Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Нови имунологични и масспектрометрични методи за комплексен анализ на устойчиви олигозахариди в царевични стъбла, предварително третирани с AFEX. Лигноцелулозната биомаса е устойчива алтернатива на изкопаемите горива и се използва широко за разработване на биотехнологии за производство на продукти като храни, фуражи, горива и химикали. Ключът към тези технологии е разработването на конкурентни по отношение на разходите процеси за превръщане на сложни въглехидрати, присъстващи в клетъчните стени на растенията, в прости захари като глюкоза, ксилоза и арабиноза. Тъй като лигноцелулозната биомаса е много упорита, тя трябва да бъде подложена на термохимични обработки (напр. ексфолиране на амонячни влакна (AFEX), разредени киселини (DA), йонни течности (IL)) и биологични обработки (напр. ензимна хидролиза и микробна ферментация) в комбинация, за да се получи желаният продукт. Въпреки това, когато в процеса на хидролиза се използват търговски гъбични ензими, само 75-85% от образуваните разтворими захари са монозахариди, а останалите 15-25% са разтворими, трудно обработваеми олигозахариди, които не винаги са достъпни за микроорганизмите. Преди това успешно изолирахме и пречистихме разтворими упорити олигозахариди, използвайки комбинация от разделяне с въглерод и диатомит и хроматография с изключване по размер, а също така изследвахме техните ензимно-инхибиторни свойства. Установихме, че олигозахаридите, съдържащи замествания на метилирана уронова киселина с по-висока степен на полимеризация (DP), са по-трудни за обработка с търговски ензимни смеси, отколкото олигозахаридите с ниска DP и неутралните олигозахариди. Тук докладваме за използването на няколко допълнителни метода, включително профилиране на гликани с помощта на моноклонални антитела (mAb), специфични за гликани от растителна биомаса, за характеризиране на гликанови връзки в клетъчните стени на растенията и ензимните хидролизати, матрично-асистирана лазерна десорбционна йонизация, масспектрометрия с време на полет. MALDI-TOF-MS) използва структурно-информативни диагностични пикове, получени чрез спектроскопия след вторичен разпад на отрицателни йони, газова хроматография и масспектрометрия (GC-MS) за характеризиране на олигозахаридните връзки със и без дериватизация. Поради малкия размер на олигозахаридите (DP 4–20), тези молекули са трудни за използване за свързване и характеризиране на mAb. За да преодолеем този проблем, приложихме нов метод за имобилизиране на олигозахариди, базиран на биотинова конюгация, който успешно маркира по-голямата част от нискоразтворимите олигозахариди върху повърхността на микроплаката. След това методът беше използван във високопроизводителна моноклонална антитяло система за специфичен лигиращ анализ. Този нов метод ще улесни разработването на по-усъвършенствани високопроизводителни гликомни анализи в бъдеще, които могат да се използват за изолиране и характеризиране на олигозахариди, присъстващи в биомаркери, за диагностични цели.
Лигноцелулозната биомаса, съставена от селскостопански, горски, тревни и дървесни материали, е потенциална суровина за производството на биобазирани продукти, включително храни, фуражи, горива и химически прекурсори за производство на продукти с по-висока стойност1. Въглехидратите (като целулоза и хемицелулоза), присъстващи в клетъчните стени на растенията, се деполимеризират в монозахариди чрез химическа обработка и биотрансформация (като ензимна хидролиза и микробна ферментация). Често срещаните предварителни обработки включват разширяване на амонячни влакна (AFEX), разредена киселина (DA), йонна течност (IL) и парна експлозия (SE), които използват комбинация от химикали и топлина за намаляване на производството на лигноцелулоза чрез отваряне на клетъчните стени на растенията3,4. упоритостта на материята,5. Ензимната хидролиза се извършва при високо съдържание на твърди вещества, като се използват търговски ензими, съдържащи активни въглехидрати (CAZymes), и микробна ферментация, като се използват трансгенни дрожди или бактерии за производство на биобазирани горива и химикали6.
CAZymes в търговските ензими са съставени от сложна смес от ензими, които синергично разцепват сложни въглехидратно-захарни връзки, за да образуват монозахариди2,7. Както съобщихме по-рано, сложната мрежа от ароматни полимери на лигнина с въглехидратите ги прави силно трудноразрешими, което води до непълно превръщане на захарта, натрупвайки 15-25% от полови олигозахариди, които не се произвеждат по време на ензимната хидролиза на предварително обработената биомаса. Това е често срещан проблем при различни методи за предварителна обработка на биомаса. Някои от причините за това затруднение включват инхибиране на ензимите по време на хидролизата или липсата или ниските нива на основни ензими, необходими за разкъсване на захарните връзки в растителната биомаса. Разбирането на състава и структурните характеристики на захарите, като захарните връзки в олигозахаридите, ще ни помогне да подобрим превръщането на захарта по време на хидролизата, което ще направи биотехнологичните процеси конкурентноспособни по отношение на разходите с продуктите, получени от петрол.
