Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Métode spektrométri imunologis sareng massa énggal pikeun analisa kompleks oligosakarida pengkuh dina stover jagung anu dirawat kalayan AFEX.Biomassa lignoselulosa mangrupikeun alternatif anu lestari pikeun bahan bakar fosil sareng seueur dianggo pikeun ngembangkeun biotéhnologi pikeun produksi produk sapertos tuangeun, pakan, suluh sareng bahan kimia.Konci pikeun téknologi ieu nyaéta pamekaran prosés anu kompetitif pikeun ngarobih karbohidrat kompléks anu aya dina témbok sél tutuwuhan janten gula sederhana sapertos glukosa, xilosa sareng arabinosa.Kusabab biomassa lignoselulosa nekad pisan, éta kedah dirawat ku perlakuan termokimia (contona, pengelupasan serat amonia (AFEX), asam éncér (DA), cairan ionik (IL)) sareng perlakuan biologis (contona, hidrolisis énzimatik sareng fermentasi mikroba) dina kombinasi pikeun kéngingkeun produk anu dipikahoyong..Nanging, nalika énzim jamur komérsial dianggo dina prosés hidrolisis, ngan 75-85% tina gula larut anu kabentuk nyaéta monosakarida, sareng 15-25% sésana nyaéta oligosakarida anu leyur, intractable, anu henteu salawasna sayogi pikeun mikroorganisme.Saméméhna, urang geus hasil ngasingkeun jeung dimurnikeun leyur oligosakarida nekad ngagunakeun kombinasi karbon jeung separation bumi diatomaceous jeung ukuran pangaluaran kromatografi, sarta ogé nalungtik sipat inhibitory énzim maranéhanana.Kami mendakan yén oligosakarida anu ngandung darajat polimérisasi (DP) substitusi asam uronik métilated langkung sesah diolah ku campuran énzim komérsial tibatan DP rendah sareng oligosakarida nétral.Di dieu urang ngalaporkeun pamakéan sababaraha métode tambahan, kaasup profil glycan maké antibodi monoklonal (mAbs) husus pikeun tutuwuhan glycans biomassa pikeun characterize beungkeut glycan dina témbok sél tutuwuhan jeung hidrolisat énzimatik, matrix-dibantuan ionisasi desorpsi laser, time-of-flight massspectrometry..MALDI-TOF-MS) ngagunakeun puncak diagnostik struktur-informatif diala ku spéktroskopi sanggeus buruk sekundér ion négatip, kromatografi gas jeung spéktrometri massa (GC-MS) pikeun characterize beungkeut oligosakarida kalawan jeung tanpa derivatization.Alatan ukuran leutik oligosakarida (DP 4-20), molekul ieu hésé dipaké pikeun mAb mengikat jeung karakterisasi.Pikeun ngatasi masalah ieu, kami nerapkeun metode immobilisasi oligosakarida dumasar-konjugasi biotin anyar anu suksés dilabélan mayoritas oligosakarida larut DP low dina permukaan microplate, anu teras dianggo dina sistem mAb throughput anu luhur pikeun analisa ligation khusus.Métode anyar ieu bakal ngagampangkeun pamekaran tés glikome throughput tinggi anu langkung maju di hareup anu tiasa dianggo pikeun ngasingkeun sareng ciri oligosakarida anu aya dina biomarker pikeun tujuan diagnostik.
Biomassa lignoselulosa, diwangun ku bahan tatanén, kehutanan, jukut jeung kai, mangrupa bahan pangan poténsial pikeun ngahasilkeun produk dumasar-bio, kaasup pangan, pakan, suluh jeung prékursor kimiawi pikeun ngahasilkeun produk nu leuwih luhur1.Karbohidrat (sapertos selulosa sareng hémiselulosa) anu aya dina témbok sél tutuwuhan didepolimérisasi janten monosakarida ku cara ngolah kimia sareng biotransformasi (sapertos hidrolisis énzimatik sareng fermentasi mikroba).Pra-perlakuan umum kaasup ékspansi serat amonia (AFEX), asam éncér (DA), cairan ionik (IL), jeung ledakan uap (SE), nu ngagunakeun kombinasi bahan kimia jeung panas pikeun ngurangan produksi lignoselulosa ku muka témbok sél tutuwuhan3,4.stubbornness zat, 5. Hidrolisis énzimatik dilumangsungkeun dina beban padet tinggi maké énzim komérsial-ngandung karbohidrat aktif (CAZymes) jeung fermentasi mikroba ngagunakeun ragi transgenik atawa baktéri pikeun ngahasilkeun suluh jeung bahan kimia dumasar-bio 6 .
