Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін сайтты стильдер мен JavaScriptсіз көрсетеміз.
AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері пешіндегі тұрақты олигосахаридтерді кешенді талдауға арналған жаңа иммунологиялық және масс-спектрометриялық әдістер. Лигноцеллюлозалық биомасса қазба отындарына тұрақты балама болып табылады және азық-түлік, жем, отын және химиялық заттар сияқты өнімдерді өндіруге арналған биотехнологияларды әзірлеу үшін кеңінен қолданылады. Бұл технологиялардың кілті - өсімдік жасуша қабырғаларында болатын күрделі көмірсуларды глюкоза, ксилоза және арабиноза сияқты қарапайым қанттарға айналдырудың бәсекеге қабілетті процестерін әзірлеу. Лигноцеллюлозалық биомасса өте берік болғандықтан, қажетті өнімді алу үшін оны термохимиялық өңдеуден (мысалы, аммиак талшықтарын қабыршақтау (AFEX), сұйылтылған қышқылдар (DA), иондық сұйықтықтар (IL)) және биологиялық өңдеуден (мысалы, ферментативті гидролиз және микробтық ашыту) өткізу керек. Дегенмен, гидролиз процесінде коммерциялық саңырауқұлақ ферменттері қолданылған кезде, түзілген еритін қанттардың тек 75-85%-ы моносахаридтер, ал қалған 15-25%-ы микроорганизмдер үшін әрқашан қолжетімді бола бермейтін еритін, ерімейтін олигосахаридтер болып табылады. Бұған дейін біз көміртегі мен диатомды жерді бөлу және өлшемді алып тастау хроматографиясының тіркесімін қолдана отырып, еритін қатал олигосахаридтерді сәтті бөліп алып, тазарттық, сондай-ақ олардың ферменттерді тежеу ​​қасиеттерін зерттедік. Біз полимерленудің (DP) жоғары дәрежесі бар метилденген урон қышқылының орын басуларын қамтитын олигосахаридтерді коммерциялық фермент қоспаларымен өңдеу төмен DP және бейтарап олигосахаридтерге қарағанда қиынырақ екенін анықтадық. Мұнда біз өсімдік жасуша қабырғаларындағы гликан байланыстарын сипаттау үшін өсімдік биомассасының гликандарына тән моноклоналды антиденелерді (mAbs) пайдаланып гликан профилін жасау және ферментативті гидролиздеу, матрица көмегімен лазерлік десорбция ионизациясы, ұшу уақытының масс-спектрометриясы сияқты бірнеше қосымша әдістерді қолдану туралы хабарлаймыз. . MALDI-TOF-MS) теріс иондардың екінші реттік ыдырауынан кейін спектроскопия, газ хроматографиясы және масс-спектрометрия (GC-MS) арқылы алынған құрылымдық-ақпараттық диагностикалық шыңдарды туындыланумен және онсыз олигосахаридтік байланыстарды сипаттау үшін пайдаланады. Олигосахаридтердің кішігірім өлшеміне (DP 4–20) байланысты бұл молекулаларды mAb байланысу және сипаттау үшін пайдалану қиын. Бұл мәселені шешу үшін біз микропластина бетіндегі төмен DP еритін олигосахаридтердің көпшілігін сәтті белгілеген биотин конъюгациясына негізделген жаңа олигосахарид иммобилизациялау әдісін қолдандық, ол кейіннен арнайы лигация талдауы үшін жоғары өткізу қабілетті mAb жүйесінде қолданылды. Бұл жаңа әдіс болашақта диагностикалық мақсаттарда биомаркерлерде болатын олигосахаридтерді оқшаулау және сипаттау үшін пайдаланылуы мүмкін жоғары өткізу қабілетті гликом талдауларының озық әдістерін әзірлеуге ықпал етеді.
Ауыл шаруашылығы, орман шаруашылығы, шөп және ағаш материалдарынан тұратын лигноцеллюлозалық биомасса жоғары құнды өнімдерді алу үшін азық-түлік, жем, отын және химиялық прекурсорларды қоса алғанда, биологиялық негіздегі өнімдерді өндіру үшін әлеуетті шикізат болып табылады1. Өсімдік жасуша қабырғаларында болатын көмірсулар (мысалы, целлюлоза және гемицеллюлоза) химиялық өңдеу және биотрансформация (мысалы, ферментативті гидролиз және микробтық ашыту) арқылы моносахаридтерге деполимерленеді. Жалпы алдын ала өңдеуге аммиак талшығының кеңеюі (AFEX), сұйылтылған қышқыл (DA), иондық сұйықтық (IL) және бу жарылысы (SE) жатады, олар өсімдік жасуша қабырғаларын ашу арқылы лигноцеллюлоза өндірісін азайту үшін химиялық заттар мен жылудың тіркесімін пайдаланады3,4. Заттың кеуектілігі, 5. Ферментативті гидролиз коммерциялық белсенді көмірсулар бар ферменттерді (CAZymes) және биологиялық негіздегі отындар мен химиялық заттарды алу үшін трансгенді ашытқыларды немесе бактерияларды пайдаланып микробтық ашытуды пайдаланып жоғары қатты заттар жүктемесінде жүзеге асырылады6.
