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AFEX で前処理したトウモロコシ茎葉中の残留性オリゴ糖の複雑な分析のための新しい免疫学的および質量分析法。リグノセルロース系バイオマスは化石燃料の持続可能な代替品であり、食品、飼料、燃料、化学薬品などの製品を生産するためのバイオテクノロジーの開発に広く使用されています。これらの技術の鍵は、植物の細胞壁に存在する複雑な炭水化物をグルコース、キシロース、アラビノースなどの単糖に変換するコスト競争力のあるプロセスの開発です。リグノセルロース系バイオマスは非常に頑固であるため、所望の生成物を得るには、熱化学処理（例：アンモニア繊維剥離（AFEX）、希酸（DA）、イオン液体（IL））と生物学的処理（例：酵素加水分解および微生物発酵）を組み合わせて行う必要があります。。しかし、市販の真菌酵素を加水分解プロセスに使用すると、形成される可溶性糖の 75 ～ 85% のみが単糖であり、残りの 15 ～ 25% は可溶性の扱いにくいオリゴ糖であり、微生物が常に利用できるわけではありません。これまでに、我々は炭素と珪藻土の分離とサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて、可溶性の頑固なオリゴ糖の単離と精製に成功し、またそれらの酵素阻害特性も調査しました。我々は、より高い重合度（DP）のメチル化ウロン酸置換を含むオリゴ糖は、低重合度および中性のオリゴ糖よりも市販の酵素ブレンドで処理することが難しいことを発見しました。今回我々は、植物バイオマスグリカンに特異的なモノクローナル抗体（mAb）を使用して植物細胞壁および酵素加水分解物のグリカン結合を特徴付けるグリカンプロファイリング、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、飛行時間型質量分析など、いくつかの追加方法の使用を報告します。。MALDI-TOF-MS) は、負イオンの二次崩壊後の分光法、ガスクロマトグラフィーおよび質量分析法 (GC-MS) によって得られた構造情報となる診断用ピークを使用して、誘導体化の有無にかかわらずオリゴ糖結合を特徴付けます。オリゴ糖 (DP 4 ～ 20) はサイズが小さいため、これらの分子を mAb の結合および特性評価に使用するのは困難です。この問題を克服するために、我々は新しいビオチン結合ベースのオリゴ糖固定化法を適用し、マイクロプレート表面上の低DP可溶性オリゴ糖の大部分を標識することに成功し、その後、特異的ライゲーション解析のためのハイスループットmAbシステムで使用しました。この新しい方法は、将来、診断目的でバイオマーカーに存在するオリゴ糖を単離および特性評価するために使用できる、より高度なハイスループット グライコーム アッセイの開発を促進します。
リグノセルロース系バイオマスは、農業、林業、草および木質材料で構成されており、より高価値の製品を生産するための食品、飼料、燃料、化学前駆体などのバイオベース製品の生産原料となる可能性があります1。植物の細胞壁に存在する炭水化物（セルロースやヘミセルロースなど）は、化学処理や生体内変換（酵素加水分解や微生物発酵など）により単糖類に解重合されます。一般的な前処理には、アンモニア繊維拡張 (AFEX)、希酸 (DA)、イオン液体 (IL)、および水蒸気爆発 (SE) が含まれます。これらは化学物質と熱を組み合わせて植物の細胞壁を開いてリグノセルロースの生産を削減します 3,4。酵素加水分解は、市販の活性炭水化物含有酵素 (CAZyme) を使用した高固形分負荷で実行され、トランスジェニック酵母または細菌を使用した微生物発酵により、バイオベースの燃料および化学物質が生産されます 6 。
市販の酵素に含まれる CAZyme は、複雑な炭水化物と糖の結合を相乗的に切断して単糖を形成する酵素の複雑な混合物で構成されています 2,7。以前に報告したように、リグニンと炭水化物の芳香族ポリマーの複雑なネットワークにより、リグニンは非常に扱いにくくなり、不完全な糖変換につながり、前処理されたバイオマスの酵素加水分解中に生成されない性オリゴ糖の15〜25％が蓄積します。これは、さまざまなバイオマス前処理方法に共通する問題です。このボトルネックの理由としては、加水分解中の酵素阻害、植物バイオマスの糖結合を切断するために必要な必須酵素の欠如または低レベルなどが挙げられます。オリゴ糖の糖結合など、糖の組成や構造的特徴を理解することは、加水分解中の糖変換を改善し、バイオテクノロジープロセスを石油由来製品とコスト競争力のあるものにするのに役立ちます。
