Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Нови имунологични и масспектрометрични методи за комплексен анализ на устойчиви олигозахариди в царевична печка, предварително обработена с AFEX.Лигноцелулозната биомаса е устойчива алтернатива на изкопаемите горива и се използва широко за разработване на биотехнологии за производство на продукти като храни, фуражи, горива и химикали.Ключът към тези технологии е разработването на икономически конкурентни процеси за превръщане на сложни въглехидрати, присъстващи в стените на растителните клетки, в прости захари като глюкоза, ксилоза и арабиноза.Тъй като лигноцелулозната биомаса е много упорита, тя трябва да бъде подложена на термохимични обработки (напр. ексфолиране на амонячни влакна (AFEX), разредени киселини (DA), йонни течности (IL)) и биологични обработки (напр. ензимна хидролиза и микробна ферментация) в комбинация, за да се получи желаният продукт..Въпреки това, когато в процеса на хидролиза се използват търговски гъбични ензими, само 75-85% от образуваните разтворими захари са монозахариди, а останалите 15-25% са разтворими, неразрешими олигозахариди, които не винаги са достъпни за микроорганизмите.Преди това ние успешно изолирахме и пречистихме разтворими упорити олигозахариди, използвайки комбинация от отделяне на въглерод и диатомитна пръст и хроматография за изключване по размер, а също така изследвахме техните ензимни инхибиторни свойства.Ние открихме, че олигозахаридите, съдържащи заместители на метилирана уронова киселина с по-висока степен на полимеризация (DP), са по-трудни за обработка с търговски ензимни смеси, отколкото ниско DP и неутрални олигозахариди.Тук докладваме за използването на няколко допълнителни метода, включително профилиране на гликан с помощта на моноклонални антитела (mAbs), специфични за гликани от растителна биомаса, за характеризиране на гликановите връзки в клетъчните стени на растенията и ензимните хидролизати, матрично-подпомогната йонизация на лазерна десорбция, масспектрометрия по време на полет..MALDI-TOF-MS) използва структурно-информативни диагностични пикове, получени чрез спектроскопия след вторично разпадане на отрицателни йони, газова хроматография и масспектрометрия (GC-MS) за характеризиране на олигозахаридните връзки със и без дериватизация.Поради малкия размер на олигозахаридите (DP 4–20), тези молекули са трудни за използване за свързване и характеризиране на mAb.За да преодолеем този проблем, ние приложихме нов метод за имобилизиране на олигозахариди, базиран на конюгиране на биотин, който успешно маркира по-голямата част от разтворимите олигозахариди с ниско DP върху повърхността на микроплаката, който след това беше използван в високопроизводителна mAb система за специфичен анализ на лигиране.Този нов метод ще улесни разработването на по-усъвършенствани високопроизводителни гликомни анализи в бъдеще, които могат да се използват за изолиране и характеризиране на олигозахариди, присъстващи в биомаркери за диагностични цели.
Лигноцелулозната биомаса, съставена от земеделски, горски, тревни и дървесни материали, е потенциална суровина за производството на продукти на биологична основа, включително храни, фуражи, горива и химически прекурсори за производство на продукти с по-висока стойност1.Въглехидратите (като целулоза и хемицелулоза), присъстващи в стените на растителните клетки, се деполимеризират в монозахариди чрез химическа обработка и биотрансформация (като ензимна хидролиза и микробна ферментация).Обичайните предварителни обработки включват разширяване на амонячни влакна (AFEX), разредена киселина (DA), йонна течност (IL) и парна експлозия (SE), които използват комбинация от химикали и топлина за намаляване на производството на лигноцелулоза чрез отваряне на стените на растителните клетки3,4.упоритост на материята, 5. Ензимната хидролиза се извършва при високо натоварване с твърди вещества, като се използват търговски активни въглехидрати, съдържащи ензими (CAZymes) и микробна ферментация, използваща трансгенни дрожди или бактерии за производство на горива и химикали на биологична основа 6 .
CAZymes в търговските ензими са съставени от сложна смес от ензими, които синергично разцепват сложните въглехидратно-захарни връзки, за да образуват монозахариди 2,7.Както съобщихме по-рано, сложната мрежа от ароматни полимери на лигнин с въглехидрати ги прави силно неподатливи, което води до непълно преобразуване на захарта, натрупвайки 15-25% от половите олигозахариди, които не се произвеждат по време на ензимната хидролиза на предварително обработената биомаса.Това е често срещан проблем при различни методи за предварителна обработка на биомаса.Някои причини за това затруднение включват ензимно инхибиране по време на хидролиза или липса или ниски нива на основни основни ензими, които са необходими за разрушаване на захарните връзки в растителната биомаса.Разбирането на състава и структурните характеристики на захарите, като например захарните връзки в олигозахаридите, ще ни помогне да подобрим превръщането на захарта по време на хидролиза, правейки биотехнологичните процеси конкурентни по отношение на разходите с продуктите, получени от петрол.