Определянето на структурата на въглехидратите е предизвикателство и изисква комбинация от методи като течна хроматография (LC)11,12, ядрено-магнитно-резонансна спектроскопия (NMR)13, капилярна електрофореза (CE)14,15,16 и масспектрометрия (MS)17. ,осемнадесет. MS методите, като например времепролетна масспектрометрия с лазерна десорбция и йонизация с помощта на матрица (MALDI-TOF-MS), са универсален метод за идентифициране на въглехидратни структури. Напоследък, тандемната MS с индуцирана от сблъсък дисоциация (CID) на натриеви йонни адукти е най-широко използвана за идентифициране на пръстови отпечатъци, съответстващи на позиции на свързване на олигозахариди, аномерни конфигурации, последователности и позиции на разклоняване 20, 21.
Анализът на гликаните е отличен инструмент за задълбочена идентификация на въглехидратните връзки22. Този метод използва моноклонални антитела (mAb), насочени към гликана на клетъчната стена на растенията, като сонди за разбиране на сложните въглехидратни връзки. Повече от 250 mAb са налични в световен мащаб, проектирани срещу различни линейни и разклонени олигозахариди, използващи различни захариди24. Няколко mAb са широко използвани за характеризиране на структурата, състава и модификациите на клетъчната стена на растенията, тъй като има значителни разлики в зависимост от типа на растителната клетка, органа, възрастта, стадия на развитие и средата на растеж25,26. Съвсем наскоро този метод се използва за разбиране на популациите на везикули в растителните и животинските системи и техните съответни роли в транспорта на гликани, определени от субклетъчни маркери, стадии на развитие или стимули на околната среда, и за определяне на ензимната активност. Някои от различните структури на гликани и ксилани, които са идентифицирани, включват пектин (P), ксилан (X), манан (M), ксилоглукани (XylG), глюкани със смесени връзки (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманан (GalG), глюкуронова киселина-арабиноксилан (GArbX) и арабино-галактан (ArbG)29.
Въпреки всички тези изследователски усилия обаче, само няколко проучвания са се фокусирали върху естеството на натрупването на олигозахариди по време на хидролиза с високо съдържание на твърди вещества (HSL), включително освобождаване на олигозахариди, промени в дължината на олигомерната верига по време на хидролиза, различни полимери с нисък DP и техните криви на разпределение 30,31,32. Междувременно, въпреки че анализът на гликаните се е доказал като полезен инструмент за цялостен анализ на структурата на гликаните, е трудно да се оценят водоразтворимите олигозахариди с нисък DP, използвайки методи с антитела. По-малките DP олигозахариди с молекулно тегло по-малко от 5-10 kDa не се свързват с ELISA плаки 33, 34 и се отмиват преди добавяне на антитела.
Тук, за първи път, демонстрираме ELISA анализ върху покрити с авидин плаки, използвайки моноклонални антитела, комбинирайки едноетапна процедура за биотинилиране на разтворими рефракторни олигозахариди с анализ на гликом. Нашият подход към анализа на гликом беше валидиран чрез MALDI-TOF-MS и GC-MS базиран анализ на комплементарни олигозахаридни връзки, използвайки триметилсилилна (TMS) дериватизация на хидролизирани захарни състави. Този иновативен подход може да бъде разработен като високопроизводителен метод в бъдеще и да намери по-широко приложение в биомедицинските изследвания35.
Посттранслационните модификации на ензими и антитела, като например гликозилиране,36 влияят на тяхната биологична активност. Например, промените в гликозилирането на серумните протеини играят важна роля при възпалителния артрит, а промените в гликозилирането се използват като диагностични маркери37. В литературата се съобщава за различни гликани, които лесно се появяват при различни заболявания, включително хронични възпалителни заболявания на стомашно-чревния тракт и черния дроб, вирусни инфекции, рак на яйчниците, гърдата и простатата38,39,40. Разбирането на структурата на гликаните, използващи ELISA методи за гликани, базирани на антитела, ще осигури допълнителна увереност при диагностицирането на заболяванията без използването на сложни MS методи.