炭水化物の構造を決定することは困難であり、液体クロマトグラフィー (LC)11、12、核磁気共鳴分光法 (NMR)13、キャピラリー電気泳動 (CE)14、15、16、質量分析法 (MS)17 などの方法の組み合わせが必要です。、十八。マトリックスを使用したレーザー脱離およびイオン化による飛行時間型質量分析法 (MALDI-TOF-MS) などの MS 法は、炭水化物の構造を同定するための汎用性の高い方法です。最近、ナトリウムイオン付加物の衝突誘起解離 (CID) タンデム MS は、オリゴ糖の結合位置、アノマー配置、配列、分岐位置に対応するフィンガープリントを同定するために最も広く使用されています 20、21 。
糖鎖分析は、炭水化物結合を詳細に特定するための優れたツールです22。この方法では、植物細胞壁グリカンに対するモノクローナル抗体 (mAb) をプローブとして使用し、複雑な炭水化物結合を理解します。世界中で 250 を超える mAb が入手可能であり、さまざまな糖を使用してさまざまな直鎖および分岐オリゴ糖に対して設計されています 24。植物細胞の種類、器官、年齢、発生段階、生育環境に応じて大きな違いがあるため、植物細胞壁の構造、組成、修飾を特徴付けるためにいくつかの mAb が広く使用されています 25,26。最近では、この方法は、植物および動物系の小胞集団と、細胞内マーカー、発育段階、または環境刺激によって決定される糖鎖輸送におけるそれぞれの役割を理解し、酵素活性を決定するために使用されています。同定されているグリカンおよびキシランのさまざまな構造には、ペクチン (P)、キシラン (X)、マンナン (M)、キシログルカン (XylG)、混合結合グルカン (MLG)、アラビノキシラン (ArbX)、ガラクトマンナン (GalG)、グルクロン酸-アラビノキシラン (GArbX)、およびアラビノ-ガラクタン (ArbG) が含まれます 29。
しかし、これらすべての研究努力にもかかわらず、オリゴ糖の放出、加水分解中のオリゴマー鎖長の変化、さまざまな低DPポリマー、およびそれらの曲線など、高固体負荷（HSL）加水分解中のオリゴ糖蓄積の性質に焦点を当てた研究はわずか数件しかありません。分布30、31、32。一方、糖鎖解析は糖鎖構造の網羅的な解析に有用なツールであることがわかっていますが、水溶性の低DPオリゴ糖を抗体法で評価することは困難です。分子量が 5 ～ 10 kDa 未満の小さな DP オリゴ糖は ELISA プレート 33、34 に結合せず、抗体添加前に洗い流されます。
ここでは、可溶性難治性オリゴ糖のワンステップビオチン化手順とグライコーム分析を組み合わせた、モノクローナル抗体を使用したアビジンコートプレート上での ELISA アッセイを初めて実証します。グライコーム分析に対する当社のアプローチは、加水分解糖組成物のトリメチルシリル (TMS) 誘導体化を使用した相補的オリゴ糖結合の MALDI-TOF-MS および GC-MS ベースの分析によって検証されました。この革新的なアプローチは、将来的にはハイスループットな方法として開発され、生物医学研究においてより広範な応用が見込まれる可能性があります 35。
グリコシル化などの酵素や抗体の翻訳後修飾 36 は、それらの生物活性に影響を与えます。例えば、血清タンパク質のグリコシル化の変化は炎症性関節炎において重要な役割を果たしており、グリコシル化の変化は診断マーカーとして使用されます 37。文献では、さまざまなグリカンが、胃腸管および肝臓の慢性炎症性疾患、ウイルス感染症、卵巣がん、乳がん、前立腺がんなどのさまざまな疾患に容易に現れることが報告されています 38,39,40。抗体ベースのグリカン ELISA 法を使用してグリカンの構造を理解すると、複雑な MS 法を使用せずに疾患診断の信頼性がさらに高まります。
私たちの以前の研究では、頑固なオリゴ糖が前処理と酵素加水分解の後も加水分解されないままであることが示されました (図 1)。私たちは以前に発表した研究で、AFEX で前処理したトウモロコシ茎葉加水分解物 (ACSH) からオリゴ糖を単離するための活性炭固相抽出法を開発しました8。最初の抽出と分離の後、オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によってさらに分画され、分子量の順に収集されました。各種前処理により遊離した糖モノマーおよびオリゴマーを糖組成分析により分析しました。さまざまな前処理方法で得られた糖オリゴマーの含有量を比較すると、頑固なオリゴ糖の存在はバイオマスから単糖への変換における一般的な問題であり、少なくとも 10 ～ 15%、さらには最大 18% の糖収率の低下につながる可能性があります。私たち。この方法は、オリゴ糖画分のさらなる大量生産に使用されます。得られた ACH とその後の分子量の異なる画分は、この研究でオリゴ糖の特性評価のための実験材料として使用されました。
