Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസർ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുണ്ട്.മികച്ച അനുഭവത്തിനായി, നിങ്ങൾ ഒരു അപ്‌ഡേറ്റ് ചെയ്‌ത ബ്രൗസർ ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).അതിനിടയിൽ, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ശൈലികളും JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് റെൻഡർ ചെയ്യും.
കോൺ സ്റ്റൗവറിലെ സ്ഥിരമായ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ വിശകലനത്തിനായി പുതിയ രോഗപ്രതിരോധ, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിക് രീതികൾ AFEX ഉപയോഗിച്ച് മുൻകൂട്ടി തയ്യാറാക്കിയിട്ടുണ്ട്.ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ് ഫോസിൽ ഇന്ധനങ്ങൾക്ക് സുസ്ഥിരമായ ഒരു ബദലാണ്, ഭക്ഷണം, തീറ്റ, ഇന്ധനങ്ങൾ, രാസവസ്തുക്കൾ തുടങ്ങിയ ഉൽപന്നങ്ങളുടെ ഉൽപ്പാദനത്തിനായി ബയോടെക്നോളജി വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ചെടികളുടെ കോശഭിത്തികളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളെ ഗ്ലൂക്കോസ്, സൈലോസ്, അറബിനോസ് തുടങ്ങിയ ലളിതമായ പഞ്ചസാരകളാക്കി മാറ്റുന്നതിനുള്ള ചെലവ്-മത്സര പ്രക്രിയകളുടെ വികസനമാണ് ഈ സാങ്കേതികവിദ്യകളുടെ താക്കോൽ.ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ് വളരെ ശാഠ്യമുള്ളതിനാൽ, ആവശ്യമുള്ള ഉൽപ്പന്നം ലഭിക്കുന്നതിന് അത് തെർമോകെമിക്കൽ ചികിത്സകൾക്കും (ഉദാ, അമോണിയ ഫൈബർ എക്സ്ഫോളിയേഷൻ (AFEX), നേർപ്പിച്ച ആസിഡുകൾ (DA), അയോണിക് ദ്രാവകങ്ങൾ (IL)) ജൈവ ചികിത്സകൾക്കും (ഉദാ, എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ്, മൈക്രോബയൽ ഫെർമെന്റേഷൻ) വിധേയമാക്കണം..എന്നിരുന്നാലും, ജലവിശ്ലേഷണ പ്രക്രിയയിൽ വാണിജ്യ ഫംഗൽ എൻസൈമുകൾ ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, രൂപം കൊള്ളുന്ന ലയിക്കുന്ന പഞ്ചസാരയുടെ 75-85% മാത്രമേ മോണോസാക്രറൈഡുകളാകൂ, ശേഷിക്കുന്ന 15-25% ലയിക്കുന്നതും അവ്യക്തവുമായ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളാണ്, അവ എല്ലായ്പ്പോഴും സൂക്ഷ്മാണുക്കൾക്ക് ലഭ്യമല്ല.മുമ്പ്, കാർബൺ, ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്ത് വേർതിരിക്കൽ, വലുപ്പം ഒഴിവാക്കൽ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി എന്നിവയുടെ സംയോജനം ഉപയോഗിച്ച് ലയിക്കുന്ന മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഞങ്ങൾ വിജയകരമായി വേർതിരിച്ച് ശുദ്ധീകരിച്ചു, കൂടാതെ അവയുടെ എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്ററി ഗുണങ്ങളും പരിശോധിച്ചു.കുറഞ്ഞ ഡിപി, ന്യൂട്രൽ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ എന്നിവയെ അപേക്ഷിച്ച് ഉയർന്ന അളവിലുള്ള പോളിമറൈസേഷൻ (ഡിപി) മെഥൈലേറ്റഡ് യൂറോണിക് ആസിഡ് സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ അടങ്ങിയ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നത് കൂടുതൽ ബുദ്ധിമുട്ടാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.പ്ലാന്റ് സെൽ ഭിത്തികളിലും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിലും ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകൾ, മാട്രിക്സ്-അസിസ്റ്റഡ് ലേസർ ഡിസോർപ്ഷൻ അയോണൈസേഷൻ, ടൈം-ഓഫ്-ഫ്ലൈറ്റ് മാസ്-സ്പെക്ട്രോമെട്രി എന്നിവയിൽ ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളുടെ സ്വഭാവം വ്യക്തമാക്കുന്നതിന് പ്ലാന്റ് ബയോമാസ് ഗ്ലൈക്കാനുകൾക്ക് പ്രത്യേകമായ മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ (എംഎബിഎസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഗ്ലൈക്കാൻ പ്രൊഫൈലിംഗ് ഉൾപ്പെടെ നിരവധി അധിക രീതികളുടെ ഉപയോഗം ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു..നെഗറ്റീവ് അയോണുകൾ, ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (ജിസി-എംഎസ്) എന്നിവയുടെ ദ്വിതീയ ക്ഷയത്തിന് ശേഷം സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി വഴി ലഭിച്ച ഘടന-വിജ്ഞാനപരമായ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് കൊടുമുടികൾ, ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ചും അല്ലാതെയും ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബോണ്ടുകളെ ചിത്രീകരിക്കാൻ MALDI-TOF-MS ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ (DP 4-20) ചെറിയ വലിപ്പം കാരണം, ഈ തന്മാത്രകൾ mAb ബൈൻഡിംഗിനും സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനും ഉപയോഗിക്കാൻ പ്രയാസമാണ്.ഈ പ്രശ്‌നം മറികടക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഒരു പുതിയ ബയോട്ടിൻ സംയോജന-അടിസ്ഥാന ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഇമ്മൊബിലൈസേഷൻ രീതി പ്രയോഗിച്ചു, അത് മൈക്രോപ്ലേറ്റ് പ്രതലത്തിൽ ഭൂരിഭാഗം കുറഞ്ഞ ഡിപി ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളും വിജയകരമായി ലേബൽ ചെയ്‌തു, അത് പ്രത്യേക ലിഗേഷൻ വിശകലനത്തിനായി ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് mAb സിസ്റ്റത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചു.രോഗനിർണ്ണയ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ബയോമാർക്കറുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളെ വേർതിരിച്ചറിയാനും സ്വഭാവം കാണിക്കാനും ഉപയോഗിക്കാവുന്ന ഭാവിയിൽ കൂടുതൽ വിപുലമായ ഹൈ ത്രൂപുട്ട് ഗ്ലൈക്കോം അസെകൾ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന് ഈ പുതിയ രീതി സഹായിക്കും.
ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസ്, കാർഷിക, വനം, പുല്ല്, മരംകൊണ്ടുള്ള വസ്തുക്കൾ എന്നിവ ചേർന്നതാണ്, ഉയർന്ന മൂല്യമുള്ള ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഭക്ഷണം, തീറ്റ, ഇന്ധനം, രാസ മുൻഗാമികൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള ജൈവ അധിഷ്ഠിത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഉൽപാദനത്തിനുള്ള സാധ്യതയുള്ള ഫീഡ്സ്റ്റോക്കാണ്1.സസ്യകോശ ഭിത്തികളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകൾ (സെല്ലുലോസ്, ഹെമിസെല്ലുലോസ് എന്നിവ) രാസ സംസ്കരണത്തിലൂടെയും ബയോ ട്രാൻസ്ഫോർമേഷനിലൂടെയും (എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ്, മൈക്രോബയൽ ഫെർമെന്റേഷൻ പോലുള്ളവ) മോണോസാക്രറൈഡുകളായി ഡിപോളിമറൈസ് ചെയ്യുന്നു.സാധാരണ പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റുകളിൽ അമോണിയ ഫൈബർ എക്സ്പാൻഷൻ (AFEX), നേർപ്പിച്ച ആസിഡ് (DA), അയോണിക് ലിക്വിഡ് (IL), സ്റ്റീം സ്ഫോടനം (SE) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, ഇത് സസ്യകോശ ഭിത്തികൾ തുറന്ന് ലിഗ്നോസെല്ലുലോസ് ഉത്പാദനം കുറയ്ക്കുന്നതിന് രാസവസ്തുക്കളും താപവും സംയോജിപ്പിച്ച് ഉപയോഗിക്കുന്നു3,4.ദ്രവ്യത്തിന്റെ പിടിവാശി, 5. വാണിജ്യാടിസ്ഥാനത്തിലുള്ള കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് അടങ്ങിയ എൻസൈമുകൾ (CAZymes) ഉപയോഗിച്ച് ഉയർന്ന സോളിഡ് ലോഡിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണം നടത്തുന്നു, കൂടാതെ ജൈവ അധിഷ്ഠിത ഇന്ധനങ്ങളും രാസവസ്തുക്കളും ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ട്രാൻസ്ജെനിക് യീസ്റ്റുകളോ ബാക്ടീരിയകളോ ഉപയോഗിച്ച് സൂക്ഷ്മജീവികളുടെ അഴുകൽ 6 .
