Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет.Сіз пайдаланып жатқан шолғыш нұсқасында шектеулі CSS қолдауы бар.Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз).Әзірше, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
AFEX алдын ала өңделген жүгері пешіндегі тұрақты олигосахаридтерді кешенді талдаудың жаңа иммунологиялық және масс-спектрометриялық әдістері.Лигноцеллюлозды биомасса қазба отындарына тұрақты балама болып табылады және тамақ, жем, отын және химиялық заттар сияқты өнімдерді өндіру үшін биотехнологияларды әзірлеу үшін кеңінен қолданылады.Бұл технологиялардың кілті өсімдік жасушасының қабырғаларында болатын күрделі көмірсуларды глюкоза, ксилоза және арабиноза сияқты қарапайым қанттарға айналдыру үшін бәсекеге қабілетті процестерді дамыту болып табылады.Лигноцеллюлозды биомасса өте қыңыр болғандықтан, қажетті өнімді алу үшін термохимиялық өңдеулерге (мысалы, аммиак талшығының қабыршақтануы (AFEX), сұйылтылған қышқылдар (DA), иондық сұйықтықтар (IL)) және биологиялық өңдеулерге (мысалы, ферментативті гидролиз және микробтық ашыту) араласу керек..Алайда, гидролиз процесінде коммерциялық саңырауқұлақ ферменттерін пайдаланған кезде түзілетін еритін қанттардың тек 75-85% моносахаридтер, ал қалған 15-25% микроорганизмдер үшін әрқашан бола бермейтін еритін, ерімейтін олигосахаридтер.Бұрын біз көміртекті және диатомды жерді бөлу және өлшемді алып тастау хроматографиясының комбинациясын қолдана отырып, еритін қыңыр олигосахаридтерді сәтті оқшаулап, тазарттық, сонымен қатар олардың ферменттерін тежеу ​​қасиеттерін зерттедік.Құрамында полимерленудің жоғары дәрежесі бар олигосахаридтерді метилденген урон қышқылының алмастырулары төмен DP және бейтарап олигосахаридтерге қарағанда коммерциялық фермент қоспаларымен өңдеу қиынырақ екенін анықтадық.Мұнда біз өсімдік жасушасының қабырғалары мен ферменттік гидролизаттардағы гликандық байланыстарды сипаттау үшін өсімдік биомасса гликандарына тән моноклоналды антиденелерді (mAbs) пайдалана отырып, гликан профилін жасауды, матрица көмегімен лазерлік десорбция ионизациясын, ұшу уақытының масс-спектрометриясын қоса бірнеше қосымша әдістерді қолдану туралы хабарлаймыз..MALDI-TOF-MS) теріс иондардың қайталама ыдырауынан кейін спектроскопия арқылы алынған құрылымдық-ақпараттық диагностикалық шыңдарды, газ хроматографиясын және масс-спектрометрияны (GC-MS) туындыланатын және жоқ олигосахаридтік байланыстарды сипаттау үшін пайдаланады.Олигосахаридтердің (DP 4–20) шағын мөлшеріне байланысты бұл молекулаларды mAb байланыстыру және сипаттау үшін пайдалану қиын.Бұл мәселені шешу үшін біз биотин конъюгациясы негізінде олигосахаридтерді иммобилизациялаудың жаңа әдісін қолдандық, ол микропластинаның бетінде төмен DP еритін олигосахаридтердің көпшілігін сәтті белгіледі, содан кейін ол арнайы байлау талдауы үшін жоғары өткізу қабілетті mAb жүйесінде қолданылды.Бұл жаңа әдіс болашақта диагностикалық мақсаттарда биомаркерлерде бар олигосахаридтерді оқшаулау және сипаттау үшін пайдаланылуы мүмкін неғұрлым жетілдірілген жоғары өткізу қабілеттілігі бар гликомдық талдауларды әзірлеуді жеңілдетеді.
Ауыл шаруашылығы, орман шаруашылығы, шөп және ағаш материалдарынан тұратын лигноцеллюлозды биомасса био-негізделген өнімдерді, соның ішінде азық-түлікті, жемшөпті, отынды және жоғары құнды өнімдерді өндіру үшін химиялық прекурсорларды өндіру үшін әлеуетті шикізат болып табылады.Өсімдік жасушасының қабырғаларында болатын көмірсулар (мысалы, целлюлоза және гемицеллюлоза) химиялық өңдеу және биотрансформация (ферменттік гидролиз және микробтық ашыту сияқты) арқылы моносахаридтерге деполимерленеді.Жалпы алдын ала өңдеуге аммиак талшықтарының кеңеюі (AFEX), сұйылтылған қышқыл (DA), иондық сұйықтық (IL) және бу жарылысы (SE) жатады, олар өсімдік жасушаларының қабырғаларын ашу арқылы лигноцеллюлоза өндірісін азайту үшін химиялық заттар мен жылу комбинациясын пайдаланады3,4.заттың қыңырлығы, 5. Ферментативті гидролиз коммерциялық белсенді көмірсулары бар ферменттерді (CAZymes) және био негізіндегі отын мен химиялық заттарды алу үшін трансгенді ашытқыларды немесе бактерияларды пайдалана отырып микробтық ашытуды пайдалана отырып, қатты заттардың жоғары жүктемесінде жүзеге асырылады 6 .