前処理と酵素加水分解の後、残留性オリゴ糖は加水分解されずに残りました。ここで (A) は、活性炭と珪藻土の充填層を使用して、AFEX で前処理したトウモロコシ茎葉加水分解物 (ACSH) からオリゴ糖を分離するオリゴ糖分離方法です。(B) オリゴ糖の分離方法。オリゴ糖はサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によってさらに分離されました。(C) 各種前処理（希酸：DA、イオン液体：IL、AFEX）により放出される糖モノマーおよびオリゴマー。酵素加水分解条件：２５％（ｗ／ｗ）の高固形分負荷（約８％グルカン負荷）、９６時間加水分解、２０ｍｇ／ｇの市販酵素負荷（Ｃｔｅｃ２：Ｈｔｅｃ２：ＭＰ－２：１：１比）、および（Ｄ）ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉（ＡＣＳ）から放出されるグルコース、キシロースおよびアラビノースの糖モノマーおよびオリゴマー。
グリカン分析は、固体バイオマス残留物から単離された抽出物中のグリカンの包括的な構造分析に有用なツールであることが証明されています。しかし、低分子量のオリゴ糖は ELISA プレートに固定化することが難しく、抗体添加前に洗浄されてしまうため、この従来の方法では水溶性糖は過小評価されます 41。したがって、抗体の結合と特性評価のために、ワンステップのビオチン化法を使用して、アビジンでコーティングされた ELISA プレート上に可溶性の非準拠オリゴ糖をコーティングしました。このメソッドは、以前に製造した ACSH とその分子量 (または重合度、DP) に基づく分画を使用してテストされました。糖鎖の還元末端にビオチン-LC-ヒドラジドを付加することにより、ワンステップビオチン化を使用してオリゴ糖結合親和性を高めました（図2）。溶液中では、還元末端のヘミアセタール基がビオチン-LC-ヒドラジドのヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成します。還元剤 NaCNBH3 の存在下では、ヒドラゾン結合は安定なビオチン化最終生成物に還元されます。糖還元末端の修飾により、低DPオリゴ糖のELISAプレートへの結合が可能になり、我々の研究では、グリカンを標的としたmAbを使用して、アビジンでコーティングされたプレート上でこれが行われました。
ビオチン化オリゴ糖のELISAに基づくモノクローナル抗体のスクリーニング。ここで、(A) オリゴ糖のビオチン化とそれに続く NeutrAvidin コーティングプレート上のグリカン標的 mAb による ELISA スクリーニングの組み合わせ、および (B) は反応生成物のビオチン化のための 1 ステップ手順を示します。
次に、オリゴ糖結合抗体を含むアビジンでコーティングされたプレートに一次抗体と二次抗体を加え、光と時間に敏感な媒体で洗浄しました。抗体の結合が完了したら、TMB 基質を加えてプレートをインキュベートします。最後に反応を硫酸で停止させた。インキュベートしたプレートをELISAリーダーを使用して分析し、各抗体の結合強度を測定し、抗体特異的架橋を検出しました。実験の詳細とパラメーターについては、対応するセクション「材料と方法」を参照してください。
我々は、ACSH およびリグノセルロース加水分解物から単離された粗オリゴ糖画分および精製オリゴ糖画分に存在する可溶性オリゴ糖を特徴付けることにより、特定の用途に対するこの新しく開発された方法の有用性を実証します。図 3 に示すように、ビオアシル化グライコーム アッセイ法を使用して ACSH で同定される最も一般的なエピトープ置換キシランは、通常、ウロン酸 (U) またはメチルウロン酸 (MeU) およびペクチン アラビノガラクタンです。それらのほとんどは、非加水分解固体 (UHS) のグリカンの分析に関する以前の研究でも見つかりました 43。