CAZymes dina énzim komérsial diwangun ku campuran kompléks énzim anu sinergis meulah beungkeut karbohidrat-gula kompléks pikeun ngabentuk monosakarida2,7.Salaku urang dilaporkeun saméméhna, jaringan kompléks polimér aromatik lignin jeung karbohidrat ngajadikeun eta kacida intractable, nu ngakibatkeun konversi gula lengkep, accumulating 15-25% tina oligosakarida kelamin nu teu dihasilkeun salila hidrolisis énzimatik biomassa pretreated.Ieu masalah umum kalawan rupa métode pretreatment biomassa.Sababaraha alesan pikeun bottleneck ieu kalebet inhibisi énzim nalika hidrolisis, atanapi henteuna atanapi tingkat rendah énzim penting anu dipikabutuh pikeun megatkeun beungkeut gula dina biomassa tutuwuhan.Ngartos komposisi sareng ciri struktural gula, sapertos beungkeut gula dina oligosakarida, bakal ngabantosan urang ningkatkeun konversi gula salami hidrolisis, ngajantenkeun prosés biotéhnologis kompetitif sareng produk turunan minyak bumi.
Nangtukeun struktur karbohidrat téh nangtang sarta merlukeun kombinasi métode kayaning kromatografi cair (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 jeung mass spectrometry (MS)17., dalapan belas.Métode MS sapertos spéktrométri massa time-of-flight kalayan desorpsi laser sareng ionisasi nganggo matriks (MALDI-TOF-MS) mangrupikeun metode anu serbaguna pikeun ngaidentipikasi struktur karbohidrat.Anyar-anyar ieu, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS tina adducts ion natrium geus paling loba dipaké pikeun ngaidentipikasi sidik pakait jeung posisi kantétan oligosakarida, konfigurasi anomeric, runtuyan, sarta posisi branching 20, 21.
Analisis Glycan mangrupikeun alat anu saé pikeun idéntifikasi jero beungkeut karbohidrat22.Métode ieu ngagunakeun antibodi monoklonal (mAbs) anu diarahkeun pikeun melak glycan témbok sél salaku panyilidikan pikeun ngartos beungkeut karbohidrat kompléks.Leuwih ti 250 mAbs sadia di sakuliah dunya, dirancang ngalawan sagala rupa oligosakarida linier jeung cabang ngagunakeun rupa sakarida24.Sababaraha mAbs geus loba dipaké pikeun ciri struktur, komposisi, jeung modifikasi tina témbok sél tutuwuhan, sabab aya béda anu signifikan gumantung kana jenis sél tutuwuhan, organ, umur, tahap ngembangkeun, jeung lingkungan tumuwuh25,26.Nu leuwih anyar, métode ieu geus dipaké pikeun ngarti populasi vesicle dina tutuwuhan jeung sistem sasatoan sarta peran masing-masing dina angkutan glycan sakumaha ditangtukeun ku spidol subsélular, tahap ngembangkeun, atawa rangsangan lingkungan, sarta pikeun nangtukeun aktivitas énzimatik.Sababaraha struktur anu béda tina glycans sareng xylans anu parantos diidentifikasi kalebet pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans ikatan campuran (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbXgaan) sareng arabinoxylan (GArbX.
Sanajan kitu, sanajan sagala usaha panalungtikan ieu, ngan sababaraha studi geus fokus kana alam akumulasi oligosakarida salila hidrolisis beban padet tinggi (HSL), kaasup release oligosakarida, parobahan panjang ranté oligomeric salila hidrolisis, rupa-rupa polimér DP low, sarta kurva maranéhanana.sebaran 30,31,32.Samentara éta, sanajan analisis glycan geus kabuktian jadi alat mangpaat pikeun analisis komprehensif ngeunaan struktur glycan, hese evaluate oligosakarida DP low larut cai ngagunakeun métode antibodi.Oligosakarida DP anu langkung alit kalayan beurat molekul kirang ti 5-10 kDa henteu ngabeungkeut kana pelat ELISA 33, 34 sareng dikumbah sateuacan nambihan antibodi.
Di dieu, pikeun kahiji kalina, urang nunjukkeun hiji assay ELISA dina pelat avidin-coated maké antibodi monoklonal, ngagabungkeun prosedur biotinilasi hiji-hambalan pikeun oligosakarida refractory larut jeung analisis glikom.Pendekatan kami pikeun analisis glikom disahkeun ku MALDI-TOF-MS sareng analisis dumasar GC-MS tina beungkeutan oligosakarida pelengkap ngagunakeun derivatisasi trimethylsilyl (TMS) komposisi gula terhidrolisis.Pendekatan inovatif ieu tiasa dikembangkeun salaku padika high-throughput ka hareup sareng mendakan aplikasi anu langkung lega dina panalungtikan biomedis35.
Modifikasi pasca-translasi énzim sareng antibodi, sapertos glikosilasi,36 mangaruhan kagiatan biologisna.Contona, parobahan glikosilasi protéin sérum maénkeun peran penting dina radang rematik, sarta parobahan glikosilasi dipaké salaku spidol diagnostik37.Rupa-rupa glycans geus dilaporkeun dina literatur gampang muncul dina rupa-rupa kasakit, kaasup kasakit radang kronis saluran cerna jeung ati, inféksi viral, ovarium, payudara, sarta kanker prostat38,39,40.Ngartos struktur glycans nganggo metode glycan ELISA berbasis antibodi bakal masihan kapercayaan tambahan dina diagnosis panyakit tanpa ngagunakeun metode MS anu kompleks.
