از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت ارائه می کنیم.
روش های جدید ایمونولوژیک و طیف سنجی جرمی برای تجزیه و تحلیل پیچیده الیگوساکاریدهای پایدار در ذرت پیش تیمار شده با AFEX.زیست توده لیگنوسلولزی یک جایگزین پایدار برای سوخت های فسیلی است و به طور گسترده برای توسعه بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی مانند غذا، خوراک، سوخت و مواد شیمیایی استفاده می شود.کلید این فناوری‌ها توسعه فرآیندهای رقابتی برای تبدیل کربوهیدرات‌های پیچیده موجود در دیواره سلولی گیاه به قندهای ساده مانند گلوکز، زایلوز و آرابینوز است.از آنجایی که زیست توده لیگنوسلولزی بسیار سرسخت است، باید تحت تیمارهای ترموشیمیایی (مانند لایه برداری الیاف آمونیاکی (AFEX)، اسیدهای رقیق (DA)، مایعات یونی (IL)) و تیمارهای بیولوژیکی (مثلاً هیدرولیز آنزیمی و تخمیر میکروبی) قرار گیرد تا محصول مورد نظر به دست آید..با این حال، هنگامی که از آنزیم های قارچی تجاری در فرآیند هیدرولیز استفاده می شود، تنها 75-85٪ از قندهای محلول تشکیل شده را مونوساکاریدها تشکیل می دهند و 15-25٪ باقیمانده الیگوساکاریدهای محلول و غیرقابل حل هستند که همیشه در دسترس میکروارگانیسم ها نیستند.پیش از این، ما با استفاده از ترکیبی از جداسازی کربن و خاک دیاتومه و کروماتوگرافی حذف اندازه، الیگوساکاریدهای سرسخت محلول را با موفقیت جدا و خالص کردیم، و همچنین خواص بازدارندگی آنزیم آنها را بررسی کردیم.ما دریافته‌ایم که الیگوساکاریدهای حاوی درجه بالاتر پلیمریزاسیون (DP) جایگزین‌های اسید اورونیک متیله پردازش با مخلوط‌های آنزیمی تجاری نسبت به الیگوساکاریدهای DP کم و خنثی دشوارتر است.در اینجا ما استفاده از چندین روش اضافی، از جمله پروفایل گلیکان را با استفاده از آنتی بادی‌های مونوکلونال (mAbs) مخصوص گلیکان‌های زیست توده گیاهی برای مشخص کردن پیوندهای گلیکان در دیواره‌های سلولی گیاه و هیدرولیزهای آنزیمی، یونیزاسیون دفع لیزری به کمک ماتریکس، طیف‌سنجی جرمی زمان پرواز گزارش می‌کنیم..MALDI-TOF-MS) از پیک‌های تشخیصی ساختاری به‌دست‌آمده از طیف‌سنجی پس از فروپاشی ثانویه یون‌های منفی، کروماتوگرافی گازی و طیف‌سنجی جرمی (GC-MS) برای توصیف پیوندهای الیگوساکاریدی با و بدون مشتق‌سازی استفاده می‌کند.به دلیل اندازه کوچک الیگوساکاریدها (DP 4-20)، استفاده از این مولکول ها برای اتصال و مشخصه یابی mAb دشوار است.برای غلبه بر این مشکل، ما یک روش جدید بیحرکتی الیگوساکارید مبتنی بر کونژوگاسیون بیوتین را به کار بردیم که با موفقیت اکثر الیگوساکاریدهای محلول با DP پایین را روی سطح میکروپلیت نشان‌گذاری کرد، که سپس در یک سیستم mAb با توان عملیاتی بالا برای آنالیز بستن خاص استفاده شد.این روش جدید توسعه آزمایش‌های پیشرفته‌تر گلیکوم با توان عملیاتی بالا را در آینده تسهیل می‌کند که می‌توانند برای جداسازی و شناسایی الیگوساکاریدهای موجود در نشانگرهای زیستی برای اهداف تشخیصی مورد استفاده قرار گیرند.
زیست توده لیگنوسلولزی، متشکل از کشاورزی، جنگلداری، چمن و مواد چوبی، یک ماده اولیه بالقوه برای تولید محصولات زیستی، از جمله مواد غذایی، خوراک، سوخت و پیش سازهای شیمیایی برای تولید محصولات با ارزش بالاتر است.کربوهیدرات ها (مانند سلولز و همی سلولز) موجود در دیواره سلولی گیاه با پردازش شیمیایی و تبدیل زیستی (مانند هیدرولیز آنزیمی و تخمیر میکروبی) به مونوساکاریدها تبدیل می شوند.پیش تیمارهای متداول شامل انبساط فیبر آمونیاک (AFEX)، اسید رقیق (DA)، مایع یونی (IL) و انفجار بخار (SE) است که از ترکیبی از مواد شیمیایی و حرارت برای کاهش تولید لیگنوسلولز با باز کردن دیواره‌های سلولی گیاه استفاده می‌کنند.سرسختی ماده، 5. هیدرولیز آنزیمی با بار جامد بالا با استفاده از آنزیم های تجاری حاوی کربوهیدرات فعال (CAZymes) و تخمیر میکروبی با استفاده از مخمرها یا باکتری های تراریخته برای تولید سوخت های زیستی و مواد شیمیایی انجام می شود.