Определянето на структурата на въглехидратите е предизвикателство и изисква комбинация от методи като течна хроматография (LC)11,12, спектроскопия с ядрено-магнитен резонанс (NMR)13, капилярна електрофореза (CE)14,15,16 и масспектрометрия (MS)17., осемнадесет.MS методи, като време-пролетна масспектрометрия с лазерна десорбция и йонизация с помощта на матрица (MALDI-TOF-MS), са универсален метод за идентифициране на въглехидратни структури.Напоследък, тандемна MS на адукти на натриев йон, предизвикана от сблъсък на дисоциация (CID), е най-широко използвана за идентифициране на пръстови отпечатъци, съответстващи на позиции на прикрепване на олигозахариди, аномерни конфигурации, последователности и позиции на разклоняване 20, 21.
Гликановият анализ е отличен инструмент за задълбочена идентификация на въглехидратните връзки22.Този метод използва моноклонални антитела (mAbs), насочени към гликана на растителната клетъчна стена като сонди за разбиране на сложни въглехидратни връзки.Повече от 250 mAbs са достъпни в целия свят, проектирани срещу различни линейни и разклонени олигозахариди, използващи различни захариди24.Няколко моноклонални антитела са широко използвани за характеризиране на структурата, състава и модификациите на растителната клетъчна стена, тъй като има значителни разлики в зависимост от типа растителна клетка, орган, възраст, етап на развитие и среда на растеж 25, 26.Съвсем наскоро този метод беше използван за разбиране на популациите на везикули в растителни и животински системи и техните съответни роли в транспорта на гликани, определени от субклетъчни маркери, етапи на развитие или стимули от околната среда, и за определяне на ензимната активност.Някои от идентифицираните различни структури на гликани и ксилани включват пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглюкани (XylG), глюкани със смесена връзка (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманан (GalG), глюкуронова киселина-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Въпреки това, въпреки всички тези изследователски усилия, само няколко проучвания са фокусирани върху естеството на натрупването на олигозахариди по време на хидролиза с високо натоварване на твърди вещества (HSL), включително освобождаване на олигозахариди, промени в дължината на олигомерната верига по време на хидролиза, различни полимери с ниско DP и техните криви.разпределения 30,31,32.Междувременно, въпреки че анализът на гликан се е доказал като полезен инструмент за цялостен анализ на структурата на гликана, е трудно да се оценят водоразтворими олигозахариди с ниско DP, като се използват методи на антитела.По-малки DP олигозахариди с молекулно тегло по-малко от 5-10 kDa не се свързват с ELISA плаки 33, 34 и се отмиват преди добавянето на антитяло.
Тук за първи път демонстрираме ELISA анализ върху покрити с авидин плаки, използвайки моноклонални антитела, комбинирайки едноетапна процедура на биотинилиране за разтворими рефрактерни олигозахариди с гликомен анализ.Нашият подход към анализа на гликома беше валидиран чрез MALDI-TOF-MS и GC-MS базиран анализ на комплементарни олигозахаридни връзки, използвайки дериватизация на триметилсилил (TMS) на хидролизирани захарни състави.Този иновативен подход може да бъде разработен като метод с висока производителност в бъдеще и да намери по-широко приложение в биомедицинските изследвания35.
Посттранслационните модификации на ензими и антитела, като гликозилиране,36 влияят на тяхната биологична активност.Например, промените в гликозилирането на серумните протеини играят важна роля при възпалителен артрит и промените в гликозилирането се използват като диагностични маркери37.В литературата се съобщава, че различни гликани лесно се появяват при различни заболявания, включително хронични възпалителни заболявания на стомашно-чревния тракт и черния дроб, вирусни инфекции, рак на яйчниците, гърдата и простатата38,39,40.Разбирането на структурата на гликаните с помощта на базирани на антитела гликанови ELISA методи ще осигури допълнителна увереност при диагностицирането на заболяването без използването на сложни методи на МС.