細胞壁グリカンに対するモノクローナル抗体を使用した、難解なオリゴ糖エピトープの検出。「中性」画分はACN画分であり、「酸性」画分はFA画分です。ヒートマップ上の明るい赤色はエピトープ含有量が高いことを示し、明るい青色は背景が空白であることを示します。スケール上の色の値は、配合物 N=2 の生の OD 値に基づいています。抗体によって認識される主なエピトープを右側に示します。
これらの非セルロース構造は、最も一般的に使用される市販酵素を含む、試験した市販酵素混合物中の最も一般的なセルラーゼおよびヘミセルラーゼによって切断できませんでした。したがって、それらの加水分解には新しい補助酵素が必要です。必要な非セルロース補助酵素がないと、親糖ポリマーが広範囲に加水分解されて短いフラグメントになり、市販の酵素混合物を使用して溶解したとしても、これらの非セルロース結合は単糖への完全な変換を妨げます。
シグナル分布とその結合強度をさらに研究したところ、結合エピトープは、二量体の低DP画分（D、E、F、DP）よりも高DP糖画分（A、B、C、DP 20+まで）の方が低いことが示されました（図1）。酸性フラグメントは、中性フラグメントよりも非セルロース エピトープでより一般的です。これらの現象は、高DPおよび酸部分が酵素加水分解に対してより耐性があるという、我々の以前の研究で観察されたパターンと一致しています。したがって、非セルロースグリカンエピトープおよび U および MeU 置換の存在は、オリゴ糖の安定性に大きく寄与する可能性があります。低DPオリゴ糖では、特にエピトープが二量体または三量体オリゴ糖である場合、結合効率と検出効率に問題が生じる可能性があることに注意してください。これは、特定の mAb に結合するエピトープを 1 つだけ含む、さまざまな長さの市販のオリゴ糖を使用してテストできます。
したがって、構造特異的抗体を使用すると、特定の種類の難解な結合が明らかになりました。使用する抗体の種類、適切なライゲーション パターン、および抗体が生成するシグナルの強度 (最も豊富な場合と最も少ない場合) に応じて、新しい酵素を同定し、酵素混合物に半定量的に添加して、より完全な糖変換を行うことができます。ACSHオリゴ糖の解析を例にとると、バイオマス素材ごとの糖鎖結合のデータベースを構築できます。ここで、抗体の異なる親和性を考慮する必要があり、その親和性が不明な場合、異なる抗体のシグナルを比較する際に特定の困難が生じることに注意してください。さらに、グリカン結合の比較は、同じ抗体のサンプル間で最も効果的である可能性があります。これらの頑固な結合は CAZyme データベースにリンクされ、そこから酵素を特定したり、候補酵素を選択して結合破壊酵素をテストしたり、バイオリファイナリーで使用するためにこれらの酵素を発現する微生物システムを開発したりできます 44。
リグノセルロース加水分解物中に存在する低分子量オリゴ糖を特徴付ける代替方法を免疫学的方法がどのように補完するかを評価するために、MALDI (図 4、S1 ～ S8) と、同じパネル (図 5) のオリゴ糖部分で GC-MS に基づく TMS 由来糖の分析を実行しました。MALDI は、オリゴ糖分子の質量分布が目的の構造と一致するかどうかを比較するために使用されます。図上。図４は、ニュートラルコンポーネントＡＣＮ−ＡおよびＡＣＮ−ＢのＭＣを示す。ACN-A分析により、DP 4〜8（図4）からDP 22（図S1）までの範囲のペントース糖が確認され、その重量はMeU-キシランオリゴ糖に相当します。ACN-B 分析により、DP 8 ～ 15 のペントースおよびグルコキシラン系列が確認されました。図S3などの補足資料では、FA-C酸性部分の質量分布マップは、ELISAベースのmAbスクリーニングで見つかった置換キシランと一致する、DPが8〜15の一連の(Me)U置換ペントース糖を示しています。エピトープは一貫しています。
ACS に存在する可溶性非準拠オリゴ糖の MALDI-MS スペクトル。ここで、(A) メチル化ウロン酸 (DP 4 ～ 8) 置換グルクロキシラン オリゴ糖を含む ACN-A 低重量範囲画分、および (B) ACN-B キシランおよびグルクロキシランで置換されたメチル化ウロン酸オリゴ糖 (DP 8 ～ 15)。
難治性オリゴ糖の糖鎖残基の組成の分析。ここで (A) GC-MS 分析を使用して得られたさまざまなオリゴ糖画分の TMS 糖組成。(B) オリゴ糖に存在するさまざまなTMS由来の糖の構造。ACN – 中性オリゴ糖を含むアセトニトリル画分、および FA – 酸性オリゴ糖を含むフェルラ酸画分。