CAZymes در آنزیم های تجاری از مخلوط پیچیده ای از آنزیم ها تشکیل شده است که به طور هم افزایی پیوندهای پیچیده کربوهیدرات-قند را برای تشکیل مونوساکاریدها می شکافند.همانطور که قبلاً گزارش دادیم، شبکه پیچیده پلیمرهای معطر لیگنین با کربوهیدرات ها آنها را بسیار مقاوم می کند، که منجر به تبدیل قند ناقص می شود و 15-25٪ از الیگوساکاریدهای جنسی را که در طی هیدرولیز آنزیمی زیست توده از پیش تیمار شده تولید نمی شوند، جمع می کند.این یک مشکل رایج در روش های مختلف پیش تصفیه زیست توده است.برخی از دلایل این تنگنا عبارتند از مهار آنزیم در طول هیدرولیز، یا عدم وجود یا سطوح پایین آنزیم های ضروری ضروری که برای شکستن پیوندهای قندی در زیست توده گیاهی لازم است.درک ترکیب و ویژگی های ساختاری قندها، مانند پیوندهای قندی در الیگوساکاریدها، به ما کمک می کند تا تبدیل قند را در طول هیدرولیز بهبود بخشیم و فرآیندهای بیوتکنولوژیکی را با محصولات مشتق شده از نفت رقابتی کنند.
تعیین ساختار کربوهیدرات ها چالش برانگیز است و به ترکیبی از روش هایی مانند کروماتوگرافی مایع (LC)11،12، طیف سنجی تشدید مغناطیسی هسته ای (NMR)13، الکتروفورز مویرگی (CE)14،15،16 و طیف سنجی جرمی (MS)17 نیاز دارد.،هجده.روش های MS مانند طیف سنجی جرمی زمان پرواز با دفع لیزر و یونیزاسیون با استفاده از ماتریس (MALDI-TOF-MS) یک روش همه کاره برای شناسایی ساختارهای کربوهیدراتی است.اخیراً، MS پشت سر هم از جداسازی ناشی از برخورد (CID) ترکیبات افزایشی یون سدیم به طور گسترده برای شناسایی اثر انگشت مربوط به موقعیت‌های اتصال الیگوساکارید، پیکربندی‌های آنومری، توالی‌ها و موقعیت‌های انشعاب استفاده شده است.
تجزیه و تحلیل گلیکان یک ابزار عالی برای شناسایی عمیق پیوندهای کربوهیدراتی است.این روش از آنتی بادی های مونوکلونال (mAbs) که به گلیکان دیواره سلولی گیاه هدایت می شوند به عنوان پروب برای درک پیوندهای کربوهیدرات پیچیده استفاده می کند.بیش از 250 mAbs در سراسر جهان موجود است که در برابر الیگوساکاریدهای خطی و شاخه‌دار مختلف با استفاده از ساکاریدهای مختلف طراحی شده‌اند.چندین mAb به طور گسترده برای توصیف ساختار، ترکیب و تغییرات دیواره سلولی گیاه استفاده شده است، زیرا بسته به نوع سلول گیاهی، اندام، سن، مرحله رشد و محیط رشد تفاوت های قابل توجهی وجود دارد.اخیراً، این روش برای درک جمعیت وزیکول ها در سیستم های گیاهی و جانوری و نقش مربوطه آنها در انتقال گلیکان که توسط نشانگرهای درون سلولی، مراحل رشد یا محرک های محیطی تعیین می شود و برای تعیین فعالیت آنزیمی استفاده شده است.برخی از ساختارهای مختلف گلیکان‌ها و زایلان‌ها که شناسایی شده‌اند عبارتند از: پکتین (P)، زایلان (X)، مانان (M)، زایل‌گلوکان‌ها (XylG)، گلوکان‌های باند مخلوط (MLG)، آرابینوکسیلان (ArbX)، گالاکتومانان (GalG)، گلوکورونیک اسید-arabinoxylan) و arabinoxylan (GA.rbgal)29.
