Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saamiseks soovitame kasutada uuendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Uued immunoloogilised ja massispektromeetrilised meetodid püsivate oligosahhariidide kompleksanalüüsiks AFEX-iga eeltöödeldud maisiahjus.Lignotselluloosi biomass on jätkusuutlik alternatiiv fossiilkütustele ja seda kasutatakse laialdaselt biotehnoloogiate arendamiseks selliste toodete nagu toit, sööt, kütused ja kemikaalid tootmiseks.Nende tehnoloogiate võtmeks on kulutõhusate protsesside väljatöötamine taimeraku seintes leiduvate keeruliste süsivesikute muundamiseks lihtsateks suhkruteks, nagu glükoos, ksüloos ja arabinoos.Kuna lignotselluloosne biomass on väga kangekaelne, tuleb soovitud toote saamiseks läbida termokeemiline töötlemine (nt ammoniaagikiu koorimine (AFEX), lahjendatud happed (DA), ioonsed vedelikud (IL)) ja bioloogilised töötlused (nt ensümaatiline hüdrolüüs ja mikroobne kääritamine)..Kui aga hüdrolüüsiprotsessis kasutatakse kaubanduslikke seenensüüme, on ainult 75–85% moodustunud lahustuvatest suhkrutest monosahhariidid ja ülejäänud 15–25% on lahustuvad, raskesti ravitavad oligosahhariidid, mis pole alati mikroorganismidele kättesaadavad.Varem oleme edukalt eraldanud ja puhastanud lahustuvaid kangekaelseid oligosahhariide, kasutades süsiniku ja kobediatomiidi eraldamise ja suuruskromatograafia kombinatsiooni, ning uurinud ka nende ensüüme inhibeerivaid omadusi.Oleme leidnud, et oligosahhariide, mis sisaldavad kõrgema polümerisatsiooniastmega (DP) metüleeritud uroonhappe asendusi, on kaubanduslike ensüümide segudega keerulisem töödelda kui madala DP-ga ja neutraalseid oligosahhariide.Siin kirjeldame mitmete täiendavate meetodite kasutamist, sealhulgas glükaani profiilide koostamist, kasutades taimede biomassi glükaanidele spetsiifilisi monoklonaalseid antikehi (mAb), et iseloomustada glükaani sidemeid taimeraku seintes ja ensümaatilistes hüdrolüsaatides, maatriksi abil laserdesorptsiooni ionisatsiooni, lennuaja massispektromeetriat..MALDI-TOF-MS) kasutab struktuuriinformatiivseid diagnostilisi piike, mis on saadud spektroskoopiaga pärast negatiivsete ioonide sekundaarset lagunemist, gaasikromatograafiat ja massispektromeetriat (GC-MS), et iseloomustada oligosahhariidsidemeid koos derivatiseerimisega ja ilma.Oligosahhariidide (DP 4–20) väikese suuruse tõttu on neid molekule raske mAb sidumiseks ja iseloomustamiseks kasutada.Selle probleemi lahendamiseks rakendasime uut biotiini konjugatsioonil põhinevat oligosahhariidide immobiliseerimismeetodit, mis märgistas edukalt enamiku madala DP-ga lahustuvaid oligosahhariide mikroplaadi pinnal, mida seejärel kasutati spetsiifilise ligeerimisanalüüsi jaoks suure läbilaskevõimega mAb süsteemis.See uus meetod hõlbustab tulevikus täiustatud suure läbilaskevõimega glükoosianalüüside väljatöötamist, mida saab kasutada diagnostilistel eesmärkidel biomarkerites esinevate oligosahhariidide isoleerimiseks ja iseloomustamiseks.
Põllumajandus-, metsa-, rohu- ja puitmaterjalidest koosnev lignotselluloosi biomass on potentsiaalne lähteaine biopõhiste toodete, sealhulgas toidu, sööda, kütuse ja keemiliste lähteainete tootmiseks, et toota kõrgema väärtusega tooteid1.Taime rakuseintes sisalduvad süsivesikud (nagu tselluloos ja hemitselluloos) depolümeriseeritakse monosahhariidideks keemilise töötlemise ja biotransformatsiooni teel (nagu ensümaatiline hüdrolüüs ja mikroobne fermentatsioon).Levinud eeltöötlused hõlmavad ammoniaagikiu paisutamist (AFEX), lahjendatud hapet (DA), ioonilist vedelikku (IL) ja auruplahvatus (SE), mis kasutavad kemikaalide ja kuumuse kombinatsiooni, et vähendada lignotselluloosi tootmist, avades taimeraku seinad3,4.aine kangekaelsus, 5. Ensümaatiline hüdrolüüs viiakse läbi suure tahke aine koormuse juures, kasutades kaubanduslikke aktiivseid süsivesikuid sisaldavaid ensüüme (CAZymes) ja mikroobset kääritamist, kasutades transgeenseid pärme või baktereid biopõhiste kütuste ja kemikaalide tootmiseks 6 .