Предишното ни проучване показа, че упоритите олигозахариди остават нехидролизирани след предварителна обработка и ензимна хидролиза (Фигура 1). В нашата публикувана по-рано работа разработихме метод за твърдофазна екстракция с активен въглен, за да изолираме олигозахариди от предварително обработен с AFEX хидролизат от царевични стърготини (ACSH)8. След първоначалната екстракция и разделяне, олигозахаридите бяха допълнително фракционирани чрез хроматография с изключване по размер (SEC) и събрани по ред на молекулното тегло. Захарните мономери и олигомери, освободени от различни предварителни обработки, бяха анализирани чрез анализ на състава на захарта. При сравняване на съдържанието на захарни олигомери, получени чрез различни методи за предварителна обработка, наличието на упорити олигозахариди е често срещан проблем при превръщането на биомасата в монозахариди и може да доведе до намаляване на добива на захар с поне 10-15% и дори до 18%. САЩ. Този метод се използва за по-нататъшно мащабно производство на олигозахаридни фракции. Полученият ACH и последващите му фракции с различни молекулни тегла бяха използвани като експериментален материал за характеризиране на олигозахариди в тази работа.
След предварителна обработка и ензимна хидролиза, персистиращите олигозахариди остават нехидролизирани. Тук (А) е метод за разделяне на олигозахариди, при който олигозахаридите се изолират от предварително обработен с AFEX хидролизат на царевични стърнища (ACSH), използвайки пълнежен слой от активен въглен и диатомит; (Б) Метод за разделяне на олигозахариди. Олигозахаридите са допълнително разделени чрез хроматография с изключване по размер (SEC); (В) Захаридни мономери и олигомери, освободени от различни предварителни обработки (разредена киселина: DA, йонна течност: IL и AFEX). Условия на ензимна хидролиза: високо съдържание на твърди вещества от 25% (w/w) (приблизително 8% глюканово зареждане), 96 часа хидролиза, 20 mg/g търговско ензимно зареждане (съотношение Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) и (Г) Захарни мономери и олигомери на глюкоза, ксилоза и арабиноза, освободени от предварително обработени с AFEX царевични стърнища (ACS).
Анализът на гликаните се е доказал като полезен инструмент за цялостен структурен анализ на гликани в екстракти, изолирани от остатъци от твърда биомаса. Водоразтворимите захари обаче са недостатъчно представени при използване на този традиционен метод41, тъй като олигозахаридите с ниско молекулно тегло са трудни за имобилизиране върху ELISA плаки и се отмиват преди добавяне на антитела. Следователно, за свързване и характеризиране на антитела е използван едноетапен метод на биотинилиране за покриване на разтворими, несъвместими олигозахариди върху ELISA плаки, покрити с авидин. Този метод е тестван с помощта на нашия предварително произведен ACSH и фракция, базирана на неговото молекулно тегло (или степен на полимеризация, DP). Едноетапното биотинилиране е използвано за увеличаване на афинитета на свързване на олигозахариди чрез добавяне на биотин-LC-хидразид към редуциращия край на въглехидрата (фиг. 2). В разтвор, полуацеталната група в редуциращия край реагира с хидразидната група на биотин-LC-хидразид, за да образува хидразонова връзка. В присъствието на редуциращия агент NaCNBH3, хидразоновата връзка се редуцира до стабилен биотинилиран краен продукт. С модифицирането на редуциращия захарта край, свързването на олигозахариди с нисък DP към ELISA плаки стана възможно и в нашето проучване това беше направено върху покрити с авидин плаки, използвайки моноклонални антитела, насочени към гликан.
Скрининг на моноклонални антитела, базиран на ELISA, за биотинилирани олигозахариди. Тук (A) е комбинирано биотинилиране на олигозахариди и последващ ELISA скрининг с гликано-насочени моноклонални антитела върху покрити с NeutrAvidin плаки, а (B) е показана едноетапна процедура за биотинилиране на реакционни продукти.
След това към първичните и вторичните антитела бяха добавени покрити с авидин плаки с олигозахарид-конюгирани антитела и измити в светлочувствителна и времечувствителна среда. След като свързването на антителата завърши, добавете TMB субстрат, за да инкубирате плаката. Реакцията най-накрая беше спряна със сярна киселина. Инкубираните плаки бяха анализирани с помощта на ELISA четец, за да се определи силата на свързване на всяко антитяло и да се открие специфично за антитялото омрежване. За подробности и параметри на експеримента вижте съответния раздел „Материали и методи“.