با این حال، علی‌رغم تمام این تلاش‌های تحقیقاتی، تنها چند مطالعه بر ماهیت تجمع الیگوساکارید در طول هیدرولیز بار جامد بالا (HSL) متمرکز شده‌اند، از جمله آزادسازی الیگوساکارید، تغییرات طول زنجیره الیگومری در طول هیدرولیز، پلیمرهای مختلف با DP کم و منحنی‌های آنها.توزیع 30،31،32.در همین حال، اگرچه تجزیه و تحلیل گلیکان ثابت کرده است که ابزار مفیدی برای تجزیه و تحلیل جامع ساختار گلیکان است، ارزیابی الیگوساکاریدهای DP کم محلول در آب با استفاده از روش های آنتی بادی دشوار است.الیگوساکاریدهای DP کوچکتر با وزن مولکولی کمتر از 5-10 کیلو دالتون به صفحات ELISA 33، 34 متصل نمی شوند و قبل از افزودن آنتی بادی شسته می شوند.
در اینجا، برای اولین بار، ما یک روش الایزا را بر روی صفحات پوشش داده شده با آویدین با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال نشان می دهیم، که یک روش بیوتینیلاسیون یک مرحله ای برای الیگوساکاریدهای نسوز محلول را با تجزیه و تحلیل گلیکوم ترکیب می کند.رویکرد ما به تجزیه و تحلیل گلیکوم توسط تجزیه و تحلیل مبتنی بر MALDI-TOF-MS و GC-MS پیوندهای الیگوساکارید مکمل با استفاده از مشتق سازی تری متیلسیلیل (TMS) از ترکیبات قند هیدرولیز شده تایید شد.این رویکرد نوآورانه می تواند به عنوان روشی با توان عملیاتی بالا در آینده توسعه یابد و کاربرد گسترده تری در تحقیقات زیست پزشکی پیدا کند.
تغییرات پس از ترجمه آنزیم ها و آنتی بادی ها، مانند گلیکوزیلاسیون، بر فعالیت بیولوژیکی آنها تأثیر می گذارد.به عنوان مثال، تغییرات در گلیکوزیلاسیون پروتئین های سرم نقش مهمی در آرتریت التهابی دارد و تغییرات در گلیکوزیلاسیون به عنوان نشانگرهای تشخیصی استفاده می شود.در مقالات گزارش شده است که گلیکان های مختلفی به راحتی در انواع بیماری ها ظاهر می شوند، از جمله بیماری های التهابی مزمن دستگاه گوارش و کبد، عفونت های ویروسی، سرطان های تخمدان، سینه و پروستات 38،39،40.درک ساختار گلیکان ها با استفاده از روش های الایزای گلیکان مبتنی بر آنتی بادی، اطمینان بیشتری را در تشخیص بیماری بدون استفاده از روش های پیچیده ام اس فراهم می کند.
مطالعه قبلی ما نشان داد که الیگوساکاریدهای سرسخت پس از پیش تیمار و هیدرولیز آنزیمی هیدرولیز نشده باقی می مانند (شکل 1).در کار منتشر شده قبلی خود، ما یک روش استخراج فاز جامد زغال چوب فعال را برای جداسازی الیگوساکاریدها از هیدرولیز ذرت (ACSH)8 پیش تیمار شده با AFEX توسعه دادیم.پس از استخراج و جداسازی اولیه، الیگوساکاریدها توسط کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) تکه تکه شدند و به ترتیب وزن مولکولی جمع‌آوری شدند.مونومرهای قند و الیگومرهای آزاد شده از پیش تیمارهای مختلف با تجزیه و تحلیل ترکیب قند مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.هنگام مقایسه محتوای الیگومرهای قند به‌دست‌آمده با روش‌های مختلف پیش تیمار، وجود الیگوساکاریدهای سرسخت یک مشکل رایج در تبدیل زیست توده به مونوساکارید است و می‌تواند منجر به کاهش عملکرد قند حداقل 10-15٪ و حتی تا 18٪ شود.ایالات متحدهاین روش برای تولید بیشتر فراکسیون های الیگوساکارید در مقیاس بزرگ استفاده می شود.ACH حاصل و بخش‌های بعدی آن با وزن‌های مولکولی متفاوت به‌عنوان ماده آزمایشی برای توصیف الیگوساکاریدها در این کار استفاده شد.
پس از پیش تیمار و هیدرولیز آنزیمی، الیگوساکاریدهای پایدار هیدرولیز نشده باقی ماندند.در اینجا (A) یک روش جداسازی الیگوساکارید است که در آن الیگوساکاریدها از هیدرولیز ذرت پیش تیمار شده با AFEX (ACSH) با استفاده از یک بستر بسته بندی شده از کربن فعال و خاک دیاتومه جدا می شوند.(ب) روش جداسازی الیگوساکاریدها.الیگوساکاریدها توسط کروماتوگرافی حذف اندازه (SEC) از هم جدا شدند.(C) مونومرها و الیگومرهای ساکارید آزاد شده از پیش تیمارهای مختلف (اسید رقیق شده: DA، مایع یونی: IL و AFEX).شرایط هیدرولیز آنزیمی: بارگیری جامد بالا 25% (وزنی/وزنی) (تقریباً 8% بارگیری گلوکان)، هیدرولیز 96 ساعت، بارگیری تجاری آنزیم 20 میلی گرم بر گرم (نسبت Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) و (D) مونومرهای قند و گلوآرانوز-کوراز اکسترانس آزاد شده از الیکوآرانوز xx. بیش از (ACS).