Коммерциялық ферменттердегі CAZymes күрделі көмірсу-қант байланыстарын синергетикалық түрде үзіп, моносахаридтерді түзетін ферменттердің күрделі қоспасынан тұрады2,7. Бұрын хабарлағанымыздай, лигниннің көмірсулармен хош иісті полимерлерінің күрделі желісі оларды өте қиын етеді, бұл қанттың толық емес түрленуіне әкеледі, алдын ала өңделген биомассаның ферментативті гидролизі кезінде өндірілмейтін жыныстық олигосахаридтердің 15-25%-ын жинақтайды. Бұл биомассаны алдын ала өңдеудің әртүрлі әдістерімен жиі кездесетін мәселе. Бұл кедергінің кейбір себептеріне гидролиз кезінде ферменттің тежелуі немесе өсімдік биомассасындағы қант байланыстарын үзу үшін қажетті маңызды маңызды ферменттердің болмауы немесе төмен деңгейі жатады. Олигосахаридтердегі қант байланыстары сияқты қанттардың құрамы мен құрылымдық сипаттамаларын түсіну гидролиз кезінде қанттың түрленуін жақсартуға көмектеседі, бұл биотехнологиялық процестерді мұнайдан алынатын өнімдермен бәсекелестікке қабілетті етеді.
Көмірсулардың құрылымын анықтау қиын және сұйық хроматография (LC)11,12, ядролық магниттік-резонанстық спектроскопия (ЯМР)13, капиллярлық электрофорез (CE)14,15,16 және масс-спектрометрия (MS)17 сияқты әдістердің үйлесімін қажет етеді. , он сегіз. Лазерлік десорбциямен ұшу уақытының масс-спектрометриясы және матрицаны (MALDI-TOF-MS) пайдаланып иондау сияқты MS әдістері көмірсулар құрылымдарын анықтаудың жан-жақты әдісі болып табылады. Жақында натрий иондарының аддукттарының соқтығысудан туындаған диссоциация (CID) тандемдік MS-і олигосахаридтердің бекіту позицияларына, аномерлік конфигурацияларына, тізбектеріне және тармақталу позицияларына сәйкес келетін саусақ іздерін анықтау үшін кеңінен қолданылды 20, 21.
Гликан талдауы көмірсу байланыстарын терең анықтаудың тамаша құралы болып табылады22. Бұл әдіс күрделі көмірсу байланыстарын түсіну үшін өсімдік жасуша қабырғасының гликанына бағытталған моноклоналды антиденелер (mAbs) зондтар ретінде қолданылады. Әлемде әртүрлі сахаридтерді қолдана отырып, әртүрлі сызықтық және тармақталған олигосахаридтерге қарсы жасалған 250-ден астам мAbs бар24. Өсімдік жасушасының түріне, мүшесіне, жасына, даму кезеңіне және өсу ортасына байланысты айтарлықтай айырмашылықтар болғандықтан, өсімдік жасуша қабырғасының құрылымын, құрамын және модификацияларын сипаттау үшін бірнеше мAbs кеңінен қолданылды25,26. Жақында бұл әдіс өсімдік және жануарлар жүйелеріндегі көпіршік популяцияларын және олардың жасушаішілік маркерлермен, даму кезеңдері немесе қоршаған орта тітіркендіргіштерімен анықталатын гликан тасымалдаудағы тиісті рөлдерін түсіну және ферментативті белсенділікті анықтау үшін қолданылды. Гликандар мен ксиландардың анықталған әртүрлі құрылымдарына пектин (P), ксилан (X), маннан (M), ксилоглюкандар (XylG), аралас байланыс глюкандары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон қышқылы-арабиноксилан (GArbX) және арабино-галактан (ArbG) жатады.
Дегенмен, осы зерттеу жұмыстарының барлығына қарамастан, олигосахаридтердің жоғары қатты заттар жүктемесі (HSL) гидролизі кезінде жиналу сипатына, соның ішінде олигосахаридтің бөлінуіне, гидролиз кезіндегі олигомерлі тізбек ұзындығының өзгеруіне, әртүрлі төмен ДП полимерлеріне және олардың қисықтарына бағытталған зерттеулер аз ғана. таралулар 30,31,32. Сонымен қатар, гликан талдауы гликан құрылымын кешенді талдау үшін пайдалы құрал болып табылатыны дәлелденгенімен, суда еритін төмен ДП олигосахаридтерін антидене әдістерін қолдана отырып бағалау қиын. Молекулалық салмағы 5-10 кДа-дан аз кішірек ДП олигосахаридтері ELISA пластиналарына 33, 34 байланыспайды және антидене қосқанға дейін жуылып кетеді.
Мұнда біз алғаш рет моноклоналды антиденелерді қолдана отырып, авидинмен қапталған пластиналарда ELISA талдауын көрсетеміз, еритін отқа төзімді олигосахаридтер үшін бір сатылы биотинилдеу процедурасын гликом талдауымен біріктіреміз. Гликом талдауына деген көзқарасымыз гидролизденген қант құрамдарын триметилсилил (TMS) туындылауын қолдана отырып, комплементарлы олигосахарид байланыстарының MALDI-TOF-MS және GC-MS негізіндегі талдауымен расталды. Бұл инновациялық тәсіл болашақта жоғары өнімді әдіс ретінде әзірленуі және биомедициналық зерттеулерде кеңінен қолданылуы мүмкін35.
Ферменттер мен антиденелердің трансляциядан кейінгі модификациялары, мысалы, гликозилдену,36 олардың биологиялық белсенділігіне әсер етеді. Мысалы, сарысу ақуыздарының гликозилденуіндегі өзгерістер қабыну артритінде маңызды рөл атқарады, ал гликозилденудегі өзгерістер диагностикалық маркерлер ретінде қолданылады37. Әдебиеттерде әртүрлі гликандардың асқазан-ішек жолдары мен бауырдың созылмалы қабыну аурулары, вирустық инфекциялар, аналық без, сүт безі және қуық асты безі қатерлі ісігі сияқты әртүрлі ауруларда оңай пайда болатыны туралы хабарланған38,39,40. Антиденелерге негізделген гликан ELISA әдістерін қолдана отырып, гликандардың құрылымын түсіну күрделі MS әдістерін қолданбай ауруды диагностикалауда қосымша сенімділік береді.