Предишното ни проучване показа, че упоритите олигозахариди остават нехидролизирани след предварителна обработка и ензимна хидролиза (Фигура 1).В предишната ни публикувана работа разработихме метод за екстракция на твърда фаза с активен въглен, за да изолираме олигозахариди от предварително третиран с AFEX хидролизат от царевица (ACSH)8.След първоначална екстракция и разделяне, олигозахаридите бяха допълнително фракционирани чрез хроматография с изключване по размер (SEC) и събрани по реда на молекулното тегло.Захарните мономери и олигомери, освободени от различни предварителни обработки, бяха анализирани чрез анализ на състава на захарта.Когато се сравнява съдържанието на захарни олигомери, получени чрез различни методи за предварителна обработка, наличието на упорити олигозахариди е често срещан проблем при превръщането на биомасата в монозахариди и може да доведе до намаляване на добива на захар от най-малко 10-15% и дори до 18%.НАС.Този метод се използва за по-нататъшно широкомащабно производство на олигозахаридни фракции.Полученият ACH и неговите последващи фракции с различни молекулни тегла бяха използвани като експериментален материал за характеризиране на олигозахаридите в тази работа.
След предварителна обработка и ензимна хидролиза, устойчивите олигозахариди остават нехидролизирани.Тук (A) е метод за разделяне на олигозахариди, при който олигозахаридите се изолират от предварително обработен с AFEX хидролизат от царевица (ACSH), като се използва натъпкан слой от активен въглен и диатомитна пръст;(B) Метод за разделяне на олигозахариди.Олигозахаридите бяха допълнително разделени чрез хроматография с изключване по размер (SEC);(C) Захаридни мономери и олигомери, освободени от различни предварителни обработки (разредена киселина: DA, йонна течност: IL и AFEX).Условия на ензимна хидролиза: високо съдържание на твърди вещества от 25% (w/w) (приблизително 8% натоварване на глюкан), 96 часа хидролиза, 20 mg/g търговско натоварване на ензими (съотношение Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (D) Захарни мономери и олигомери на глюкоза, ксилоза и арабиноза, освободени от предварително обработена с AFEX царевична печка ( ACS).
Гликановият анализ се оказа полезен инструмент за цялостен структурен анализ на гликани в екстракти, изолирани от твърди остатъци от биомаса.Въпреки това, водоразтворимите захариди са недостатъчно представени при използване на този традиционен метод41, тъй като олигозахаридите с ниско молекулно тегло е трудно да се имобилизират върху ELISA плаките и се измиват преди добавянето на антитяло.Следователно, за свързване и характеризиране на антитела, беше използван метод на едноетапно биотинилиране за покриване на разтворими, несъответстващи олигозахариди върху покрити с авидин ELISA плаки.Този метод беше тестван с помощта на нашия произведен по-рано ACSH и фракция на базата на неговото молекулно тегло (или степен на полимеризация, DP).Използва се едноетапно биотинилиране за увеличаване на афинитета на свързване на олигозахариди чрез добавяне на биотин-LC-хидразид към редуциращия край на въглехидрата (фиг. 2).В разтвор полуацеталната група в редуциращия край реагира с хидразидната група на биотин-LC-хидразид, за да образува хидразонова връзка.В присъствието на редуциращия агент NaCNBH3, хидразоновата връзка се редуцира до стабилен биотинилиран краен продукт.С модификацията на редуциращия края на захарта, свързването на олигозахариди с ниска DP към ELISA плаки стана възможно и в нашето изследване това беше направено върху покрити с авидин плаки, използвайки гликан-насочени mAbs.
Скрининг на моноклонални антитела на базата на ELISA за биотинилирани олигозахариди.Тук (A) комбинирано биотинилиране на олигозахариди и последващ ELISA скрининг с гликан-насочени mAbs върху плаки, покрити с NeutrAvidin и (B) показва едноетапна процедура за биотинилиране на реакционни продукти.
Покрити с авидин плаки с олигозахарид-конюгирани антитела след това се добавят към първични и вторични антитела и се промиват в чувствителна към светлина и време среда.След като приключи свързването на антитялото, добавете TMB субстрат, за да инкубирате плаката.Накрая реакцията се спира със сярна киселина.Инкубираните плаки бяха анализирани с помощта на ELISA четец за определяне на силата на свързване на всяко антитяло за откриване на антитяло-специфично кръстосано свързване.За подробности и параметри на експеримента вижте съответния раздел „Материали и методи“.