Демонстрираме полезността на този новоразработен метод за специфични приложения, като характеризираме разтворимите олигозахариди, присъстващи в ACSH, както и в сурови и пречистени олигозахаридни фракции, изолирани от лигноцелулозни хидролизати. Както е показано на Фигура 3, най-често срещаните епитопно-заместени ксилани, идентифицирани в ACSH, използващи методи за биоацилиран гликом, обикновено са уронови (U) или метилуронови (MeU) и пектинови арабиногалактани. Повечето от тях бяха открити и в предишното ни проучване върху анализа на гликани на нехидролизирани твърди вещества (UHS)43.
Откриване на рекалцитрантни олигозахаридни епитопи с помощта на моноклонално антитяло, насочено към гликана на клетъчната стена. „Неутралната“ фракция е ACN фракцията, а „киселинната“ фракция е FA фракцията. По-ярките червени цветове на топлинната карта показват по-високо съдържание на епитопи, а по-ярките сини цветове показват празен фон. Стойностите на цветовете на скалата са базирани на суровите стойности на оптичната плътност (OD) за формулировки N=2. Основните епитопи, разпознати от антителата, са показани вдясно.
Тези нецелулозни структури не могат да бъдат разцепени от най-често срещаните целулази и хемицелулази в тестваната търговска ензимна смес, която включва най-често използваните търговски ензими. Следователно, за тяхната хидролиза са необходими нови помощни ензими. Без необходимите нецелулозни помощни ензими, тези нецелулозни връзки предотвратяват пълното превръщане в монозахариди, дори ако техните основни захарни полимери са екстензивно хидролизирани на по-къси фрагменти и разтворени с помощта на търговски ензимни смеси.
По-нататъшно проучване на разпределението на сигнала и неговата сила на свързване показа, че свързващите епитопи са по-ниски във фракциите на захарите с висок DP (A, B, C, DP до 20+), отколкото във фракциите с нисък DP (D, E, F, DP) (в димерите) (фиг. 1). Киселинните фрагменти са по-често срещани в нецелулозните епитопи, отколкото в неутралните фрагменти. Тези явления са в съответствие с наблюдавания модел в предишното ни проучване, където високият DP и киселинните остатъци са по-устойчиви на ензимна хидролиза. Следователно, наличието на нецелулозни гликанови епитопи и U и MeU замествания може значително да допринесе за стабилността на олигозахаридите. Трябва да се отбележи, че ефективността на свързване и откриване може да бъде проблематична за олигозахаридите с нисък DP, особено ако епитопът е димерен или тримерен олигозахарид. Това може да се тества с помощта на търговски олигозахариди с различна дължина, всеки от които съдържа само един епитоп, който се свързва със специфично mAb.
По този начин, използването на структурно-специфични антитела разкри определени видове упорити връзки. В зависимост от вида на използваното антитяло, подходящия модел на лигиране и силата на сигнала, който то произвежда (най-многобройни и най-малко разпространени), нови ензими могат да бъдат идентифицирани и добавени полуколичествено към ензимната смес за по-пълно гликоконверсия. Вземайки за пример анализа на ACSH олигозахариди, можем да създадем база данни за гликанови връзки за всеки биомасен материал. Тук трябва да се отбележи, че трябва да се вземе предвид различният афинитет на антителата и ако техният афинитет е неизвестен, това ще създаде определени трудности при сравняване на сигналите на различни антитела. Освен това, сравнението на гликанови връзки може да работи най-добре между проби за едно и също антитяло. Тези упорити връзки могат да бъдат свързани с базата данни CAZyme, от която можем да идентифицираме ензими, да изберем кандидат-ензими и да тестваме за ензими, разкъсващи връзки, или да разработим микробни системи за експресиране на тези ензими за използване в биорафинерии44.
За да оценим как имунологичните методи допълват алтернативни методи за характеризиране на нискомолекулни олигозахариди, присъстващи в лигноцелулозни хидролизати, извършихме MALDI (фиг. 4, S1-S8) и анализ на захариди, получени от TMS, базиран на GC-MS върху същия панел (фиг. 5) олигозахаридна част. MALDI се използва за сравнение дали масовото разпределение на олигозахаридните молекули съответства на предвидената структура. На фиг. 4 е показана молекулната плътност (MC) на неутралните компоненти ACN-A и ACN-B. ACN-A анализът потвърди диапазон от пентозни захари, вариращи от DP 4–8 (фиг. 4) до DP 22 (фиг. S1), чиито тегла съответстват на MeU-ксиланови олигозахариди. ACN-B анализът потвърди пентозните и глюкоксилановите серии с DP 8-15. В допълнителни материали, като например Фигура S3, картите на масовото разпределение на киселинната част на FA-C показват диапазон от (Me)U заместени пентозни захари с DP от 8-15, които са съвместими със заместените ксилани, открити при ELISA-базиран скрининг на моноклонални антитела. Епитопите са съвместими.