Kaubanduslikes ensüümides olevad CAZüümid koosnevad komplekssest ensüümide segust, mis lõhustab sünergistlikult kompleksseid süsivesikute-suhkru sidemeid, moodustades monosahhariidid2,7.Nagu varem teatasime, muudab ligniini aromaatsete polümeeride kompleksne võrgustik süsivesikutega need väga raskesti lahendatavaks, mis viib suhkru mittetäieliku muundamiseni, kogudes 15–25% suguoligosahhariididest, mida ei toodeta eeltöödeldud biomassi ensümaatilise hüdrolüüsi käigus.See on levinud probleem erinevate biomassi eeltöötlusmeetodite puhul.Selle kitsaskoha mõned põhjused hõlmavad ensüümide inhibeerimist hüdrolüüsi ajal või oluliste oluliste ensüümide puudumist või madalat taset, mis on vajalikud suhkrusidemete katkestamiseks taime biomassis.Suhkrute koostise ja struktuuriomaduste, näiteks oligosahhariidide suhkrusidemete mõistmine aitab meil parandada suhkru muundamist hüdrolüüsi ajal, muutes biotehnoloogilised protsessid naftast saadud toodetega konkurentsivõimeliseks.
Süsivesikute struktuuri määramine on keeruline ja nõuab selliste meetodite kombinatsiooni nagu vedelikkromatograafia (LC)11,12, tuumamagnetresonantsspektroskoopia (NMR)13, kapillaarelektroforees (CE)14,15,16 ja massispektromeetria (MS)17., kaheksateist.MS-meetodid, nagu lennuaja massispektromeetria laserdesorptsiooni ja maatriksi abil ioniseerimisega (MALDI-TOF-MS), on mitmekülgne meetod süsivesikute struktuuride tuvastamiseks.Hiljuti on naatriumioonaduktide kokkupõrke põhjustatud dissotsiatsiooni (CID) tandem MS-i kõige laialdasemalt kasutatud oligosahhariidi kinnituspositsioonidele, anomeersetele konfiguratsioonidele, järjestustele ja hargnemispositsioonidele 20, 21 vastavate sõrmejälgede tuvastamiseks.
Glükaanianalüüs on suurepärane vahend süsivesikute sidemete põhjalikuks tuvastamiseks22.See meetod kasutab komplekssete süsivesikute seoste mõistmiseks sondidena monoklonaalseid antikehi (mAb), mis on suunatud taime rakuseina glükaanile.Kogu maailmas on saadaval üle 250 mAb, mis on loodud erinevate lineaarsete ja hargnenud oligosahhariidide vastu, kasutades erinevaid sahhariide24.Taimeraku seina struktuuri, koostise ja modifikatsioonide iseloomustamiseks on laialdaselt kasutatud mitmeid mAb-sid, kuna taimeraku tüübist, elundist, vanusest, arengufaasist ja kasvukeskkonnast olenevalt on olulised erinevused25,26.Hiljuti on seda meetodit kasutatud taimede ja loomade süsteemide vesiikulite populatsioonide ja nende vastavate rollide mõistmiseks glükaani transpordis, mis on määratud subtsellulaarsete markerite, arengufaaside või keskkonnastiimulitega, ning ensümaatilise aktiivsuse määramiseks.Mõned tuvastatud glükaanide ja ksülaanide erinevad struktuurid on pektiin (P), ksülaan (X), mannaan (M), ksüloglükaanid (XylG), segasidemega glükaanid (MLG), arabinoksülaan (ArbX), galaktomannaan (GalG), glükuroonhape-arabinoksülaan (GArb-G) ja arabinaksülaan (GArbX)2.
Kuid hoolimata kõigist nendest uurimistöödest on vaid mõned uuringud keskendunud oligosahhariidide akumulatsiooni olemusele suure tahke aine koormuse (HSL) hüdrolüüsi ajal, sealhulgas oligosahhariidide vabanemisele, oligomeerse ahela pikkuse muutustele hüdrolüüsi ajal, erinevatele madala DP-ga polümeeridele ja nende kõveratele.jaotused 30,31,32.Samal ajal, kuigi glükaanianalüüs on osutunud kasulikuks vahendiks glükaani struktuuri põhjalikuks analüüsiks, on raske hinnata vees lahustuvaid madala DP-ga oligosahhariide, kasutades antikeha meetodeid.Väiksemad DP-oligosahhariidid molekulmassiga alla 5-10 kDa ei seondu ELISA plaatidega 33, 34 ja pestakse enne antikeha lisamist minema.
Siin demonstreerime esimest korda ELISA testi avidiiniga kaetud plaatidel, kasutades monoklonaalseid antikehi, kombineerides lahustuvate tulekindlate oligosahhariidide üheastmelise biotinüülimisprotseduuri glükoosianalüüsiga.Meie lähenemisviis glükoosianalüüsile kinnitati MALDI-TOF-MS ja GC-MS-põhise komplementaarsete oligosahhariidsidemete analüüsiga, kasutades hüdrolüüsitud suhkrukompositsioonide trimetüülsilüüli (TMS) derivatiseerimist.Seda uuenduslikku lähenemist saab tulevikus arendada suure läbilaskevõimega meetodina ja leida laiemat rakendust biomeditsiinilistes uuringutes35.
Ensüümide ja antikehade translatsioonijärgsed modifikatsioonid, nagu glükosüülimine,36 mõjutavad nende bioloogilist aktiivsust.Näiteks seerumi valkude glükosüülimise muutused mängivad olulist rolli põletikulise artriidi korral ning glükosüülimise muutusi kasutatakse diagnostiliste markeritena37.Kirjanduses on teatatud mitmesugustest glükaanidest, mis ilmnevad kergesti mitmesuguste haiguste korral, sealhulgas seedetrakti ja maksa kroonilised põletikulised haigused, viirusinfektsioonid, munasarja-, rinna- ja eesnäärmevähk38, 39, 40.Glükaanide struktuuri mõistmine antikehadel põhinevate glükaani ELISA meetodite abil annab täiendava kindlustunde haiguste diagnoosimisel ilma keerulisi MS meetodeid kasutamata.