Ulikan kami saméméhna némbongkeun yén oligosakarida nekad tetep unhydrolyzed sanggeus pretreatment jeung hidrolisis énzimatik (Gambar 1).Dina karya urang saméméhna diterbitkeun, urang ngembangkeun hiji metode ékstraksi fase padet areng diaktipkeun pikeun ngasingkeun oligosakarida tina AFEX-pretreated jagung stover hydrolyzate (ACSH)8.Sanggeus ékstraksi awal jeung pamisahan, oligosakarida salajengna difraksinasi ku kromatografi pangaluaran ukuran (SEC) jeung dikumpulkeun dina urutan beurat molekul.Monomer gula jeung oligomér dileupaskeun tina rupa-rupa pretreatments dianalisis ku analisis komposisi gula.Lamun ngabandingkeun eusi oligomer gula diala ku rupa-rupa métode pretreatment, ayana oligosakarida nekad mangrupakeun masalah umum dina konversi biomassa kana monosakarida sarta bisa ngakibatkeun pangurangan dina ngahasilkeun gula sahenteuna 10-15% komo nepi ka 18%.URANG.Métode ieu dianggo pikeun produksi fraksi oligosakarida skala ageung.ACH anu dihasilkeun sarta fraksi saterusna kalawan beurat molekul béda dipaké salaku bahan eksperimen pikeun karakterisasi oligosakarida dina karya ieu.
Sanggeus pretreatment jeung hidrolisis énzimatik, oligosakarida pengkuh tetep unhydrolysed.Di dieu (A) mangrupakeun metoda separation oligosakarida nu oligosakarida diisolasi tina AFEX-pretreated jagong stover hydrolyzate (ACSH) ngagunakeun ranjang dipak karbon diaktipkeun jeung bumi diatomaceous;(B) Métode pikeun misahkeun oligosakarida.Oligosakarida salajengna dipisahkeun ku kromatografi pangaluaran ukuran (SEC);(C) Monomer sakarida sareng oligomér dileupaskeun tina sababaraha perlakuan awal (asam éncér: DA, cairan ionik: IL sareng AFEX).Kaayaan hidrolisis énzimatik: muatan padet tinggi 25% (w/w) (kurang leuwih 8% beban glukan), 96 jam hidrolisis, 20 mg/g muatan énzim komérsial (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) jeung (D) monomér gula jeung oligomer glukosa, xylose jeung arabinosa dileupaskeun tina AFEX presttreated AFEX .
Analisis Glycan geus kabuktian jadi alat mangpaat pikeun analisis struktural komprehensif glycans dina extracts diisolasi tina résidu biomassa padet.Tapi, sakarida larut cai kurang diwakilan nganggo metodeu tradisional ieu41 sabab oligosakarida beurat molekul rendah hese diammobilisasi dina pelat ELISA sareng dikumbah sateuacan tambahan antibodi.Ku alatan éta, pikeun ngariung jeung karakterisasi antibodi, métode biotinilasi hiji-hambalan dipaké pikeun coated leyur, oligosakarida non-patuh dina pelat ELISA coated avidin.Metoda ieu diuji ngagunakeun ACSH urang dihasilkeun saméméhna sarta fraksi dumasar kana beurat molekul na (atawa darajat polimérisasi, DP).Hiji-hambalan biotinilasi dipaké pikeun ngaronjatkeun oligosakarida mengikat pangirut ku nambahkeun biotin-LC-hydrazide kana tungtung ngurangan karbohidrat (Gbr. 2).Dina leyuran, gugus hémiacetal dina tungtung réduksi meta jeung gugus hidrazida biotin-LC-hidrazida pikeun ngabentuk beungkeut hidrazon.Ku ayana agén pangréduksi NaCNBH3, beungkeut hidrazon diréduksi jadi produk tungtung biotinilasi anu stabil.Kalayan modifikasi tungtung pangurangan gula, ngariung oligosakarida DP rendah kana pelat ELISA janten mungkin, sareng dina pangajaran urang ieu dilakukeun dina pelat anu dilapis avidin nganggo mAbs sasaran glycan.
Saringan antibodi monoklonal dumasar kana ELISA pikeun oligosakarida biotinilasi.Di dieu (A) gabungan biotinilasi oligosakarida sareng saringan ELISA salajengna sareng mAbs sasaran glycan dina pelat dilapis NeutrAvidin sareng (B) nunjukkeun prosedur hiji-léngkah pikeun biotinilasi produk réaksi.
Pelat anu dilapis Avidin sareng antibodi konjugasi oligosakarida teras diasupkeun kana antibodi primér sareng sekundér sareng dikumbah dina medium anu sénsitip cahaya sareng waktos.Saatos beungkeutan antibodi réngsé, tambahkeun substrat TMB pikeun ngainkubasi piring.Réaksi ahirna dieureunkeun ku asam sulfat.Pelat anu diinkubasi dianalisis nganggo pamaca ELISA pikeun nangtukeun kakuatan beungkeutan unggal antibodi pikeun ngadeteksi cross-linking khusus antibodi.Pikeun detil sareng parameter percobaan, tingali bagian anu cocog "Bahan sareng Métode".