آنالیز گلیکان ثابت کرده است که ابزار مفیدی برای تجزیه و تحلیل ساختاری جامع گلیکان ها در عصاره های جدا شده از بقایای زیست توده جامد است.با این حال، ساکاریدهای محلول در آب با استفاده از این روش سنتی کمتر معرفی می شوند، زیرا الیگوساکاریدهای با وزن مولکولی کم به سختی در صفحات ELISA بی حرکت هستند و قبل از افزودن آنتی بادی شسته می شوند.بنابراین، برای اتصال آنتی‌بادی و تعیین خصوصیات، یک روش بیوتینیلاسیون یک مرحله‌ای برای پوشش دادن الیگوساکاریدهای محلول و غیر منطبق بر روی صفحات الایزای پوشش داده شده با آویدین استفاده شد.این روش با استفاده از ACSH که قبلاً تولید شده بود و کسری بر اساس وزن مولکولی آن (یا درجه پلیمریزاسیون، DP) آزمایش شد.بیوتینیلاسیون یک مرحله ای برای افزایش میل ترکیبی اتصال الیگوساکارید با افزودن بیوتین-LC-هیدرازید به انتهای احیاکننده کربوهیدرات استفاده شد (شکل 2).در محلول، گروه همی استال در انتهای احیا کننده با گروه هیدرازید بیوتین-LC-هیدرازید واکنش می دهد و پیوند هیدرازون تشکیل می دهد.در حضور عامل احیا کننده NaCNBH3، پیوند هیدرازون به محصول نهایی بیوتینیله شده با ثبات کاهش می یابد.با اصلاح انتهای کاهنده قند، اتصال الیگوساکاریدهای DP کم به صفحات ELISA امکان پذیر شد و در مطالعه ما این کار بر روی صفحات پوشش داده شده با آویدین با استفاده از mAbs هدفمند با گلیکان انجام شد.
غربالگری آنتی بادی های مونوکلونال بر اساس الایزا برای الیگوساکاریدهای بیوتینیله.در اینجا (A) بیوتینیلاسیون ترکیبی الیگوساکاریدها و غربالگری الایزا متعاقب آن با بادی‌آب‌های هدفدار گلیکان روی صفحات پوشش‌داده‌شده NeutrAvidin و (B) یک روش یک مرحله‌ای برای بیوتینیلاسیون محصولات واکنش نشان می‌دهد.
سپس صفحات پوشیده شده با آویدین با آنتی بادی های کونژوگه با الیگوساکارید به آنتی بادی های اولیه و ثانویه اضافه شدند و در محیط حساس به نور و زمان شسته شدند.پس از اتمام اتصال آنتی بادی، بستر TMB را برای انکوباسیون پلیت اضافه کنید.در نهایت واکنش با اسید سولفوریک متوقف شد.صفحات انکوبه شده با استفاده از ELISA reader برای تعیین قدرت اتصال هر آنتی بادی برای تشخیص اتصال متقابل خاص آنتی بادی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.برای جزئیات و پارامترهای آزمایش، به بخش مربوطه "مواد و روش ها" مراجعه کنید.
ما کاربرد این روش جدید توسعه‌یافته را برای کاربردهای خاص با توصیف الیگوساکاریدهای محلول موجود در ACSH و همچنین در فراکسیون‌های الیگوساکارید خام و خالص جدا شده از هیدرولیزهای لیگنوسلولزی نشان می‌دهیم.همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، رایج ترین زایلان های جایگزین شده با اپی توپ شناسایی شده در ACSH با استفاده از روش های سنجش گلیکوم بیواسیله، معمولا اورونیک (U) یا متیلورونیک (MeU) و آرابینوگالاکتان پکتیک هستند.بسیاری از آنها همچنین در مطالعه قبلی ما در مورد تجزیه و تحلیل گلیکان جامدات غیرهیدرولیز نشده (UHS)43 یافت شدند.