Коммерциялық ферменттердегі CAZymes моносахаридтер түзу үшін күрделі көмірсу-қант байланыстарын синергетикалық түрде ыдырататын ферменттердің күрделі қоспасынан тұрады2,7.Бұрын хабарлағанымыздай, көмірсулары бар лигниннің хош иісті полимерлерінің күрделі желісі оларды өте төзімді етеді, бұл қанттың толық емес конверсиясына әкеледі, алдын ала өңделген биомассаның ферментативті гидролизі кезінде түзілмейтін жыныстық олигосахаридтердің 15-25% жинақтайды.Бұл әртүрлі биомассаны алдын ала өңдеу әдістерімен жиі кездесетін мәселе.Бұл кедергінің кейбір себептеріне гидролиз кезінде ферментті тежеу ​​немесе өсімдік биомассасындағы қант байланыстарын бұзу үшін қажетті маңызды маңызды ферменттердің болмауы немесе төмен деңгейі жатады.Олигосахаридтердегі қант байланыстары сияқты қанттардың құрамы мен құрылымдық сипаттамаларын түсіну гидролиз кезінде қанттың конверсиясын жақсартуға көмектеседі, биотехнологиялық процестерді мұнай өнімдерімен бәсекеге қабілетті етеді.
Көмірсулардың құрылымын анықтау қиын және сұйық хроматография (LC)11,12, ядролық магниттік-резонансты спектроскопия (ЯМР)13, капиллярлық электрофорез (CE)14,15,16 және масс-спектрометрия (MS)17 сияқты әдістердің комбинациясын қажет етеді., он сегіз.Матрицаны (MALDI-TOF-MS) қолданатын лазерлік десорбциямен және ионизациямен ұшу уақытының масс-спектрометриясы сияқты MS әдістері көмірсу құрылымдарын анықтаудың әмбебап әдісі болып табылады.Жақында натрий иондарының қосындыларының соқтығысқан диссоциация (CID) тандемі MS олигосахаридтерді бекіту позицияларына, аномерлік конфигурацияларға, тізбектерге және тармақталу орындарына сәйкес келетін саусақ іздерін анықтау үшін кеңінен қолданылды 20, 21 .
Гликандық талдау көмірсу байланыстарын терең анықтаудың тамаша құралы болып табылады22.Бұл әдіс күрделі көмірсулар байланысын түсіну үшін зондтар ретінде өсімдік жасуша қабырғасының гликанына бағытталған моноклоналды антиденелерді (mAbs) пайдаланады.250-ден астам мАб бүкіл әлемде қол жетімді, олар әртүрлі сахаридтерді қолданатын әртүрлі сызықтық және тармақталған олигосахаридтерге қарсы жасалған24.Өсімдік жасушасы қабырғасының құрылымын, құрамын және модификациясын сипаттау үшін бірнеше мАб кеңінен қолданылды, өйткені өсімдік жасушасының түріне, органына, жасына, даму кезеңіне және өсу ортасына байланысты айтарлықтай айырмашылықтар бар25,26.Жақында бұл әдіс өсімдік және жануарлар жүйелеріндегі везикулалар популяциясын және олардың субклеткалық маркерлермен, даму кезеңдерімен немесе қоршаған орта стимулдарымен анықталатын гликан тасымалдауындағы сәйкес рөлдерін түсіну және ферментативті белсенділікті анықтау үшін қолданылды.Анықталған гликандар мен ксиландардың кейбір әртүрлі құрылымдарына пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкандар (XylG), аралас байланыс глюкандары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон қышқылы-арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон қышқылы-арабиноксиланакт (GA2)араб (ГАБ2) кіреді.
Дегенмен, барлық осы зерттеу күштеріне қарамастан, жоғары қатты заттардың жүктемесі (HSL) гидролизі кезінде олигосахаридтердің жинақталуының табиғатына, соның ішінде олигосахаридтердің бөлінуіне, гидролиз кезінде олигомерлі тізбек ұзындығының өзгеруіне, әртүрлі төмен DP полимерлеріне және олардың қисық сызықтарына назар аударылған.бөлу 30,31,32.Сонымен қатар, гликандық талдау гликан құрылымын жан-жақты талдау үшін пайдалы құрал екендігі дәлелденгенімен, антиденелер әдістерін қолдана отырып, суда еритін төмен DP олигосахаридтерін бағалау қиын.Молекулярлық салмағы 5-10 кДа-дан аз кішірек ДП олигосахаридтері ELISA 33, 34 пластинкаларымен байланыспайды және антиденелерді қосқанға дейін жуылады.
Мұнда алғаш рет моноклоналды антиденелерді пайдаланып, еритін отқа төзімді олигосахаридтер үшін бір сатылы биотинилдеу процедурасын гликомдық талдаумен біріктіретін авидинмен қапталған пластиналарда ИФА талдауын көрсетеміз.Біздің гликомды талдауға деген көзқарасымыз MALDI-TOF-MS және GC-MS негізіндегі комплементарлы олигосахаридтік байланыстардың гидролизделген қант композицияларының триметилсилил (TMS) туындысын пайдалану арқылы талдауымен расталды.Бұл инновациялық тәсіл болашақта жоғары өнімді әдіс ретінде әзірленуі және биомедициналық зерттеулерде кеңірек қолданылуы мүмкін35.
Гликозилдену сияқты ферменттер мен антиденелердің трансляциядан кейінгі модификациялары36 олардың биологиялық белсенділігіне әсер етеді.Мысалы, қабыну артритінде қан сарысуындағы ақуыздардың гликозилденуінің өзгеруі маңызды рөл атқарады, ал гликозилдену өзгерістері диагностикалық маркерлер ретінде қолданылады37.Әдебиеттерде әртүрлі гликандар әртүрлі ауруларда, соның ішінде асқазан-ішек жолдарының және бауырдың созылмалы қабыну ауруларында, вирустық инфекцияларда, аналық без, сүт безі және простата қатерлі ісігінде оңай пайда болатыны туралы хабарланған38,39,40.Антиденеге негізделген гликан ИФА әдістерін қолдану арқылы гликандардың құрылымын түсіну күрделі MS әдістерін қолданбай-ақ ауруды диагностикалауға қосымша сенімділікті қамтамасыз етеді.