Kami nunjukkeun utilitas metodeu anu nembé dikembangkeun pikeun aplikasi khusus ku cara ngacirian oligosakarida larut anu aya dina ACSH ogé dina fraksi oligosakarida anu dimurnikeun sareng diisolasi tina hidrolisat lignoselulosa.Ditémbongkeun saperti dina Gambar 3, xylans diganti epitope paling umum dicirikeun dina ACSH ngagunakeun métode bioacylated glycome assay biasana uronic (U) atawa methyluronic (MeU) jeung pectic arabinogalactans.Kaseueuranana ogé dipendakan dina panilitian urang sateuacana ngeunaan analisa glycans tina padet non-hidrolisis (UHS)43.
Deteksi épitopes oligosakarida recalcitrant maké antibodi monoklonal diarahkeun ka glycan témbok sél.Fraksi "nétral" nyaéta fraksi ACN sareng fraksi "asam" nyaéta fraksi FA.Beureum caang dina peta panas nunjukkeun eusi epitope nu leuwih luhur, jeung biru caang nunjukkeun latar kosong.Nilai warna dina skala dumasar kana nilai OD atah pikeun formulasi N=2.Epitopes utama anu dikenal ku antibodi dipidangkeun di sisi katuhu.
Struktur non-selulosa ieu teu bisa dibeulah ku sélulase paling umum jeung hémiselulase dina campuran énzim komérsial diuji, nu ngawengku énzim komersil paling ilahar dipake.Ku alatan éta, énzim bantu anyar diperlukeun pikeun hidrolisis maranéhanana.Tanpa énzim aksésori non-selulosa anu diperlukeun, beungkeut non-selulosa ieu nyegah konversi lengkep jadi monosakarida, sanajan polimér gula indungna sacara éksténsif dihidrolisis jadi fragmen pondok tur leyur maké campuran énzim komérsial.
Ulikan salajengna ngeunaan sebaran sinyal jeung kakuatan beungkeut na némbongkeun yén epitopes mengikat éta handap dina fraksi gula DP tinggi (A, B, C, DP nepi ka 20+) ti fraksi DP low (D, E, F, DP) dina dimer) (Gbr. 1).Sempalan asam langkung umum dina épitop non-selulosa tibatan sempalan nétral.Fenomena ieu konsisten sareng pola anu dititénan dina panilitian urang sateuacana, dimana DP tinggi sareng gugus asam langkung tahan ka hidrolisis énzimatik.Ku alatan éta, ayana epitopes glycan non-selulosa jeung substitusi U jeung MeU bisa greatly nyumbang kana stabilitas oligosakarida.Perlu dicatet yén efisiensi beungkeutan sareng deteksi tiasa janten masalah pikeun oligosakarida DP rendah, khususna upami epitope mangrupikeun oligosakarida dimérik atanapi trimérik.Ieu bisa diuji maké oligosakarida komérsial tina panjangna béda, unggal ngandung ngan hiji epitope nu ngiket ka mAb husus.
Ku kituna, pamakéan antibodi struktur-spésifik ngungkabkeun sababaraha jenis beungkeut recalcitrant.Gumantung kana jinis antibodi anu dianggo, pola ligasi anu pas, sareng kakuatan sinyal anu dihasilkeunana (pangleutikna sareng sakedik seueur), énzim énggal tiasa diidentifikasi sareng nambihan semi-kuantitatif kana campuran énzim pikeun konversi glikogén anu langkung lengkep.Nyandak analisa oligosakarida ACSH sabagé conto, urang tiasa nyiptakeun database beungkeut glycan pikeun unggal bahan biomassa.Ieu kudu dicatet yén pangirut béda antibodi kudu dibawa kana rekening, sarta lamun pangirut maranéhanana henteu dipikawanoh, ieu bakal nyieun kasusah tangtu lamun ngabandingkeun sinyal antibodi béda.Salaku tambahan, ngabandingkeun beungkeut glycan tiasa dianggo pangsaéna antara conto pikeun antibodi anu sami.Beungkeut nekad ieu teras tiasa dikaitkeun kana pangkalan data CAZyme, dimana urang tiasa ngaidentipikasi énzim, milih calon énzim sareng nguji énzim pemecah beungkeut, atanapi ngembangkeun sistem mikroba pikeun nganyatakeun énzim ieu pikeun dianggo dina biorefineries44.