تشخیص اپی توپ های الیگوساکارید مقاوم با استفاده از یک آنتی بادی مونوکلونال هدایت شده به گلیکان دیواره سلولی.کسر "خنثی" کسر ACN و کسر "اسیدی" کسر FA است.قرمزهای روشن‌تر در نقشه حرارتی نشان‌دهنده محتوای اپی توپ بالاتر و آبی‌های روشن‌تر نشان‌دهنده پس‌زمینه خالی است.مقادیر رنگ در مقیاس بر اساس مقادیر خام OD برای فرمولاسیون N=2 است.اپی توپ های اصلی شناسایی شده توسط آنتی بادی ها در سمت راست نشان داده شده اند.
این ساختارهای غیر سلولزی را نمی‌توان توسط رایج‌ترین سلولازها و همی سلولازها در مخلوط آنزیمی تجاری آزمایش‌شده، که شامل رایج‌ترین آنزیم‌های تجاری مورد استفاده است، شکافت.بنابراین، آنزیم های کمکی جدید برای هیدرولیز آنها مورد نیاز است.بدون آنزیم های ضروری غیر سلولزی، این پیوندهای غیر سلولزی از تبدیل کامل به مونوساکاریدها جلوگیری می کنند، حتی اگر پلیمرهای قند اصلی آنها به طور گسترده به قطعات کوتاه تر هیدرولیز شده و با استفاده از مخلوط های آنزیمی تجاری حل شوند.
مطالعه بیشتر توزیع سیگنال و قدرت اتصال آن نشان داد که اپی توپ های اتصال در بخش های قند با DP بالا (A, B, C, DP تا 20+) کمتر از بخش های DP پایین (D, E, F, DP) در دایمرها بود (شکل 1).قطعات اسیدی در اپی توپ های غیر سلولزی بیشتر از قطعات خنثی هستند.این پدیده‌ها با الگوی مشاهده‌شده در مطالعه قبلی ما، که در آن بخش‌های DP و اسید بالا نسبت به هیدرولیز آنزیمی مقاوم‌تر بودند، مطابقت دارند.بنابراین، وجود اپی توپ‌های گلیکان غیر سلولزی و جایگزین‌های U و MeU می‌تواند تا حد زیادی به پایداری الیگوساکاریدها کمک کند.لازم به ذکر است که کارایی اتصال و تشخیص می تواند برای الیگوساکاریدهای DP کم مشکل ساز باشد، به خصوص اگر اپی توپ یک الیگوساکارید دایمریک یا تریمریک باشد.این را می توان با استفاده از الیگوساکاریدهای تجاری با طول های مختلف، که هر کدام حاوی تنها یک اپی توپ است که به یک mAb خاص متصل می شود، آزمایش کرد.
بنابراین، استفاده از آنتی‌بادی‌های ساختاری خاص، انواع خاصی از پیوندهای مقاوم را نشان داد.بسته به نوع آنتی بادی مورد استفاده، الگوی بستن مناسب و قدرت سیگنالی که تولید می کند (بیشترین و کمترین فراوانی)، آنزیم های جدید را می توان شناسایی کرد و به صورت نیمه کمی به مخلوط آنزیم اضافه کرد تا تبدیل گلیکو کاملتر شود.با در نظر گرفتن تجزیه و تحلیل الیگوساکاریدهای ACSH به عنوان مثال، ما می توانیم یک پایگاه داده از پیوندهای گلیکان برای هر ماده زیست توده ایجاد کنیم.در اینجا لازم به ذکر است که میل ترکیبی مختلف آنتی بادی ها باید در نظر گرفته شود و اگر میل ترکیبی آنها ناشناخته باشد، در مقایسه سیگنال های آنتی بادی های مختلف مشکلات خاصی ایجاد می کند.علاوه بر این، مقایسه پیوندهای گلیکان ممکن است بین نمونه ها برای همان آنتی بادی بهترین کار را داشته باشد.سپس می‌توان این پیوندهای سرسخت را به پایگاه داده CAZyme پیوند داد، که از آن می‌توان آنزیم‌ها را شناسایی کرد، آنزیم‌های کاندید را انتخاب کرد و آنزیم‌های شکستن پیوند را آزمایش کرد، یا سیستم‌های میکروبی را برای بیان این آنزیم‌ها برای استفاده در پالایشگاه‌های زیستی توسعه داد.
