilasi menggunakan ELISA. 25 μl sampel berbiotinilasi (100 μl dari setiap sampel pekat yang diencerkan dalam 5 ml larutan buffer Tris 0,1 M (TBS)) ditambahkan ke setiap sumur pelat yang dilapisi avidin. Sumur kontrol dilapisi dengan 50 μl biotin dengan konsentrasi 10 μg/ml dalam TBS 0,1 M. Air deionisasi digunakan sebagai pelapis untuk pengukuran blanko. Tablet diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dalam gelap. Cuci pelat 3 kali dengan susu skim 0,1% dalam TBS 0,1 M menggunakan program no. 11 untuk Grenier flat 3A.
Penambahan dan pencucian antibodi primer. Tambahkan 40 µl antibodi primer ke setiap sumur. Inkubasi mikropelat selama 1 jam pada suhu kamar dalam keadaan gelap. Pelat kemudian dicuci 3 kali dengan susu 0,1% dalam TBS 0,1M menggunakan program pencucian #11 untuk Grenier Flat 3A.
Tambahkan antibodi sekunder dan cuci. Tambahkan 50 µl antibodi sekunder tikus/tikus percobaan (diencerkan 1:5000 dalam susu 0,1% dalam TBS 0,1 M) ke setiap sumur. Inkubasi mikropelat selama 1 jam pada suhu kamar dalam gelap. Mikropelat kemudian dicuci 5 kali dengan susu 0,1% dalam TBS 0,1 M menggunakan program pencucian pelat Grenier Flat 5A #12.
Menambahkan substrat. Tambahkan 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) ke substrat dasar (dengan menambahkan 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogen peroksida ke dalam 15 ml air deionisasi). Siapkan substrat TMB dan kocok dengan vortex sebelum digunakan. Inkubasi mikropelat pada suhu kamar selama 30 menit. Dalam kondisi gelap.
Selesaikan langkah ini dan baca tabletnya. Tambahkan 50 µl asam sulfat 1 N ke setiap sumur dan catat absorbansi dari 450 hingga 655 nm menggunakan pembaca ELISA.
Siapkan larutan 1 mg/ml analit berikut dalam air deionisasi: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmannosamin (manNAc), N-asetilglukosamin (glcNAc), N-asetilgalaktosamin (galNAc), inositol (standar internal). Dua standar disiapkan dengan menambahkan larutan gula 1 mg/mL yang ditunjukkan pada Tabel 1. Sampel dibekukan dan diliofilisasi pada suhu -80°C hingga semua air hilang (biasanya sekitar 12-18 jam).
Tambahkan 100–500 µg sampel ke dalam tabung berpenutup ulir di atas timbangan analitik. Catat jumlah yang ditambahkan. Sebaiknya sampel dilarutkan dalam pelarut dengan konsentrasi tertentu dan ditambahkan ke dalam tabung sebagai alikuot cair. Gunakan 20 µl inositol 1 mg/ml sebagai standar internal untuk setiap tabung sampel. Jumlah standar internal yang ditambahkan ke sampel harus sama dengan jumlah standar internal yang ditambahkan ke tabung standar.
Tambahkan 8 ml metanol anhidrat ke dalam vial bertutup ulir. Kemudian tambahkan 4 ml larutan HCl metanol 3 N, tutup rapat, dan kocok. Proses ini tidak menggunakan air.
Tambahkan 500 µl larutan metanol HCl 1 M ke dalam sampel oligosakarida dan tabung TMS standar. Sampel diinkubasi semalaman (168 jam) pada suhu 80°C dalam blok termal. Keringkan produk metanolisis pada suhu kamar menggunakan manifold pengering. Tambahkan 200 µl MeOH dan keringkan kembali. Proses ini diulangi dua kali. Tambahkan 200 µl metanol, 100 µl piridin, dan 100 µl anhidrida asetat ke dalam sampel dan campur hingga rata. Sampel diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit dan dikeringkan. Tambahkan 200 µl metanol dan keringkan kembali.
Tambahkan 200 µl Tri-Sil dan panaskan tabung tertutup selama 20 menit pada suhu 80°C, lalu dinginkan hingga suhu ruang. Gunakan pengering untuk mengeringkan sampel lebih lanjut hingga volumenya sekitar 50 µl. Penting untuk dicatat bahwa kami tidak membiarkan sampel mengering sepenuhnya.
Tambahkan 2 ml heksana dan campur rata dengan menggunakan vortex. Isi ujung pipet Pasteur (5-8 mm) dengan sepotong kapas kaca dengan memasukkan kapas kaca di atas pipet berdiameter 5-3/4 inci. Sampel disentrifugasi pada 3000 g selama 2 menit. Residu yang tidak larut akan mengendap. Keringkan sampel hingga volume 100-150 µl. Volume sekitar 1 µl diinjeksikan ke dalam GC-MS pada suhu awal 80 °C dan waktu awal 2,0 menit (Tabel 2).