Біздің алдыңғы зерттеуіміз қыңыр олигосахаридтердің алдын ала өңдеуден және ферментативті гидролизден кейін гидролизденбегенін көрсетті (1-сурет).Бұрын жарияланған жұмысымызда біз AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері пеші гидролизатынан (ACSH)8 олигосахаридтерді оқшаулау үшін белсендірілген көмірдің қатты фазалық экстракция әдісін жасадық.Бастапқы экстракция мен бөлінуден кейін олигосахаридтер өлшемді алып тастау хроматографиясы (SEC) арқылы әрі қарай бөлшектелді және молекулалық салмақ тәртібі бойынша жиналды.Қант құрамын талдау арқылы әр түрлі алдын ала өңдеуден босатылған қант мономерлер мен олигомерлер талданды.Әртүрлі алдын ала өңдеу әдістерімен алынған қант олигомерлерінің құрамын салыстырған кезде, қыңыр олигосахаридтердің болуы биомассаны моносахаридтерге айналдыру кезінде жиі кездесетін мәселе болып табылады және қант шығымының кем дегенде 10-15%, тіпті 18% дейін төмендеуіне әкелуі мүмкін.АҚШ.Бұл әдіс олигосахаридтік фракцияларды одан әрі кең көлемде алу үшін қолданылады.Осы жұмыста олигосахаридтерді сипаттау үшін тәжірибелік материал ретінде алынған ACH және оның әр түрлі молекулалық массасы бар келесі фракциялары пайдаланылды.
Алдын ала өңдеуден және ферментативті гидролизден кейін тұрақты олигосахаридтер гидролизденбеген күйінде қалды.Мұнда (A) олигосахаридтерді бөлу әдісі, онда олигосахаридтер белсендірілген көмір мен диатомды топырақтың оралған қабатын пайдаланып, AFEX алдын ала өңделген жүгері гидролизатынан (ACSH) оқшауланады;B) Олигосахаридтерді бөлу әдісі.Олигосахаридтер одан әрі өлшемді алып тастау хроматографиясы (SEC) арқылы бөлінді;(C) Әртүрлі алдын ала өңдеуден (сұйылтылған қышқыл: DA, иондық сұйықтық: IL және AFEX) бөлінген сахарид мономерлер мен олигомерлер.Ферменттік гидролиз жағдайлары: қатты заттардың жоғары жүктемесі 25% (өт/ж) (шамамен 8% глюкан жүктемесі), 96 сағат гидролиз, 20 мг/г коммерциялық ферментті жүктеме (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 қатынасы) және (D) Қант мономерлері мен қанттың мономерлері және АФ-ЭКС-тен босаған олигомерлері ACS).
Гликандық талдау қатты биомасса қалдықтарынан оқшауланған сығындылардағы гликандардың жан-жақты құрылымдық талдауы үшін пайдалы құрал болып шықты.Дегенмен, суда еритін сахаридтер осы дәстүрлі әдіспен41 аз ұсынылған, себебі төмен молекулалық салмақты олигосахаридтерді ELISA пластинкаларында иммобилизациялау қиын және антиденелерді қоспас бұрын жуылады.Сондықтан антиденелерді байланыстыру және сипаттау үшін еритін, сәйкес келмейтін олигосахаридтерді авидинмен қапталған ELISA пластиналарына жабу үшін бір сатылы биотинилдеу әдісі қолданылды.Бұл әдіс бұрын өндірілген ACSH және оның молекулалық салмағына (немесе полимерлену дәрежесіне, DP) негізделген фракцияны пайдаланып сыналған.Көмірсулардың қалпына келтіретін ұшына биотин-LC-гидразидті қосу арқылы олигосахаридтермен байланысу жақындығын арттыру үшін бір сатылы биотинилизация қолданылды (2-сурет).Ерітіндіде қалпына келтіру ұшында орналасқан гемиацетальды топ биотин-LC-гидразидтің гидразидтік тобымен әрекеттесіп, гидразон байланысын түзеді.NaCNBH3 тотықсыздандырғыш агентінің қатысуымен гидразон байланысы тұрақты биотинделген соңғы өнімге дейін тотықсызданады.Қантты қалпына келтіру ұшының модификациясымен төмен DP олигосахаридтерін ELISA пластиналарына байланыстыру мүмкін болды, және біздің зерттеуімізде бұл гликанға бағытталған мАб көмегімен авидинмен қапталған пластиналарда жасалды.
Биотинденген олигосахаридтерге ИФА негізінде моноклоналды антиденелерді скрининг.Мұнда (A) олигосахаридтердің біріктірілген биотинилденуі және кейіннен NeutrAvidin жабыны бар пластиналардағы гликанға бағытталған mAbs көмегімен ИФА скринингі және (B) реакция өнімдерінің биотинилденуі үшін бір сатылы процедураны көрсетеді.
Содан кейін олигосахаридтермен конъюгацияланған антиденелері бар авидинмен қапталған пластиналар бастапқы және қайталама антиденелерге қосылды және жарық пен уақытқа сезімтал ортада жуылды.Антиденелерді байланыстыру аяқталғаннан кейін пластинаны инкубациялау үшін TMB субстратын қосыңыз.Соңында күкірт қышқылымен реакция тоқтатылды.Антиденеге тән кросс-байланысты анықтау үшін әрбір антидененің байланысу күшін анықтау үшін инкубацияланған пластиналар ELISA оқу құралының көмегімен талданды.Эксперименттің егжей-тегжейлері мен параметрлерін сәйкес «Материалдар мен әдістер» бөлімінен қараңыз.