Ние демонстрираме полезността на този новоразработен метод за специфични приложения чрез характеризиране на разтворимите олигозахариди, присъстващи в ACSH, както и в сурови и пречистени олигозахаридни фракции, изолирани от лигноцелулозни хидролизати.Както е показано на фигура 3, най-често срещаните епитоп-заместени ксилани, идентифицирани в ACSH с помощта на методи за анализ на биоацилиран гликом, обикновено са уронови (U) или метилуронови (MeU) и пектинови арабиногалактани.Повечето от тях бяха открити и в нашето предишно проучване за анализ на гликани на нехидролизирани твърди вещества (UHS)43.
Откриване на непокорни олигозахаридни епитопи с помощта на моноклонално антитяло, насочено към гликана на клетъчната стена.„Неутралната“ фракция е ACN фракцията, а „киселинната“ фракция е FA фракцията.По-ярките червени на топлинната карта показват по-високо съдържание на епитоп, а по-ярките сини показват празен фон.Стойностите на цвета на скалата се основават на необработените стойности на OD за състави N=2.Основните епитопи, разпознати от антителата, са показани вдясно.
Тези нецелулозни структури не могат да бъдат разцепени от най-често срещаните целулази и хемицелулази в тестваната търговска ензимна смес, която включва най-често използваните търговски ензими.Следователно за тяхната хидролиза са необходими нови спомагателни ензими.Без необходимите нецелулозни допълнителни ензими, тези нецелулозни връзки предотвратяват пълното превръщане в монозахариди, дори ако техните родителски захарни полимери са екстензивно хидролизирани в по-къси фрагменти и разтворени с помощта на търговски ензимни смеси.
По-нататъшно изследване на разпределението на сигнала и неговата сила на свързване показа, че свързващите епитопи са по-ниски в захарни фракции с висок DP (A, B, C, DP до 20+), отколкото във фракции с нисък DP (D, E, F, DP) в димери) (фиг. 1).Киселинните фрагменти са по-чести в нецелулозните епитопи, отколкото неутралните фрагменти.Тези явления са в съответствие с модела, наблюдаван в нашето предишно проучване, където високите DP и киселинни части са по-устойчиви на ензимна хидролиза.Следователно, наличието на нецелулозни гликанови епитопи и U и MeU замествания може значително да допринесе за стабилността на олигозахаридите.Трябва да се отбележи, че ефективността на свързване и откриване може да бъде проблематична за олигозахариди с ниска DP, особено ако епитопът е димерен или тримерен олигозахарид.Това може да се тества с помощта на търговски олигозахариди с различни дължини, всеки от които съдържа само един епитоп, който се свързва със специфично mAb.
По този начин използването на структурно-специфични антитела разкрива определени видове непокорни връзки.В зависимост от вида на използваното антитяло, подходящия модел на лигиране и силата на сигнала, който произвежда (най-много и най-малко), нови ензими могат да бъдат идентифицирани и добавени полуколичествено към ензимната смес за по-пълна гликоконверсия.Като вземем за пример анализа на ACSH олигозахариди, можем да създадем база данни с гликанови връзки за всеки материал от биомаса.Тук трябва да се отбележи, че трябва да се има предвид различният афинитет на антителата и ако техният афинитет е неизвестен, това ще създаде известни затруднения при сравняване на сигналите на различни антитела.В допълнение, сравнението на гликановите връзки може да работи най-добре между проби за едно и също антитяло.След това тези упорити връзки могат да бъдат свързани с базата данни CAZyme, от която можем да идентифицираме ензими, да изберем кандидат ензими и да тестваме за разрушаващи връзката ензими или да разработим микробни системи за експресиране на тези ензими за използване в биорафинерии44.
За да оценим как имунологичните методи допълват алтернативните методи за характеризиране на олигозахариди с ниско молекулно тегло, присъстващи в лигноцелулозни хидролизати, ние извършихме MALDI (Фиг. 4, S1-S8) и анализ на TMS-получени захариди на базата на GC-MS на същия панел (Фиг. 5) олигозахаридна част.MALDI се използва за сравнение дали масовото разпределение на олигозахаридните молекули съответства на планираната структура.На фиг.4 показва МС на неутралните компоненти ACN-A и ACN-B.ACN-A анализът потвърди набор от пентозни захари, вариращи от DP 4–8 (фиг. 4) до DP 22 (фиг. S1), чиито тегла съответстват на MeU-ксилан олигозахариди.ACN-B анализът потвърди серията пентоза и глюкоксилан с DP 8-15.В допълнителен материал, като Фигура S3, картите на масовото разпределение на киселинната част на FA-C показват диапазон от (Me)U заместени пентозни захари с DP от 8-15, които са в съответствие със заместените ксилани, открити при ELISA-базиран mAb скрининг.Епитопите са последователни.