വാണിജ്യ എൻസൈമുകളിലെ CAZymes എൻസൈമുകളുടെ ഒരു സങ്കീർണ്ണ മിശ്രിതം ചേർന്നതാണ്, അത് സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ്-പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകളെ സമന്വയിപ്പിച്ച് മോണോസാക്കറൈഡുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു.ഞങ്ങൾ നേരത്തെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതുപോലെ, കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുള്ള ലിഗ്നിന്റെ ആരോമാറ്റിക് പോളിമറുകളുടെ സങ്കീർണ്ണ ശൃംഖല അവയെ വളരെ അപ്രസക്തമാക്കുന്നു, ഇത് അപൂർണ്ണമായ പഞ്ചസാര പരിവർത്തനത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു, പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത ബയോമാസിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ് സമയത്ത് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കപ്പെടാത്ത 15-25% ലൈംഗിക ഒളിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ശേഖരിക്കുന്നു.വിവിധ ബയോമാസ് പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റ് രീതികളിലെ ഒരു സാധാരണ പ്രശ്നമാണിത്.ഈ തടസ്സത്തിനുള്ള ചില കാരണങ്ങളിൽ ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് എൻസൈം തടയൽ, അല്ലെങ്കിൽ സസ്യ ജൈവവസ്തുക്കളിൽ പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകൾ തകർക്കാൻ ആവശ്യമായ അവശ്യ എൻസൈമുകളുടെ അഭാവം അല്ലെങ്കിൽ കുറഞ്ഞ അളവ് എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളിലെ പഞ്ചസാര ബോണ്ടുകൾ പോലെയുള്ള പഞ്ചസാരയുടെ ഘടനയും ഘടനാപരമായ സവിശേഷതകളും മനസ്സിലാക്കുന്നത്, ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് പഞ്ചസാരയുടെ പരിവർത്തനം മെച്ചപ്പെടുത്താൻ ഞങ്ങളെ സഹായിക്കും, ബയോടെക്നോളജിക്കൽ പ്രക്രിയകൾ പെട്രോളിയം ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന ഉൽപ്പന്നങ്ങളുമായി ചെലവ് കുറഞ്ഞതാക്കും.
കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ ഘടന നിർണ്ണയിക്കുന്നത് വെല്ലുവിളി നിറഞ്ഞതാണ്, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (എൽസി)11,12, ന്യൂക്ലിയർ മാഗ്നറ്റിക് റെസൊണൻസ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി (എൻഎംആർ)13, കാപ്പിലറി ഇലക്ട്രോഫോറെസിസ് (സിഇ)14,15,16, മാസ്സ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (എംഎസ്)17 തുടങ്ങിയ രീതികളുടെ സംയോജനം ആവശ്യമാണ്.,പതിനെട്ടു.കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ഘടനകളെ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള ഒരു ബഹുമുഖ രീതിയാണ്, ടൈം-ഓഫ്-ഫ്ലൈറ്റ് മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി, മാട്രിക്സ് (MALDI-TOF-MS) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ലേസർ ഡിസോർപ്ഷൻ, അയോണൈസേഷൻ എന്നിവ പോലുള്ള MS രീതികൾ.അടുത്തിടെ, ഒളിഗോസാക്കറൈഡ് അറ്റാച്ച്‌മെന്റ് സ്ഥാനങ്ങൾ, അനോമെറിക് കോൺഫിഗറേഷനുകൾ, സീക്വൻസുകൾ, ബ്രാഞ്ചിംഗ് പൊസിഷനുകൾ 20, 21 എന്നിവയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട വിരലടയാളങ്ങൾ തിരിച്ചറിയാൻ സോഡിയം അയോൺ അഡക്‌റ്റുകളുടെ കൂട്ടിയിടി-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡിസോസിയേഷൻ (സിഐഡി) ടാൻഡം എംഎസ് ഏറ്റവും വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.
കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ബോണ്ടുകളെ ആഴത്തിൽ തിരിച്ചറിയുന്നതിനുള്ള മികച്ച ഉപകരണമാണ് ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം22.ഈ രീതി സങ്കീർണ്ണമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ബന്ധങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിനുള്ള പേടകങ്ങളായി സെൽ വാൾ ഗ്ലൈകാൻ പ്ലാന്റിലേക്ക് നയിക്കുന്ന മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ (mAbs) ഉപയോഗിക്കുന്നു.250-ലധികം mAbs ലോകമെമ്പാടും ലഭ്യമാണ്.സസ്യകോശങ്ങളുടെ തരം, അവയവം, പ്രായം, വളർച്ചാ ഘട്ടം, വളർച്ചാ പരിതസ്ഥിതി എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ച് കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ ഉള്ളതിനാൽ, ചെടിയുടെ കോശഭിത്തിയുടെ ഘടന, ഘടന, പരിഷ്‌ക്കരണങ്ങൾ എന്നിവയെ ചിത്രീകരിക്കാൻ നിരവധി mAbs വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കപ്പെടുന്നു.അടുത്തിടെ, ഈ രീതി സസ്യ-ജന്തു സമ്പ്രദായങ്ങളിലെ വെസിക്കിൾ പോപ്പുലേഷനും ഉപകോശ മാർക്കറുകൾ, വികസന ഘട്ടങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ പാരിസ്ഥിതിക ഉത്തേജനം എന്നിവയാൽ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്ന ഗ്ലൈക്കൻ ഗതാഗതത്തിൽ അവയുടെ പങ്ക് മനസ്സിലാക്കാനും എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനം നിർണ്ണയിക്കാനും ഉപയോഗിക്കുന്നു.പെക്റ്റിൻ (പി), സൈലാൻ (എക്സ്), മന്നൻ (എം), സൈലോഗ്ലൂക്കൻസ് (എക്‌സിൽജി), മിക്സഡ് ബോണ്ട് ഗ്ലൂക്കൻസ് (എംഎൽജി), അറബിനോക്സിലാൻ (ആർബിഎക്സ്), ഗാലക്റ്റോമാനൻ (ഗാൽജി), ഗ്ലൂക്കുറോണിക്) ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡും (ജിഎറാബിനോക്സൈലാൻ ആസിഡും) ഉൾപ്പെടുന്നു. 9.
എന്നിരുന്നാലും, ഈ ഗവേഷണ ശ്രമങ്ങളെല്ലാം ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് റിലീസ്, ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് ഒലിഗോമെറിക് ചെയിൻ ദൈർഘ്യം, വിവിധ ലോ ഡിപി പോളിമറുകൾ, അവയുടെ വളവുകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെ ഉയർന്ന സോളിഡ് ലോഡ് (എച്ച്എസ്എൽ) ജലവിശ്ലേഷണ സമയത്ത് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ശേഖരണത്തിന്റെ സ്വഭാവത്തെക്കുറിച്ച് കുറച്ച് പഠനങ്ങൾ മാത്രമേ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചിട്ടുള്ളൂ.വിതരണങ്ങൾ 30,31,32.അതേസമയം, ഗ്ലൈക്കൻ ഘടനയുടെ സമഗ്രമായ വിശകലനത്തിന് ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം ഒരു ഉപയോഗപ്രദമായ ഉപകരണമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ആന്റിബോഡി രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന ലോ ഡിപി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ വിലയിരുത്തുന്നത് ബുദ്ധിമുട്ടാണ്.5-10 kDa-ൽ താഴെയുള്ള തന്മാത്രാഭാരമുള്ള ചെറിയ DP ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ELISA പ്ലേറ്റുകൾ 33, 34 എന്നിവയുമായി ബന്ധിക്കുന്നില്ല, അവ ആന്റിബോഡി കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് കഴുകി കളയുന്നു.
ഇവിടെ, ആദ്യമായി, മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ച് എവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഞങ്ങൾ ഒരു ELISA പരിശോധന നടത്തുന്നു, ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനവുമായി ലയിക്കുന്ന റിഫ്രാക്ടറി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കുള്ള ഒരു-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ നടപടിക്രമം സംയോജിപ്പിക്കുന്നു.ഹൈഡ്രോലൈസ്ഡ് ഷുഗർ കോമ്പോസിഷനുകളുടെ ട്രൈമെതൈൽസിലിൽ (ടിഎംഎസ്) ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് കോംപ്ലിമെന്ററി ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ലിങ്കേജുകളുടെ MALDI-TOF-MS, GC-MS എന്നിവ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള വിശകലനം വഴി ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനത്തിലേക്കുള്ള ഞങ്ങളുടെ സമീപനം സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടു.ഈ നൂതനമായ സമീപനം ഭാവിയിൽ ഒരു ഹൈ-ത്രൂപുട്ട് രീതിയായി വികസിപ്പിക്കുകയും ബയോമെഡിക്കൽ ഗവേഷണത്തിൽ വിപുലമായ പ്രയോഗം കണ്ടെത്തുകയും ചെയ്യാം35.
ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷൻ പോലെയുള്ള എൻസൈമുകളുടെയും ആന്റിബോഡികളുടെയും വിവർത്തനത്തിനു ശേഷമുള്ള മാറ്റങ്ങൾ അവയുടെ ജൈവിക പ്രവർത്തനത്തെ ബാധിക്കുന്നു.ഉദാഹരണത്തിന്, സെറം പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷനിലെ മാറ്റങ്ങൾ കോശജ്വലന സന്ധിവാതത്തിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഗ്ലൈക്കോസൈലേഷനിലെ മാറ്റങ്ങൾ ഡയഗ്നോസ്റ്റിക് മാർക്കറുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു37.ദഹനനാളത്തിന്റെയും കരളിന്റെയും വിട്ടുമാറാത്ത കോശജ്വലന രോഗങ്ങൾ, വൈറൽ അണുബാധകൾ, അണ്ഡാശയം, സ്തനങ്ങൾ, പ്രോസ്റ്റേറ്റ് കാൻസർ എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ വിവിധ രോഗങ്ങളിൽ വിവിധ ഗ്ലൈക്കനുകൾ എളുപ്പത്തിൽ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നതായി സാഹിത്യത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.ആന്റിബോഡി അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഗ്ലൈക്കൻ എലിസ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെ ഘടന മനസ്സിലാക്കുന്നത് സങ്കീർണ്ണമായ എംഎസ് രീതികൾ ഉപയോഗിക്കാതെ തന്നെ രോഗനിർണയത്തിൽ കൂടുതൽ ആത്മവിശ്വാസം നൽകും.