Meie eelmine uuring näitas, et kangekaelsed oligosahhariidid jäid pärast eeltöötlust ja ensümaatilist hüdrolüüsi hüdrolüüsimata (joonis 1).Varem avaldatud töös töötasime välja aktiivsöe tahkefaasilise ekstraheerimise meetodi, et isoleerida oligosahhariidid AFEX-iga eeltöödeldud maisihoidja hüdrolüsaadist (ACSH)8.Pärast esialgset ekstraheerimist ja eraldamist fraktsioneeriti oligosahhariidid suuruse välistuskromatograafia (SEC) abil ja koguti molekulmassi järjekorras.Erinevatest eeltöötlustest vabanenud suhkru monomeere ja oligomeere analüüsiti suhkru koostise analüüsiga.Kui võrrelda erinevate eeltöötlemismeetoditega saadud suhkruoligomeeride sisaldust, siis biomassi monosahhariidideks muutumisel on tõrksate oligosahhariidide esinemine sagedaseks probleemiks ning võib viia suhkrusaagise vähenemiseni vähemalt 10-15% ja isegi kuni 18%.USA.Seda meetodit kasutatakse oligosahhariidifraktsioonide edasiseks suuremahuliseks tootmiseks.Saadud ACH-d ja selle järgnevaid erineva molekulmassiga fraktsioone kasutati selles töös katsematerjalina oligosahhariidide iseloomustamiseks.
Pärast eeltöötlust ja ensümaatilist hüdrolüüsi jäid püsivad oligosahhariidid hüdrolüüsimata.Siin (A) on oligosahhariidide eraldamise meetod, milles oligosahhariidid eraldatakse AFEX-iga eeltöödeldud maisipõletushüdrolüsaadist (ACSH), kasutades aktiivsöest ja kobediatomiitmullast pakitud kihti;(B) Oligosahhariidide eraldamise meetod.Oligosahhariidid eraldati täiendavalt suuruseralduskromatograafiaga (SEC);(C) Erinevatest eeltöötlustest vabanevad sahhariidi monomeerid ja oligomeerid (lahjendatud hape: DA, ioonne vedelik: IL ja AFEX).Ensümaatilise hüdrolüüsi tingimused: kõrge kuivainesisaldus 25% (mass/mass) (ligikaudu 8% glükaani sisaldus), 96-tunnine hüdrolüüs, 20 mg/g kaubanduslik ensüümi laadimine (suhe Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) ja (D) suhkru monomeerid ja oligomeerid (eelnevalt vabanenud korroosireaktsioonist ja arafosüülglükoosi AC-st, xaf-glükoosist ja araroosist). S).
Glükaanianalüüs on osutunud kasulikuks vahendiks tahketest biomassi jääkidest eraldatud ekstraktides sisalduvate glükaanide põhjalikuks struktuurianalüüsiks.Kuid vees lahustuvad sahhariidid on selle traditsioonilise meetodi kasutamisel alaesindatud41, kuna madala molekulmassiga oligosahhariide on ELISA plaatidele raske immobiliseerida ja need pestakse enne antikeha lisamist välja.Seetõttu kasutati antikeha sidumiseks ja iseloomustamiseks üheastmelist biotinüülimise meetodit, et katta lahustuvad, mitteühilduvad oligosahhariidid avidiiniga kaetud ELISA plaatidel.Seda meetodit testiti meie varem toodetud ACSH ja selle molekulmassil (või polümerisatsiooniastmel, DP) põhineva fraktsiooniga.Oligosahhariidide sidumisafiinsuse suurendamiseks kasutati üheastmelist biotinüülimist, lisades süsivesiku redutseerivale otsale biotiin-LC-hüdrasiidi (joonis 2).Lahuses reageerib redutseerivas otsas olev poolatsetaalrühm biotiin-LC-hüdrasiidi hüdrasiidrühmaga, moodustades hüdrasoonsideme.Redutseerija NaCNBH3 juuresolekul redutseeritakse hüdrasoonside stabiilseks biotinüülitud lõpp-produktiks.Suhkru redutseeriva otsa modifitseerimisega sai võimalikuks madala DP-ga oligosahhariidide seondumine ELISA plaatidega ja meie uuringus tehti seda avidiiniga kaetud plaatidel, kasutades glükaanile suunatud mAb-sid.
Monoklonaalsete antikehade sõelumine ELISA põhjal biotinüülitud oligosahhariidide suhtes.Siin (A) oligosahhariidide kombineeritud biotinüülimine ja sellele järgnev ELISA sõelumine glükaani sihtmärgiga monoklonaalsete antikehadega NeutrAvidiniga kaetud plaatidel ja (B) näitab reaktsiooniproduktide biotinüülimise üheastmelist protseduuri.