Pikeun evaluate kumaha métode immunological ngalengkepan métode alternatif pikeun characterizing oligosakarida beurat molekul low hadir dina hidrolisat lignoselulosa, kami dipigawé MALDI (Gbr. 4, S1-S8) jeung analisis sakarida TMS-turunan dumasar kana GC-MS dina panel sarua (Gbr. 5) bagian oligosakarida.MALDI dianggo pikeun ngabandingkeun naha distribusi massa molekul oligosakarida cocog sareng struktur anu dimaksud.Dina Gbr.4 nembongkeun MC komponén nétral ACN-A jeung ACN-B.Analisis ACN-A dikonfirmasi sauntuyan gula pentosa mimitian ti DP 4-8 (Gbr. 4) nepi ka DP 22 (Gbr. S1), anu beurat pakait jeung oligosakarida MeU-xylan.Analisis ACN-B dikonfirmasi séri pentosa sareng glukoksilan kalayan DP 8-15.Dina bahan tambahan sapertos Gambar S3, peta distribusi massa gugus asam FA-C nunjukkeun sauntuyan (Me) U diganti gula pentosa kalayan DP 8-15 anu konsisten sareng xylan anu disubstitusi anu aya dina saringan mAb basis ELISA.Epitopes konsisten.
Séktrum MALDI-MS tina oligosakarida anu teu patuh larut anu aya dina ACS.Di dieu, (A) ACN-A fraksi rentang beurat low ngandung asam uronik métilated (DP 4-8) diganti glucuroxylan oligosakarida jeung (B) ACN-B xylan na methylated asam uronik oligosakarida diganti ku glucuroxylan (DP 8-15).
Analisis komposisi résidu glycan oligosakarida refractory.Di dieu (A) komposisi sakarida TMS rupa-rupa fraksi oligosakarida diala ngagunakeun analisis GC-MS.(B) Struktur rupa-rupa gula turunan TMS anu aya dina oligosakarida.ACN - fraksi acetonitrile ngandung oligosakarida nétral jeung FA - fraksi asam ferulic ngandung oligosakarida asam.
Kacindekan sejen metot ieu dicokot tina analisis LC-MS tina fraksi oligosakarida, ditémbongkeun saperti dina Gambar S9 (metode bisa ditempo dina bahan tambahan éléktronik).Fragmen héksosa sareng gugus -OAc dititénan sababaraha kali salami ligasi fraksi ACN-B.Pananjung ieu henteu ngan ukur negeskeun fragméntasi anu dititénan dina analisis glikom sareng MALDI-TOF, tapi ogé nyayogikeun inpormasi anyar ngeunaan turunan karbohidrat poténsial dina biomassa lignoselulosa anu parantos dirawat.
Kami ogé nganalisis komposisi gula tina fraksi oligosakarida ngagunakeun derivatisasi gula TMS.Ngagunakeun GC-MS, urang nangtukeun komposisi neural (non-turunan) jeung gula asam (GluA na GalA) dina fraksi oligosakarida (Gbr. 5).Asam glukuronat kapanggih dina komponén asam C jeung D, sedengkeun asam galacturonic kapanggih dina komponén asam A jeung B, duanana mangrupakeun komponén DP tinggi gula asam.Hasil ieu henteu ngan ukur ngonfirmasi data ELISA sareng MALDI kami, tapi ogé konsisten sareng studi saméméhna ngeunaan akumulasi oligosakarida.Ku alatan éta, kami yakin yén métode imunologis modern ngagunakeun biotinilasi oligosakarida jeung screening ELISA saterusna cukup pikeun ngadeteksi oligosakarida recalcitrant leyur dina sagala rupa sampel biologis.
Kusabab métode screening mAb basis ELISA geus disahkeun ku sababaraha métode béda, urang hayang salajengna ngajajah poténsi metoda kuantitatif anyar ieu.Dua oligosakarida komérsial, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) jeung 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), dibeuli jeung diuji maké pendekatan mAb anyar nargétkeun glycan témbok sél.Gambar 6 nembongkeun korelasi linier antara sinyal mengikat biotinilasi jeung konsentrasi log konsentrasi oligosakarida, suggesting model adsorption Langmuir mungkin.Diantara mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, sareng CCRC-M151 pakait sareng XHE, sareng CCRC-M108, CCRC-M109, sareng LM11 pakait sareng A2XX dina rentang 1 nm dugi ka 100 nano.Alatan kasadiaan kawates antibodi salila percobaan, percobaan kawates dipigawé kalawan unggal konsentrasi oligosakarida.Ieu kudu dicatet yén sababaraha antibodi meta béda pisan ka oligosakarida sarua salaku substrat, presumably sabab ngabeungkeut epitopes rada béda jeung bisa mibanda affinities mengikat pisan béda.Mékanisme jeung implikasi tina idéntifikasi epitope akurat bakal leuwih kompleks lamun pendekatan mAb anyar dilarapkeun ka sampel nyata.
Dua oligosakarida komérsial dipaké pikeun nangtukeun rentang deteksi rupa-rupa mAbs glycan-targeting.Di dieu, korelasi linier kalawan konsentrasi log konsentrasi oligosakarida nunjukkeun pola adsorpsi Langmuir pikeun (A) XHE kalawan mAb sarta (B) A2XX kalawan mAb.Epitopes pakait nunjukkeun struktur oligosakarida komérsial dipaké salaku substrat dina assay nu.