Біздің алдыңғы зерттеуіміз алдын ала өңдеуден және ферментативті гидролизден кейін қатал олигосахаридтердің гидролизденбегенін көрсетті (1-сурет). Бұрын жарияланған жұмысымызда біз AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері гидролизатынан (ACSH)8 олигосахаридтерді бөліп алу үшін белсендірілген көмірдің қатты фазалы экстракция әдісін әзірледік. Бастапқы экстракциядан және бөлуден кейін олигосахаридтер өлшемді алып тастау хроматографиясы (SEC) арқылы фракцияланды және молекулалық салмақ ретімен жиналды. Әртүрлі алдын ала өңдеуден бөлініп шыққан қант мономерлері мен олигомерлері қант құрамын талдау арқылы талданды. Әртүрлі алдын ала өңдеу әдістерімен алынған қант олигомерлерінің құрамын салыстырған кезде, қатал олигосахаридтердің болуы биомассаны моносахаридтерге айналдырудағы жиі кездесетін мәселе болып табылады және қант өнімділігінің кем дегенде 10-15%-ға, тіпті 18%-ға дейін төмендеуіне әкелуі мүмкін. АҚШ. Бұл әдіс олигосахарид фракцияларын одан әрі ірі көлемде өндіру үшін қолданылады. Алынған ACH және одан кейінгі әртүрлі молекулалық салмақтағы фракциялар осы жұмыста олигосахаридтерді сипаттау үшін тәжірибелік материал ретінде пайдаланылды.
Алдын ала өңдеуден және ферментативті гидролизден кейін тұрақты олигосахаридтер гидролизденбеген күйінде қалды. Мұнда (A) олигосахаридтерді AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері гидролизатынан (ACSH) белсендірілген көмір мен диатомды жердің тығыз қабатын пайдаланып бөліп алатын олигосахаридтерді бөлу әдісі; (B) Олигосахаридтерді бөлу әдісі. Олигосахаридтер өлшемді алып тастау хроматографиясы (SEC) арқылы одан әрі бөлінді; (C) Әртүрлі алдын ала өңдеуден бөлінетін сахарид мономерлер мен олигомерлер (сұйылтылған қышқыл: DA, иондық сұйықтық: IL және AFEX). Ферменттік гидролиз жағдайлары: 25% (салмақ/салмақ) қатты заттардың жоғары жүктемесі (шамамен 8% глюкан жүктемесі), 96 сағаттық гидролиз, 20 мг/г коммерциялық фермент жүктемесі (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 қатынасы) және (D) AFEX алдын ала өңделген жүгері пешінен (ACS) бөлінетін глюкозаның, ксилозаның және арабинозаның қант мономерлері мен олигомерлері.
Гликан талдауы қатты биомасса қалдықтарынан бөлініп алынған сығындылардағы гликандардың кешенді құрылымдық талдауы үшін пайдалы құрал болып шықты. Дегенмен, суда еритін сахаридтер осы дәстүрлі әдісті қолдану арқылы жеткіліксіз ұсынылған41, себебі төмен молекулалық салмақты олигосахаридтерді ELISA пластинкаларында иммобилизациялау қиын және антиденелерді қоспас бұрын жуып тастайды. Сондықтан, антиденелерді байланыстыру және сипаттау үшін авидинмен қапталған ELISA пластинкаларындағы еритін, сәйкес келмейтін олигосахаридтерді жабу үшін бір сатылы биотинилдеу әдісі қолданылды. Бұл әдіс бұрын алынған ACSH және оның молекулалық салмағына (немесе полимерлену дәрежесіне, DP) негізделген фракцияны пайдаланып сыналды. Бір сатылы биотинилдеу көмірсулардың тотықсыздандырғыш ұшына биотин-LC-гидразид қосу арқылы олигосахаридтердің байланысу аффинділігін арттыру үшін қолданылды (2-сурет). Ерітіндіде тотықсыздандырғыш ұшындағы гемиацеталды топ биотин-LC-гидразидтің гидразид тобымен әрекеттесіп, гидразон байланысын түзеді. NaCNBH3 тотықсыздандырғышының қатысуымен гидразон байланысы тұрақты биотинилденген соңғы өнімге дейін тотықсызданады. Қантты тотықсыздандыратын ұшты өзгерту арқылы төмен ДП олигосахаридтерін ELISA пластинкаларына байланыстыру мүмкін болды, және біздің зерттеуімізде бұл гликанға бағытталған mAbs пайдаланып авидинмен қапталған пластинкаларда жасалды.
Биотинделген олигосахаридтерге арналған ELISA негізіндегі моноклоналды антиденелерді скринингтеу. Мұнда (A) олигосахаридтерді біріктірілген биотинилдеу және кейіннен нейтравидинмен қапталған пластиналарда гликанға бағытталған mAbs көмегімен ELISA скринингі және (B) реакция өнімдерін биотинилдеудің бір сатылы процедурасы көрсетілген.
Олигосахаридпен конъюгацияланған антиденелермен авидинмен қапталған пластиналар бастапқы және екінші реттік антиденелерге қосылып, жарық пен уақытқа сезімтал ортада жуылды. Антидене байланысы аяқталғаннан кейін, пластинаны инкубациялау үшін TMB субстратын қосыңыз. Реакция ақырында күкірт қышқылымен тоқтатылды. Инкубацияланған пластиналар антиденелерге тән айқаспалы байланысты анықтау үшін әрбір антидененің байланысу күшін анықтау үшін ELISA оқу құрылғысын пайдаланып талданды. Тәжірибенің егжей-тегжейлері мен параметрлерін «Материалдар мен әдістер» бөлімінен қараңыз.