برای ارزیابی چگونگی تکمیل روش‌های ایمونولوژیک روش‌های جایگزین برای مشخص کردن الیگوساکاریدهای با وزن مولکولی کم موجود در هیدرولیزهای لیگنوسلولزی، ما MALDI (شکل 4، S1-S8) و تجزیه و تحلیل ساکاریدهای مشتق شده از TMS بر اساس GC-MS را در همان پانل (شکل 5) الیگوساکارید انجام دادیم.MALDI برای مقایسه اینکه آیا توزیع جرمی مولکول های الیگوساکارید با ساختار مورد نظر مطابقت دارد یا خیر استفاده می شود.روی انجیرشکل 4 MC اجزای خنثی ACN-A و ACN-B را نشان می دهد.تجزیه و تحلیل ACN-A طیفی از قندهای پنتوز را از DP 4-8 (شکل 4) تا DP 22 (شکل S1) تأیید کرد که وزن آنها با الیگوساکاریدهای MeU-xylan مطابقت دارد.تجزیه و تحلیل ACN-B سری پنتوز و گلوکوکسیلان را با DP 8-15 تایید کرد.در مواد تکمیلی مانند شکل S3، نقشه‌های توزیع جرم قسمت اسیدی FA-C طیفی از قندهای پنتوز جایگزین شده (Me)U را با DP 15-8 نشان می‌دهد که با زایلان‌های جایگزین یافت شده در غربالگری mAb مبتنی بر ELISA مطابقت دارد.اپی توپ ها سازگار هستند.
طیف MALDI-MS از الیگوساکاریدهای غیر سازگار محلول موجود در ACS.در اینجا، (A) فراکسیون‌های محدوده وزن کم ACN-A حاوی اسید اورونیک متیله (DP 4-8) گلوکوروکسیلان الیگوساکاریدها و (B) ACN-B زایلان و الیگوساکاریدهای اسید اورونیک متیله شده با گلوکوروکسیلان (DP 8-15) جایگزین شدند.
تجزیه و تحلیل ترکیب باقی مانده گلیکان الیگوساکاریدهای نسوز.در اینجا (A) ترکیب ساکارید TMS از فراکسیون های مختلف الیگوساکارید به دست آمده با استفاده از تجزیه و تحلیل GC-MS.(ب) ساختار قندهای مختلف مشتق از TMS موجود در الیگوساکاریدها.ACN - کسر استونیتریل حاوی الیگوساکاریدهای خنثی و FA - کسر اسید فرولیک حاوی الیگوساکاریدهای اسیدی.
نتیجه جالب دیگری از تجزیه و تحلیل LC-MS از بخش اولیگوساکارید، همانطور که در شکل S9 نشان داده شده است، به دست آمد (روش ها را می توان در مواد تکمیلی الکترونیکی مشاهده کرد).قطعاتی از گروه های هگزوز و -OAc به طور مکرر در طول بستن بخش ACN-B مشاهده شد.این یافته نه تنها تکه تکه شدن مشاهده شده در تجزیه و تحلیل گلیکوم و MALDI-TOF را تأیید می کند، بلکه اطلاعات جدیدی در مورد مشتقات کربوهیدرات بالقوه در زیست توده لیگنوسلولزی پیش تیمار شده ارائه می دهد.
ما همچنین ترکیب قند بخش اولیگوساکارید را با استفاده از مشتق‌سازی قند TMS تجزیه و تحلیل کردیم.با استفاده از GC-MS، ما ترکیب قندهای عصبی (غیر مشتق) و اسیدی (GluA و GalA) را در بخش اولیگوساکارید تعیین کردیم (شکل 5).اسید گلوکورونیک در اجزای اسیدی C و D یافت می شود، در حالی که اسید گالاکتورونیک در اجزای اسیدی A و B یافت می شود که هر دو از اجزای DP بالا در قندهای اسیدی هستند.این نتایج نه تنها داده‌های ELISA و MALDI ما را تأیید می‌کنند، بلکه با مطالعات قبلی ما در مورد تجمع الیگوساکارید نیز مطابقت دارند.بنابراین، ما معتقدیم که روش‌های ایمونولوژیک مدرن با استفاده از بیوتینیلاسیون الیگوساکاریدها و غربالگری الایزا متعاقب آن برای تشخیص الیگوساکاریدهای مقاوم محلول در نمونه‌های بیولوژیکی مختلف کافی است.
از آنجایی که روش‌های غربالگری mAb مبتنی بر الایزا با چندین روش مختلف تأیید شده‌اند، می‌خواهیم پتانسیل این روش کمی جدید را بیشتر بررسی کنیم.دو الیگوساکارید تجاری، زایلوهگزا ساکارید الیگوساکارید (XHE) و 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، خریداری و با استفاده از یک رویکرد جدید mAb که گلیکان دیواره سلولی را هدف قرار می‌دهد، مورد آزمایش قرار گرفتند.شکل 6 یک همبستگی خطی بین سیگنال اتصال بیوتینیله و غلظت log غلظت الیگوساکارید را نشان می دهد که مدل جذب لانگمویر ممکن را پیشنهاد می کند.در بین mAbs، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، و CCRC-M151 با XHE و CCRC-M108، CCRC-M109 و LM11 با A2XX nmno در محدوده 10 تا 10 همبستگی داشتند.با توجه به محدودیت در دسترس بودن آنتی بادی ها در طول آزمایش، آزمایشات محدودی با هر غلظت الیگوساکارید انجام شد.در اینجا لازم به ذکر است که برخی از آنتی بادی ها به الیگوساکارید یکسان به عنوان یک سوبسترا واکنش بسیار متفاوتی نشان می دهند، احتمالاً به این دلیل که به اپی توپ های کمی متفاوت متصل می شوند و می توانند پیوندهای پیوندی بسیار متفاوتی داشته باشند.مکانیسم ها و پیامدهای شناسایی دقیق اپی توپ زمانی که رویکرد جدید mAb به نمونه های واقعی اعمال شود، بسیار پیچیده تر خواهد بود.