Pamakéan antibodi monoklonal sasaran glycan (analisis glikomik atanapi saringan mAb berbasis ELISA) mangrupikeun alat anu kuat pikeun karakterisasi jero kalolobaan glycans témbok sél utama anu ngawangun biomassa tutuwuhan.Sanajan kitu, analisis glycan klasik ngan ciri glycans témbok sél nu leuwih gede, sabab lolobana oligosakarida teu éfisién immobilized dina piring ELISA.Dina ulikan ieu, AFEX-pretreated jagong stover ieu énzimatik dihidrolisis dina kandungan padet tinggi.Analisis gula digunakeun pikeun nangtukeun komposisi karbohidrat témbok sél recalcitrant dina hidrolisat.Sanajan kitu, analisis mAb oligosakarida leutik dina hidrolisat ieu underestimated, sarta parabot tambahan diperlukeun pikeun éféktif immobilize oligosakarida dina pelat ELISA.
Kami ngalaporkeun di dieu metode immobilisasi oligosakarida anu énggal sareng efisien pikeun saringan mAb ku ngagabungkeun biotinilasi oligosakarida dituturkeun ku saringan ELISA dina pelat anu dilapis NeutrAvidin™.The oligosakarida biotinilasi immobilized némbongkeun pangirut cukup keur antibodi sangkan deteksi gancang tur efisien oligosakarida recalcitrant.Analisis komposisi oligosakarida nekad ieu dumasar kana spéktrométri massa dikonfirmasi hasil pendekatan anyar ieu pikeun immunoscreening.Ku kituna, panilitian ieu nunjukkeun yén kombinasi biotinilasi oligosakarida sareng saringan ELISA sareng antibodi monoklonal sasaran glycan tiasa dianggo pikeun ngadeteksi crosslinks dina oligosakarida sareng tiasa diterapkeun sacara lega dina kajian biokimia sanés anu ngagambarkeun struktur oligosakarida.
Métode profiling glycan berbasis biotin ieu mangrupikeun laporan munggaran anu tiasa nalungtik beungkeut karbohidrat recalcitrant tina oligosakarida larut dina biomassa tutuwuhan.Ieu ngabantuan ngartos naha sababaraha bagian biomassa nekad pisan dina produksi biofuel.Métode ieu ngeusian jurang anu penting dina métode analisis glikom sareng ngalegaan aplikasina ka sajumlah substrat anu langkung ageung saluareun oligosakarida tutuwuhan.Ka hareupna, urang tiasa nganggo robotika pikeun biotinilasi sareng nganggo metodeu anu parantos dikembangkeun pikeun nganalisa conto-throughput tinggi nganggo ELISA.
Jarami jagung (CS) dipelak tina siki hibrid Pioneer 33A14 dipanén taun 2010 ti Kramer Farms di Ray, Colorado.Kalawan idin ti nu boga lahan, biomassa ieu bisa dipaké pikeun panalungtikan. Sampel disimpen garing <6% Uap dina kantong zip-lock dina suhu kamar. Sampel disimpen garing <6% Uap dina kantong zip-lock dina suhu kamar. Образцы хранились сухими при влажности < 6% dina пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Sampel disimpen garing dina kalembaban <6% dina kantong seleting dina suhu kamar.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Sampel disimpen dina kantong seleting dina suhu kamar kalayan kalembaban <6%.Panalitian saluyu sareng pedoman lokal sareng nasional.Analisis komposisi dilaksanakeun nganggo protokol NREL.Komposisi kapanggih ngandung 31,4% glukan, 18,7% xilan, 3,3% arabinan, 1,2% galaktan, 2,2% asetil, 14,3% lignin, 1,7% protéin jeung 13,4% lebu.
Cellic® CTec2 (138 mg protéin / ml, pisan VCNI 0001) mangrupakeun campuran kompléks cellulase, β-glucosidase jeung Cellic® HTec2 (157 mg protéin / ml, loba VHN00001) ti Novozymes (Franklinton, NC, AS)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), adun kompléks énzim pectin degrading, disumbangkeun ku DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, AS).Konsentrasi protéin énzim ditangtukeun ku estimasi eusi protéin (jeung ngurangan kontribusi nitrogén non-protéin) ngagunakeun analisis nitrogén Kjeldahl (métode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Bumi diatomaceous 545 dibeuli ti EMD Millipore (Billerica, MA).Karbon diaktipkeun (DARCO, 100 bolong granules), Avicel (PH-101), beech xylan, sarta sakabeh bahan kimia sejenna dibeuli ti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Pretreatment AFEX dilaksanakeun di GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, AS).Pra-perlakuan dilumangsungkeun dina 140 ° C. salila 15 menit.46 waktos tinggal dina rasio 1: 1 amonia anhidrat ka biomassa dina 60% (w / w) loading dina reaktor bets benchtop stainless steel (Parr Instruments Company).Butuh waktu 30 menit.Réaktor dibawa ka 140 ° C jeung amonia gancang dileupaskeun, sahingga biomassa gancang balik deui ka suhu kamar.Komposisi AFEX pre-treated corn stover (ACS) éta sarupa jeung untreated corn stover (UT-CS).