Біз ACSH құрамындағы еритін олигосахаридтерді, сондай-ақ лигноцеллюлозалық гидролизаттардан бөлініп алынған шикі және тазартылған олигосахарид фракцияларын сипаттау арқылы осы жаңадан жасалған әдістің нақты қолданбалар үшін пайдалылығын көрсетеміз. 3-суретте көрсетілгендей, биоацилденген гликом талдау әдістерін қолдана отырып, ACSH-да анықталған ең көп таралған эпитоп алмастырылған ксиландар әдетте урондық (U) немесе метилурондық (MeU) және пектикалық арабиногалактандар болып табылады. Олардың көпшілігі гидролизденбеген қатты заттардың (UHS) гликандарын талдау бойынша алдыңғы зерттеуімізде де табылған43.
Жасуша қабырғасының гликанына бағытталған моноклоналды антиденені пайдаланып, қажымайтын олигосахарид эпитоптарын анықтау. «Бейтарап» фракция - ACN фракциясы, ал «қышқыл» фракция - FA фракциясы. Жылу картасындағы ашық қызыл түстер эпитоптың жоғары құрамын, ал ашық көк түстер бос фонды көрсетеді. Шкаладағы түс мәндері N=2 формулалары үшін шикі OD мәндеріне негізделген. Антиденелер таныған негізгі эпитоптар оң жақта көрсетілген.
Бұл целлюлоза емес құрылымдарды ең көп қолданылатын коммерциялық ферменттерді қамтитын, тексерілген коммерциялық фермент қоспасындағы ең көп таралған целлюлазалар мен гемицеллюлазалар бөле алмады. Сондықтан олардың гидролизі үшін жаңа қосалқы ферменттер қажет. Қажетті целлюлоза емес қосалқы ферменттерсіз бұл целлюлоза емес байланыстар моносахаридтерге толық айналуына кедергі келтіреді, тіпті олардың бастапқы қант полимерлері қысқа фрагменттерге кеңінен гидролизденіп, коммерциялық фермент қоспаларын пайдаланып ерітілген болса да.
Сигналдың таралуын және оның байланысу күшін одан әрі зерттеу димерлерде байланыстыру эпитоптарының жоғары DP қант фракцияларында (A, B, C, DP 20+ дейін) төмен DP фракцияларына (D, E, F, DP) қарағанда төмен екенін көрсетті (1-сурет). Қышқыл фрагменттері целлюлоза емес эпитоптарда бейтарап фрагменттерге қарағанда жиі кездеседі. Бұл құбылыстар біздің алдыңғы зерттеуімізде байқалған үлгіге сәйкес келеді, онда жоғары DP және қышқыл бөліктері ферментативті гидролизге төзімдірек болды. Сондықтан, целлюлоза емес гликан эпитоптарының және U және MeU алмастыруларының болуы олигосахаридтердің тұрақтылығына үлкен үлес қоса алады. Төмен DP олигосахаридтері үшін байланыстыру және анықтау тиімділігі проблемалы болуы мүмкін екенін атап өткен жөн, әсіресе эпитоп димерлі немесе тримерлі олигосахарид болса. Мұны әртүрлі ұзындықтағы коммерциялық олигосахаридтерді пайдаланып тексеруге болады, олардың әрқайсысында белгілі бір mAb-пен байланысатын тек бір эпитоп бар.
Осылайша, құрылымға тән антиденелерді қолдану белгілі бір түрдегі бағынбайтын байланыстарды анықтады. Қолданылатын антидене түріне, тиісті лигатура үлгісіне және ол шығаратын сигналдың күшіне (ең көп және ең аз мөлшерде) байланысты жаңа ферменттерді анықтауға және гликоконверсияны толық алу үшін фермент қоспасына жартылай сандық түрде қосуға болады. Мысал ретінде ACSH олигосахаридтерін талдауды ала отырып, әрбір биомасса материалы үшін гликан байланыстарының дерекқорын жасай аламыз. Мұнда антиденелердің әртүрлі аффинділігін ескеру қажет екенін және егер олардың аффинділігі белгісіз болса, бұл әртүрлі антиденелердің сигналдарын салыстырған кезде белгілі бір қиындықтар туғызатынын атап өткен жөн. Сонымен қатар, гликан байланыстарын салыстыру бірдей антидене үшін үлгілер арасында ең жақсы жұмыс істеуі мүмкін. Содан кейін бұл қыңыр байланыстарды CAZyme дерекқорына байланыстыруға болады, одан біз ферменттерді анықтай аламыз, кандидат ферменттерді таңдай аламыз және байланыс үзетін ферменттерді тексере аламыз немесе биоөңдеу зауыттарында пайдалану үшін осы ферменттерді экспрессиялау үшін микробтық жүйелерді жасай аламыз44.
Лигноцеллюлозалық гидролизаттарда кездесетін төмен молекулалық салмақты олигосахаридтерді сипаттаудың балама әдістерін иммунологиялық әдістердің қалай толықтыратынын бағалау үшін біз MALDI (4-сурет, S1-S8) және GC-MS негізіндегі TMS-тен алынған сахаридтерді талдауды сол панельде (5-сурет) олигосахарид бөлігінде жүргіздік. MALDI олигосахарид молекулаларының массалық таралуы мақсатты құрылымға сәйкес келетінін салыстыру үшін қолданылады. 4-суретте ACN-A және ACN-B бейтарап компоненттерінің MC көрсетілген. ACN-A талдауы DP 4-8 (4-сурет) бастап DP 22 (S1-сурет) дейінгі пентоза қанттарының диапазонын растады, олардың салмағы MeU-ксилан олигосахаридтеріне сәйкес келеді. ACN-B талдауы DP 8-15 бар пентоза мен глюкоксилан қатарын растады. S3 суреті сияқты қосымша материалдарда FA-C қышқылдық бөлігінің массалық таралу карталары ELISA негізіндегі mAb скринингінде табылған алмастырылған ксиландармен сәйкес келетін DP 8-15 болатын (Me)U алмастырылған пентоза қанттарының диапазонын көрсетеді. Эпитоптар біркелкі.