മുൻകൂർ ചികിത്സയ്ക്കും എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണത്തിനും ശേഷവും കഠിനമായ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 1).ഞങ്ങളുടെ മുമ്പ് പ്രസിദ്ധീകരിച്ച സൃഷ്ടിയിൽ, AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റവർ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് (ACSH)8 ൽ നിന്ന് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ഞങ്ങൾ സജീവമാക്കിയ കരി സോളിഡ്-ഫേസ് എക്സ്ട്രാക്ഷൻ രീതി വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു.പ്രാരംഭ വേർതിരിച്ചെടുക്കലിനും വേർപിരിയലിനും ശേഷം, ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (എസ്ഇസി) വഴി കൂടുതൽ ഭിന്നിപ്പിക്കുകയും തന്മാത്രാ ഭാരം ക്രമത്തിൽ ശേഖരിക്കുകയും ചെയ്തു.വിവിധ പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റുകളിൽ നിന്ന് പുറത്തിറങ്ങിയ ഷുഗർ മോണോമറുകളും ഒലിഗോമറുകളും പഞ്ചസാരയുടെ ഘടന വിശകലനം വഴി വിശകലനം ചെയ്തു.വിവിധ പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റ് രീതികളിലൂടെ ലഭിച്ച ഷുഗർ ഒലിഗോമറുകളുടെ ഉള്ളടക്കം താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ, ബയോമാസ് മോണോസാക്രറൈഡുകളാക്കി മാറ്റുന്നതിൽ മുരടിച്ച ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാന്നിധ്യം ഒരു സാധാരണ പ്രശ്നമാണ്, ഇത് പഞ്ചസാരയുടെ വിളവ് കുറഞ്ഞത് 10-15% വരെയും 18% വരെയും കുറയ്ക്കാൻ ഇടയാക്കും.യു.എസ്.ഈ രീതി കൂടുതൽ വലിയ തോതിലുള്ള ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളുടെ ഉത്പാദനത്തിനായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന എസിഎച്ചും വ്യത്യസ്ത തന്മാത്രാ ഭാരങ്ങളുള്ള അതിന്റെ തുടർന്നുള്ള ഭിന്നസംഖ്യകളും ഈ സൃഷ്ടിയിൽ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനുള്ള പരീക്ഷണ വസ്തുക്കളായി ഉപയോഗിച്ചു.
പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റിനും എൻസൈമാറ്റിക് ജലവിശ്ലേഷണത്തിനും ശേഷം, സ്ഥിരമായ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടർന്നു.ഇവിടെ (A) ഒരു ഒലിഗോസാക്രറൈഡ് വേർതിരിക്കൽ രീതിയാണ്, അതിൽ AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റവർ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റിൽ (ACSH) നിന്ന് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നത് സജീവമാക്കിയ കാർബണും ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്തും ഉള്ള ഒരു പായ്ക്ക് ബെഡ് ഉപയോഗിച്ച്;(ബി) ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വേർതിരിക്കുന്നതിനുള്ള രീതി.സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (എസ്ഇസി) ഉപയോഗിച്ച് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ കൂടുതൽ വേർതിരിക്കുന്നു;(സി) വിവിധ പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റുകളിൽ നിന്ന് പുറത്തുവിടുന്ന സാക്കറൈഡ് മോണോമറുകളും ഒലിഗോമറുകളും (നേർപ്പിച്ച ആസിഡ്: DA, അയോണിക് ദ്രാവകം: IL, AFEX).എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ് അവസ്ഥകൾ: ഉയർന്ന സോളിഡുകളുടെ ലോഡിംഗ് 25% (w/w) (ഏകദേശം 8% ഗ്ലൂക്കൻ ലോഡിംഗ്), 96 മണിക്കൂർ ജലവിശ്ലേഷണം, 20 mg/g വാണിജ്യ എൻസൈം ലോഡിംഗ് (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 അനുപാതം) കൂടാതെ (D) ഷുഗർ മോണോമറുകൾ, ഗ്ലൂക്കോറോസെറ്റ്-ഇഎക്‌സ് എന്നിവയിൽ നിന്നും പുറത്തിറക്കിയ പഞ്ചസാര മോണോമറുകൾ ated corn stover (ACS).
ഖര ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത സത്തിൽ ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെ സമഗ്രമായ ഘടനാപരമായ വിശകലനത്തിന് ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം ഉപയോഗപ്രദമായ ഉപകരണമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.എന്നിരുന്നാലും, ഈ പരമ്പരാഗത രീതി ഉപയോഗിച്ച് വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന സാക്കറൈഡുകൾ കുറവായി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ആന്റിബോഡി ബൈൻഡിംഗിനും സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനുമായി, എവിഡിൻ പൂശിയ ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ ലയിക്കുന്നതും അനുയോജ്യമല്ലാത്തതുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾ പൂശാൻ ഒരു-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ രീതി ഉപയോഗിച്ചു.ഈ രീതി ഞങ്ങൾ മുമ്പ് നിർമ്മിച്ച ACSH ഉപയോഗിച്ചും അതിന്റെ തന്മാത്രാ ഭാരം (അല്ലെങ്കിൽ പോളിമറൈസേഷന്റെ അളവ്, ഡിപി) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു അംശവും ഉപയോഗിച്ചാണ് പരീക്ഷിച്ചത്.കാർബോഹൈഡ്രേറ്റിന്റെ (ചിത്രം 2) കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്ത് ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡ് ചേർത്ത് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബൈൻഡിംഗ് അഫിനിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ ഒറ്റ-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ ഉപയോഗിച്ചു.ലായനിയിൽ, കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്തുള്ള ഹെമിയാസെറ്റൽ ഗ്രൂപ്പ് ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡിന്റെ ഹൈഡ്രസൈഡ് ഗ്രൂപ്പുമായി പ്രതിപ്രവർത്തിച്ച് ഹൈഡ്രാസോൺ ബോണ്ട് ഉണ്ടാക്കുന്നു.കുറയ്ക്കുന്ന ഏജന്റ് NaCNBH3 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, ഹൈഡ്രസോൺ ബോണ്ട് സ്ഥിരതയുള്ള ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് അന്തിമ ഉൽപ്പന്നമായി ചുരുങ്ങുന്നു.പഞ്ചസാര കുറയ്ക്കുന്ന അവസാനത്തിന്റെ പരിഷ്ക്കരണത്തോടെ, കുറഞ്ഞ ഡിപി ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളെ ELISA പ്ലേറ്റുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നത് സാധ്യമായി, ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ ഇത് ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗേറ്റഡ് mAbs ഉപയോഗിച്ച് അവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ചെയ്തു.
ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്കായി ELISA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളുടെ സ്ക്രീനിംഗ്.ഇവിടെ (എ) ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സംയോജിത ബയോട്ടിനൈലേഷനും ന്യൂട്രാവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഗ്ലൈക്കൻ ടാർഗെറ്റുചെയ്‌ത mAbs ഉപയോഗിച്ചുള്ള ELISA സ്ക്രീനിംഗും (B) പ്രതികരണ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനായി ഒരു-ഘട്ട നടപടിക്രമം കാണിക്കുന്നു.
ഒലിഗോസാക്രറൈഡ്-സംയോജിത ആന്റിബോഡികളുള്ള അവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകൾ പിന്നീട് പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികളിലേക്ക് ചേർക്കുകയും പ്രകാശവും സമയ-സെൻസിറ്റീവ് മീഡിയത്തിൽ കഴുകുകയും ചെയ്തു.ആന്റിബോഡി ബൈൻഡിംഗ് പൂർത്തിയായ ശേഷം, പ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുന്നതിന് TMB സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് ചേർക്കുക.ഒടുവിൽ സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് പ്രതികരണം നിർത്തി.ആന്റിബോഡി-നിർദ്ദിഷ്ട ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഓരോ ആന്റിബോഡിയുടെയും ബൈൻഡിംഗ് ശക്തി നിർണ്ണയിക്കാൻ ഒരു ELISA റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റഡ് പ്ലേറ്റുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു.പരീക്ഷണത്തിന്റെ വിശദാംശങ്ങൾക്കും പാരാമീറ്ററുകൾക്കും, അനുബന്ധ വിഭാഗം "മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും" കാണുക.
ACSH-ൽ ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത അസംസ്കൃതവും ശുദ്ധീകരിച്ചതുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളും പ്രത്യേക ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കായി പുതുതായി വികസിപ്പിച്ച ഈ രീതിയുടെ പ്രയോജനം ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു.ചിത്രം 3-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ബയോഅസൈലേറ്റഡ് ഗ്ലൈക്കോം അസ്സെ രീതികൾ ഉപയോഗിച്ച് ACSH-ൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുള്ള ഏറ്റവും സാധാരണമായ എപ്പിറ്റോപ്പ്-പകരം xylans സാധാരണയായി uronic (U) അല്ലെങ്കിൽ methyluronic (MeU), പെക്റ്റിക് അറബിനോഗലക്റ്റൻസ് എന്നിവയാണ്.ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാത്ത സോളിഡുകളുടെ (UHS) ഗ്ലൈക്കണുകളുടെ വിശകലനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനത്തിലും അവയിൽ മിക്കതും കണ്ടെത്തി.
സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന ഒരു മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് റികാൽസിട്രന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് എപിടോപ്പുകൾ കണ്ടെത്തൽ."ന്യൂട്രൽ" ഫ്രാക്ഷൻ എസിഎൻ ഫ്രാക്ഷൻ ആണ്, "അസിഡിക്" ഫ്രാക്ഷൻ എഫ്എ ഫ്രാക്ഷൻ ആണ്.ഹീറ്റ്‌മാപ്പിലെ തിളക്കമുള്ള ചുവപ്പ് ഉയർന്ന എപ്പിറ്റോപ്പ് ഉള്ളടക്കത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ തെളിച്ചമുള്ള നീലകൾ ശൂന്യമായ പശ്ചാത്തലത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.N=2 ഫോർമുലേഷനുകൾക്കായുള്ള റോ OD മൂല്യങ്ങളെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ് സ്കെയിലിലെ വർണ്ണ മൂല്യങ്ങൾ.ആന്റിബോഡികൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞ പ്രധാന എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ വലതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
ഈ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ഘടനകളെ പരീക്ഷിച്ച വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതത്തിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ സെല്ലുലേസുകളാലും ഹെമിസെല്ലുലേസുകളാലും പിളർത്താൻ കഴിയില്ല, അതിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന വാണിജ്യ എൻസൈമുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു.അതിനാൽ, അവയുടെ ജലവിശ്ലേഷണത്തിന് പുതിയ സഹായ എൻസൈമുകൾ ആവശ്യമാണ്.ആവശ്യമായ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ആക്സസറി എൻസൈമുകൾ ഇല്ലാതെ, ഈ നോൺ-സെല്ലുലോസ് ബോണ്ടുകൾ മോണോസാക്രറൈഡുകളിലേക്കുള്ള പൂർണ്ണമായ പരിവർത്തനത്തെ തടയുന്നു, അവയുടെ മാതൃ പഞ്ചസാര പോളിമറുകൾ ചെറിയ ശകലങ്ങളായി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യുകയും വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ലയിപ്പിക്കുകയും ചെയ്താലും.
സിഗ്നൽ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷനെക്കുറിച്ചും അതിന്റെ ബൈൻഡിംഗ് ശക്തിയെക്കുറിച്ചും കൂടുതൽ പഠനം നടത്തിയപ്പോൾ, ഉയർന്ന ഡിപി ഷുഗർ ഫ്രാക്ഷനുകളിൽ (എ, ബി, സി, ഡിപി 20+ വരെ) ബൈൻഡിംഗ് എപിടോപ്പുകൾ താഴ്ന്ന ഡിപി ഫ്രാക്ഷനുകളേക്കാൾ (ഡി, ഇ, എഫ്, ഡിപി) ഡൈമറുകളിൽ കുറവാണെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 1).ന്യൂട്രൽ ശകലങ്ങളേക്കാൾ നോൺ-സെല്ലുലോസ് എപ്പിടോപ്പുകളിൽ ആസിഡ് ശകലങ്ങൾ കൂടുതലായി കാണപ്പെടുന്നു.ഈ പ്രതിഭാസങ്ങൾ ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച പാറ്റേണുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അവിടെ ഉയർന്ന ഡിപിയും ആസിഡ് ഭാഗങ്ങളും എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസിനെ കൂടുതൽ പ്രതിരോധിക്കും.അതിനാൽ, നോൺ-സെല്ലുലോസ് ഗ്ലൈക്കൻ എപിടോപ്പുകളുടെയും U, MeU സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകളുടെയും സാന്നിധ്യം ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സ്ഥിരതയ്ക്ക് വലിയ സംഭാവന നൽകും.ബൈൻഡിംഗും ഡിറ്റക്ഷൻ കാര്യക്ഷമതയും കുറഞ്ഞ ഡിപി ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്ക് പ്രശ്നമാകുമെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, പ്രത്യേകിച്ച് എപ്പിറ്റോപ്പ് ഒരു ഡൈമെറിക് അല്ലെങ്കിൽ ട്രൈമെറിക് ഒലിഗോസാക്കറൈഡാണെങ്കിൽ.വ്യത്യസ്‌ത ദൈർഘ്യമുള്ള വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഇത് പരിശോധിക്കാവുന്നതാണ്, ഓരോന്നിനും ഒരു പ്രത്യേക mAb-യുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഒരു എപ്പിറ്റോപ്പ് മാത്രമേ അടങ്ങിയിട്ടുള്ളൂ.
അങ്ങനെ, ഘടന-നിർദ്ദിഷ്ട ആന്റിബോഡികളുടെ ഉപയോഗം ചില തരം റീകാൽസിട്രന്റ് ബോണ്ടുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി.ഉപയോഗിക്കുന്ന ആന്റിബോഡിയുടെ തരം, ഉചിതമായ ലിഗേഷൻ പാറ്റേൺ, അത് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന സിഗ്നലിന്റെ ശക്തി എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ച് (ഏറ്റവും കുറഞ്ഞതും സമൃദ്ധവും), കൂടുതൽ പൂർണ്ണമായ ഗ്ലൈക്കോകൺവേർഷനായി എൻസൈം മിശ്രിതത്തിലേക്ക് പുതിയ എൻസൈമുകൾ തിരിച്ചറിയാനും അർദ്ധ അളവിൽ ചേർക്കാനും കഴിയും.ACSH ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ വിശകലനം ഉദാഹരണമായി എടുത്താൽ, ഓരോ ബയോമാസ് മെറ്റീരിയലിനും ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളുടെ ഒരു ഡാറ്റാബേസ് നമുക്ക് സൃഷ്ടിക്കാൻ കഴിയും.ആൻറിബോഡികളുടെ വ്യത്യസ്തമായ അടുപ്പം കണക്കിലെടുക്കേണ്ടതുണ്ടെന്ന് ഇവിടെ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, അവയുടെ ബന്ധം അജ്ഞാതമാണെങ്കിൽ, വ്യത്യസ്ത ആന്റിബോഡികളുടെ സിഗ്നലുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുമ്പോൾ ഇത് ചില ബുദ്ധിമുട്ടുകൾ സൃഷ്ടിക്കും.കൂടാതെ, ഒരേ ആന്റിബോഡിയുടെ സാമ്പിളുകൾക്കിടയിൽ ഗ്ലൈക്കൻ ബോണ്ടുകളുടെ താരതമ്യം മികച്ച രീതിയിൽ പ്രവർത്തിച്ചേക്കാം.ഈ ശാഠ്യമുള്ള ബോണ്ടുകളെ പിന്നീട് CAZyme ഡാറ്റാബേസുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, അതിൽ നിന്ന് നമുക്ക് എൻസൈമുകൾ തിരിച്ചറിയാനും കാൻഡിഡേറ്റ് എൻസൈമുകൾ തിരഞ്ഞെടുക്കാനും ബോണ്ട് ബ്രേക്കിംഗ് എൻസൈമുകൾക്കായി പരിശോധിക്കാനും അല്ലെങ്കിൽ ഈ എൻസൈമുകൾ ബയോറിഫൈനറികളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മൈക്രോബയൽ സിസ്റ്റങ്ങൾ വികസിപ്പിക്കാനും കഴിയും.
ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ലോ മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനുള്ള ഇതര രീതികൾ രോഗപ്രതിരോധ രീതികൾ എങ്ങനെ പൂർത്തീകരിക്കുന്നുവെന്ന് വിലയിരുത്താൻ, ഞങ്ങൾ MALDI (ചിത്രം 4, S1-S8) കൂടാതെ GC-MS അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള TMS-ഉൽപ്പന്ന സാച്ചറൈഡുകളുടെ വിശകലനവും ഒരേ പാനലിൽ (ചിത്രം 5) ഭാഗം oligosaccharide നടത്തി.ഒലിഗോസാക്രറൈഡ് തന്മാത്രകളുടെ ബഹുജന വിതരണം ഉദ്ദേശിച്ച ഘടനയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നുണ്ടോ എന്ന് താരതമ്യം ചെയ്യാൻ MALDI ഉപയോഗിക്കുന്നു.അത്തിപ്പഴത്തിൽ.4 ന്യൂട്രൽ ഘടകങ്ങളായ ACN-A, ACN-B എന്നിവയുടെ MC കാണിക്കുന്നു.ACN-A വിശകലനം ഡിപി 4–8 (ചിത്രം 4) മുതൽ ഡിപി 22 (ചിത്രം എസ് 1) വരെയുള്ള പെൻറോസ് ഷുഗറുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി സ്ഥിരീകരിച്ചു, അവയുടെ ഭാരം MeU-xylan ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുമായി യോജിക്കുന്നു.ACN-B വിശകലനം ഡിപി 8-15 ഉള്ള പെന്റോസ്, ഗ്ലൂക്കോക്സിലാൻ സീരീസ് സ്ഥിരീകരിച്ചു.ചിത്രം S3 പോലെയുള്ള അനുബന്ധ സാമഗ്രികളിൽ, FA-C അസിഡിക് മൊയിറ്റി മാസ് ഡിസ്‌ട്രിബ്യൂഷൻ മാപ്പുകൾ ELISA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള mAb സ്ക്രീനിംഗിൽ കാണപ്പെടുന്ന പകരക്കാരായ സൈലാനുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്ന 8-15 DP ഉള്ള (Me)U പകരമുള്ള പെന്റോസ് ഷുഗറുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി കാണിക്കുന്നു.എപ്പിടോപ്പുകൾ സ്ഥിരതയുള്ളതാണ്.