MALDI-MS спектър на разтворими несъвместими олигозахариди, присъстващи в ACS. Тук (A) ACN-A фракции с нисък тегловен диапазон, съдържащи метилирана уронова киселина (DP 4-8), заместени с глюкуроксиланови олигозахариди, и (B) ACN-B ксилан и метилирани уронови киселинни олигозахариди, заместени с глюкуроксилан (DP 8-15).
Анализ на състава на гликановия остатък на резистентни олигозахариди. Тук (A) TMS захариден състав на различни олигозахаридни фракции, получени чрез GC-MS анализ. (B) Структури на различни TMS-производни захари, присъстващи в олигозахаридите. ACN – ацетонитрилна фракция, съдържаща неутрални олигозахариди, и FA – ферулова киселинна фракция, съдържаща киселинни олигозахариди.
Друг интересен извод беше направен от LC-MS анализа на олигозахаридната фракция, както е показано на Фигура S9 (методите могат да се видят в допълнителните електронни материали). Фрагменти от хексозни и -OAc групи бяха наблюдавани многократно по време на лигирането на ACN-B фракцията. Това откритие не само потвърждава фрагментацията, наблюдавана при гликомния и MALDI-TOF анализ, но също така предоставя нова информация за потенциални въглехидратни производни в предварително обработена лигноцелулозна биомаса.
Анализирахме също захарния състав на олигозахаридната фракция, използвайки TMS захарна дериватизация. Използвайки GC-MS, определихме състава на невронните (недеривативни) и киселинните захари (GluA и GalA) в олигозахаридната фракция (Фиг. 5). Глюкуроновата киселина се намира в киселинните компоненти C и D, докато галактуроновата киселина се намира в киселинните компоненти A и B, като и двата са компоненти с висок DP на киселинните захари. Тези резултати не само потвърждават нашите ELISA и MALDI данни, но и са в съответствие с предишните ни изследвания за натрупване на олигозахариди. Следователно, ние вярваме, че съвременните имунологични методи, използващи биотинилиране на олигозахариди и последващ ELISA скрининг, са достатъчни за откриване на разтворими, рекалцитрантни олигозахариди в различни биологични проби.
Тъй като методите за скрининг на моноклонални антитела, базирани на ELISA, са валидирани чрез няколко различни метода, ние искахме да проучим по-нататък потенциала на този нов количествен метод. Два търговски олигозахарида, ксилохексазахариден олигозахарид (XHE) и 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX), бяха закупени и тествани, използвайки нов подход за моноклонални антитела, насочен към гликана на клетъчната стена. Фигура 6 показва линейна корелация между биотинилирания свързващ сигнал и логаритмичната концентрация на олигозахарида, което предполага възможен модел на адсорбция по Лангмюр. Сред моноклоналните антитела, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 и CCRC-M151 корелират с XHE, а CCRC-M108, CCRC-M109 и LM11 корелират с A2XX в диапазон от 1 nm до 100 nano. Поради ограничената наличност на антитела по време на експеримента, бяха проведени ограничени експерименти с всяка концентрация на олигозахарид. Трябва да се отбележи, че някои антитела реагират много различно на един и същ олигозахарид като субстрат, вероятно защото се свързват с малко по-различни епитопи и могат да имат много различен афинитет на свързване. Механизмите и последиците от точната идентификация на епитопите ще бъдат много по-сложни, когато новият подход с моноклонални антитела се приложи към реални проби.
Два търговски олигозахарида бяха използвани за определяне на обхвата на откриване на различни моноклонални антитела, насочени към гликани. Тук линейните корелации с логаритмичната концентрация на олигозахарида показват модели на адсорбция по Лангмюр за (A) XHE с моноклонално антитяло и (B) A2XX с моноклонално антитяло. Съответните епитопи показват структурите на търговските олигозахариди, използвани като субстрати в анализа.
Използването на моноклонални антитела, насочени към гликани (гликокомичен анализ или ELISA-базиран скрининг на моноклонални антитела), е мощен инструмент за задълбочено характеризиране на повечето от основните гликани в клетъчната стена, които изграждат растителната биомаса. Класическият анализ на гликаните обаче характеризира само по-големите гликани в клетъчната стена, тъй като повечето олигозахариди не са ефективно имобилизирани върху ELISA плаки. В това проучване, предварително третирана с AFEX царевична стърготина беше ензимно хидролизиран при високо съдържание на твърди вещества. Анализът на захарта беше използван за определяне на състава на устойчивите въглехидрати в клетъчната стена в хидролизата. Анализът на моноклонални антитела на по-малки олигозахариди в хидролизатите обаче е подценен и са необходими допълнителни инструменти за ефективно имобилизиране на олигозахариди върху ELISA плаки.