図 S9 に示すように、オリゴ糖画分の LC-MS 分析から別の興味深い結論が得られました (方法は電子補足資料で参照できます)。ACN-B 画分のライゲーション中に、ヘキソースおよび -OAc 基の断片が繰り返し観察されました。この発見は、グライコームおよび MALDI-TOF 分析で観察された断片化を裏付けるだけでなく、前処理されたリグノセルロース系バイオマス中の潜在的な炭水化物誘導体に関する新しい情報も提供します。
また、TMS糖誘導体化を用いてオリゴ糖画分の糖組成も分析しました。GC-MSを使用して、オリゴ糖画分中の神経糖（非誘導体）および酸性糖（GluAおよびGalA）の組成を決定しました（図5）。グルクロン酸は酸性成分CおよびDに含まれ、ガラクツロン酸は酸性成分AおよびBに含まれており、どちらも酸性糖の高DP成分です。これらの結果は、ELISA および MALDI データを裏付けるだけでなく、オリゴ糖蓄積に関する以前の研究とも一致しています。したがって、オリゴ糖のビオチン化とそれに続く ELISA スクリーニングを使用する最新の免疫学的方法は、さまざまな生体サンプル中の可溶性難解なオリゴ糖を検出するのに十分であると考えられます。
ELISA ベースの mAb スクリーニング法はいくつかの異なる方法で検証されているため、この新しい定量法の可能性をさらに探求したいと考えました。2 つの市販のオリゴ糖、キシロ六糖オリゴ糖 (XHE) と 23-α-L-アラビノフラノシル-キシロトリオース (A2XX) を購入し、細胞壁グリカンを標的とする新しい mAb アプローチを使用してテストしました。図 6 は、ビオチン化結合シグナルとオリゴ糖濃度の対数濃度の間の直線相関を示し、ラングミュア吸着モデルの可能性を示唆しています。mAb の中で、CCRC-M137、CCRC-M138、CCRC-M147、CCRC-M148、および CCRC-M151 は XHE と相関し、CCRC-M108、CCRC-M109、および LM11 は 1 nm ～ 100 ナノの範囲で A2XX と相関しました。実験中に利用できる抗体が限られているため、各オリゴ糖濃度で限られた実験を実施しました。ここで、一部の抗体は、基質として同じオリゴ糖に対して非常に異なる反応を示すことに注意してください。これは、おそらくそれらがわずかに異なるエピトープに結合し、非常に異なる結合親和性を有する可能性があるためです。新しい mAb アプローチが実際のサンプルに適用される場合、正確なエピトープ同定のメカニズムと影響はさらに複雑になります。
2 つの市販のオリゴ糖を使用して、さまざまなグリカンを標的とする mAb の検出範囲を決定しました。ここで、オリゴ糖濃度の対数濃度との線形相関は、(A) mAb による XHE および (B) mAb による A2XX のラングミュア吸着パターンを示します。対応するエピトープは、アッセイで基質として使用される市販のオリゴ糖の構造を示します。
グリカンを標的としたモノクローナル抗体 (糖鎖分析または ELISA ベースの mAb スクリーニング) の使用は、植物バイオマスを構成する主要な細胞壁グリカンのほとんどを詳細に特性評価するための強力なツールです。ただし、ほとんどのオリゴ糖は ELISA プレートに効率的に固定化されていないため、従来のグリカン分析ではより大きな細胞壁グリカンのみが特徴付けられます。この研究では、AFEX で前処理されたトウモロコシ茎葉を高い固形分含有量で酵素的に加水分解しました。糖分析を使用して、加水分解物中の難解な細胞壁炭水化物の組成を決定しました。しかし、加水分解物中のより小さいオリゴ糖の mAb 分析は過小評価されており、ELISA プレート上にオリゴ糖を効果的に固定するには追加のツールが必要です。
我々はここで、オリゴ糖ビオチン化とそれに続く NeutrAvidin™ コーティングプレート上での ELISA スクリーニングを組み合わせることで、mAb スクリーニングのための新規かつ効率的なオリゴ糖固定化方法を報告します。固定化されたビオチン化オリゴ糖は、抗体に対して十分な親和性を示し、難解なオリゴ糖の迅速かつ効率的な検出を可能にしました。質量分析に基づくこれらの頑固なオリゴ糖の組成の分析により、免疫スクリーニングへのこの新しいアプローチの結果が確認されました。したがって、これらの研究は、オリゴ糖のビオチン化とグリカンを標的としたモノクローナル抗体による ELISA スクリーニングの組み合わせが、オリゴ糖の架橋の検出に使用でき、オリゴ糖の構造を特徴付ける他の生化学的研究に広く適用できることを示しています。