Біз ACSH құрамында, сондай-ақ лигноцеллюлозды гидролизаттардан оқшауланған шикі және тазартылған олигосахаридтер фракцияларында бар еритін олигосахаридтерді сипаттау арқылы арнайы қолданбалар үшін осы жаңадан әзірленген әдістің пайдалылығын көрсетеміз.3-суретте көрсетілгендей, биоацилденген гликомды талдау әдістерін пайдалана отырып, ACSH-да анықталған ең көп таралған эпитопты алмастыратын ксиландар әдетте урондық (U) немесе метилурондық (MeU) және пектикалық арабиногалактандар болып табылады.Олардың көпшілігі гидролизденбеген қатты заттардың гликандарының (UHS)43 талдауы бойынша біздің алдыңғы зерттеуімізде де табылды.
Жасуша қабырғасының гликанына бағытталған моноклоналды антидененің көмегімен рекалцитрантты олигосахарид эпитоптарын анықтау.«Бейтарап» фракция ACN фракциясы және «қышқыл» фракциясы FA фракциясы болып табылады.Жылу картасындағы ашық қызыл түстер эпитоптың жоғары мазмұнын көрсетеді, ал ашық көк түс бос фонды көрсетеді.Шкаладағы түс мәндері N=2 тұжырымдары үшін өңделмеген OD мәндеріне негізделген.Антиденелермен танылған негізгі эпитоптар оң жақта көрсетілген.
Бұл целлюлоза емес құрылымдарды сыналған коммерциялық ферменттер қоспасындағы ең көп таралған целлюлазалар мен гемицеллюлазалар ажырата алмады, оған ең жиі қолданылатын коммерциялық ферменттер кіреді.Сондықтан олардың гидролизі үшін жаңа көмекші ферменттер қажет.Қажетті целлюлоза емес қосалқы ферменттер болмаса, бұл целлюлоза емес байланыстар, тіпті олардың негізгі қант полимерлері қысқа фрагменттерге кеңінен гидролизденіп, коммерциялық фермент қоспалары арқылы ерітілген болса да, моносахаридтерге толық айналуды болдырмайды.
Сигналдың таралуын және оның байланыстыру күшін одан әрі зерттеу димерлерде төмен DP фракцияларына (D, E, F, DP) қарағанда, жоғары DP қант фракцияларында (A, B, C, DP 20+ дейін) байланыстырушы эпитоптардың төмен екенін көрсетті) (1-сурет).Қышқыл фрагменттері бейтарап фрагменттерге қарағанда целлюлоза емес эпитоптарда жиі кездеседі.Бұл құбылыстар біздің алдыңғы зерттеуімізде байқалған үлгіге сәйкес келеді, мұнда жоғары DP және қышқыл бөліктері ферментативті гидролизге төзімдірек болды.Сондықтан целлюлоза емес гликан эпитоптарының және U және MeU алмастыруларының болуы олигосахаридтердің тұрақтылығына үлкен ықпал етуі мүмкін.Төмен DP олигосахаридтер үшін байланыстыру және анықтау тиімділігі проблемалы болуы мүмкін екенін атап өткен жөн, әсіресе эпитоп димерлі немесе тримерлі олигосахарид болса.Мұны әр түрлі ұзындықтағы коммерциялық олигосахаридтер арқылы тексеруге болады, олардың әрқайсысында белгілі бір мАб-мен байланысатын бір ғана эпитоп бар.
Осылайша, құрылымға спецификалық антиденелерді қолдану рекалцитративті байланыстардың белгілі бір түрлерін анықтады.Қолданылатын антидененің түріне, сәйкес байлау үлгісіне және ол шығаратын сигналдың күшіне (ең көп және ең аз) байланысты жаңа ферменттерді анықтауға және толық гликоконверсия үшін ферменттер қоспасына жартылай сандық түрде қосуға болады.Мысал ретінде ACSH олигосахаридтерінің талдауын ала отырып, біз әрбір биомасса материалы үшін гликандық байланыстардың дерекқорын жасай аламыз.Бұл жерде айта кететін жайт, антиденелердің әртүрлі жақындығын ескеру керек, ал егер олардың жақындығы белгісіз болса, бұл әртүрлі антиденелердің сигналдарын салыстыру кезінде белгілі бір қиындықтар туғызады.Сонымен қатар, гликандық байланыстарды салыстыру бір антидене үшін үлгілер арасында жақсы нәтиже береді.Содан кейін бұл қыңыр байланыстарды CAZyme дерекқорымен байланыстыруға болады, оның ішінен біз ферменттерді анықтай аламыз, кандидат ферменттерді таңдай аламыз және байланысты үзетін ферменттерді сынай аламыз немесе биоөңдеу зауыттарында пайдалану үшін осы ферменттерді экспрессиялау үшін микробтық жүйелерді жасай аламыз44.