Тук представяме нов и ефикасен метод за имобилизиране на олигозахариди за скрининг на моноклонални антитела чрез комбиниране на биотинилиране на олигозахариди, последвано от ELISA скрининг върху покрити с NeutrAvidin™ плочи. Имобилизираните биотинилирани олигозахариди показват достатъчен афинитет към антитялото, за да позволят бързо и ефикасно откриване на резистентни олигозахариди. Анализът на състава на тези упорити олигозахариди, базиран на масспектрометрия, потвърждава резултатите от този нов подход към имуноскрининга. По този начин, тези проучвания показват, че комбинацията от биотинилиране на олигозахариди и ELISA скрининг с моноклонални антитела, насочени към гликан, може да се използва за откриване на кръстосани връзки в олигозахариди и може да се прилага широко в други биохимични изследвания, характеризиращи структурата на олигозахаридите.
Този метод за профилиране на гликани, базиран на биотин, е първият доклад, способен да изследва устойчивите въглехидратни връзки на разтворими олигозахариди в растителната биомаса. Това помага да се разбере защо някои части от биомасата са толкова упорити, когато става въпрос за производство на биогорива. Този метод запълва важна празнина в методите за анализ на гликоми и разширява приложението му до по-широк спектър от субстрати отвъд растителните олигозахариди. В бъдеще може да използваме роботика за биотинилиране и да използваме разработения от нас метод за високопроизводителен анализ на проби, използвайки ELISA.
Царевична слама (CS), отгледана от хибридни семена Pioneer 33A14, е събрана през 2010 г. от фермата Kramer в Рей, Колорадо. С разрешението на собственика на земята, тази биомаса може да бъде използвана за изследвания. Пробите се съхраняваха сухи с влажност < 6% в торбички с цип при стайна температура. Пробите се съхраняваха сухи с влажност < 6% в торбички с цип при стайна температура. Образци се съхраняваха сухи при влажност < 6% в пакети със застежка-молния при стайна температура. Пробите се съхраняваха сухи при влажност <6% в торбички с цип при стайна температура.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образци хранени в пакети със защита-молния при стайна температура с влажност < 6%. Пробите се съхраняват в торбички с цип при стайна температура и влажност < 6%.Проучването е проведено в съответствие с местните и националните насоки. Съставният анализ е извършен с помощта на протокола NREL. Установено е, че съставът съдържа 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% протеин и 13,4% пепел.
Cellic® CTec2 (138 mg протеин/ml, партида VCNI 0001) е сложна смес от целулаза, β-глюкозидаза и Cellic® HTec2 (157 mg протеин/ml, партида VHN00001) от Novozymes (Франклинтън, Северна Каролина, САЩ). Multifect Pectinase® (72 mg протеин/mL), сложна смес от ензими, разграждащи пектин, е дарена от DuPont Industrial Biosciences (Пало Алто, Калифорния, САЩ). Концентрациите на ензимните протеини са определени чрез оценка на съдържанието на протеин (и изваждане на приноса на непротеиновия азот), използвайки азотен анализ по Келдал (метод AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Ню Йорк, САЩ). Диатомитната пръст 545 е закупена от EMD Millipore (Билерика, Масачузетс). Активен въглен (DARCO, гранули 100 mesh), Avicel (PH-101), буков ксилан и всички други химикали са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури).
Предварителната обработка с AFEX беше извършена в GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA). Предварителната обработка беше проведена при 140°C за 15 минути. Време на престой 46 при съотношение 1:1 на безводен амоняк към биомаса при 60% (w/w) зареждане в настолен реактор от неръждаема стомана за периодично нагряване (Parr Instruments Company). Отне 30 минути. Реакторът беше доведен до 140°C и амонякът беше бързо освободен, което позволи на биомасата бързо да се върне до стайна температура. Съставът на предварително обработената с AFEX царевична стърнища (ACS) беше подобен на този на нетретираната царевична стърнища (UT-CS).