ACS-ൽ ലയിക്കുന്ന നോൺ-കംപ്ലയന്റ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ MALDI-MS സ്പെക്ട്രം.ഇവിടെ, (A) മെഥൈലേറ്റഡ് യൂറോണിക് ആസിഡ് (DP 4-8) അടങ്ങിയ ACN-A ലോ വെയ്റ്റ് റേഞ്ച് ഫ്രാക്ഷനുകൾ ഗ്ലൂക്കുറോക്‌സിലാൻ ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളും (B) ACN-B xylan, methylated uronic acid oligosaccharides എന്നിവയ്ക്ക് പകരമായി (DPP8-15)
റിഫ്രാക്ടറി ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ ഗ്ലൈക്കൻ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ ഘടനയുടെ വിശകലനം.ഇവിടെ (എ) ജിസി-എംഎസ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച വിവിധ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഭിന്നസംഖ്യകളുടെ ടിഎംഎസ് സാക്കറൈഡ് ഘടന.(ബി) ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന വിവിധ ടിഎംഎസ്-ഉത്പന്ന ഷുഗറുകളുടെ ഘടനകൾ.എസിഎൻ - ന്യൂട്രൽ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ അടങ്ങിയ അസെറ്റോണിട്രൈൽ ഫ്രാക്ഷൻ, ആസിഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ അടങ്ങിയ എഫ്എ - ഫെറുലിക് ആസിഡ് ഫ്രാക്ഷൻ.
ചിത്രം S9-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഒളിഗോസാക്കറൈഡ് അംശത്തിന്റെ LC-MS വിശകലനത്തിൽ നിന്ന് മറ്റൊരു രസകരമായ നിഗമനം ലഭിച്ചു (ഇലക്ട്രോണിക് സപ്ലിമെന്ററി മെറ്റീരിയലിൽ രീതികൾ കാണാം).ACN-B ഫ്രാക്ഷന്റെ ലിഗേഷൻ സമയത്ത് ഹെക്സോസ്, -OAc ഗ്രൂപ്പുകളുടെ ശകലങ്ങൾ ആവർത്തിച്ച് നിരീക്ഷിച്ചു.ഈ കണ്ടെത്തൽ ഗ്ലൈക്കോമിലും മാൾഡി-ടോഫ് വിശകലനത്തിലും നിരീക്ഷിച്ച വിഘടനത്തെ സ്ഥിരീകരിക്കുക മാത്രമല്ല, പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത ലിഗ്നോസെല്ലുലോസിക് ബയോമാസിലെ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ഡെറിവേറ്റീവുകളെക്കുറിച്ചുള്ള പുതിയ വിവരങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു.
ടിഎംഎസ് ഷുഗർ ഡെറിവേറ്റൈസേഷൻ ഉപയോഗിച്ച് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഫ്രാക്ഷന്റെ പഞ്ചസാരയുടെ ഘടനയും ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു.ജിസി-എംഎസ് ഉപയോഗിച്ച്, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഫ്രാക്ഷൻ (ചിത്രം 5) ലെ ന്യൂറൽ (നോൺ-ഡെറിവേറ്റീവ്), അസിഡിക് ഷുഗർ (GluA, GalA) എന്നിവയുടെ ഘടന ഞങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.അസിഡിക് ഘടകങ്ങളായ സി, ഡി എന്നിവയിൽ ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ് കാണപ്പെടുന്നു, അതേസമയം ഗാലക്‌ടൂറോണിക് ആസിഡ് അമ്ല ഘടകങ്ങളായ എ, ബി എന്നിവയിൽ കാണപ്പെടുന്നു, ഇവ രണ്ടും അമ്ല പഞ്ചസാരയുടെ ഉയർന്ന ഡിപി ഘടകങ്ങളാണ്.ഈ ഫലങ്ങൾ ഞങ്ങളുടെ ELISA, MALDI ഡാറ്റ സ്ഥിരീകരിക്കുക മാത്രമല്ല, ഒളിഗോസാക്കറൈഡ് ശേഖരണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ മുൻ പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.അതിനാൽ, വിവിധ ബയോളജിക്കൽ സാമ്പിളുകളിൽ ലയിക്കുന്ന റികാൽസിട്രന്റ് ഒളിഗോസാക്രറൈഡുകൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ ബയോട്ടിനൈലേഷനും തുടർന്നുള്ള ELISA സ്ക്രീനിംഗും ഉപയോഗിച്ചുള്ള ആധുനിക രോഗപ്രതിരോധ രീതികൾ മതിയെന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നു.
ELISA അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള mAb സ്ക്രീനിംഗ് രീതികൾ വ്യത്യസ്ത രീതികളാൽ സാധൂകരിക്കപ്പെട്ടതിനാൽ, ഈ പുതിയ അളവ് രീതിയുടെ സാധ്യതകൾ കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ആഗ്രഹിക്കുന്നു.രണ്ട് വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ, സൈലോഹെക്സാസാക്കറൈഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡ് (XHE), 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കനെ ലക്ഷ്യമിട്ടുള്ള ഒരു പുതിയ mAb സമീപനം ഉപയോഗിച്ച് വാങ്ങുകയും പരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ബൈൻഡിംഗ് സിഗ്നലും ഒലിഗോസാക്കറൈഡിന്റെ ലോഗ് കോൺസെൻട്രേഷനും തമ്മിലുള്ള ഒരു രേഖീയ പരസ്പരബന്ധം ചിത്രം 6 കാണിക്കുന്നു, ഇത് സാധ്യമായ ലാങ്‌മുയർ അഡ്‌സോർപ്ഷൻ മോഡൽ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.mAbs-ൽ, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, CCRC-M151 എന്നിവ XHE-യുമായി പരസ്പരബന്ധിതമാണ്, കൂടാതെ CCRC-M108, CCRC-M109, LM11 എന്നിവ A2X0 nm വരെ ഒരു പരിധിവരെ A2X0n വരെ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.പരീക്ഷണ സമയത്ത് ആന്റിബോഡികളുടെ പരിമിതമായ ലഭ്യത കാരണം, ഓരോ ഒലിഗോസാക്കറൈഡിന്റെ സാന്ദ്രതയിലും പരിമിതമായ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി.ചില ആൻറിബോഡികൾ ഒരേ ഒലിഗോസാക്കറൈഡിനോട് വളരെ വ്യത്യസ്തമായ രീതിയിൽ പ്രതികരിക്കുന്നു എന്നത് ഇവിടെ ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, കാരണം അവ അല്പം വ്യത്യസ്തമായ എപ്പിടോപ്പുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുകയും വളരെ വ്യത്യസ്തമായ ബൈൻഡിംഗ് അഫിനിറ്റികൾ ഉണ്ടായിരിക്കുകയും ചെയ്യും.യഥാർത്ഥ സാമ്പിളുകളിൽ പുതിയ mAb സമീപനം പ്രയോഗിക്കുമ്പോൾ കൃത്യമായ എപ്പിറ്റോപ്പ് ഐഡന്റിഫിക്കേഷന്റെ മെക്കാനിസങ്ങളും പ്രത്യാഘാതങ്ങളും വളരെ സങ്കീർണ്ണമായിരിക്കും.
വിവിധ ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റിംഗ് mAbs-കളുടെ കണ്ടെത്തൽ പരിധി നിർണ്ണയിക്കാൻ രണ്ട് വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഉപയോഗിച്ചു.ഇവിടെ, ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് കോൺസൺട്രേഷന്റെ ലോഗ് കോൺസൺട്രേഷനുമായുള്ള ലീനിയർ കോറിലേഷനുകൾ (A) mAb ഉള്ള XHE, (B) MAb ഉള്ള A2XX എന്നിവയ്‌ക്കായുള്ള ലാങ്‌മുയർ അഡ്‌സോർപ്‌ഷൻ പാറ്റേണുകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.വിശകലനത്തിൽ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്ന വാണിജ്യ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ ഘടനയെ അനുബന്ധ എപ്പിറ്റോപ്പുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റഡ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളുടെ ഉപയോഗം (ഗ്ലൈക്കോകോമിക് അനാലിസിസ് അല്ലെങ്കിൽ ELISA-അധിഷ്ഠിത mAb സ്ക്രീനിംഗ്) സസ്യങ്ങളുടെ ജൈവവസ്തുക്കൾ ഉണ്ടാക്കുന്ന മിക്ക സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനുകളുടെയും ആഴത്തിലുള്ള സ്വഭാവരൂപീകരണത്തിനുള്ള ശക്തമായ ഉപകരണമാണ്.എന്നിരുന്നാലും, ക്ലാസിക്കൽ ഗ്ലൈക്കൻ വിശകലനം വലിയ സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനുകളെ മാത്രമേ ചിത്രീകരിക്കൂ, കാരണം മിക്ക ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളും ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ കാര്യക്ഷമമായി നിശ്ചലമാകില്ല.ഈ പഠനത്തിൽ, AFEX-പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റവർ ഉയർന്ന സോളിഡ് ഉള്ളടക്കത്തിൽ എൻസൈമാറ്റിക്കായി ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്തു.ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റിലെ റീകാൽസിട്രന്റ് സെൽ വാൾ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റിന്റെ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ പഞ്ചസാര വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു.എന്നിരുന്നാലും, ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റുകളിലെ ചെറിയ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ mAb വിശകലനം കുറച്ചുകാണുന്നു, കൂടാതെ ELISA പ്ലേറ്റുകളിൽ ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ ഫലപ്രദമായി നിശ്ചലമാക്കാൻ അധിക ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.