Seejärel lisati primaarsetele ja sekundaarsetele antikehadele avidiiniga kaetud plaadid oligosahhariidiga konjugeeritud antikehadega ning pesti valgus- ja ajatundlikus keskkonnas.Kui antikeha seondumine on lõppenud, lisage plaadi inkubeerimiseks TMB substraati.Lõpuks peatati reaktsioon väävelhappega.Inkubeeritud plaate analüüsiti ELISA lugeja abil, et määrata iga antikeha seondumistugevus, et tuvastada antikehaspetsiifiline ristsidumine.Katse üksikasjad ja parameetrid leiate vastavast jaotisest “Materjalid ja meetodid”.
Näitame selle äsja väljatöötatud meetodi kasulikkust spetsiifiliste rakenduste jaoks, iseloomustades ACSH-s leiduvaid lahustuvaid oligosahhariide, samuti lignotselluloosi hüdrolüsaatidest eraldatud toor- ja puhastatud oligosahhariidide fraktsioone.Nagu on näidatud joonisel 3, on kõige levinumad epitoobiga asendatud ksülaanid, mis ACSH-s bioatsüülitud glükoosianalüüsi meetodeid kasutades tuvastatakse, tavaliselt uroon- (U) või metüüluroon- (MeU) ja pektiin-arabinogalaktaanid.Enamik neist leiti ka meie eelmises uuringus hüdrolüüsimata tahkete ainete (UHS) glükaanide analüüsi kohta43.
Tõrksate oligosahhariidide epitoopide tuvastamine, kasutades rakuseina glükaanile suunatud monoklonaalset antikeha."Neutraalne" fraktsioon on ACN-fraktsioon ja "happeline" fraktsioon on FA-fraktsioon.Eredamad punased soojuskaardil näitavad suuremat epitoobi sisaldust ja heledamad sinised näitavad tühja tausta.Skaalal olevad värviväärtused põhinevad preparaatide N=2 töötlemata OD väärtustel.Peamised antikehade poolt äratuntavad epitoobid on näidatud paremal.
Testitud kaubanduslikus ensüümide segus, mis sisaldab kõige sagedamini kasutatavaid kaubanduslikke ensüüme, ei saanud neid mittetselluloosi struktuure lõhustada kõige tavalisemate tsellulaaside ja hemitsellulaaside abil.Seetõttu on nende hüdrolüüsiks vaja uusi abiensüüme.Ilma vajalike mittetselluloosi lisaensüümideta takistavad need mittetselluloosi sidemed täielikku muundumist monosahhariidideks, isegi kui nende lähtesuhkru polümeerid hüdrolüüsitakse ulatuslikult lühemateks fragmentideks ja lahustatakse kaubanduslike ensüümide segude abil.
Signaali jaotuse ja selle sidumistugevuse edasine uurimine näitas, et kõrge DP-ga suhkrufraktsioonides (A, B, C, DP kuni 20+) olid seondumise epitoobid madalamad kui dimeeride madala DP-ga fraktsioonides (D, E, F, DP) (joonis 1).Happelised fragmendid on tavalisemad mittetselluloosi epitoopides kui neutraalsed fragmendid.Need nähtused on kooskõlas meie eelmises uuringus täheldatud mustriga, kus kõrge DP ja happelised osad olid ensümaatilise hüdrolüüsi suhtes vastupidavamad.Seetõttu võivad mittetselluloosi glükaani epitoopide olemasolu ning U ja MeU asendused oluliselt kaasa aidata oligosahhariidide stabiilsusele.Tuleb märkida, et madala DP-ga oligosahhariidide puhul võib seondumise ja tuvastamise efektiivsus olla problemaatiline, eriti kui epitoop on dimeerne või trimeerne oligosahhariid.Seda saab testida erineva pikkusega kaubanduslike oligosahhariididega, millest igaüks sisaldab ainult ühte epitoopi, mis seondub spetsiifilise mAb-ga.
Seega näitas struktuurispetsiifiliste antikehade kasutamine teatud tüüpi tõrksaid sidemeid.Olenevalt kasutatava antikeha tüübist, sobivast ligeerimismustrist ja selle tekitatava signaali tugevusest (kõige ja kõige vähem esinev), saab identifitseerida uusi ensüüme ja lisada neid poolkvantitatiivselt ensüümide segule täielikuma glükokonversiooni saavutamiseks.Võttes näiteks ACSH oligosahhariidide analüüsi, saame luua iga biomassi materjali glükaanisidemete andmebaasi.Siinkohal tuleb märkida, et arvesse tuleks võtta antikehade erinevat afiinsust ja kui nende afiinsus on teadmata, tekitab see teatud raskusi erinevate antikehade signaalide võrdlemisel.Lisaks võib glükaanisidemete võrdlemine sama antikeha proovide vahel kõige paremini toimida.Need kangekaelsed sidemed saab seejärel siduda CAZyme'i andmebaasiga, kust saame tuvastada ensüüme, valida kandidaatensüüme ja testida sidemeid purustavaid ensüüme või arendada mikroobseid süsteeme nende ensüümide ekspresseerimiseks biorafineerimistehastes kasutamiseks44.