ACS құрамындағы еритін, сәйкес келмейтін олигосахаридтердің MALDI-MS спектрі. Мұнда, (A) метилденген урон қышқылы (DP 4-8) алмастырылған глюкуроксилан олигосахаридтерін қамтитын ACN-A төмен салмақ диапазонындағы фракциялар және (B) глюкуроксиланмен алмастырылған ACN-B ксилан және метилденген урон қышқылы олигосахаридтері (DP 8-15).
Отқа төзімді олигосахаридтердің гликан қалдығының құрамын талдау. Мұнда (A) GC-MS талдауы арқылы алынған әртүрлі олигосахарид фракцияларының TMS сахаридінің құрамы. (B) Олигосахаридтерде кездесетін әртүрлі TMS-тен алынған қанттардың құрылымдары. ACN – бейтарап олигосахаридтерді қамтитын ацетонитрил фракциясы және FA – қышқыл олигосахаридтерді қамтитын ферул қышқылының фракциясы.
S9 суретте көрсетілгендей, олигосахарид фракциясының LC-MS талдауынан тағы бір қызықты қорытынды жасалды (әдістерді электрондық қосымша материалдан көруге болады). ACN-B фракциясын байлау кезінде гексоза және -OAc топтарының фрагменттері бірнеше рет байқалды. Бұл жаңалық гликом мен MALDI-TOF талдауында байқалған фрагментацияны растап қана қоймай, сонымен қатар алдын ала өңделген лигноцеллюлозалық биомассадағы көмірсулардың туындыларының әлеуеті туралы жаңа ақпарат береді.
Біз сондай-ақ TMS қант туындысын қолдана отырып, олигосахарид фракциясының қант құрамын талдадық. GC-MS көмегімен біз олигосахарид фракциясындағы нейрондық (туынды емес) және қышқыл қанттардың (GluA және GalA) құрамын анықтадық (5-сурет). Глюкурон қышқылы C және D қышқыл компоненттерінде кездеседі, ал галактурон қышқылы A және B қышқыл компоненттерінде кездеседі, олардың екеуі де қышқыл қанттардың жоғары DP компоненттері болып табылады. Бұл нәтижелер біздің ELISA және MALDI деректерімізді растап қана қоймай, сонымен қатар олигосахаридтердің жиналуын зерттеу бойынша бұрынғы зерттеулерімізге де сәйкес келеді. Сондықтан, біз олигосахаридтердің биотинилденуін және кейінгі ELISA скринингін қолданатын заманауи иммунологиялық әдістер әртүрлі биологиялық үлгілерде еритін еритін олигосахаридтерді анықтау үшін жеткілікті деп санаймыз.
ELISA негізіндегі mAb скрининг әдістері бірнеше түрлі әдістермен тексерілгендіктен, біз бұл жаңа сандық әдістің әлеуетін одан әрі зерттегіміз келді. Екі коммерциялық олигосахарид, ксилогексахарид олигосахариді (XHE) және 23-α-L-арабинофуранозил-ксилотриоза (A2XX) сатып алынып, жасуша қабырғасының гликанына бағытталған жаңа mAb тәсілін қолдана отырып сыналды. 6-суретте биотинилденген байланыс сигналы мен олигосахарид концентрациясының логарифмдік концентрациясы арасындағы сызықтық корреляция көрсетілген, бұл Ленгмюр адсорбция моделінің мүмкін екенін көрсетеді. mAbs арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 және CCRC-M151 XHE-мен корреляцияланды, ал CCRC-M108, CCRC-M109 және LM11 1 нм-ден 100 наноға дейінгі диапазонда A2XX-пен корреляцияланды. Тәжірибе кезінде антиденелердің шектеулі қолжетімділігіне байланысты әрбір олигосахарид концентрациясымен шектеулі тәжірибелер жүргізілді. Мұнда кейбір антиденелер субстрат ретінде бірдей олигосахаридке өте әртүрлі әсер ететінін атап өткен жөн, себебі олар сәл өзгеше эпитоптармен байланысады және өте әртүрлі байланысу қасиеттеріне ие болуы мүмкін. Жаңа mAb тәсілі нақты үлгілерге қолданылған кезде эпитоптарды дәл анықтау механизмдері мен салдары әлдеқайда күрделі болады.
Әртүрлі гликанға бағытталған mAb анықтау диапазонын анықтау үшін екі коммерциялық олигосахарид пайдаланылды. Мұнда олигосахарид концентрациясының логарифмдік концентрациясымен сызықтық корреляциялар (A) mAb бар XHE және (B) mAb бар A2XX үшін Ленгмюр адсорбция үлгілерін көрсетеді. Сәйкес эпитоптар талдауда субстраттар ретінде пайдаланылған коммерциялық олигосахаридтердің құрылымдарын көрсетеді.
Гликанға бағытталған моноклоналды антиденелерді қолдану (гликокомикалық талдау немесе ELISA негізіндегі mAb скринингі) өсімдік биомассасын құрайтын негізгі жасуша қабырғасы гликандарының көпшілігін терең сипаттау үшін қуатты құрал болып табылады. Дегенмен, классикалық гликан талдауы тек үлкенірек жасуша қабырғасы гликандарын сипаттайды, себебі олигосахаридтердің көпшілігі ELISA тақталарында тиімді иммобилизацияланбайды. Бұл зерттеуде AFEX-пен алдын ала өңделген жүгері ұны қатты заттардың жоғары мөлшерінде ферментативті түрде гидролизденді. Гидролизаттағы қайта қалпына келтірілген жасуша қабырғасы көмірсуларының құрамын анықтау үшін қант талдауы қолданылды. Дегенмен, гидролизаттағы кішірек олигосахаридтердің mAb талдауы бағаланбайды және ELISA тақталарындағы олигосахаридтерді тиімді иммобилизациялау үшін қосымша құралдар қажет.