ന്യൂട്രാഅവിഡിൻ™ പൂശിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ ELISA സ്ക്രീനിംഗും തുടർന്ന് ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ബയോട്ടിനൈലേഷനും സംയോജിപ്പിച്ച് mAb സ്ക്രീനിംഗിനായി ഒരു നവീനവും കാര്യക്ഷമവുമായ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് ഇമ്മൊബിലൈസേഷൻ രീതി ഞങ്ങൾ ഇവിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു.നിശ്ചലമാക്കപ്പെട്ട ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ, ആവർത്തിച്ചുള്ള ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ വേഗത്തിലും കാര്യക്ഷമമായും കണ്ടെത്തുന്നതിന് ആന്റിബോഡിയോട് മതിയായ അടുപ്പം കാണിച്ചു.മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഈ ശാഠ്യമുള്ള ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ ഘടനയുടെ വിശകലനം ഇമ്മ്യൂണോസ്ക്രീനിംഗിലേക്കുള്ള ഈ പുതിയ സമീപനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.അതിനാൽ, ഈ പഠനങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നത്, ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളിലെ ക്രോസ്ലിങ്കുകൾ കണ്ടെത്താൻ ഒലിഗോസാക്രറൈഡ് ബയോട്ടിനൈലേഷനും എലിസ സ്ക്രീനിംഗും ഗ്ലൈക്കൻ-ടാർഗെറ്റഡ് മോണോക്ലോണൽ ആന്റിബോഡികളും ഉപയോഗിക്കാമെന്നും ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ ഘടനയെ ചിത്രീകരിക്കുന്ന മറ്റ് ബയോകെമിക്കൽ പഠനങ്ങളിൽ ഇത് വ്യാപകമായി പ്രയോഗിക്കാമെന്നും തെളിയിക്കുന്നു.
ഈ ബയോട്ടിൻ അധിഷ്ഠിത ഗ്ലൈക്കൻ പ്രൊഫൈലിംഗ് രീതി, സസ്യ ജൈവവസ്തുക്കളിൽ ലയിക്കുന്ന ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ റീകാൽസിട്രന്റ് കാർബോഹൈഡ്രേറ്റ് ബോണ്ടുകളെ കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ കഴിവുള്ള ആദ്യ റിപ്പോർട്ടാണ്.ജൈവ ഇന്ധന ഉൽപാദനത്തിന്റെ കാര്യത്തിൽ ബയോമാസിന്റെ ചില ഭാഗങ്ങൾ ഇത്ര ശാഠ്യമുള്ളത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ ഇത് സഹായിക്കുന്നു.ഈ രീതി ഗ്ലൈക്കോം വിശകലന രീതികളിലെ ഒരു പ്രധാന വിടവ് നികത്തുകയും പ്ലാന്റ് ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകൾക്ക് അപ്പുറത്തുള്ള വിശാലമായ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിലേക്ക് അതിന്റെ പ്രയോഗം വ്യാപിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.ഭാവിയിൽ, ബയോട്ടിനൈലേഷനായി ഞങ്ങൾ റോബോട്ടിക്‌സ് ഉപയോഗിക്കുകയും ELISA ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകളുടെ ഉയർന്ന ത്രൂപുട്ട് വിശകലനത്തിനായി ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ച രീതി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്യാം.
പയനിയർ 33 എ 14 ഹൈബ്രിഡ് വിത്തുകളിൽ നിന്ന് വളർത്തിയ കോൺ സ്ട്രോ (സിഎസ്) 2010 ൽ കൊളറാഡോയിലെ റേയിലെ ക്രാമർ ഫാമിൽ നിന്ന് വിളവെടുത്തു.ഭൂവുടമയുടെ അനുമതിയോടെ, ഈ ജൈവവസ്തു ഗവേഷണത്തിന് ഉപയോഗിക്കാം. സാമ്പിളുകൾ ഊഷ്മാവിൽ സിപ്പ് ലോക്ക് ബാഗുകളിൽ ഉണങ്ങിയ <6% ഈർപ്പം സംഭരിച്ചു. സാമ്പിളുകൾ ഊഷ്മാവിൽ സിപ്പ് ലോക്ക് ബാഗുകളിൽ ഉണങ്ങിയ <6% ഈർപ്പം സംഭരിച്ചു. പ്രസ്തുത ലേഖനം സാമ്പിളുകൾ ഊഷ്മാവിൽ സിപ്പർ ചെയ്ത ബാഗുകളിൽ <6% ഈർപ്പത്തിൽ ഉണക്കി സൂക്ഷിച്ചു.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ഒബ്രസി ഹ്രന്യത് വ് പകെതഹ് സൊസ്തെജ്കൊയ്-മൊല്നിഎയ് പ്രൈ കോംനറ്റ്നോയ് ടെംപെരതുരെ സെ വ്ലജ്നൊസ്ത്യു < 6%. സാമ്പിളുകൾ 6% ഈർപ്പം ഉള്ള ഊഷ്മാവിൽ സിപ്പർ ബാഗുകളിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു.പഠനം പ്രാദേശികവും ദേശീയവുമായ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾ പാലിച്ചു.എൻആർഇഎൽ പ്രോട്ടോക്കോൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് കോമ്പോസിഷണൽ വിശകലനം നടത്തിയത്.ഘടനയിൽ 31.4% ഗ്ലൂക്കൻ, 18.7% സൈലാൻ, 3.3% അറബിനാൻ, 1.2% ഗാലക്റ്റൻ, 2.2% അസറ്റൈൽ, 14.3% ലിഗ്നിൻ, 1.7% പ്രോട്ടീൻ, 13. 4% ചാരം എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി.
Cellic® CTec2 (138 mg പ്രോട്ടീൻ/ml, ലോട്ട് VCNI 0001) സെല്ലുലേസ്, β-glucosidase, Cellic® HTec2 (157 mg പ്രോട്ടീൻ/ml, ലോട്ട് VHN00001) എന്നിവയുടെ ഒരു സങ്കീർണ്ണ മിശ്രിതമാണ് Novozymes (Franklinton, NC, USA)).പെക്റ്റിൻ വിഘടിപ്പിക്കുന്ന എൻസൈമുകളുടെ സങ്കീർണ്ണമായ മിശ്രിതമായ മൾട്ടിഫെക്റ്റ് പെക്റ്റിനേസ്® (72 mg പ്രോട്ടീൻ/mL), DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) സംഭാവന ചെയ്തു.Kjeldahl നൈട്രജൻ വിശകലനം (AOAC രീതി 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഉള്ളടക്കം (പ്രോട്ടീൻ ഇതര നൈട്രജന്റെ സംഭാവന കുറയ്ക്കുകയും) കണക്കാക്കിയാണ് എൻസൈം പ്രോട്ടീൻ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.ഡയറ്റോമേഷ്യസ് എർത്ത് 545 ഇഎംഡി മില്ലിപോറിൽ നിന്ന് (ബില്ലെറിക്ക, എംഎ) വാങ്ങിയതാണ്.സജീവമാക്കിയ കാർബൺ (DARCO, 100 മെഷ് ഗ്രാന്യൂൾസ്), Avicel (PH-101), ബീച്ച് സൈലാൻ, കൂടാതെ മറ്റെല്ലാ രാസവസ്തുക്കളും Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ്.
GLBRC-ൽ (ബയോമാസ് കൺവേർഷൻ റിസർച്ച് ലബോറട്ടറി, MSU, Lansing, MI, USA) AFEX പ്രീട്രീറ്റ്മെന്റ് നടത്തി.15 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 140 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രീ-ട്രീറ്റ്മെന്റ് നടത്തി.46 താമസ സമയം 1:1 അൺഹൈഡ്രസ് അമോണിയയും ബയോമാസും 60% (w/w) ന് സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ ബെഞ്ച്ടോപ്പ് ബാച്ച് റിയാക്ടറിൽ ലോഡ് ചെയ്യുന്നു (പാർ ഇൻസ്ട്രുമെന്റ്സ് കമ്പനി).30 മിനിറ്റ് എടുത്തു.റിയാക്റ്റർ 140 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലേക്ക് കൊണ്ടുവരികയും അമോണിയ അതിവേഗം പുറത്തുവിടുകയും ചെയ്തു, ബയോമാസ് വേഗത്തിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിലേക്ക് മടങ്ങാൻ അനുവദിച്ചു.AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത കോൺ സ്റ്റോവറിന്റെ (ACS) ഘടന ചികിത്സിക്കാത്ത കോൺ സ്റ്റോവറിന് (UT-CS) സമാനമാണ്.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡുകളുടെ വൻതോതിലുള്ള ഉൽപ്പാദനത്തിനുള്ള ഒരു പ്രാരംഭ വസ്തുവായി ഉയർന്ന ഖരപദാർഥങ്ങൾ ACSH 25% (w/w) (ഏകദേശം 8% ഡെക്‌സ്ട്രാൻ ലോഡിംഗ്) തയ്യാറാക്കി.Cellic® Ctec2 10 mg പ്രോട്ടീൻ/g glucan (പ്രീട്രീറ്റ് ചെയ്ത ബയോമാസിൽ), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg പ്രോട്ടീൻ/g glucan, Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA) എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള വാണിജ്യ എൻസൈം മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ചാണ് എസിഎസിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ് നടത്തിയത്.).), 5 മില്ലിഗ്രാം പ്രോട്ടീൻ / g dextran.3 ലിറ്റർ, പിഎച്ച് 4.8, 50 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്, 250 ആർപിഎം എന്നിവയുടെ പ്രവർത്തന അളവിലുള്ള 5 ലിറ്റർ ബയോ റിയാക്ടറിൽ എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസ് നടത്തി.96 മണിക്കൂർ ജലവിശ്ലേഷണത്തിനു ശേഷം, ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് 6000 ആർപിഎമ്മിൽ 30 മിനിറ്റും പിന്നീട് 14000 ആർപിഎമ്മിൽ 30 മിനിറ്റും ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാത്ത ഖരപദാർഥങ്ങൾ നീക്കം ചെയ്യുന്നതിനായി സെൻട്രിഫ്യൂഗേഷൻ വഴി ശേഖരിച്ചു.0.22 എംഎം ഫിൽട്ടർ ബീക്കറിലൂടെ ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് അണുവിമുക്തമായ ഫിൽട്ടറേഷന് വിധേയമാക്കി.ഫിൽട്ടർ ചെയ്ത ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ അണുവിമുക്തമായ കുപ്പികളിൽ സൂക്ഷിക്കുകയും തുടർന്ന് കാർബണിൽ ഭിന്നിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.