Et hinnata, kuidas immunoloogilised meetodid täiendavad alternatiivseid meetodeid lignotselluloosi hüdrolüsaatides esinevate madala molekulmassiga oligosahhariidide iseloomustamiseks, teostasime samal paneelil (joonis 5) oligosahhariidi osal MALDI (joonis 4, S1-S8) ja GC-MS-i põhjal TMS-st saadud sahhariidide analüüsi.MALDI-t kasutatakse selleks, et võrrelda, kas oligosahhariidimolekulide massijaotus vastab kavandatud struktuurile.Joonisel fig.4 on näidatud neutraalsete komponentide ACN-A ja ACN-B MC.ACN-A analüüs kinnitas pentoossuhkrute valikut vahemikus DP 4-8 (joonis 4) kuni DP 22 (joonis S1), mille massid vastavad MeU-ksülaani oligosahhariididele.ACN-B analüüs kinnitas pentoosi ja glükoksülaani seeriat DP 8-15-ga.Täiendavas materjalis, nagu joonis S3, näitavad FA-C happeliste osade massijaotuse kaardid (Me)U-asendatud pentoossuhkrute vahemikku DP-ga 8-15, mis on kooskõlas ELISA-põhise mAb-sõeluuringu käigus leitud asendatud ksülaanidega.Epitoobid on järjepidevad.
ACS-is esinevate lahustuvate mitteühilduvate oligosahhariidide MALDI-MS spekter.Siin on (A) ACN-A madala massivahemiku fraktsioonid, mis sisaldavad metüülitud uroonhappe (DP 4-8) asendatud glükuroksülaanoligosahhariide ja (B) ACN-B ksülaani ja metüülitud uroonhappe oligosahhariide, mis on asendatud glükuroksülaaniga (DP 8-15).
Tulekindlate oligosahhariidide glükaanijäägi koostise analüüs.Siin (A) GC-MS analüüsi abil saadud erinevate oligosahhariidifraktsioonide TMS-i sahhariidi koostis.(B) Oligosahhariidides esinevate erinevate TMS-st saadud suhkrute struktuurid.ACN – neutraalseid oligosahhariide sisaldav atsetonitriili fraktsioon ja FA – happeoligosahhariide sisaldav feruulhappe fraktsioon.
Veel üks huvitav järeldus tehti oligosahhariidi fraktsiooni LC-MS analüüsist, nagu on näidatud joonisel S9 (meetodeid võib näha elektroonilises lisamaterjalis).ACN-B fraktsiooni ligeerimisel täheldati korduvalt heksoosi ja -OAc rühmade fragmente.See leid mitte ainult ei kinnita glükoosi ja MALDI-TOF analüüsis täheldatud killustumist, vaid annab ka uut teavet võimalike süsivesikute derivaatide kohta eeltöödeldud lignotselluloosses biomassis.
Samuti analüüsisime oligosahhariidi fraktsiooni suhkru koostist, kasutades TMS suhkru derivatiseerimist.GC-MS abil määrasime oligosahhariidi fraktsioonis neuraalsete (mittederivatiivsete) ja happeliste suhkrute (GluA ja GalA) koostise (joonis 5).Glükuroonhapet leidub happelistes komponentides C ja D, galakturoonhapet aga happelistes komponentides A ja B, mis mõlemad on happeliste suhkrute kõrge DP komponendid.Need tulemused mitte ainult ei kinnita meie ELISA ja MALDI andmeid, vaid on kooskõlas ka meie varasemate oligosahhariidide akumulatsiooni uuringutega.Seetõttu usume, et kaasaegsed immunoloogilised meetodid, mis kasutavad oligosahhariidide biotinüülimist ja sellele järgnevat ELISA skriinimist, on piisavad lahustuvate tõrksate oligosahhariidide tuvastamiseks erinevates bioloogilistes proovides.
Kuna ELISA-põhised mAb-sõeluuringumeetodid on valideeritud mitme erineva meetodi abil, tahtsime selle uue kvantitatiivse meetodi potentsiaali täiendavalt uurida.Osteti kaks kaubanduslikku oligosahhariidi, ksüloheksasahhariidoligosahhariid (XHE) ja 23-α-L-arabinofuranosüülksülotrioos (A2XX), mida testiti, kasutades uut rakuseina glükaanile suunatud mAb lähenemist.Joonisel 6 on näidatud lineaarne korrelatsioon biotinüülitud sidumissignaali ja oligosahhariidide kontsentratsiooni logaritmilise kontsentratsiooni vahel, mis viitab võimalikule Langmuiri adsorptsioonimudelile.MAb-dest korreleerusid CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 ja CCRC-M151 XHE-ga ning CCRC-M108, CCRC-M109 ja LM11 korreleerusid A2XX-ga vahemikus 100 nm.Antikehade piiratud kättesaadavuse tõttu katse ajal viidi iga oligosahhariidi kontsentratsiooniga läbi piiratud katsed.Siinkohal tuleb märkida, et mõned antikehad reageerivad substraadina samale oligosahhariidile väga erinevalt, arvatavasti seetõttu, et nad seonduvad veidi erinevate epitoopidega ja neil võib olla väga erinev seondumisafiinsus.Täpse epitoobi tuvastamise mehhanismid ja tagajärjed on palju keerulisemad, kui uut mAb-meetodit rakendatakse tõelistele proovidele.
Erinevate glükaani sihtivate mAb-de tuvastamisvahemiku määramiseks kasutati kahte kaubanduslikku oligosahhariidi.Siin näitavad lineaarsed korrelatsioonid oligosahhariidide kontsentratsiooni logaritmilise kontsentratsiooniga Langmuiri adsorptsioonimustreid (A) XHE jaoks mAb-ga ja (B) A2XX jaoks mAb-ga.Vastavad epitoobid näitavad testis substraatidena kasutatud kaubanduslike oligosahhariidide struktuure.