Високо съдържание на твърди вещества ACSH 25% (w/w) (приблизително 8% декстраново зареждане) беше приготвен като изходен материал за мащабно производство на олигозахариди. Ензимната хидролиза на ACS беше извършена с помощта на търговска ензимна смес, включваща Cellic® Ctec2 10 mg протеин/g глюкан (в предварително обработена биомаса), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg протеин/g глюкан и Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA). ), 5 mg протеин/g декстран. Ензимната хидролиза беше проведена в 5-литров биореактор с работен обем от 3 литра, pH 4.8, 50°C и 250 rpm. След хидролиза в продължение на 96 часа, хидролизатът беше събран чрез центрофугиране при 6000 rpm за 30 минути и след това при 14000 rpm за 30 минути за отстраняване на нехидролизираните твърди вещества. След това хидролизатът се подлага на стерилна филтрация през филтърна чаша с размер на отвора 0,22 мм. Филтрираният хидролизат се съхранява в стерилни бутилки при 4°C и след това се фракционира върху активен въглен.
Анализ на състава на проби от биомаса на базата на екстракти съгласно лабораторните аналитични процедури на NREL: подготовка на проби за анализ на състава (NREL/TP-510-42620) и определяне на структурни въглехидрати и лигнин в биомасата (NREL/TP-510 – 42618)47.
Анализът на олигозахаридите в хидролизатния поток беше извършен в мащаб 2 ml, използвайки метод за киселинна хидролиза, базиран на автоклав. Смесете пробата от хидролизата с 69,7 µl 72% сярна киселина в 10 ml епруветка с винтова капачка и инкубирайте в продължение на 1 час на настолна компютърна програма при 121 °C, охладете върху лед и филтрирайте в епруветка за високоефективна течна хроматография (HPLC). Концентрацията на олигозахариди беше определена чрез изваждане на концентрацията на монозахариди в нехидролизираната проба от общата концентрация на захар в киселинно хидролизираната проба.
Концентрациите на глюкоза, ксилоза и арабиноза в киселинно хидролизираната биомаса бяха анализирани с помощта на Shimadzu HPLC система, оборудвана с автосамплер, нагревател на колоната, изократична помпа и детектор на индекса на пречупване на колона Bio-Rad Aminex HPX-87H. Колоната беше поддържана при 50°C и елуирана с поток от 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 във вода.
Супернатантът на хидролизата беше разреден и анализиран за съдържание на мономери и олигозахариди. Мономерните захари, получени след ензимна хидролиза, бяха анализирани чрез HPLC, оборудвана с колона Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P и колона за предпазване от пепел. Температурата на колоната беше поддържана на 80°C, като като мобилна фаза беше използвана вода със скорост на потока 0,6 ml/min. Олигозахаридите бяха определени чрез хидролиза в разредена киселина при 121°C съгласно методите, описани в реф. 41, 48, 49.
Захариден анализ беше извършен върху сурови, предварително третирани с AFEX и всички нехидролизирани остатъци от биомаса (включително производство на серийни екстракти от клетъчни стени и техния скрининг на моноклонални антитела), използвайки предварително описани процедури 27, 43, 50, 51. За гликомен анализ, неразтворими в алкохол остатъци от материал на растителни клетъчни стени се приготвят от остатъци от биомаса и се подлагат на серийна екстракция с все по-агресивни реагенти като амониев оксалат (50 mM), натриев карбонат (50 mM и 0,5% w/v), CON. (1M и 4M, и двата с 1% w/v натриев борохидрид) и киселинен хлорит, както е описано по-рано 52,53. След това екстрактите бяха подложени на ELISA срещу сложен панел от моноклонални антитела 50, насочени към гликана на клетъчната стена, и реакциите на свързване на моноклоналните антитела бяха представени като топлинна карта. Моноклоналните антитела, насочени към гликана на растителната клетъчна стена, бяха закупени от лабораторни запаси (серии CCRC, JIM и MAC).
Едноетапно биотинилиране на олигозахариди. Конюгацията на въглехидрати с биотин-LC-хидразид е извършена по следната процедура. Биотин-LC-хидразид (4,6 mg/12 μmol) е разтворен в диметилсулфоксид (DMSO, 70 μl) чрез енергично разбъркване и нагряване при 65°C за 1 минута. Добавена е ледена оцетна киселина (30 µl) и сместа е излята върху натриев цианоборохидрид (6,4 mg/100 µmol) и е напълно разтворена след нагряване при 65°C за около 1 минута. След това, от 5 до 8 μl от реакционната смес са добавени към изсушения олигозахарид (1-100 nmol), за да се получи 10-кратен или по-голям моларен излишък на маркирания спрямо редуциращия край. Реакцията е проведена при 65°C за 2 часа, след което пробите са незабавно пречистени. В експериментите за маркиране без редукция не е използван натриев цианоборохидрид и пробите са реагирали при 65°C в продължение на 2,5 часа.