このビオチンベースのグリカンプロファイリング方法は、植物バイオマス中の可溶性オリゴ糖の難解な炭水化物結合を調査できる最初の報告です。これは、バイオ燃料の生産に関して、バイオマスの一部の部分がなぜそれほど頑固であるかを理解するのに役立ちます。この方法は、グライコーム分析方法における重要なギャップを埋め、その適用を植物オリゴ糖を超えて広範囲の基質に拡張します。将来的には、ビオチン化にロボット工学を使用し、ELISA を使用したサンプルのハイスループット分析のために開発した方法を使用する可能性があります。
パイオニア 33A14 ハイブリッド種子から栽培されたトウモロコシ ストロー (CS) は、コロラド州レイのクレイマー ファームから 2010 年に収穫されました。地主の許可があれば、このバイオマスを研究に使用することができます。 サンプルは、ジップロックバッグに入れ、湿度 6% 未満で室温で乾燥状態で保管されました。 サンプルは、ジップロックバッグに入れ、湿度 6% 未満で室温で乾燥状態で保管されました。 Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. サンプルは、ジッパー付き袋に入れ、湿度 6% 未満で室温で乾燥状態で保管されました。サンプルは、周囲温度で乾燥して＜６％の水分が密封袋内に存在した。サンプルを室温で乾燥 < 6% 6％未満。 サンプルはジッパー袋に入れて室温、湿度 < 6% で保存します。この研究は地方および国のガイドラインに準拠しました。NRELプロトコルを使用して組成分析を実行しました。この組成物は、３１．４％のグルカン、１８．７％のキシラン、３．３％のアラビナン、１．２％のガラクタン、２．２％のアセチル、１４．３％のリグニン、１．７％のタンパク質および１３．４％の灰分を含むことが判明した。
Cellic® CTec2 (138 mg タンパク質/ml、ロット VCNI 0001) は、Novozymes (Franklinton、NC、USA) 製のセルラーゼ、β-グルコシダーゼおよび Cellic® HTec2 (157 mg タンパク質/ml、ロット VHN00001) の複合混合物です。ペクチン分解酵素の複合ブレンドである Multifect Pectinase® (タンパク質 72 mg/mL) は、DuPont Industrial Biosciences (米国カリフォルニア州パロアルト) から寄贈されました。酵素タンパク質濃度は、ケルダール窒素分析 (AOAC メソッド 2001.11、Dairy One Cooperative Inc.、米国ニューヨーク州イサカ) を使用してタンパク質含有量を推定する (および非タンパク質窒素の寄与を差し引く) ことによって決定しました。珪藻土 545 は EMD Millipore (マサチューセッツ州ビレリカ) から購入しました。活性炭 (DARCO、100 メッシュ顆粒)、Avicel (PH-101)、ブナキシラン、およびその他すべての化学物質は Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。
AFEX 前処理は、GLBRC (バイオマス変換研究所、MSU、米国ミシガン州ランシング) で実施されました。前処理は１４０℃で１５分間行った。ステンレス鋼ベンチトップバッチ反応器（Parr Instruments Company）中、60％（w/w）装填で無水アンモニア対バイオマスの比率が1：1での滞留時間は46時間。30分かかりました。反応器を140℃に加熱すると、アンモニアが急速に放出され、バイオマスがすぐに室温に戻ることができました。AFEX 前処理トウモロコシ茎葉 (ACS) の組成は、未処理トウモロコシ茎葉 (UT-CS) の組成と類似していました。
高固形分 ACSH 25% (w/w) (デキストラン含有量約 8%) を、オリゴ糖の大規模生産のための出発物質として調製しました。ACSの酵素加水分解は、Cellic® Ctec2 10 mgタンパク質/gグルカン（前処理バイオマス中）、Htec2（Novozymes、Franklinton、NC）、5 mgタンパク質/gグルカン、およびMultifect Pectinase（Genencor Inc、USA）を含む市販の酵素混合物を使用して実行されました。）。）、タンパク質 5 mg/デキストラン 1 g。酵素加水分解は、作業容積 3 リットル、pH 4.8、50℃、250 rpm の 5 リットルバイオリアクター内で実行されました。９６時間加水分解した後、加水分解物を６０００ｒｐｍで３０分間、次いで１４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して集めて、未加水分解固体を除去した。次いで、加水分解物を０．２２ｍｍフィルタービーカーを通して滅菌濾過した。濾過した加水分解物を滅菌ボトルに４℃で保存し、次いで炭素上で分別した。