Glükaanile suunatud monoklonaalsete antikehade kasutamine (glükokoomiline analüüs või ELISA-põhine mAb sõelumine) on võimas vahend enamiku peamiste rakuseina glükaanide, mis moodustavad taime biomassi, põhjalikuks iseloomustamiseks.Kuid klassikaline glükaanianalüüs iseloomustab ainult suuremaid rakuseina glükaane, kuna enamik oligosahhariide ei ole ELISA plaatidele tõhusalt immobiliseeritud.Selles uuringus hüdrolüüsiti AFEX-iga eeltöödeldud maisiahju ensümaatiliselt kõrge kuivainesisaldusega.Hüdrolüsaadis olevate tõrksate rakuseina süsivesikute koostise määramiseks kasutati suhkruanalüüsi.Siiski on väiksemate oligosahhariidide mAb analüüs hüdrolüsaatides alahinnatud ja oligosahhariidide tõhusaks immobiliseerimiseks ELISA plaatidele on vaja täiendavaid tööriistu.
Siin kirjeldame uudset ja tõhusat oligosahhariidide immobiliseerimismeetodit mAb skriinimiseks, kombineerides oligosahhariidide biotinüülimist, millele järgneb ELISA sõelumine NeutrAvidin™ kaetud plaatidel.Immobiliseeritud biotinüülitud oligosahhariidid näitasid antikeha suhtes piisavat afiinsust, et võimaldada tõrksate oligosahhariidide kiiret ja tõhusat tuvastamist.Nende kangekaelsete oligosahhariidide koostise analüüs massispektromeetria põhjal kinnitas selle uue lähenemise tulemusi immuunsõeluuringule.Seega näitavad need uuringud, et oligosahhariidide biotinüülimise ja ELISA skriinimise kombinatsiooni glükaanile suunatud monoklonaalsete antikehadega saab kasutada oligosahhariidide ristsidemete tuvastamiseks ja seda saab laialdaselt rakendada teistes oligosahhariidide struktuuri iseloomustavates biokeemilistes uuringutes.
See biotiinil põhinev glükaani profiilide koostamise meetod on esimene aruanne, mis suudab uurida taimede biomassis lahustuvate oligosahhariidide tõrksaid süsivesikute sidemeid.See aitab mõista, miks mõned biomassi osad on biokütuste tootmisel nii kangekaelsed.See meetod täidab olulise lünga glükoosianalüüsi meetodites ja laiendab selle rakendamist laiemale hulgale substraatidele peale taimsete oligosahhariidide.Tulevikus võime kasutada robootikat biotinüülimiseks ja kasutada meetodit, mille oleme välja töötanud proovide suure läbilaskevõimega analüüsimiseks ELISA abil.
Pioneer 33A14 hübriidseemnetest kasvatatud maisiõled (CS) koguti 2010. aastal Colorado osariigis Rays asuvast Kramer Farmsist.Maaomaniku loal saab seda biomassi teadustööks kasutada. Proove hoiti kuivana < 6% niiskusega lukuga kottides toatemperatuuril. Proove hoiti kuivana < 6% niiskusega lukuga kottides toatemperatuuril. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Proove hoiti kuivana <6% niiskuse juures lukuga kottides toatemperatuuril.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Proove hoitakse lukuga kottides toatemperatuuril, mille õhuniiskus on < 6%.Uuring vastas kohalikele ja riiklikele juhistele.Kompositsioonianalüüs viidi läbi NREL-i protokolli kasutades.Leiti, et koostis sisaldab 31,4% glükaani, 18,7% ksülaani, 3,3% arabinaani, 1,2% galaktaani, 2,2% atsetüüli, 14,3% ligniini, 1,7% valku ja 13,4% tuhka.
Cellic® CTec2 (138 mg valku/ml, partii VCNI 0001) on Novozymesi (Franklinton, NC, USA) tsellulaasi, β-glükosidaasi ja Cellic® HTec2 (157 mg valku/ml, partii VHN00001) komplekssegu.Multifect Pectinase® (72 mg valku/ml), pektiini lagundavate ensüümide komplekssegu, annetas DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Ensüümvalgu kontsentratsioonid määrati valgusisalduse hindamisega (ja mittevalgulise lämmastiku osaluse lahutamisega), kasutades Kjeldahli lämmastikuanalüüsi (AOAC meetod 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomiitmuld 545 osteti ettevõttelt EMD Millipore (Billerica, MA).Aktiivsüsi (DARCO, 100 silma graanulid), Avicel (PH-101), pöögi ksülaan ja kõik muud kemikaalid osteti firmalt Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX-i eeltöötlus viidi läbi GLBRC-s (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Eeltöötlus viidi läbi temperatuuril 140 °C 15 minutit.46 veevaba ammoniaagi ja biomassi suhtega 1:1 60% (w/w) laadimisel roostevabast terasest lauapealses perioodilises reaktoris (Parr Instruments Company).Aega kulus 30 minutit.Reaktor viidi temperatuurini 140 °C ja ammoniaak vabastati kiiresti, võimaldades biomassil kiiresti toatemperatuurini tõusta.AFEXi eeltöödeldud maisiahju (ACS) koostis oli sarnane töötlemata maisiahju (UT-CS) koostisega.