Иммунологиялық әдістердің лигноцеллюлозды гидролизаттарда бар төмен молекулалық салмақты олигосахаридтерді сипаттаудың балама әдістерін қалай толықтыратынын бағалау үшін біз MALDI (4-сурет, S1-S8) және сол панельде (5-сурет) олигосахаридтер бөлігінде GC-MS негізіндегі TMS-туынды сахаридтердің талдауын жасадық.MALDI олигосахаридтер молекулаларының массалық таралуы жоспарланған құрылымға сәйкес келетінін салыстыру үшін қолданылады.Суретте.4 ACN-A және ACN-B бейтарап компоненттерінің МК-сын көрсетеді.ACN-A талдауы салмақтары MeU-ксилан олигосахаридтеріне сәйкес келетін DP 4–8 (4-сурет) пен DP 22 (S1-сурет) аралығындағы пентозды қанттардың ауқымын растады.ACN-B талдауы DP 8-15 пентоза мен глюкоксилан қатарын растады.S3 суреті сияқты қосымша материалда FA-C қышқылдық бөлігінің массасының таралу карталары ELISA негізіндегі mAb скринингінде табылған алмастырылған ксиландарға сәйкес келетін DP 8-15 болатын (Me)U алмастырылған пентозды қанттардың ауқымын көрсетеді.Эпитоптар сәйкес келеді.
ACS-де бар еритін сәйкес келмейтін олигосахаридтердің MALDI-MS спектрі.Мұнда (A) құрамында метилденген урон қышқылы (DP 4-8) бар ACN-A төмен салмақ диапазонындағы фракциялар глюкуроксилан олигосахаридтерін және (B) глюкуроксиланмен (DP 8-15) алмастырылған ACN-B ксилан мен метилденген урон қышқылының олигосахаридтерін ауыстырды.
Отқа төзімді олигосахаридтердің гликандық қалдығының құрамын талдау.Мұнда (A) GC-MS талдауы арқылы алынған әртүрлі олигосахаридтік фракциялардың TMS сахариді құрамы.(B) Олигосахаридтерде болатын әртүрлі TMS туынды қанттардың құрылымдары.ACN – құрамында бейтарап олигосахаридтер бар ацетонитрилді фракция және FA – қышқыл олигосахаридтері бар ферул қышқылы фракциясы.
Тағы бір қызықты қорытынды S9 суретінде көрсетілгендей олигосахаридтер фракциясының LC-MS талдауынан жасалды (әдістерді электронды қосымша материалдан көруге болады).ACN-B фракциясын байлау кезінде гексоза және -OAc топтарының фрагменттері бірнеше рет байқалды.Бұл нәтиже гликом және MALDI-TOF талдауында байқалған фрагментацияны растап қана қоймайды, сонымен қатар алдын ала өңделген лигноцеллюлоздық биомассадағы әлеуетті көмірсулар туындылары туралы жаңа ақпаратты береді.
Біз сондай-ақ TMS қант деривациясын қолдана отырып, олигосахаридтер фракциясының қант құрамын талдадық.GC-MS көмегімен олигосахаридтік фракциядағы нейрондық (туынды емес) және қышқыл қанттардың (GluA және GalA) құрамын анықтадық (5-сурет).Глюкурон қышқылы C және D қышқылды компоненттерінде, ал галактурон қышқылы А және В қышқылды компоненттерінде кездеседі, олардың екеуі де қышқыл қанттардың жоғары DP компоненттері болып табылады.Бұл нәтижелер біздің ELISA және MALDI деректерін растап қана қоймайды, сонымен қатар олигосахаридтердің жинақталуына қатысты алдыңғы зерттеулерімізге сәйкес келеді.Сондықтан олигосахаридтердің биотинилденуі және кейінгі ИФА скринингін қолданатын заманауи иммунологиялық әдістер әртүрлі биологиялық үлгілерде еритін рекалцитрантты олигосахаридтерді анықтау үшін жеткілікті деп санаймыз.
ELISA негізіндегі mAb скрининг әдістері бірнеше түрлі әдістермен расталғандықтан, біз осы жаңа сандық әдістің әлеуетін одан әрі зерттегіміз келді.Екі коммерциялық олигосахаридтер, ксилогексасахаридтік олигосахарид (XHE) және 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX) сатып алынды және жасуша қабырғасының гликанына бағытталған жаңа mAb әдісін пайдаланып сыналған.6-сурет биотинизацияланған байланыстыру сигналы мен олигосахаридтер концентрациясының лог концентрациясы арасындағы сызықтық корреляцияны көрсетеді, бұл ықтимал Лангмюр адсорбция үлгісін ұсынады.mAbs арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 және CCRC-M151 XHE-мен корреляцияланған, ал CCRC-M108, CCRC-M109 және LM11 A2XX-мен na10nm диапазонында корреляцияланған.Тәжірибе кезінде антиденелердің шектеулі болуына байланысты әрбір олигосахарид концентрациясымен шектелген тәжірибелер жүргізілді.Бұл жерде кейбір антиденелер субстрат ретінде бір олигосахаридке мүлдем басқаша әрекет ететінін атап өткен жөн, мүмкін олар аздап әртүрлі эпитоптармен байланысады және өте әртүрлі байланысу аффинділігі болуы мүмкін.Нақты үлгілерге жаңа mAb тәсілі қолданылған кезде эпитопты дәл анықтаудың механизмдері мен салдары әлдеқайда күрделі болады.
Екі коммерциялық олигосахаридтер әртүрлі гликанға бағытталған mAbs анықтау диапазонын анықтау үшін пайдаланылды.Мұнда олигосахаридтер концентрациясының лог концентрациясымен сызықтық корреляциялар (A) XHE mAb және (B) A2XX үшін mAb үшін Ленгмюр адсорбциялық үлгілерін көрсетеді.Сәйкес эпитоптар талдауда субстрат ретінде пайдаланылатын коммерциялық олигосахаридтердің құрылымдарын көрсетеді.