MALDI-MS спектър на разтворими несъответстващи олигозахариди, присъстващи в ACS.Тук (A) ACN-A фракции с нисък диапазон на тегло, съдържащи метилирана уронова киселина (DP 4-8), заместени глюкуроксилан олигозахариди и (B) ACN-B ксилан и метилирани олигозахариди на уронова киселина, заместени с глюкуроксилан (DP 8-15).
Анализ на състава на гликановия остатък на рефрактерни олигозахариди.Тук (A) TMS захариден състав на различни олигозахаридни фракции, получен чрез GC-MS анализ.(B) Структури на различни получени от TMS захари, присъстващи в олигозахаридите.ACN – ацетонитрилна фракция, съдържаща неутрални олигозахариди и FA – фракция на ферулова киселина, съдържаща киселинни олигозахариди.
Друго интересно заключение беше направено от LC-MS анализа на олигозахаридната фракция, както е показано на фигура S9 (методите могат да се видят в електронния допълнителен материал).Фрагменти от хексозни и -OAc групи се наблюдават многократно по време на лигирането на ACN-B фракцията.Това откритие не само потвърждава фрагментацията, наблюдавана при анализа на гликом и MALDI-TOF, но също така предоставя нова информация за потенциални въглехидратни производни в предварително обработена лигноцелулозна биомаса.
Ние също анализирахме захарния състав на олигозахаридната фракция, използвайки TMS захарна дериватизация.Използвайки GC-MS, ние определихме състава на невронните (непроизводни) и киселинните захари (GluA и GalA) в олигозахаридната фракция (фиг. 5).Глюкуроновата киселина се намира в киселинните компоненти C и D, докато галактуроновата киселина се намира в киселинните компоненти A и B, като и двата са компоненти с високо съдържание на DP на киселинни захари.Тези резултати не само потвърждават нашите ELISA и MALDI данни, но също така са в съответствие с нашите предишни проучвания за натрупване на олигозахариди.Следователно, ние вярваме, че съвременните имунологични методи, използващи биотинилиране на олигозахариди и последващ ELISA скрининг, са достатъчни за откриване на разтворими непокорни олигозахариди в различни биологични проби.
Тъй като методите за скрининг на mAb, базирани на ELISA, са валидирани чрез няколко различни метода, ние искахме да проучим допълнително потенциала на този нов количествен метод.Два търговски олигозахарида, ксилохексазахарид олигозахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), бяха закупени и тествани с помощта на нов mAb подход, насочен към гликана на клетъчната стена.Фигура 6 показва линейна корелация между биотинилирания свързващ сигнал и логаритмичната концентрация на концентрацията на олигозахарид, което предполага възможен адсорбционен модел на Langmuir.Сред моноклоналните антитела, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 корелират с XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 корелират с A2XX в диапазон от 1 nm до 100 нано.Поради ограничената наличност на антитела по време на експеримента, бяха проведени ограничени експерименти с всяка концентрация на олигозахариди.Тук трябва да се отбележи, че някои антитела реагират много различно на един и същ олигозахарид като субстрат, вероятно защото се свързват с леко различни епитопи и могат да имат много различни афинитети на свързване.Механизмите и последиците от точното идентифициране на епитоп ще бъдат много по-сложни, когато новият подход на mAb се приложи към реални проби.
Два търговски олигозахарида бяха използвани за определяне на диапазона на откриване на различни гликан-таргетни mAbs.Тук линейните корелации с логаритмичната концентрация на концентрацията на олигозахариди показват модели на адсорбция на Langmuir за (A) XHE с mAb и (B) A2XX с mAb.Съответните епитопи показват структурите на търговските олигозахариди, използвани като субстрати в анализа.
Използването на моноклонални антитела, насочени към гликан (гликокомен анализ или базиран на ELISA mAb скрининг) е мощен инструмент за задълбочено характеризиране на повечето от основните гликани на клетъчната стена, които изграждат растителната биомаса.Въпреки това, класическият гликанов анализ характеризира само по-големите гликани на клетъчната стена, тъй като повечето олигозахариди не са ефективно имобилизирани върху ELISA плаки.В това проучване предварително обработената с AFEX царевична печка е ензимно хидролизирана при високо съдържание на твърди вещества.Анализът на захарта беше използван за определяне на състава на неподатливите въглехидрати на клетъчната стена в хидролизата.Въпреки това, mAb анализът на по-малки олигозахариди в хидролизатите е подценен и са необходими допълнителни инструменти за ефективно имобилизиране на олигозахариди върху ELISA плаки.