دو الیگوساکارید تجاری برای تعیین محدوده تشخیص mAbهای مختلف هدف‌گیری گلیکان استفاده شد.در اینجا، همبستگی خطی با غلظت ورود به سیستم غلظت الیگوساکارید نشان دهنده الگوهای جذب لانگمویر برای (A) XHE با mAb و (B) A2XX با mAb است.اپی توپ های مربوطه نشان دهنده ساختار الیگوساکاریدهای تجاری مورد استفاده به عنوان سوبسترا در سنجش است.
استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال هدفمند گلیکان (تجزیه و تحلیل گلیکوکومیک یا غربالگری بادی مونوکلونال مبتنی بر الایزا) ابزار قدرتمندی برای شناسایی عمیق اکثر گلیکان های دیواره سلولی اصلی است که زیست توده گیاهی را تشکیل می دهند.با این حال، تجزیه و تحلیل گلیکان کلاسیک تنها گلیکان های دیواره سلولی بزرگتر را مشخص می کند، زیرا اکثر الیگوساکاریدها به طور موثر در صفحات ELISA بی حرکت نیستند.در این مطالعه، استور ذرت پیش تیمار شده با AFEX به صورت آنزیمی در محتوای جامد بالا هیدرولیز شد.تجزیه و تحلیل قند برای تعیین ترکیب کربوهیدرات های دیواره سلولی مقاوم در هیدرولیز استفاده شد.با این حال، تجزیه و تحلیل mAb الیگوساکاریدهای کوچکتر در هیدرولیزها دست کم گرفته شده است، و ابزارهای اضافی برای بی حرکت کردن موثر الیگوساکاریدها در صفحات ELISA مورد نیاز است.
ما در اینجا یک روش جدید و کارآمد بیحرکتی اولیگوساکارید را برای غربالگری بادی مونوکلونال با ترکیب بیوتینیلاسیون الیگوساکارید و به دنبال آن غربالگری ELISA بر روی صفحات پوشش داده شده NeutrAvidin گزارش می کنیم.الیگوساکاریدهای بیوتینیله شده بی‌حرکت میل کافی برای آنتی‌بادی برای شناسایی سریع و کارآمد الیگوساکاریدهای مقاوم نشان دادند.تجزیه و تحلیل ترکیب این الیگوساکاریدهای سرسخت بر اساس طیف سنجی جرمی، نتایج این رویکرد جدید برای غربالگری ایمنی را تایید کرد.بنابراین، این مطالعات نشان می‌دهد که ترکیب بیوتینیلاسیون الیگوساکارید و غربالگری ELISA با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال هدف‌دار گلیکان می‌تواند برای شناسایی پیوندهای عرضی در الیگوساکاریدها استفاده شود و می‌تواند به طور گسترده در سایر مطالعات بیوشیمیایی که ساختار الیگوساکاریدها را مشخص می‌کنند به کار برد.
این روش پروفایل گلیکان مبتنی بر بیوتین اولین گزارشی است که قادر به بررسی پیوندهای کربوهیدراتی مقاوم در الیگوساکاریدهای محلول در زیست توده گیاهی است.این به درک اینکه چرا برخی از بخش های زیست توده در تولید سوخت زیستی بسیار سرسخت هستند کمک می کند.این روش شکاف مهمی را در روش‌های آنالیز گلیکوم پر می‌کند و کاربرد آن را به طیف وسیع‌تری از بسترهای فراتر از الیگوساکاریدهای گیاهی گسترش می‌دهد.در آینده، ممکن است از روباتیک برای بیوتینیلاسیون استفاده کنیم و از روشی که برای آنالیز با توان بالای نمونه‌ها با استفاده از ELISA توسعه داده‌ایم استفاده کنیم.