Гликанға бағытталған моноклоналды антиденелерді пайдалану (гликокомикалық талдау немесе ELISA негізіндегі mAb скринингі) өсімдік биомассасын құрайтын негізгі жасуша қабырғасының гликандарының көпшілігін терең сипаттаудың қуатты құралы болып табылады.Алайда, классикалық гликандық талдау үлкенірек жасуша қабырғасының гликандарын ғана сипаттайды, өйткені олигосахаридтердің көпшілігі ИФА пластинкаларында тиімді иммобилизацияланбайды.Бұл зерттеуде AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері пеші жоғары қатты заттардың құрамында ферментативті түрде гидролизденді.Гидролизаттағы рекалцитрантты жасуша қабырғасының көмірсуларының құрамын анықтау үшін қант талдауы қолданылды.Дегенмен, гидролизаттардағы кішірек олигосахаридтердің mAb талдауы бағаланбайды және олигосахаридтерді ELISA пластиналарында тиімді иммобилизациялау үшін қосымша құралдар қажет.
Біз мұнда олигосахаридтердің биотинилденуін біріктіру арқылы, содан кейін NeutrAvidin™ қапталған пластиналардағы ELISA скринингін біріктіру арқылы mAb скринингіне арналған жаңа және тиімді олигосахаридтерді иммобилизациялау әдісін хабарлаймыз.Иммобилизацияланған биотинилденген олигосахаридтер рекалцитрантты олигосахаридтерді жылдам және тиімді анықтауға мүмкіндік беру үшін антиденеге жеткілікті жақындықты көрсетті.Бұл қыңыр олигосахаридтердің құрамын масс-спектрометрия негізінде талдау иммуноскринингке осы жаңа тәсілдің нәтижелерін растады.Осылайша, бұл зерттеулер олигосахаридтердің биотинилденуі мен ИФА скринингінің гликанға бағытталған моноклоналды антиденелермен үйлесімі олигосахаридтердегі айқаспалы байланыстарды анықтау үшін пайдаланылуы мүмкін екенін және олигосахаридтердің құрылымын сипаттайтын басқа биохимиялық зерттеулерде кеңінен қолданылуы мүмкін екенін көрсетеді.
Бұл биотин негізіндегі гликандық профильдеу әдісі өсімдік биомассасындағы еритін олигосахаридтердің көмірсутектік байланыстарын зерттеуге қабілетті бірінші есеп болып табылады.Бұл биомассаның кейбір бөліктері биоотын өндіруге келгенде неге соншалықты қыңыр екенін түсінуге көмектеседі.Бұл әдіс гликомды талдау әдістеріндегі маңызды бос орынды толтырады және оны өсімдік олигосахаридтерінен тыс субстраттардың кең ауқымына қолдануды кеңейтеді.Болашақта біз биотинилдеу үшін робототехниканы пайдалана аламыз және ELISA көмегімен үлгілерді жоғары өнімді талдау үшін әзірлеген әдісті пайдалана аламыз.
Pioneer 33A14 гибридті тұқымдарынан өсірілген жүгері сабаны (CS) 2010 жылы Колорадо штатының Рэй қаласындағы Крамер фермаларынан жиналды.Жер иесінің рұқсатымен бұл биомассаны зерттеуге пайдалануға болады. Үлгілер құрғақ < 6% ылғалдылықта бөлме температурасында қыстырғыш қапшықтарда сақталды. Үлгілер құрғақ < 6% ылғалдылықта бөлме температурасында қыстырғыш қапшықтарда сақталды. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Үлгілер бөлме температурасында сыдырма қапшықтарда <6% ылғалдылықта құрғақ күйде сақталды.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Үлгілер ылғалдылығы < 6% бөлме температурасында найзағай қапшықтарда сақталады.Зерттеу жергілікті және ұлттық нұсқауларға сәйкес болды.Композициялық талдау NREL хаттамасы арқылы орындалды.Құрамында 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% ақуыз және 13,4% күл бар екені анықталды.
Cellic® CTec2 (138 мг протеин/мл, VCNI 0001 лот) - Novozymes (Franklinton, NC, АҚШ) фирмасының целлюлаза, β-глюкозидаза және Cellic® HTec2 (157 мг протеин/мл, VHN00001 лот) күрделі қоспасы.Multifect Pectinase® (72 мг протеин/мл), пектинді ыдырататын ферменттердің күрделі қоспасы, DuPont Industrial Biosciences (Пало Альто, Калифорния, АҚШ) сыйға тартты.Фермент ақуызының концентрациясы Kjeldahl азот талдауын (AOAC әдісі 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, АҚШ) пайдалана отырып, ақуыз мазмұнын бағалау (және белок емес азоттың үлесін шегеру) арқылы анықталды.Диатомды жер 545 EMD Millipore (Billerica, MA) компаниясынан сатып алынды.Белсендірілген көмір (DARCO, 100 торлы түйіршіктер), Avicel (PH-101), бук ксилан және барлық басқа химиялық заттар Sigma-Oldrich (Сент-Луис, МО) компаниясынан сатып алынды.
AFEX алдын ала өңдеу GLBRC (Биомассаны түрлендіруді зерттеу зертханасы, MSU, Lansing, MI, АҚШ) орындалды.Алдын ала өңдеу 140° C. 15 минут бойы жүргізілді.46 тот баспайтын болаттан жасалған стендтік пакеттік реакторда (Parr Instruments компаниясы) сусыз аммиактың биомассаға 1:1 қатынасында 60% (б/ж) жүктеу кезінде тұру уақыты.Бұл 30 минутқа созылды.Реакторды 140°С-қа дейін жеткізіп, аммиак тез бөлініп, биомассаның бөлме температурасына тез оралуына мүмкіндік берді.AFEX алдын ала өңделген жүгері пешінің (ACS) құрамы өңделмеген жүгері пешінің (UT-CS) құрамымен ұқсас болды.