NREL の実験室分析手順に従った抽出物ベースのバイオマス サンプルの組成分析: 組成分析用のサンプルの調製 (NREL/TP-510-42620)、およびバイオマス中の構造炭水化物およびリグニンの測定 (NREL/TP-510 – 42618)47。
加水分解物ストリームのオリゴ糖分析は、オートクレーブベースの酸加水分解法を使用して 2 ml スケールで実行されました。加水分解物サンプルを 10 ml スクリューキャップ培養チューブ内で 69.7 μl の 72% 硫酸と混合し、121 °C のベンチトップで 1 時間インキュベートし、氷上で冷却し、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) バイアルに濾過します。オリゴ糖の濃度は、酸加水分解したサンプル中の総糖濃度から非加水分解したサンプル中の単糖の濃度を差し引くことによって決定した。
酸加水分解バイオマス中のグルコース、キシロース、およびアラビノース濃度は、オートサンプラー、カラムヒーター、定組成ポンプ、および Bio-Rad Aminex HPX-87H カラム上の屈折率検出器を備えた島津 HPLC システムを使用して分析されました。カラムを５０℃に維持し、０．６ｍｌ／分の５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４水溶液で溶出した。フロー。
加水分解物の上清を希釈し、モノマーとオリゴ糖の含有量を分析しました。酵素加水分解後に得られた単量体糖を、Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P カラムおよびアッシュガードカラムを備えた HPLC によって分析しました。カラム温度を８０℃に維持し、水を移動相として流速０．６ｍｌ／分で使用した。オリゴ糖は、参考文献に記載されている方法に従って、121℃で希酸中で加水分解することによって測定されました。41、48、49。
糖分析は、前述の手順 27、43、50、51 を使用して、生の、AFEX 前処理済み、およびすべての非加水分解バイオマス残渣 (連続細胞壁抽出物の生成およびその mAb スクリーニングを含む) に対して実行されました。グライコーム分析では、植物細胞壁物質のアルコール不溶性残留物をバイオマス残留物から調製し、シュウ酸アンモニウム (50 mM)、炭酸ナトリウム (50 mM、0.5% w/v)、CON などのより強力な試薬による連続抽出に供します。(1M および 4M、両方とも 1% w/v 水素化ホウ素ナトリウムを含む) および前述の酸性亜塩素酸塩 52,53。次に、抽出物を細胞壁グリカンに対する mAb50 の複合パネルに対する ELISA に供し、mAb 結合反応をヒート マップとして表示しました。植物細胞壁グリカンを標的とする mAb は、実験室ストック (CCRC、JIM、および MAC シリーズ) から購入しました。
オリゴ糖のワンステップビオチン化。炭水化物とビオチン-LC-ヒドラジドの結合は、以下の手順を使用して実行されました。ビオチン－ＬＣ－ヒドラジド（４．６ｍｇ／１２μｍｏｌ）を、激しく撹拌し、６５℃で１分間加熱することによってジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、７０μｌ）に溶解した。氷酢酸（３０μｌ）を加え、混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウム（６．４ｍｇ／１００μｍｏｌ）上に注ぎ、６５℃で約１分間加熱した後、完全に溶解した。次いで、５～８μｌの反応混合物を乾燥オリゴ糖（１～１００ｎｍｏｌ）に添加して、還元末端に対して１０倍以上モル過剰の標識を得た。反応を65℃で2時間実施し、その後サンプルを直ちに精製した。標識実験ではシアノ水素化ホウ素ナトリウムを還元せずに使用せず、サンプルを65℃で2.5時間反応させた。