Тук докладваме за нов и ефективен метод за имобилизиране на олигозахариди за скрининг на mAb чрез комбиниране на олигозахаридно биотинилиране, последвано от ELISA скрининг върху плаки, покрити с NeutrAvidin™.Имобилизираните биотинилирани олигозахариди показват достатъчен афинитет към антитялото, за да позволят бързо и ефикасно откриване на непокорни олигозахариди.Анализът на състава на тези упорити олигозахариди, базиран на масспектрометрия, потвърди резултатите от този нов подход към имуноскрининга.По този начин тези проучвания показват, че комбинацията от олигозахаридно биотинилиране и ELISA скрининг с гликан-насочени моноклонални антитела може да се използва за откриване на кръстосани връзки в олигозахаридите и може да се прилага широко в други биохимични изследвания, характеризиращи структурата на олигозахаридите.
Този базиран на биотин метод за профилиране на гликан е първият доклад, способен да изследва непокорните въглехидратни връзки на разтворимите олигозахариди в растителната биомаса.Това помага да се разбере защо някои части от биомасата са толкова упорити, когато става въпрос за производство на биогорива.Този метод запълва важна празнина в методите за анализ на гликома и разширява приложението му до по-широк спектър от субстрати извън растителните олигозахариди.В бъдеще може да използваме роботика за биотинилиране и да използваме метода, който сме разработили за високопроизводителен анализ на проби с помощта на ELISA.
Царевична слама (CS), отгледана от хибридни семена на Pioneer 33A14, беше събрана през 2010 г. от Kramer Farms в Рей, Колорадо.С разрешението на собственика на земята тази биомаса може да се използва за изследвания. Пробите се съхраняват сухи < 6% влага в торби с цип при стайна температура. Пробите се съхраняват сухи < 6% влага в торби с цип при стайна температура. Образци се съхраняваха сухи при влажност < 6% в пакети със застежка-молния при стайна температура. Пробите се съхраняват сухи при <6% влажност в торби с цип при стайна температура.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образци хранени в пакети със защита-молния при стайна температура с влажност < 6%. Пробите се съхраняват в торби с цип при стайна температура и влажност < 6%.Проучването е в съответствие с местните и национални насоки.Анализът на състава беше извършен с помощта на протокола NREL.Установено е, че съставът съдържа 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% протеин и 13,4% пепел.
Cellic® CTec2 (138 mg протеин/ml, партида VCNI 0001) е сложна смес от целулаза, β-глюкозидаза и Cellic® HTec2 (157 mg протеин/ml, партида VHN00001) от Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg протеин/mL), сложна смес от ензими, разграждащи пектина, беше дарена от DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорния, САЩ).Концентрациите на ензимен протеин се определят чрез оценяване на съдържанието на протеин (и изваждане на приноса на непротеиновия азот) с помощта на азотен анализ на Kjeldahl (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Диатомит 545 е закупен от EMD Millipore (Billerica, MA).Активен въглен (DARCO, 100 mesh гранули), Avicel (PH-101), буков ксилан и всички други химикали бяха закупени от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Предварителната обработка AFEX беше извършена в GLBRC (Лаборатория за изследване на биомаса, MSU, Лансинг, Мичиган, САЩ).Предварителната обработка се провежда при 140°С за 15 минути.46 време на престой при съотношение 1:1 на безводен амоняк към биомаса при 60% (w/w) натоварване в настолен периодичен реактор от неръждаема стомана (Parr Instruments Company).Отне 30 минути.Реакторът се нагрява до 140°C и амонякът се освобождава бързо, което позволява на биомасата бързо да се върне до стайна температура.Съставът на предварително обработената с AFEX царевична печка (ACS) беше подобен на този на необработената царевична печка (UT-CS).