Олигосахаридтердің кең ауқымды өндірісі үшін бастапқы материал ретінде жоғары қатты ACSH 25% (w/w) (шамамен 8% декстран жүктемесі) дайындалды.ACS ферменттік гидролизі Cellic® Ctec2 10 мг протеин/г глюкан (алдын ала өңделген биомассада), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг ақуыз/г глюкан және Мультифект пектиназа (Genencor Inc, АҚШ) қоса алғанда, коммерциялық фермент қоспасы арқылы орындалды.).), 5 мг ақуыз/г декстран.Ферментативті гидролиз жұмыс көлемі 3 л, рН 4,8, 50°С және 250 айн/мин 5 литрлік биореакторда жүргізілді.96 сағат бойы гидролизден кейін гидролизат гидролизденбеген қатты заттарды кетіру үшін 6000 айн/мин 30 минут, содан кейін 14000 айн/мин 30 минут бойы центрифугалау арқылы жиналды.Содан кейін гидролизат 0,22 мм сүзгі стакан арқылы стерильді фильтрацияға ұшырады.Сүзілген гидролизат стерильді бөтелкелерде 4 ° C температурада сақталды, содан кейін көміртегіге бөлінді.
NREL зертханалық талдау процедураларына сәйкес сығынды негізіндегі биомасса үлгілерінің құрамын талдау: үлгілерді композициялық талдауға дайындау (NREL/TP-510-42620) және биомассадағы құрылымдық көмірсулар мен лигнинді анықтау (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизат ағынының олигосахаридтік талдауы автоклав негізіндегі қышқылды гидролиз әдісі арқылы 2 мл шкалада жүргізілді.Гидролизат үлгісін 69,7 мкл 72% күкірт қышқылымен 10 мл бұрандалы қақпағы бар культуралық түтікте араластырыңыз және үстел үстінде 121 °C температурада 1 сағат инкубациялаңыз, мұзда суытып, өнімділігі жоғары сұйық хроматография (HPLC) құтысына сүзіңіз.Олигосахаридтердің концентрациясы қышқыл-гидролизденген үлгідегі қанттың жалпы концентрациясынан гидролизденбеген үлгідегі моносахаридтердің концентрациясын шегеру арқылы анықталды.
Қышқыл гидролизделген биомассадағы глюкоза, ксилоза және арабиноза концентрациялары Bio-Rad Aminex HPX-87H бағанында автоүлгілеу құрылғысымен, бағанды ​​қыздырғышпен, изократикалық сорғымен және сыну көрсеткіші детекторымен жабдықталған Shimadzu HPLC жүйесі арқылы талданды.Колонна 50°C температурада ұсталды және судағы 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 ерітіндісімен тазартылды.ағын.
Гидролизат үстіңгі заты сұйылтылған және мономер мен олигосахаридтердің мазмұнына талдау жасалды.Ферментативті гидролизден кейін алынған мономерлік қанттар Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P бағанымен және күлден қорғау бағанымен жабдықталған HPLC арқылы талданды.Колонна температурасы 80°C деңгейінде сақталды, жылжымалы фаза ретінде су 0,6 мл/мин ағын жылдамдығымен пайдаланылды.Олигосахаридтер 121°C температурада сұйылтылған қышқылда гидролиз арқылы анықталған.41, 48, 49.
Сахарид талдауы бұрын сипатталған 27, 43, 50, 51 процедураларын қолдана отырып, шикі, AFEX алдын ала өңделген және барлық гидролизденбеген биомасса қалдықтарына (сериялық жасуша қабырғасының сығындыларын өндіруді және олардың мАб скринингін қоса) орындалды.Гликомды талдау үшін өсімдік жасушасының қабырғасы материалының спиртте ерімейтін қалдықтары биомасса қалдықтарынан дайындалады және аммоний оксалаты (50 мМ), натрий карбонаты (50 мМ және 0,5% с/т), CON сияқты агрессивті реагенттермен сериялық экстракцияға ұшырайды.(1М және 4М, екеуі де салмағы 1% натрий боргидридімен) және бұрын сипатталғандай қышқыл хлориті52,53.Содан кейін сығындылар жасуша қабырғасының гликанына бағытталған mAb50s күрделі панеліне қарсы ИФА-ға ұшырады және mAb байланыстыру реакциялары жылу картасы ретінде ұсынылды.Өсімдік жасушасының қабырғасының гликанына бағытталған mAbs зертханалық қорлардан (CCRC, JIM және MAC сериялары) сатып алынды.
Олигосахаридтердің бір сатылы биотинилденуі.Көмірсулардың биотин-LC-гидразидпен конъюгациясы келесі процедура арқылы орындалды.Биотин-LC-гидразиді (4,6 мг/12 мкмоль) қатты араластыру және 65°C температурада 1 минут қыздыру арқылы диметилсульфоксидте (DMSO, 70 мкл) ерітілді.Мұзды сірке қышқылы (30 мкл) қосылды және қоспасы натрий цианоборогидридіне (6,4 мг/100 мкмоль) құйылды және 65°C температурада шамамен 1 минут қыздырғаннан кейін толығымен ерітілді.Содан кейін 5-8 мкл реакциялық қоспа кептірілген олигосахаридке (1-100 нмоль) қосылды, тотықсыздандырғыш ұшынан 10 есе немесе одан да көп молярлық артық белгіні алу үшін.Реакция 65°C температурада 2 сағат бойы жүргізілді, содан кейін үлгілер дереу тазартылды.Натрий цианоборогидриді таңбалау эксперименттерінде тотықсыздандырылмай қолданылған жоқ, үлгілер 65°С температурада 2,5 сағат бойы әрекеттесті.