Біз мұнда NeutrAvidin™ қапталған пластиналарында олигосахарид биотинилденуін және одан кейін ELISA скринингін біріктіру арқылы mAb скринингі үшін жаңа және тиімді олигосахарид иммобилизациялау әдісін ұсынамыз. Иммобилизацияланған биотинилденген олигосахаридтер антидене үшін жеткілікті аффинділікті көрсетті, бұл қалпына келмейтін олигосахаридтерді тез және тиімді анықтауға мүмкіндік береді. Масс-спектрометрияға негізделген осы қиын олигосахаридтердің құрамын талдау иммуноскринингке арналған осы жаңа тәсілдің нәтижелерін растады. Осылайша, бұл зерттеулер олигосахарид биотинилденуін және ELISA скринингін гликанға бағытталған моноклоналды антиденелермен біріктіруді олигосахаридтердегі айқас байланыстарды анықтау үшін пайдалануға болатынын және олигосахаридтердің құрылымын сипаттайтын басқа биохимиялық зерттеулерде кеңінен қолданыла алатынын көрсетеді.
Бұл биотинге негізделген гликан профилін жасау әдісі өсімдік биомассасындағы еритін олигосахаридтердің көмірсулардағы байланыстарын зерттеуге қабілетті алғашқы есеп болып табылады. Бұл биомассаның кейбір бөліктерінің биоотын өндірісіне келгенде неге соншалықты қатал екенін түсінуге көмектеседі. Бұл әдіс гликомды талдау әдістеріндегі маңызды олқылықты толтырады және оны өсімдік олигосахаридтерінен тыс кеңірек субстраттарға қолдануды кеңейтеді. Болашақта біз биотинилдеу үшін робототехниканы пайдалануымыз және ELISA көмегімен үлгілерді жоғары өнімділікпен талдау үшін әзірлеген әдісімізді қолдануымыз мүмкін.
Pioneer 33A14 гибридті тұқымдарынан өсірілген жүгері сабаны (ЖС) 2010 жылы Колорадо штатының Рей қаласындағы Kramer Farms фермасынан жиналды. Жер иесінің рұқсатымен бұл биомассаны зерттеу үшін пайдалануға болады. Үлгілер бөлме температурасында құрғақ, ылғалдылығы 6%-дан аз пакеттерде сақталды. Үлгілер бөлме температурасында құрғақ, ылғалдылығы 6%-дан аз пакеттерде сақталды. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае. Үлгілер бөлме температурасында, сыдырмалы пакеттерде <6% ылғалдылықта құрғақ күйінде сақталды.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температурае с влажностью < 6%. Үлгілер бөлме температурасында, ылғалдылығы < 6% болатын сыдырмалы пакеттерде сақталады.Зерттеу жергілікті және ұлттық нұсқауларға сәйкес келді. Құрамдық талдау NREL хаттамасын қолдану арқылы жүргізілді. Құрамында 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% ақуыз және 13,4% күл бар екені анықталды.
Cellic® CTec2 (138 мг ақуыз/мл, партия VCNI 0001) - Novozymes (Франклинтон, Солтүстік Каролина, АҚШ) компаниясынан алынған целлюлоза, β-глюкозидаза және Cellic® HTec2 (157 мг ақуыз/мл, партия VHN00001) күрделі қоспасы. Пектинді ыдырататын ферменттердің күрделі қоспасы Multifect Pectinase® (72 мг ақуыз/мл) DuPont Industrial Biosciences (Пало-Альто, Калифорния, АҚШ) компаниясы сыйға тартты. Фермент ақуызының концентрациясы Kjeldahl азот талдауын (AOAC әдісі 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Итака, Нью-Йорк, АҚШ) қолдана отырып, ақуыз мөлшерін бағалау (және ақуыз емес азоттың үлесін алып тастау) арқылы анықталды. Диатомды жер 545 EMD Millipore (Billerica, MA) компаниясынан сатып алынды. Белсендірілген көмір (DARCO, 100 торлы түйіршіктер), Avicel (PH-101), шамшат ксиланы және басқа да барлық химиялық заттар Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) компаниясынан сатып алынды.
AFEX алдын ала өңдеуі GLBRC-де (Биомассаны конверсиялауды зерттеу зертханасы, MSU, Лансинг, MI, АҚШ) жүргізілді. Алдын ала өңдеу 140°C температурада 15 минут бойы жүргізілді. 46 минут бойы сусыз аммиактың биомассаға 1:1 қатынасында тот баспайтын болаттан жасалған үстел үстілік реакторда (Parr Instruments Company) 60% (салмақ/салмақ) жүктемемен жүргізілді. Бұл 30 минутқа созылды. Реактор 140°C-қа жеткізілді және аммиак тез бөлініп шықты, бұл биомассаның бөлме температурасына тез оралуына мүмкіндік берді. AFEX алдын ала өңделген жүгері пешінің (ACS) құрамы өңделмеген жүгері пешінің (UT-CS) құрамына ұқсас болды.