ビオチン化オリゴ糖サンプルの ELISA コーティングと洗浄。25μlのビオチン化サンプル(5mlの0.1Mトリス緩衝液(TBS)で希釈した各濃縮サンプル100μl)をアビジンコートプレートの各ウェルに添加した。対照ウェルを、0.1M TBS中10μg/mlの濃度のビオチン50μlでコーティングした。脱イオン水をブランク測定のコーティングとして使用しました。錠剤を暗所、室温で２時間インキュベートした。プログラム番号 2 を使用して、0.1 M TBS 中の 0.1% スキムミルクでプレートを 3 回洗浄します。グルニエフラット3Aの場合は11。
一次抗体の添加と洗浄。40μlの一次抗体を各ウェルに加えます。マイクロプレートを暗所、室温で 1 時間インキュベートします。次いで、プレートを、Grenier Flat 3Aの洗浄プログラム#11を使用して、0.1M TBS中の0.1%ミルクで3回洗浄した。
二次抗体を加えて洗浄します。マウス/ラット二次抗体 (0.1 M TBS 中の 0.1% ミルクで 1:5000 に希釈) 50 μl を各ウェルに追加します。マイクロプレートを暗所、室温で 1 時間インキュベートします。次いで、マイクロプレートを、Grenier Flat 5A プレート洗浄プログラム #12 を使用して、0.1 M TBS 中の 0.1% ミルクで 5 回洗浄しました。
基材を追加します。ベース基板に 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン (TMB) 50 μl を追加します (バッファー 2 滴、TMB 3 滴、過酸化水素 2 滴を脱イオン水 15 ml に加えることによって)。TMB 基板を準備します。使用前にボルテックスしてください)。マイクロプレートを室温で 30 分間インキュベートします。暗闇で。
手順を完了してタブレットを読み取ります。1 N 硫酸 50 μl を各ウェルに加え、ELISA リーダーを使用して 450 ～ 655 nm の吸光度を記録します。
これらの分析対象物の 1 mg/ml 溶液を脱イオン水で調製します: アラビノース、ラムノース、フコース、キシロース、ガラクツロン酸 (GalA)、グルクロン酸 (GlcA)、マンノース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、N-アセチルマンノサミン (manNAc)、N-アセチルグルコサミン。(glcNAc)、N-アセチルガラクトサミン (galNAc)、イノシトール (内部標準)。表１に示す１ｍｇ／ｍＬ糖溶液を加えて２つの標準を調製した。サンプルを凍結し、すべての水分が除去されるまで（通常約１２〜１８時間）−８０℃で凍結乾燥する。
100 ～ 500 µg のサンプルを化学天秤のネジ蓋付きチューブに加えます。追加した金額を記録します。サンプルを特定の濃度の溶媒に溶解し、液体のアリコートとしてチューブに加えるのが最善です。各サンプルチューブの内部標準として 1 mg/ml イノシトール 20 μl を使用します。サンプルに添加される内部標準の量は、標準チューブに添加される内部標準の量と同じでなければなりません。
8 ml の無水メタノールをねじ蓋バイアルに加えます。次いで、４mlの３Nメタノール性HCl溶液を加え、蓋をして振盪した。このプロセスでは水を使用しません。
1 M HCl メタノール溶液 500 μl をオリゴ糖サンプルと標準 TMS チューブに加えます。サンプルをサーマルブロック内で80℃で一晩(168時間)インキュベートした。乾燥マニホールドを使用してメタノリシス生成物を室温で乾燥させます。200 μl MeOH を加え、再度乾燥させます。このプロセスを 2 回繰り返します。メタノール 200 μl、ピリジン 100 μl、無水酢酸 100 μl をサンプルに加え、よく混合します。サンプルを室温で 30 分間インキュベートしました。そして乾燥させた。メタノール 200 μl を加え、再度乾燥させます。
200μlのTri-Silを加え、キャップをしたチューブを20分間加熱します。80℃に加熱し、その後室温まで冷却します。乾燥マニホールドを使用して、サンプルを約 50 μl の量までさらに乾燥させます。サンプルを完全に乾燥させなかったことに注意することが重要です。
ヘキサン 2 ml を加え、ボルテックスしてよく混合します。直径 5-3/4 インチのピペットの上にグラスウールを挿入して、パスツール ピペット (5-8 mm) の先端をグラスウールで満たします。サンプルを 3000 g で 2 分間遠心分離しました。不溶性残留物は沈殿します。サンプルを 100 ～ 150 μl になるまで乾燥させます。約 1 μl の量を、初期温度 80 °C、初期時間 2.0 分で GC-MS に注入しました (表 2)。