Биотинилденген олигосахаридтердің үлгілерін ELISA жабу және жуу.25 мкл биотинделген үлгілер (5 мл 0,1 М Tris буферінің ерітіндісінде (TBS) сұйылтылған әрбір концентрленген үлгінің 100 мкл) авидинмен қапталған пластинаның әрбір ұясына қосылды.Бақылау ұңғымалары 0,1 М TBS ішіндегі 10 мкг/мл концентрацияда 50 мкл биотинмен қапталған.Дейондандырылған су бос өлшемдер үшін жабын ретінде пайдаланылды.Планшетті 2 сағат бойы бөлме температурасында қараңғы жерде инкубациялады.№ бағдарлама арқылы тәрелкені 0,1 M TBS ішінде 0,1% майсыздандырылған сүтпен 3 рет жуыңыз.Grenier пәтері 3A үшін 11.
Біріншілік антиденелерді қосу және жуу.Әрбір ұңғымаға 40 мкл бастапқы антидене қосыңыз.Микропластинаны қараңғы жерде бөлме температурасында 1 сағат бойы инкубациялаңыз.Содан кейін табақшалар Grenier Flat 3A үшін №11 жуу бағдарламасы арқылы 0,1 M TBS ішінде 0,1% сүтпен 3 рет жуылды.
Екіншілік антиденені қосып, жуыңыз.Әрбір шұңқырға 50 мкл тышқан/егеуқұйрық екіншілік антиденені (0,1 M TBS ішіндегі 0,1% сүтте 1:5000 сұйылтылған) қосыңыз.Микропластинаны қараңғы жерде бөлме температурасында 1 сағат бойы инкубациялаңыз.Содан кейін микропластиналар Grenier Flat 5A №12 пластиналарды жуу бағдарламасы арқылы 0,1 M TBS ішінде 0,1% сүтпен 5 рет жуылды.
Субстрат қосу.Негізгі субстратқа 50 мкл 3,3′,5,5′-тетраметилбензидинді (TMB) қосыңыз (15 мл деионизацияланған суға 2 тамшы буфер, 3 тамшы ТМБ, 2 тамшы сутегі асқын тотығын қосу арқылы).TMB субстратын дайындаңыз.және қолданар алдында құйынды).Микропластинаны бөлме температурасында 30 минут инкубациялаңыз.Қараңғыда.
Қадамды аяқтап, планшетті оқыңыз.Әрбір шұңқырға 50 мкл 1 н күкірт қышқылын қосыңыз және ELISA оқу құралын пайдаланып 450-ден 655 нм-ге дейінгі сіңіруді жазыңыз.
Бұл талданатын заттардың 1 мг/мл деиондандырылған судағы ерітінділерін дайындаңыз: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактурон қышқылы (ГалА), глюкурон қышқылы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (манНАклюкозамин), N-ацетил.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (ішкі стандарт).1-кестеде көрсетілген 1 мг/мл қант ерітінділерін қосу арқылы екі стандарт дайындалды. Үлгілер барлық су жойылғанша (әдетте шамамен 12-18 сағат) -80° C температурада мұздатылады және лиофилденеді.
Аналитикалық таразыда бұрандалы қақпақ түтіктеріне 100–500 мкг үлгі қосыңыз.Қосылған соманы жазыңыз.Үлгіні еріткіштің белгілі бір концентрациясында ерітіп, оны сұйық аликвот ретінде түтікке қосқан дұрыс.Әрбір үлгі түтігі үшін ішкі стандарт ретінде 20 мкл 1 мг/мл инозитолды пайдаланыңыз.Үлгіге қосылған ішкі эталон мөлшері стандартты түтікке қосылған ішкі эталон мөлшерімен бірдей болуы керек.
Бұрандалы қақпағы бар құтыға 8 мл сусыз метанол қосыңыз.Содан кейін 4 мл 3 N. метанолик HCl ерітіндісін қақпақпен жауып, шайқаңыз.Бұл процесс суды пайдаланбайды.
Олигосахарид үлгілеріне және стандартты TMS түтіктеріне 500 мкл 1 М HCl метанол ерітіндісін қосыңыз.Үлгілер түнде (168 сағат) 80°C температурада термиялық блокта инкубацияланды.Метанолиз өнімін кептіру коллекторын пайдаланып бөлме температурасында құрғатыңыз.200 мкл MeOH қосып, қайтадан құрғатыңыз.Бұл процесс екі рет қайталанады.Үлгіге 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин және 100 мкл сірке ангидридін қосып, жақсылап араластырыңыз.Үлгілер бөлме температурасында 30 минут бойы инкубацияланды.және кептірілген.200 мкл метанол қосып, қайтадан құрғатыңыз.
200 мкл Tri-Sil қосып, қақпағы бар түтікті 20 минут қыздырыңыз.80°C, содан кейін бөлме температурасына дейін салқындатылады.Үлгіні шамамен 50 мкл көлемге дейін кептіру үшін кептіру коллекторын пайдаланыңыз.Үлгілердің толық кебуіне жол бермегенімізді ескеру маңызды.
2 мл гексан қосып, жақсылап шайқау арқылы араластырыңыз.Пастер тамшуырларының ұштарын (5-8 мм) шыны жүнді диаметрі 5-3/4 дюймдік тамшуырдың үстіне салу арқылы шыны жүннің бір бөлігімен толтырыңыз.Үлгілер 2 минут бойы 3000 г центрифугадан өтті.Кез келген ерімейтін қалдықтар тұнбаға түседі.Үлгіні 100-150 мкл дейін кептіріңіз.GC-MS-ге 80 °C бастапқы температурада және 2,0 минуттық бастапқы уақытта шамамен 1 мкл көлем енгізілді (2-кесте).