എൻ‌ആർ‌ഇ‌എൽ ലബോറട്ടറി വിശകലന നടപടിക്രമങ്ങൾക്കനുസൃതമായി എക്സ്ട്രാക്‌റ്റ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ബയോമാസ് സാമ്പിളുകളുടെ ഘടനയുടെ വിശകലനം: കോമ്പോസിഷൻ വിശകലനത്തിനായി സാമ്പിളുകൾ തയ്യാറാക്കൽ (NREL/TP-510-42620) കൂടാതെ ബയോമാസിലെ ഘടനാപരമായ കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെയും ലിഗ്നിന്റെയും നിർണ്ണയം (NREL/TP-510 - 42618)47.
ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സ്ട്രീമിന്റെ ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് വിശകലനം ഓട്ടോക്ലേവ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ആസിഡ് ഹൈഡ്രോളിസിസ് രീതി ഉപയോഗിച്ച് 2 മില്ലി സ്കെയിലിൽ നടത്തി.10 മില്ലി സ്ക്രൂ ക്യാപ് കൾച്ചർ ട്യൂബിൽ 72% സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡിന്റെ 69.7 µl ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സാമ്പിൾ കലർത്തി 121 °C താപനിലയിൽ ഒരു ബെഞ്ച്ടോപ്പിൽ 1 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക, ഐസിൽ തണുപ്പിച്ച് ഉയർന്ന പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി (HPLC) കുപ്പിയിലേക്ക് ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുക.ആസിഡ്-ഹൈഡ്രോലൈസ്ഡ് സാമ്പിളിലെ മൊത്തം പഞ്ചസാരയുടെ സാന്ദ്രതയിൽ നിന്ന് നോൺ-ഹൈഡ്രോലൈസ്ഡ് സാമ്പിളിലെ മോണോസാക്കറൈഡുകളുടെ സാന്ദ്രത കുറച്ചാണ് ഒളിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സാന്ദ്രത നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.
ഒരു ബയോ-റാഡ് അമിനെക്‌സ് HPX-87H കോളത്തിൽ ഓട്ടോസാംപ്ലർ, കോളം ഹീറ്റർ, ഐസോക്രാറ്റിക് പമ്പ്, റിഫ്രാക്‌റ്റീവ് ഇൻഡക്‌സ് ഡിറ്റക്ടർ എന്നിവ ഘടിപ്പിച്ച ഷിമാഡ്‌സു എച്ച്‌പിഎൽസി സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ആസിഡ് ഹൈഡ്രോലൈസ്ഡ് ബയോമാസിലെ ഗ്ലൂക്കോസ്, സൈലോസ്, അറബിനോസ് എന്നിവയുടെ സാന്ദ്രത വിശകലനം ചെയ്തു.കോളം 50 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നിലനിർത്തുകയും 0.6 മില്ലി/മിനിറ്റ് 5 mM H2SO4 വെള്ളത്തിൽ ലയിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.ഒഴുക്ക്.
മോണോമറിന്റെയും ഒലിഗോസാക്കറൈഡിന്റെയും ഉള്ളടക്കത്തിനായി ഹൈഡ്രോലൈസേറ്റ് സൂപ്പർനാറ്റന്റ് നേർപ്പിക്കുകയും വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.എൻസൈമാറ്റിക് ഹൈഡ്രോളിസിസിന് ശേഷം ലഭിച്ച മോണോമെറിക് ഷുഗറുകൾ ഒരു ബയോ-റാഡ് (ഹെർക്കുലീസ്, സിഎ) അമിനെക്സ് എച്ച്പിഎക്സ്-87 പി കോളവും ആഷ് ഗാർഡ് കോളവും ഘടിപ്പിച്ച എച്ച്പിഎൽസി വിശകലനം ചെയ്തു.കോളം താപനില 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നിലനിർത്തി, 0.6 മില്ലി / മിനിറ്റ് ഫ്ലോ റേറ്റ് ഉള്ള മൊബൈൽ ഘട്ടമായി വെള്ളം ഉപയോഗിച്ചു.റെഫറുകളിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന രീതികൾ അനുസരിച്ച് 121 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ നേർപ്പിച്ച ആസിഡിലെ ജലവിശ്ലേഷണം വഴി ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകൾ നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു.41, 48, 49.
മുമ്പ് വിവരിച്ച നടപടിക്രമങ്ങൾ 27, 43, 50, 51 ഉപയോഗിച്ച് അസംസ്കൃതവും AFEX പ്രീ-ട്രീറ്റ് ചെയ്തതും എല്ലാ ഹൈഡ്രോലൈസ് ചെയ്യാത്തതുമായ ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ (സീരിയൽ സെൽ വാൾ എക്സ്ട്രാക്റ്റുകളുടെ ഉത്പാദനവും അവയുടെ mAb സ്ക്രീനിംഗും ഉൾപ്പെടെ) സാക്കറൈഡ് വിശകലനം നടത്തി.ഗ്ലൈക്കോം വിശകലനത്തിനായി, പ്ലാന്റ് സെൽ വാൾ മെറ്റീരിയലിന്റെ ആൽക്കഹോൾ-ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ ബയോമാസ് അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കുകയും അമോണിയം ഓക്‌സലേറ്റ് (50 mM), സോഡിയം കാർബണേറ്റ് (50 mM, 0.5% w/v), CON പോലുള്ള വർദ്ധിച്ചുവരുന്ന ആക്രമണാത്മക റിയാക്ടറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് സീരിയൽ എക്‌സ്‌ട്രാക്ഷൻ നടത്തുകയും ചെയ്യുന്നു.(1M, 4M, രണ്ടും 1% w/v സോഡിയം ബോറോഹൈഡ്രൈഡ്) കൂടാതെ ആസിഡ് ക്ലോറൈറ്റും മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ52,53.സെൽ വാൾ ഗ്ലൈക്കാനിലേക്ക് നയിക്കുന്ന mAb50-കളുടെ ഒരു സങ്കീർണ്ണ പാനലിനെതിരെ എക്‌സ്‌ട്രാക്‌റ്റുകൾ ELISA-യ്ക്ക് വിധേയമാക്കി, mAb ബൈൻഡിംഗ് പ്രതികരണങ്ങൾ ഒരു ഹീറ്റ് മാപ്പായി അവതരിപ്പിച്ചു.പ്ലാന്റ് സെൽ വാൾ ഗ്ലൈകാൻ ടാർഗെറ്റുചെയ്യുന്ന mAbs ലബോറട്ടറി സ്റ്റോക്കുകളിൽ നിന്ന് (CCRC, JIM, MAC സീരീസ്) വാങ്ങി.
ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ ഒരു-ഘട്ട ബയോട്ടിനൈലേഷൻ.ബയോട്ടിൻ-എൽസി-ഹൈഡ്രാസൈഡുമായി കാർബോഹൈഡ്രേറ്റുകളുടെ സംയോജനം ഇനിപ്പറയുന്ന നടപടിക്രമം ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ഡൈമെതൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ (DMSO, 70 μl) ലയിപ്പിച്ച് 1 മിനിറ്റ് നേരം 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ശക്തമായി ഇളക്കി ചൂടാക്കി.ഗ്ലേഷ്യൽ അസറ്റിക് ആസിഡ് (30 µl) ചേർത്ത് മിശ്രിതം സോഡിയം സയനോബോറോഹൈഡ്രൈഡിലേക്ക് (6.4 mg/100 µmol) ഒഴിച്ചു, ഏകദേശം 1 മിനിറ്റ് 65 ° C. ചൂടാക്കിയ ശേഷം പൂർണ്ണമായും അലിഞ്ഞു.തുടർന്ന്, 5 മുതൽ 8 μl വരെ പ്രതിപ്രവർത്തന മിശ്രിതം ഉണക്കിയ ഒലിഗോസാക്കറൈഡിലേക്ക് (1-100 nmol) ചേർത്തു, കുറയ്ക്കുന്ന അറ്റത്ത് ലേബലിന്റെ 10 മടങ്ങോ അതിലധികമോ മോളാർ അധികമായി ലഭിക്കും.2 മണിക്കൂർ നേരത്തേക്ക് 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ പ്രതികരണം നടത്തി, അതിനുശേഷം സാമ്പിളുകൾ ഉടനടി ശുദ്ധീകരിച്ചു.കുറയ്ക്കാതെ ലേബലിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ സോഡിയം സയനോബോറോഹൈഡ്രൈഡ് ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ല, കൂടാതെ സാമ്പിളുകൾ 2.5 മണിക്കൂർ 65 ° C. യിൽ പ്രതിപ്രവർത്തിച്ചു.
ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് ഒലിഗോസാക്രറൈഡുകളുടെ സാമ്പിളുകൾ ELISA പൂശുകയും കഴുകുകയും ചെയ്യുന്നു.25 μl ബയോട്ടിനൈലേറ്റഡ് സാമ്പിളുകൾ (5 മില്ലി 0.1 M ട്രീസ് ബഫർ ലായനിയിൽ (TBS) ലയിപ്പിച്ച ഓരോ സാന്ദ്രീകൃത സാമ്പിളിന്റെയും 100 μl) അവിഡിൻ പൂശിയ പ്ലേറ്റിലെ ഓരോ കിണറിലും ചേർത്തു.നിയന്ത്രണ കിണറുകൾ 0.1 M TBS-ൽ 10 μg/ml എന്ന സാന്ദ്രതയിൽ 50 μl ബയോട്ടിൻ പൂശിയിരിക്കുന്നു.ശൂന്യമായ അളവുകൾക്കായി ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളം ഒരു കോട്ടിംഗായി ഉപയോഗിച്ചു.ഇരുട്ടിൽ ഊഷ്മാവിൽ 2 മണിക്കൂർ ടാബ്ലറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.പ്രോഗ്രാം നമ്പർ ഉപയോഗിച്ച് 0.1 M TBS-ൽ 0.1% സ്കിംഡ് മിൽക്ക് ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റ് 3 തവണ കഴുകുക.ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 3എയ്ക്ക് 11.
പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡികളുടെ കൂട്ടിച്ചേർക്കലും കഴുകലും.ഓരോ കിണറിലും 40 μl പ്രാഥമിക ആന്റിബോഡി ചേർക്കുക.ഇരുട്ടിൽ ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 3A-യ്‌ക്കായി വാഷ് പ്രോഗ്രാം #11 ഉപയോഗിച്ച് 0.1M TBS-ൽ 0.1% പാൽ ഉപയോഗിച്ച് പ്ലേറ്റുകൾ 3 തവണ കഴുകി.
സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡി ചേർത്ത് കഴുകുക.ഓരോ കിണറിലും 50 µl മൗസ്/എലി ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡി (0.1% പാലിൽ 1:5000 നേർപ്പിച്ചത്) ഓരോ കിണറിലും ചേർക്കുക.ഇരുട്ടിൽ ഊഷ്മാവിൽ 1 മണിക്കൂർ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഗ്രെനിയർ ഫ്ലാറ്റ് 5A പ്ലേറ്റ് വാഷ് പ്രോഗ്രാം #12 ഉപയോഗിച്ച് 0.1 M TBS-ൽ 0.1% പാൽ ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോപ്ലേറ്റുകൾ 5 തവണ കഴുകി.
ഒരു അടിവസ്ത്രം ചേർക്കുന്നു.50 µl 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) അടിസ്ഥാന സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിലേക്ക് ചേർക്കുക (2 തുള്ളി ബഫർ, 3 തുള്ളി TMB, 2 തുള്ളി ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് 15 മില്ലി ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിലേക്ക് ചേർക്കുക).TMB അടിവസ്ത്രം തയ്യാറാക്കുക.ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പുള്ള ചുഴിയും).30 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഇരുട്ടിൽ.
ഘട്ടം പൂർത്തിയാക്കി ടാബ്‌ലെറ്റ് വായിക്കുക.ഓരോ കിണറിലും 50 µl 1 N സൾഫ്യൂറിക് ആസിഡ് ചേർത്ത് ELISA റീഡർ ഉപയോഗിച്ച് 450 മുതൽ 655 nm വരെ ആഗിരണം രേഖപ്പെടുത്തുക.
ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ ഈ അനലിറ്റുകളുടെ 1 മില്ലിഗ്രാം/മില്ലി ലായനി തയ്യാറാക്കുക: അറബിനോസ്, റാംനോസ്, ഫ്യൂക്കോസ്, സൈലോസ്, ഗാലക്‌ടൂറോണിക് ആസിഡ് (GalA), ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ് (GlcA), മാനോസ്, ഗ്ലൂക്കോസ്, ഗാലക്ടോസ്, ലാക്ടോസ്, N-acetylmannosamine, N-acetylmannosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), ഇനോസിറ്റോൾ (ആന്തരിക നിലവാരം).പട്ടിക 1-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന 1 mg/mL പഞ്ചസാര ലായനികൾ ചേർത്തുകൊണ്ട് രണ്ട് മാനദണ്ഡങ്ങൾ തയ്യാറാക്കി. എല്ലാ വെള്ളവും നീക്കം ചെയ്യപ്പെടുന്നതുവരെ സാമ്പിളുകൾ -80° C.-ൽ ഫ്രീസുചെയ്‌ത് ലയോഫിലൈസ് ചെയ്യുന്നു (സാധാരണയായി ഏകദേശം 12-18 മണിക്കൂർ).
100-500 μg സാമ്പിൾ ഒരു വിശകലന ബാലൻസിൽ സ്ക്രൂ ക്യാപ് ട്യൂബുകളിലേക്ക് ചേർക്കുക.ചേർത്ത തുക രേഖപ്പെടുത്തുക.ലായകത്തിന്റെ ഒരു പ്രത്യേക സാന്ദ്രതയിൽ സാമ്പിൾ പിരിച്ചുവിടുകയും ട്യൂബിലേക്ക് ഒരു ദ്രാവക അലിഖിതമായി ചേർക്കുകയും ചെയ്യുന്നതാണ് നല്ലത്.ഓരോ സാമ്പിൾ ട്യൂബിനും ആന്തരിക മാനദണ്ഡമായി 20 µl 1 mg/ml ഇനോസിറ്റോൾ ഉപയോഗിക്കുക.സാമ്പിളിലേക്ക് ചേർത്ത ആന്തരിക നിലവാരത്തിന്റെ അളവ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ട്യൂബിലേക്ക് ചേർത്ത ആന്തരിക നിലവാരത്തിന്റെ അളവിന് തുല്യമായിരിക്കണം.
ഒരു സ്ക്രൂ ക്യാപ് കുപ്പിയിലേക്ക് 8 മില്ലി അൺഹൈഡ്രസ് മെഥനോൾ ചേർക്കുക.അതിനുശേഷം 4 മില്ലി 3 N. മെത്തനോളിക് HCl ലായനി, ക്യാപ് ചെയ്ത് കുലുക്കുക.ഈ പ്രക്രിയ വെള്ളം ഉപയോഗിക്കുന്നില്ല.
ഒലിഗോസാക്കറൈഡ് സാമ്പിളുകളിലും സാധാരണ TMS ട്യൂബുകളിലും 500 µl 1 M HCl മെഥനോൾ ലായനി ചേർക്കുക.സാമ്പിളുകൾ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് (168 മണിക്കൂർ) 80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒരു തെർമൽ ബ്ലോക്കിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.ഡ്രൈയിംഗ് മനിഫോൾഡ് ഉപയോഗിച്ച് ഊഷ്മാവിൽ മെത്തനോലിസിസ് ഉൽപ്പന്നം ഉണക്കുക.200 µl MeOH ചേർത്ത് വീണ്ടും ഉണക്കുക.ഈ പ്രക്രിയ രണ്ടുതവണ ആവർത്തിക്കുന്നു.സാമ്പിളിൽ 200 μl മെഥനോൾ, 100 μl പിറിഡിൻ, 100 μl അസറ്റിക് അൻഹൈഡ്രൈഡ് എന്നിവ ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കുക.സാമ്പിളുകൾ 30 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.ഉണക്കി.200 μl മെഥനോൾ ചേർത്ത് വീണ്ടും ഉണക്കുക.
200 μl ട്രൈ-സിൽ ചേർക്കുക, 20 മിനിറ്റ് അടച്ച ട്യൂബ് ചൂടാക്കുക.80 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്, തുടർന്ന് ഊഷ്മാവിൽ തണുപ്പിക്കുക.സാമ്പിൾ ഏകദേശം 50 µl അളവിൽ കൂടുതൽ ഉണക്കാൻ ഒരു ഡ്രൈയിംഗ് മാനിഫോൾഡ് ഉപയോഗിക്കുക.സാമ്പിളുകൾ പൂർണ്ണമായും ഉണങ്ങാൻ ഞങ്ങൾ അനുവദിച്ചില്ല എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.
2 മില്ലി ഹെക്സെയ്ൻ ചേർത്ത് നന്നായി ഇളക്കുക.5-3/4 ഇഞ്ച് വ്യാസമുള്ള പൈപ്പറ്റിനു മുകളിൽ ഗ്ലാസ് കമ്പിളി തിരുകിക്കൊണ്ട് പാസ്ചർ പൈപ്പറ്റുകളുടെ (5-8 മില്ലിമീറ്റർ) നുറുങ്ങുകൾ ഒരു ഗ്ലാസ് കമ്പിളി കൊണ്ട് നിറയ്ക്കുക.സാമ്പിളുകൾ 3000 ഗ്രാം 2 മിനിറ്റ് കേന്ദ്രീകൃതമാക്കി.ഏതെങ്കിലും ലയിക്കാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നു.സാമ്പിൾ 100-150 µl വരെ ഉണക്കുക.ഏകദേശം 1 μl വോളിയം GC-MS-ലേക്ക് 80 °C പ്രാരംഭ താപനിലയിലും പ്രാരംഭ സമയം 2.0 മിനിറ്റിലും കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു (പട്ടിക 2).