ACSH с високо съдържание на твърди вещества 25% (w/w) (приблизително 8% натоварване с декстран) се приготвя като изходен материал за широкомащабно производство на олигозахариди.Ензимната хидролиза на ACS се извършва с помощта на търговска ензимна смес, включваща Cellic® Ctec2 10 mg протеин/g глюкан (в предварително обработена биомаса), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg протеин/g глюкан и Multifect Pectinase (Genencor Inc, САЩ).).), 5 mg протеин/g декстран.Ензимната хидролиза се провежда в 5-литров биореактор с работен обем 3 литра, рН 4.8, 50°C и 250 rpm.След хидролиза за 96 часа, хидролизатът се събира чрез центрофугиране при 6000 rpm за 30 минути и след това при 14000 rpm за 30 минути за отстраняване на нехидролизираните твърди вещества.След това хидролизатът се подлага на стерилна филтрация през 0.22 mm филтърна чаша.Филтрираният хидролизат се съхранява в стерилни бутилки при 4°С и след това се фракционира върху въглен.
Анализ на състава на проби от биомаса на базата на екстракт съгласно процедурите за лабораторен анализ на NREL: подготовка на проби за анализ на състава (NREL/TP-510-42620) и определяне на структурни въглехидрати и лигнин в биомаса (NREL/TP-510 – 42618)47.
Олигозахаридният анализ на потока от хидролизат се извършва в мащаб от 2 ml, като се използва метод на киселинна хидролиза, базиран на автоклав.Смесете пробата от хидролизат с 69,7 µl 72% сярна киселина в 10 ml епруветка за култура с капачка на винт и инкубирайте за 1 час върху настолен плот при 121 °C, охладете върху лед и филтрирайте във флакон за високоефективна течна хроматография (HPLC).Концентрацията на олигозахариди се определя чрез изваждане на концентрацията на монозахариди в нехидролизираната проба от общата концентрация на захар в киселинно хидролизираната проба.
Концентрациите на глюкоза, ксилоза и арабиноза в киселинно хидролизираната биомаса бяха анализирани с помощта на Shimadzu HPLC система, снабдена с автоматичен пробоотборник, колонен нагревател, изократна помпа и детектор за индекс на пречупване на Bio-Rad Aminex HPX-87H колона.Колоната се поддържа при 50°С и се елуира с 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 във вода.поток.
Супернатантата на хидролизата се разрежда и анализира за съдържание на мономер и олигозахарид.Мономерните захари, получени след ензимна хидролиза, се анализират чрез HPLC, снабдена с колона Bio-Rad (Hercules, СА) Aminex HPX-87P и колона за защита от пепел.Температурата на колоната се поддържа при 80°С, като подвижна фаза се използва вода със скорост на потока 0.6 ml/min.Олигозахаридите се определят чрез хидролиза в разредена киселина при 121°C съгласно методите, описани в реф.41, 48, 49.
Беше извършен анализ на захариди върху сурови, предварително обработени с AFEX и всички нехидролизирани остатъци от биомаса (включително производство на екстракти от серийни клетъчни стени и техния mAb скрининг), като се използват описаните по-рано процедури 27, 43, 50, 51.За анализ на гликома, неразтворимите в алкохол остатъци от материал от растителна клетъчна стена се приготвят от остатъци от биомаса и се подлагат на серийна екстракция с все по-агресивни реагенти като амониев оксалат (50 mM), натриев карбонат (50 mM и 0,5% w/v), CON.(1М и 4М, и двата с 1% w/v натриев борохидрид) и киселинен хлорит, както е описано по-горе52,53.След това екстрактите бяха подложени на ELISA срещу сложен панел от mAb50s, насочен към гликана на клетъчната стена, и реакциите на свързване на mAb бяха представени като топлинна карта.mAbs, насочени към гликана на растителната клетъчна стена, бяха закупени от лабораторни запаси (серия CCRC, JIM и MAC).
Едноетапно биотинилиране на олигозахариди.Конюгирането на въглехидрати с биотин-LC-хидразид се извършва, като се използва следната процедура.Биотин-LC-хидразид (4.6 mg/12 µmol) се разтваря в диметилсулфоксид (DMSO, 70 µl) чрез енергично разбъркване и нагряване при 65°С за 1 min.Добавя се ледена оцетна киселина (30 ul) и сместа се излива върху натриев цианоборохидрид (6.4 mg/100 umol) и се разтваря напълно след нагряване при 65°С за около 1 минута.След това, от 5 до 8 μl от реакционната смес се добавя към изсушения олигозахарид (1-100 nmol), за да се получи 10-кратен или повече моларен излишък от етикета над редуциращия край.Реакцията се провежда при 65°С в продължение на 2 часа, след което пробите незабавно се пречистват.Не е използван натриев цианоборохидрид в експериментите за маркиране без редукция и пробите са реагирали при 65°С в продължение на 2.5 часа.