Kõrge kuivainesisaldusega ACSH 25% (mass/mass) (umbes 8% dekstraanisisaldus) valmistati oligosahhariidide suuremahulise tootmise lähteainena.ACS-i ensümaatiline hüdrolüüs viidi läbi, kasutades kaubanduslikku ensüümide segu, mis sisaldas Cellic® Ctec2 10 mg valku/g glükaani (eeltöödeldud biomassis), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg valku/g glükaani ja Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg valku/g dekstraani.Ensümaatiline hüdrolüüs viidi läbi 5-liitrises bioreaktoris töömahuga 3 liitrit, pH 4,8, 50 °C ja 250 pööret minutis.Pärast 96-tunnist hüdrolüüsi koguti hüdrolüsaat tsentrifuugimisega kiirusel 6000 p/min 30 minutit ja seejärel kiirusel 14000 p/min 30 minutit, et eemaldada hüdrolüüsimata tahked ained.Seejärel hüdrolüsaat allutati steriilsele filtrimisele läbi 0,22 mm filterkeeduklaasi.Filtreeritud hüdrolüsaati hoiti steriilsetes pudelites temperatuuril 4 °C ja seejärel fraktsioneeriti söel.
Ekstraktipõhiste biomassi proovide koostise analüüs NREL laborianalüüsi protseduuride järgi: proovide ettevalmistamine koostise analüüsiks (NREL/TP-510-42620) ning struktuursete süsivesikute ja ligniini määramine biomassis (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hüdrolüsaadi voo oligosahhariidianalüüs viidi läbi 2 ml skaalal, kasutades autoklaavipõhist happehüdrolüüsi meetodit.Segage hüdrolüsaadi proov 69,7 µl 72% väävelhappega 10 ml keeratava kaanega kultiveerimiskatsutis ja inkubeerige 1 tund töölaual temperatuuril 121 °C, jahutage jääl ja filtreerige kõrgfektiivsesse vedelikkromatograafia (HPLC) viaali.Oligosahhariidide kontsentratsioon määrati, lahutades monosahhariidide kontsentratsiooni hüdrolüüsimata proovis suhkru üldkontsentratsioonist happega hüdrolüüsitud proovis.
Glükoosi, ksüloosi ja arabinoosi kontsentratsioone happega hüdrolüüsitud biomassis analüüsiti, kasutades Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonnis Shimadzu HPLC süsteemi, mis oli varustatud automaatse proovivõtturi, kolonnisoojendi, isokraatliku pumba ja murdumisnäitaja detektoriga.Kolonni hoiti temperatuuril 50 °C ja elueeriti 0,6 ml/min 5 mM H2SO4-ga vees.voolu.
Hüdrolüsaadi supernatant lahjendati ja analüüsiti monomeeride ja oligosahhariidide sisalduse suhtes.Pärast ensümaatilist hüdrolüüsi saadud monomeerseid suhkruid analüüsiti HPLC abil, mis oli varustatud Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonni ja tuhakaitsekolonniga.Kolonni temperatuuri hoiti 80 °C juures, liikuva faasina kasutati vett voolukiirusega 0,6 ml/min.Oligosahhariidid määrati hüdrolüüsiga lahjendatud happes temperatuuril 121 °C vastavalt viidetes kirjeldatud meetoditele.41, 48, 49.
Sahhariidianalüüs viidi läbi toores, AFEX-iga eeltöödeldud ja kõigi hüdrolüüsimata biomassi jääkidega (sealhulgas rakuseina ekstraktide tootmine ja nende mAb sõelumine), kasutades eelnevalt kirjeldatud protseduure 27, 43, 50, 51.Glükoomianalüüsi jaoks valmistatakse biomassi jääkidest taime rakuseina materjali alkoholis lahustumatud jäägid ja ekstraheeritakse järjestikku järjest agressiivsemate reaktiividega nagu ammooniumoksalaat (50 mM), naatriumkarbonaat (50 mM ja 0,5% w/v), CON.(1 M ja 4 M, mõlemad 1% (mass/maht) naatriumboorhüdriidiga) ja happeklorit, nagu eelnevalt kirjeldatud52,53.Seejärel viidi ekstraktid läbi ELISA meetodil rakuseina glükaanile suunatud mAb50 komplekspaneeli vastu ja mAb seondumisreaktsioonid esitati soojuskaardina.Taime rakuseina glükaanile suunatud mAb-d osteti laborivarudest (CCRC, JIM ja MAC seeriad).
Oligosahhariidide üheastmeline biotinüülimine.Süsivesikute konjugeerimine biotiin-LC-hüdrasiidiga viidi läbi, kasutades järgmist protseduuri.Biotiin-LC-hüdrasiid (4,6 mg/12 μmol) lahustati dimetüülsulfoksiidis (DMSO, 70 μl) intensiivsel segamisel ja kuumutamisel temperatuuril 65 °C 1 min.Lisati jää-äädikhape (30 ui) ja segu valati naatriumtsüanoboorhüdriidile (6,4 mg/100 umol) ja lahustati täielikult pärast kuumutamist temperatuuril 65 °C umbes 1 minuti jooksul.Seejärel lisati kuivatatud oligosahhariidile (1-100 nmol) 5 kuni 8 μl reaktsioonisegu, et saada märgise 10-kordne või suurem molaarne liig redutseeriva otsa kohal.Reaktsioon viidi läbi temperatuuril 65 °C 2 tundi, misjärel proovid puhastati kohe.Märgistamiskatsetes naatriumtsüanoboorhüdriidi ei kasutatud ilma redutseerimiseta ja proovidel lasti reageerida temperatuuril 65 °C 2,5 tundi.