Padet tinggi ACSH 25% (w/w) (kurang leuwih 8% dextran loading) disiapkeun salaku bahan awal pikeun produksi skala badag oligosakarida.Hidrolisis énzimatik ACS dipigawé maké campuran énzim komérsial kaasup Cellic® Ctec2 10 mg protéin / g glucan (dina biomassa pretreated), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protéin / g glucan, sarta Multifect Pectinase (Genencor Inc, AS).).), 5 mg protéin / g dekstran.Hidrolisis énzimatik dilaksanakeun dina bioréaktor 5 liter kalayan volume kerja 3 liter, pH 4,8, 50 ° C sareng 250 rpm.Sanggeus hidrolisis salila 96 jam, hidrolisat dikumpulkeun ku sentrifugasi dina 6000 rpm salila 30 menit lajeng dina 14000 rpm salila 30 menit pikeun miceun padet unhydrolysed.Hidrolisat teras disaring steril ngaliwatan beaker saringan 0,22 mm.Hidrolisat anu disaring disimpen dina botol steril dina suhu 4 ° C. teras difraksinasi dina karbon.
Analisis komposisi sampel biomassa dumasar-ekstrak nurutkeun prosedur analisis laboratorium NREL: persiapan sampel pikeun analisis komposisi (NREL/TP-510-42620) jeung nangtukeun karbohidrat struktural jeung lignin dina biomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analisis oligosakarida tina aliran hidrolisat dilaksanakeun dina skala 2 ml ngagunakeun metode hidrolisis asam dumasar-autoklaf.Campur sampel hidrolisat sareng 69,7 µl asam sulfat 72% dina tabung kultur tutup screw 10 ml sareng inkubasi salami 1 jam dina benchtop dina suhu 121 °C, tiis dina és sareng saring kana vial kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).Konsentrasi oligosakarida ditangtukeun ku cara ngurangan konsentrasi monosakarida dina sampel non-hidrolisis tina total konsentrasi gula dina sampel asam-hidrolisis.
Konsentrasi glukosa, xilosa, sareng arabinosa dina biomassa asam dihidrolisis dianalisis nganggo sistem HPLC Shimadzu anu dilengkepan ku autosampler, pemanas kolom, pompa isocratic, sareng detektor indéks réfraktif dina kolom Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolom dijaga dina suhu 50 ° C sareng dielusi ku 0,6 ml / mnt 5 mM H2SO4 dina cai.ngalir.
Supernatan hidrolisat diencerkeun sareng dianalisis pikeun eusi monomér sareng oligosakarida.Gula monomérik diala sanggeus hidrolisis énzimatik dianalisis ku HPLC dilengkepan kolom Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P jeung kolom ash guard.Suhu kolom dijaga dina 80 ° C, cai dianggo salaku fase gerak kalayan laju aliran 0,6 ml / mnt.Oligosakarida ditangtukeun ku hidrolisis dina asam éncér dina 121 ° C nurutkeun métode anu dijelaskeun dina ref.41, 48, 49.
Analisis sakarida dipigawé dina atah, AFEX pre-diolah jeung sakabéh résidu biomassa non-hidrolisis (kaasup produksi ékstrak témbok sél serial jeung screening mAb maranéhanana) ngagunakeun prosedur ditétélakeun saméméhna 27, 43, 50, 51.Pikeun analisa glikome, résidu anu teu larut alkohol tina bahan témbok sél tutuwuhan disiapkeun tina résidu biomassa sareng diekstraksi séri kalayan réagen anu langkung agrésif sapertos amonium oksalat (50 mM), natrium karbonat (50 mM sareng 0,5% w / v), CON.(1M jeung 4M, duanana mibanda 1% w/v natrium borohidrida) jeung asam klorit sakumaha ditétélakeun saméméhna52,53.Ékstrak teras dipasihan ELISA ngalawan panel kompleks mAb50s anu diarahkeun ka glycan témbok sél, sareng réaksi beungkeutan mAb dibere salaku peta panas.mAbs nargétkeun glycan témbok sél tutuwuhan dibeuli ti saham laboratorium (CCRC, JIM jeung MAC runtuyan).
Biotinilasi hiji-léngkah oligosakarida.Konjugasi karbohidrat sareng biotin-LC-hydrazide dilaksanakeun nganggo prosedur ieu.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) ieu leyur dina dimétil sulfoxide (DMSO, 70 μl) ku vigorous aduk jeung pemanasan dina 65 ° C. pikeun 1 mnt.asam asétat glasial (30 µl) ditambahkeun jeung campuran ieu dituang kana natrium cyanoborohydride (6,4 mg/100 µmol) jeung sagemblengna leyur sanggeus dipanaskeun dina 65 ° C salila kira 1 menit.Lajeng, ti 5 nepi ka 8 μl campuran réaksi ditambahkeun kana oligosakarida garing (1-100 nmol) pikeun ménta kaleuwihan 10-melu atawa leuwih molar tina labél dina tungtung ngurangan.Réaksi dilaksanakeun dina 65 ° C salami 2 jam, saatos éta sampel langsung dimurnikeun.Taya natrium sianoborohidrida dipaké dina percobaan labél tanpa réduksi, sarta sampel anu diréaksikeun dina 65 ° C. salila 2,5 jam.