ELISA покритие и промиване на проби от биотинилирани олигозахариди. 25 μl биотинилирани проби (100 μl от всяка концентрирана проба, разредена в 5 ml 0,1 M Tris буферен разтвор (TBS)) бяха добавени към всяка ямка на покритата с авидин плака. Контролните ямки бяха покрити с 50 μl биотин с концентрация 10 μg/ml в 0,1 M TBS. Дейонизирана вода беше използвана като покритие за празни проби. Таблетката беше инкубирана в продължение на 2 часа при стайна температура на тъмно. Измийте плаката 3 пъти с 0,1% обезмаслено мляко в 0,1 M TBS, като използвате програма № 11 за Grenier flat 3A.
Добавяне и промиване на първични антитела. Добавете 40 µl от първичното антитяло към всяка ямка. Инкубирайте микроплаката за 1 час на стайна температура на тъмно. След това плаките бяха промити 3 пъти с 0,1% мляко в 0,1M TBS, използвайки програма за промиване #11 за Grenier Flat 3A.
Добавете вторично антитяло и измийте. Добавете 50 µl вторично антитяло от мишка/плъх (разредено 1:5000 в 0,1% мляко в 0,1 M TBS) към всяка ямка. Инкубирайте микроплаката за 1 час на стайна температура на тъмно. След това микроплаките бяха измити 5 пъти с 0,1% мляко в 0,1 M TBS, използвайки програма за измиване на плаки Grenier Flat 5A #12.
Добавяне на субстрат. Добавете 50 µl 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (TMB) към основния субстрат (чрез добавяне на 2 капки буфер, 3 капки TMB, 2 капки водороден пероксид към 15 ml дейонизирана вода). Пригответе TMB субстрата и разбъркайте на вортекс преди употреба. Инкубирайте микроплаката при стайна температура за 30 минути. На тъмно.
Изпълнете стъпката и прочетете таблетката. Добавете 50 µl 1 N сярна киселина във всяка ямка и запишете абсорбцията от 450 до 655 nm, като използвате ELISA четец.
Пригответе разтвори с концентрация 1 mg/ml на следните аналити в дейонизирана вода: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактуронова киселина (GalA), глюкуронова киселина (GlcA), маноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (вътрешен стандарт). Два стандарта бяха приготвени чрез добавяне на захарните разтвори с концентрация 1 mg/mL, показани в Таблица 1. Пробите се замразяват и лиофилизират при -80°C, докато се отстрани цялата вода (обикновено около 12-18 часа).
Добавете 100–500 µg проба в епруветки с винтови капачки върху аналитична везна. Запишете добавеното количество. Най-добре е пробата да се разтвори в разтворител със специфична концентрация и да се добави в епруветката като течна аликвотна част. Използвайте 20 µl инозитол с концентрация 1 mg/ml като вътрешен стандарт за всяка епруветка с проба. Количеството вътрешен стандарт, добавено към пробата, трябва да е същото като количеството вътрешен стандарт, добавено към стандартната епруветка.
Добавете 8 ml безводен метанол в ампула с винтова капачка. След това 4 ml 3 N метанолов разтвор на HCl, затворете капачката и разклатете. Този процес не използва вода.
Добавете 500 µl 1 M разтвор на HCl метанол към пробите от олигозахариди и стандартните TMS епруветки. Пробите се инкубират за една нощ (168 часа) при 80°C в термоблок. Изсушете продукта от метанолизата при стайна температура, използвайки сушилня. Добавете 200 µl MeOH и изсушете отново. Този процес се повтаря два пъти. Добавете 200 µl метанол, 100 µl пиридин и 100 µl оцетен анхидрид към пробата и разбъркайте добре. Пробите се инкубират при стайна температура за 30 минути и се изсушават. Добавете 200 µl метанол и изсушете отново.
Добавете 200 µl Tri-Sil и загрейте затворената епруветка за 20 минути. 80°C, след което охладете до стайна температура. Използвайте сушилня, за да изсушите допълнително пробата до обем от приблизително 50 µl. Важно е да се отбележи, че не оставихме пробите да изсъхнат напълно.
Добавете 2 ml хексан и разбъркайте добре чрез вортекс. Напълнете върховете на пастьорови пипети (5-8 mm) с парче стъклена вата, като поставите стъклената вата върху пипета с диаметър 5-3/4 инча. Пробите бяха центрофугирани при 3000 g за 2 минути. Всички неразтворими остатъци се утаяват. Изсушете пробата до 100-150 µl. Обем от приблизително 1 μl беше инжектиран в GC-MS при начална температура от 80 °C и начално време от 2,0 минути (Таблица 2).