Олигосахаридтерді ірі көлемде өндіру үшін бастапқы материал ретінде жоғары қатты заттар ACSH 25% (салмақ/салмақ) (шамамен 8% декстран жүктемесі) дайындалды. ACS ферментативті гидролизі Cellic® Ctec2 10 мг ақуыз/г глюкан (алдын ала өңделген биомассада), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 мг ақуыз/г глюкан және Multifect Pectinase (Genencor Inc, АҚШ) қамтитын коммерциялық фермент қоспасын пайдалану арқылы жүргізілді. Ферментативті гидролиз жұмыс көлемі 3 литр, рН 4,8, 50°C және 250 айн/мин болатын 5 литрлік биореакторда жүргізілді. 96 сағат бойы гидролизден кейін гидролизат гидролизденбеген қатты заттарды кетіру үшін 6000 айн/мин жылдамдықпен 30 минут бойы, содан кейін 14000 айн/мин жылдамдықпен 30 минут бойы центрифугалау арқылы жиналды. Содан кейін гидролизат 0,22 мм сүзгі стаканы арқылы стерильді сүзгіден өткізілді. Сүзілген гидролизат стерильді бөтелкелерде 4°C температурада сақталды, содан кейін көміртегіге фракцияланды.
NREL зертханалық талдау процедураларына сәйкес сығынды негізіндегі биомасса үлгілерінің құрамын талдау: құрамды талдауға үлгілерді дайындау (NREL/TP-510-42620) және биомассадағы құрылымдық көмірсулар мен лигнинді анықтау (NREL/TP-510 – 42618)47.
Гидролизат ағынының олигосахаридтік талдауы автоклав негізіндегі қышқыл гидролизі әдісін қолдана отырып, 2 мл шкала бойынша жүргізілді. Гидролизат үлгісін 10 мл бұрандалы қақпақты дақыл түтігінде 69,7 мкл 72% күкірт қышқылымен араластырып, 121 °C температурада үстел үстінде 1 сағат инкубациялаңыз, мұзда суытыңыз және жоғары өнімді сұйық хроматография (ЖСХХ) құтысына сүзіңіз. Олигосахаридтердің концентрациясы қышқыл-гидролизденген үлгідегі жалпы қант концентрациясынан гидролизденбеген үлгідегі моносахаридтердің концентрациясын алып тастау арқылы анықталды.
Қышқыл гидролизденген биомассадағы глюкоза, ксилоза және арабиноза концентрациялары Bio-Rad Aminex HPX-87H бағанындағы автоүлгілеуші, баған жылытқышы, изократиялық сорғы және сыну көрсеткіші детекторымен жабдықталған Shimadzu HPLC жүйесін пайдаланып талданды. Баған 50°C температурада ұсталып, 0,6 мл/мин 5 мМ H2SO4 су ағынымен элюцияланды.
Гидролизаттың үстіңгі қабаты сұйылтылып, мономер мен олигосахарид құрамы талданды. Ферментативті гидролизден кейін алынған мономерлі қанттар Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P бағанымен және күл қорғағыш бағанымен жабдықталған HPLC арқылы талданды. Баған температурасы 80°C температурада сақталды, жылжымалы фаза ретінде су 0,6 мл/мин ағын жылдамдығымен пайдаланылды. Олигосахаридтер 41, 48, 49 сілтемелерде сипатталған әдістерге сәйкес 121°C температурада сұйылтылған қышқылда гидролиз арқылы анықталды.
Сахаридті талдау шикі, AFEX алдын ала өңделген және барлық гидролизденбеген биомасса қалдықтарында (сериялық жасуша қабырғасының сығындыларын өндіруді және олардың mAb скринингін қоса алғанда) бұрын сипатталған 27, 43, 50, 51 процедураларын қолдана отырып жүргізілді. Гликомды талдау үшін өсімдік жасуша қабырғасы материалының спиртте ерімейтін қалдықтары биомасса қалдықтарынан дайындалады және бұрын сипатталғандай аммоний оксалат (50 мМ), натрий карбонаты (50 мМ және 0,5% w/v), CON (1M және 4M, екеуі де 1% w/v натрий борогидридімен) және қышқыл хлориті сияқты агрессивті реагенттермен сериялық экстракцияға ұшырайды52,53. Содан кейін экстракттар жасуша қабырғасының гликанына бағытталған mAb50 күрделі панеліне қарсы ELISA-ға ұшырады, ал mAb байланысу реакциялары жылу картасы ретінде ұсынылды. Өсімдік жасуша қабырғасының гликанына бағытталған mAb зертханалық қорлардан (CCRC, JIM және MAC сериялары) сатып алынды.
Олигосахаридтердің бір сатылы биотинилденуі. Көмірсулардың биотин-LC-гидразидпен конъюгациясы келесі процедураны қолдану арқылы жүргізілді. Биотин-LC-гидразид (4,6 мг/12 мкмоль) диметилсульфоксидте (DMSO, 70 мкл) қарқынды араластыру және 65°C температурада 1 минут қыздыру арқылы ерітілді. Мұздық сірке қышқылы (30 мкл) қосылып, қоспа натрий цианоборогидридіне (6,4 мг/100 мкмоль) құйылып, 65°C температурада шамамен 1 минут қыздырғаннан кейін толығымен ерітілді. Содан кейін, кептірілген олигосахаридке (1-100 нмоль) реакция қоспасының 5-тен 8 мкл-ге дейін қосылып, тотықсыздандырғыш ұшынан 10 есе немесе одан да көп молярлық артық зат алынды. Реакция 65°C температурада 2 сағат бойы жүргізілді, содан кейін үлгілер дереу тазартылды. Таңбалау тәжірибелерінде тотықсыздандырылмаған натрий цианоборогидриді қолданылмады, ал үлгілер 65°C температурада 2,5 сағат бойы реакцияға түсті.