Lapisan ELISA sareng cuci sampel oligosakarida biotinilasi.25 μl sampel biotinilasi (100 μl unggal sampel kentel éncér dina 5 ml 0,1 M Tris buffer solution (TBS)) ditambahkeun kana unggal sumur tina piring avidin-coated.Sumur kontrol dilapis ku 50 μl biotin dina konsentrasi 10 μg/ml dina 0,1 M TBS.Cai deionized dipaké salaku palapis pikeun pangukuran kosong.Tablet diinkubasi salami 2 jam dina suhu kamar di tempat anu poék.Ngumbah piring 3 kali kalayan susu skim 0,1% dina 0,1 M TBS ngagunakeun program No.11 pikeun Grenier datar 3A.
Nambahan sareng ngumbah antibodi primér.Tambahkeun 40 µl antibodi primér ka unggal sumur.Inkubasi microplate salila 1 jam dina suhu kamar dina poék.Piring lajeng dikumbah 3 kali kalayan susu 0,1% dina 0,1M TBS ngagunakeun program nyeuseuh #11 pikeun Grenier Datar 3A.
Tambahkeun antibodi sekundér jeung ngumbah.Tambahkeun 50 µl antibodi sékundér beurit/beurit (diencerkeun 1:5000 dina susu 0,1% dina 0,1 M TBS) ka unggal sumur.Inkubasi microplate salila 1 jam dina suhu kamar dina poék.The microplates lajeng dikumbah 5 kali kalawan susu 0,1% dina 0,1 M TBS ngagunakeun Grenier Datar 5A plat program nyeuseuh #12.
Nambahkeun substrat.Tambahkeun 50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) kana substrat dasar (ku cara nambahkeun 2 tetes buffer, 3 tetes TMB, 2 tetes hidrogén péroxida ka 15 ml cai deionized).Nyiapkeun substrat TMB.sareng vortex sateuacan dianggo).Inkubasi microplate dina suhu kamar salila 30 menit.Di nu poek.
Lengkepan léngkah sareng baca tablet.Tambahkeun 50 µl asam sulfat 1 N ka unggal sumur tur catet absorbance ti 450 nepi ka 655 nm maké ELISA reader.
Siapkan 1 mg/ml larutan analit ini dalam air terdeionisasi: arabinosa, rhamnosa, fukosa, xilosa, asam galakturonat (GalA), asam glukuronat (GlcA), manosa, glukosa, galaktosa, laktosa, N-asetilmannosamin (manNAc), N-asetilglukosamin.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standar internal).Dua standar anu disiapkeun ku nambahkeun 1 mg / ml solusi gula ditémbongkeun dina Table 1. Sampel beku sarta lyophilized dina -80 ° C. nepi ka sakabéh cai dipiceun (biasana ngeunaan 12-18 jam).
Tambahkeun 100–500 µg sampel ka screw cap tube dina neraca analitik.Catet jumlah ditambahkeun.Hadé pisan mun éta ngaleyurkeun sampel dina konsentrasi husus pangleyur tur nambahkeun kana tabung salaku aliquot cair.Anggo 20 µl inositol 1 mg/ml salaku standar internal pikeun tiap tabung sampel.Jumlah standar internal ditambahkeun kana sampel kudu sarua jeung jumlah standar internal ditambahkeun kana tabung baku.
Tambahkeun 8 ml métanol anhidrat kana vial tutup screw.Lajeng 4 ml 3 N. leyuran HCl métanolik, capped jeung shaken.Proses ieu henteu nganggo cai.
Tambahkeun 500 µl larutan métanol HCl 1 M kana sampel oligosakarida jeung tabung TMS standar.Sampel diinkubasi sapeuting (168 jam) dina 80 ° C. dina blok termal.Tegalan produk métanolisis dina suhu kamar maké manifold drying.Tambahkeun 200 µl MeOH jeung garing deui.Prosés ieu diulang dua kali.Tambahkeun 200 µl métanol, 100 µl piridin jeung 100 µl anhidrida asetat kana sampel sarta aduk rata.Sampel diinkubasi dina suhu kamar salami 30 menit.jeung garing.Tambahkeun 200 µl métanol jeung garing deui.
Tambahkeun 200 µl Tri-Sil sareng tabung anu ditutupan panas salami 20 menit.80 ° C, teras tiis kana suhu kamar.Paké manifold drying jang meberkeun garing sampel nepi ka volume kira 50 µl.Penting pikeun dicatet yén kami henteu ngijinkeun conto garing lengkep.
Tambahkeun 2 ml heksana jeung mix ogé ku vortexing.Eusian ujung pipettes Pasteur (5-8 mm) ku sapotong kaca wool ku cara ngasupkeun kaca wool dina luhureun pipette diaméterna 5-3/4 inci.Sampel disentrifugasi dina 3000 g salila 2 menit.Sakur résidu anu teu larut diéndapan.Tegalan sampel nepi ka 100-150 µl.Volume kira-kira 1 μl disuntikkeun kana GC-MS dina suhu awal 80 °C sareng waktos awal 2.0 menit (Tabel 2).