Biotinüülitud oligosahhariidide proovide ELISA katmine ja pesemine.Avidiiniga kaetud plaadi igasse süvendisse lisati 25 μl biotinüülitud proove (100 μl igast kontsentreeritud proovist, mis oli lahjendatud 5 ml 0,1 M Tris-puhverlahuses (TBS)).Kontrollaugud kaeti 50 μl biotiiniga kontsentratsiooniga 10 μg/ml 0,1 M TBS-is.Pimekatsete mõõtmiseks kasutati kattena deioniseeritud vett.Tabletti inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril pimedas.Peske plaati 3 korda 0,1% lõssi lahusega 0,1 M TBS-is, kasutades programmi nr.11 Grenieri korteri 3A jaoks.
Primaarsete antikehade lisamine ja pesemine.Lisage igasse süvendisse 40 µl primaarset antikeha.Inkubeerige mikroplaati 1 tund toatemperatuuril pimedas.Seejärel pesti plaate kolm korda 0,1% piimaga 0,1 M TBS-s, kasutades pesuprogrammi nr 11 Grenier Flat 3A jaoks.
Lisage sekundaarne antikeha ja peske.Lisage igasse süvendisse 50 µl hiire/roti sekundaarset antikeha (lahjendatud 1:5000 0,1% piimas 0,1 M TBS-is).Inkubeerige mikroplaati 1 tund toatemperatuuril pimedas.Seejärel pesti mikroplaate 5 korda 0,1% piimaga 0,1 M TBS-s, kasutades Grenier Flat 5A plaadipesuprogrammi nr 12.
Substraadi lisamine.Lisage alussubstraadile 50 µl 3,3',5,5'-tetrametüülbensidiini (TMB) (lisage 2 tilka puhvrit, 3 tilka TMB-d, 2 tilka vesinikperoksiidi 15 ml deioniseeritud veele).Valmistage ette TMB substraat.ja segage enne kasutamist keerisega).Inkubeerige mikroplaati toatemperatuuril 30 minutit.Pimedas.
Viige see samm lõpule ja lugege tahvelarvutit.Lisage igasse süvendisse 50 µl 1 N väävelhapet ja registreerige ELISA lugeja abil neeldumine 450 kuni 655 nm.
Valmistage nendest analüütidest 1 mg/ml lahused deioniseeritud vees: arabinoos, ramnoos, fukoos, ksüloos, galakturoonhape (GalA), glükuroonhape (GlcA), mannoos, glükoos, galaktoos, laktoos, N-atsetüülmannosamiin (manNAc), N-atsetüülglükoosamiin.(glcNAc), N-atsetüülgalaktoosamiin (galNAc), inositool (sisestandard).Kaks standardit valmistati, lisades tabelis 1 näidatud 1 mg/ml suhkrulahuseid. Proovid külmutatakse ja lüofiliseeritakse temperatuuril -80 °C kuni kogu vee eemaldamiseni (tavaliselt umbes 12-18 tundi).
Lisage 100–500 µg proovi analüütiliste kaalude keeratava kaanega katsutitesse.Märkige lisatud summa.Parim on lahustada proov kindlas kontsentratsioonis lahustis ja lisada see tuubi vedela alikvoodina.Kasutage iga prooviklaasi sisestandardina 20 µl 1 mg/ml inositooli.Proovile lisatud sisestandardi kogus peab olema sama, mis standardkatseklaasi lisatud sisestandardi kogus.
Lisage keeratava korgiga viaali 8 ml veevaba metanooli.Seejärel 4 ml 3 N HCl metanoolilahust, suletakse korgiga ja loksutatakse.See protsess ei kasuta vett.
Lisage oligosahhariidiproovidele ja standardsetele TMS-tuubidele 500 µl 1 M HCl metanoolilahust.Proove inkubeeriti üleöö (168 tundi) temperatuuril 80 °C termoplokis.Kuivatage metanolüüsi saadus toatemperatuuril, kasutades kuivatuskollektorit.Lisage 200 µl MeOH ja kuivatage uuesti.Seda protsessi korratakse kaks korda.Lisage proovile 200 µl metanooli, 100 µl püridiini ja 100 µl atseetanhüdriidi ning segage hästi.Proove inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit.ja kuivatati.Lisage 200 µl metanooli ja kuivatage uuesti.
Lisage 200 µl Tri-Sili ja kuumutage korgiga katsutit 20 minutit.80 °C, seejärel jahutati toatemperatuurini.Proovi täiendavaks kuivatamiseks kuni ligikaudu 50 µl mahuni kasutage kuivatuskollektorit.Oluline on märkida, et me ei lasknud proovidel täielikult kuivada.
Lisage 2 ml heksaani ja segage hästi vorteksiga.Täitke Pasteuri pipettide (5–8 mm) otsad klaasvillatükiga, sisestades klaasvilla 5–3/4 tollise läbimõõduga pipeti peale.Proove tsentrifuugiti 3000 g juures 2 minutit.Kõik lahustumatud jäägid sadestatakse.Kuivatage proov mahuni 100–150 µl.Algtemperatuuril 80 °C ja algajal 2,0 minutit süstiti GC-MS-i ligikaudu 1 μl (tabel 2).