Биотинделген олигосахаридтердің үлгілерін ELISA арқылы жабу және жуу. Авидинмен қапталған пластинаның әрбір ұяшығына 25 мкл биотинделген үлгілер (әрбір концентрацияланған үлгіден 100 мкл 5 мл 0,1 М Трис буферлік ерітіндісінде (TBS) сұйылтылған) қосылды. Бақылау ұяшықтары 0,1 М TBS ерітіндісінде 10 мкг/мл концентрациясында 50 мкл биотинмен жабылды. Бос өлшемдер үшін жабын ретінде деионизацияланған су пайдаланылды. Таблетка бөлме температурасында қараңғы жерде 2 сағат бойы инкубацияланды. Grenier flat 3A үшін №11 бағдарламаны пайдаланып, пластинаны 0,1 М TBS ерітіндісінде 0,1% майсыздандырылған сүтпен 3 рет жуыңыз.
Бастапқы антиденелерді қосу және жуу. Әр ұяшыққа 40 мкл бастапқы антидене қосыңыз. Микропластинаны бөлме температурасында қараңғыда 1 сағат бойы инкубациялаңыз. Содан кейін пластиналар Grenier Flat 3A үшін №11 жуу бағдарламасын пайдаланып, 0,1% сүтпен 0,1 мл TBS-те 3 рет жуылды.
Екінші реттік антиденелерді қосып, жуыңыз. Әр ұяшыққа 50 мкл тышқан/егеуқұйрық екінші реттік антиденелерін (0,1% сүтте 0,1 M TBS ерітіндісінде 1:5000 сұйылтылған) қосыңыз. Микропластинаны бөлме температурасында қараңғы жерде 1 сағат бойы инкубациялаңыз. Содан кейін микропластиналар Grenier Flat 5A пластина жуу бағдарламасы №12 көмегімен 0,1% сүтте 0,1 M TBS ерітіндісінде 5 рет жуылды.
Субстрат қосу. Негізгі субстратқа 50 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB) қосыңыз (15 мл деионизацияланған суға 2 тамшы буфер, 3 тамшы TMB, 2 тамшы сутегі асқын тотығын қосу арқылы). TMB субстратын дайындаңыз. Қолданар алдында араластырыңыз). Микропластинаны бөлме температурасында 30 минут бойы инкубациялаңыз. Қараңғы жерде.
Қадамды аяқтап, планшетті оқыңыз. Әр ұяшыққа 50 мкл 1 Н күкірт қышқылын қосып, ELISA оқу құралын пайдаланып, 450-ден 655 нм-ге дейінгі абсорбцияны жазып алыңыз.
Осы аналиттердің 1 мг/мл ерітінділерін деионизацияланған суда дайындаңыз: арабиноза, рамноза, фукоза, ксилоза, галактурон қышқылы (GalA), глюкурон қышқылы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (manNAc), N-ацетилглюкозамин. (glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (ішкі стандарт). 1-кестеде көрсетілген 1 мг/мл қант ерітінділерін қосу арқылы екі стандарт дайындалды. Үлгілер барлық су алынғанша (әдетте шамамен 12-18 сағат) -80°C температурада мұздатылған және лиофилизацияланған.
Аналитикалық таразыдағы қақпақты түтіктерге бұрап бекіту үшін 100–500 мкг үлгі қосыңыз. Қосылған мөлшерді жазып алыңыз. Үлгіні белгілі бір концентрациядағы еріткіште ерітіп, оны түтікке сұйық аликвот ретінде қосқан дұрыс. Әрбір үлгі түтігі үшін ішкі стандарт ретінде 20 мкл 1 мг/мл инозитолды пайдаланыңыз. Үлгіге қосылған ішкі стандарт мөлшері стандартты түтікке қосылған ішкі стандарт мөлшерімен бірдей болуы керек.
Бұрандалы қақпағы бар құтыға 8 мл сусыз метанол қосыңыз. Содан кейін 4 мл 3 Н метанолды HCl ерітіндісін қосып, қақпағын жауып, шайқаңыз. Бұл процесс суды пайдаланбайды.
Олигосахарид үлгілеріне және стандартты TMS түтіктеріне 500 мкл 1 М HCl метанол ерітіндісін қосыңыз. Үлгілер 80°C температурада түні бойы (168 сағат) термиялық блокта инкубацияланды. Метанолиз өнімін бөлме температурасында кептіргіш коллекторды пайдаланып кептіріңіз. 200 мкл MeOH қосып, қайтадан кептіріңіз. Бұл процесс екі рет қайталанады. Үлгіге 200 мкл метанол, 100 мкл пиридин және 100 мкл сірке ангидриді қосып, жақсылап араластырыңыз. Үлгілер бөлме температурасында 30 минут инкубацияланды және кептірілді. 200 мкл метанол қосып, қайтадан кептіріңіз.
200 мкл Tri-Sil қосып, қақпағы жабылған түтікті 20 минут бойы 80°C температурада қыздырыңыз, содан кейін бөлме температурасына дейін суытыңыз. Үлгіні шамамен 50 мкл көлемге дейін кептіру үшін кептіру коллекторын пайдаланыңыз. Үлгілердің толық кебуіне жол бермегенімізді ескеру маңызды.
2 мл гексан қосып, жақсылап араластырыңыз. Пастер пипеткаларының (5-8 мм) ұштарын шыны жүнді диаметрі 5-3/4 дюймдік пипетканың үстіне салу арқылы шыны жүннің бір бөлігімен толтырыңыз. Үлгілер 3000 г-да 2 минут бойы центрифугаланды. Ерімейтін қалдықтар тұнбаға түседі. Үлгіні 100-150 мкл дейін кептіріңіз. GC-MS-ке шамамен 1 мкл көлем бастапқы температурада 80 °C және бастапқы 2,0 минут уақытында енгізілді (2-кесте).