ELISA покритие и промиване на проби от биотинилирани олигозахариди.25 μl биотинилирани проби (100 μl от всяка концентрирана проба, разредена в 5 ml 0,1 М Tris буферен разтвор (TBS)) се добавят към всяка ямка на покритата с авидин плака.Контролните ямки бяха покрити с 50 μl биотин при концентрация от 10 μg/ml в 0.1 М TBS.Дейонизирана вода беше използвана като покритие за празни измервания.Таблетката се инкубира в продължение на 2 часа при стайна температура на тъмно.Измийте плочата 3 пъти с 0,1% обезмаслено мляко в 0,1 M TBS, като използвате програма №.11 за Grenier flat 3A.
Добавяне и промиване на първични антитела.Добавете 40 µl първично антитяло към всяка ямка.Инкубирайте микроплаката за 1 час при стайна температура на тъмно.След това плаките се промиват 3 пъти с 0.1% мляко в 0.1М TBS, като се използва програма за измиване #11 за Grenier Flat 3A.
Добавете вторично антитяло и измийте.Добавете 50 µl вторично антитяло от мишка/плъх (разредено 1:5000 в 0,1% мляко в 0,1 М TBS) към всяка ямка.Инкубирайте микроплаката за 1 час при стайна температура на тъмно.След това микроплаките се промиват 5 пъти с 0.1% мляко в 0.1 М TBS, като се използва програма за измиване на плаки Grenier Flat 5A #12.
Добавяне на субстрат.Добавете 50 µl 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) към основния субстрат (като добавите 2 капки буфер, 3 капки TMB, 2 капки водороден пероксид към 15 ml дейонизирана вода).Подгответе TMB субстрата.и разклатете преди употреба).Инкубирайте микроплаката при стайна температура за 30 минути.На тъмно.
Завършете стъпката и прочетете таблета.Добавете 50 µl 1 N сярна киселина към всяка ямка и запишете абсорбцията от 450 до 655 nm, като използвате ELISA четец.
Пригответе 1 mg/ml разтвори на тези аналити в дейонизирана вода: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронова киселина (GalA), глюкуронова киселина (GlcA), маноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (вътрешен стандарт).Бяха приготвени два стандарта чрез добавяне на 1 mg/mL захарни разтвори, показани в Таблица 1. Пробите се замразяват и лиофилизират при -80°С, докато цялата вода се отстрани (обикновено около 12-18 часа).
Добавете 100–500 µg проба в епруветки с винтова капачка на аналитична везна.Запишете добавената сума.Най-добре е пробата да се разтвори в определена концентрация на разтворител и да се добави към епруветката като течна аликвотна част.Използвайте 20 µl от 1 mg/ml инозитол като вътрешен стандарт за всяка епруветка с проба.Количеството вътрешен стандарт, добавен към пробата, трябва да бъде същото като количеството вътрешен стандарт, добавен към стандартната епруветка.
Добавете 8 ml безводен метанол във флакон с винтова капачка.След това 4 ml 3 N. метанолов разтвор на НС1, запушен и разклатен.Този процес не използва вода.
Добавете 500 µl от 1 М разтвор на HCl метанол към олигозахаридните проби и стандартните TMS епруветки.Пробите се инкубират една нощ (168 часа) при 80°С в термичен блок.Продуктът от метанолизата се изсушава при стайна температура, като се използва изсушаващ колектор.Добавете 200 ul MeOH и изсушете отново.Този процес се повтаря два пъти.Добавете 200 µl метанол, 100 µl пиридин и 100 µl оцетен анхидрид към пробата и разбъркайте добре.Пробите се инкубират при стайна температура в продължение на 30 минути.и се изсушава.Добавете 200 µl метанол и изсушете отново.
Добавете 200 µl Tri-Sil и загрейте епруветката с капачка за 20 минути.80°C, след което се охлажда до стайна температура.Използвайте изсушаващ колектор, за да изсушите допълнително пробата до обем от приблизително 50 µl.Важно е да се отбележи, че не оставихме пробите да изсъхнат напълно.
Добавете 2 ml хексан и разбъркайте добре на вортекс.Напълнете върховете на пипетите на Пастьор (5-8 mm) с парче стъклена вата, като поставите стъклената вата върху пипета с диаметър 5-3/4 инча.Пробите се центрофугират при 3000 g за 2 минути.Всички неразтворими остатъци се утаяват.Изсушете пробата до 100-150 µl.Обем от приблизително 1 μl се инжектира в GC-MS при начална температура от 80 °C и начално време от 2,0 минути (Таблица 2).