کاه ذرت (CS) رشد یافته از دانه های هیبریدی پایونیر 33A14 در سال 2010 از مزارع کرامر در ری، کلرادو برداشت شد.با اجازه مالک زمین می توان از این زیست توده برای تحقیقات استفاده کرد. نمونه ها با رطوبت کمتر از 6 درصد در کیسه های زیپ دار در دمای اتاق نگهداری شدند. نمونه ها با رطوبت کمتر از 6 درصد در کیسه های زیپ دار در دمای اتاق نگهداری شدند. 6% در پکیج با برایستژкой-молнией при комнатной температуре. نمونه ها به صورت خشک با رطوبت کمتر از 6 درصد در کیسه های زیپ دار در دمای اتاق نگهداری شدند.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ذخیره سازی در بسته ها با برایستژкой-молнией при комнатной температуре со влажностью < 6%. نمونه ها در کیسه های زیپ دار در دمای اتاق با رطوبت کمتر از 6% نگهداری می شوند.این مطالعه با دستورالعمل های محلی و ملی مطابقت داشت.تجزیه و تحلیل ترکیبی با استفاده از پروتکل NREL انجام شد.این ترکیب حاوی 31.4٪ گلوکان، 18.7٪ زایلان، 3.3٪ آرابینان، 1.2٪ گالاکتان، 2.2٪ استیل، 14.3٪ لیگنین، 1.7٪ پروتئین و 13.4٪ خاکستر بود.
Cellic® CTec2 (138 میلی گرم پروتئین در میلی لیتر، مقدار VCNI 0001) مخلوط پیچیده ای از سلولاز، β-گلوکوزیداز و Cellic® HTec2 (157 میلی گرم پروتئین در میلی لیتر، مقدار VHN00001) از Novozymes (فرانکلینتون، NC، ایالات متحده) است.Multifect Pectinase® (72 میلی گرم پروتئین در میلی لیتر)، یک ترکیب پیچیده از آنزیم های تجزیه کننده پکتین، توسط DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto، CA، USA) اهدا شد.غلظت پروتئین آنزیم با تخمین محتوای پروتئین (و کم کردن سهم نیتروژن غیر پروتئینی) با استفاده از تجزیه و تحلیل نیتروژن Kjeldahl (روش AOAC 2001.11، Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) تعیین شد.دیاتومه 545 از EMD Millipore (Billerica, MA) خریداری شد.کربن فعال (دارکو، گرانول 100 مش)، آویسل (PH-101)، زایلان راش، و همه مواد شیمیایی دیگر از سیگما-آلدریچ (سنت لوئیس، MO) خریداری شد.
پیش تیمار AFEX در GLBRC (آزمایشگاه تحقیقاتی تبدیل زیست توده، MSU، Lansing، MI، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.پیش تیمار در دمای 140 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انجام شد.46 زمان ماند در نسبت 1:1 آمونیاک بی آب به زیست توده در بارگیری 60% (وزنی/وزنی) در یک راکتور دسته ای رومیزی فولادی ضد زنگ (شرکت ابزارهای Parr).30 دقیقه طول کشید.راکتور به 140 درجه سانتیگراد رسانده شد و آمونیاک به سرعت آزاد شد و به زیست توده اجازه داد تا به سرعت به دمای اتاق بازگردد.ترکیب اجاق ذرت پیش تیمار شده با AFEX (ACS) شبیه به استور ذرت تیمار نشده (UT-CS) بود.
جامدات بالا ACSH 25% (وزنی/وزنی) (تقریباً 8% بارگذاری دکستران) به عنوان ماده اولیه برای تولید الیگوساکاریدها در مقیاس بزرگ تهیه شد.هیدرولیز آنزیمی ACS با استفاده از مخلوط آنزیمی تجاری شامل Cellic® Ctec2 10 میلی گرم پروتئین در گرم گلوکان (در زیست توده پیش تیمار شده)، Htec2 (Novozymes، فرانکلینتون، NC)، 5 میلی گرم پروتئین در گرم گلوکان و Multifect Pectinase (Genencor Inc، ایالات متحده) انجام شد.).) 5 میلی گرم پروتئین در گرم دکستران.هیدرولیز آنزیمی در بیوراکتور 5 لیتری با حجم کاری 3 لیتر، pH 4.8، 50 درجه سانتی گراد و 250 دور در دقیقه انجام شد.پس از هیدرولیز به مدت 96 ساعت، هیدرولیز با سانتریفیوژ در دور 6000 به مدت 30 دقیقه و سپس در 14000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه جمع آوری شد تا جامدات هیدرولیز نشده خارج شوند.سپس هیدرولیز از طریق یک فنجان فیلتر 0.22 میلی متری تحت فیلتراسیون استریل قرار گرفت.هیدرولیز فیلتر شده در بطری های استریل در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد و سپس بر روی کربن تکه تکه شد.
تجزیه و تحلیل ترکیب نمونه‌های زیست توده مبتنی بر عصاره بر اساس روش‌های آنالیز آزمایشگاهی NREL: آماده‌سازی نمونه‌ها برای آنالیز ترکیب (NREL/TP-510-42620) و تعیین کربوهیدرات‌های ساختاری و لیگنین در زیست توده (NREL/TP-510 – 42618)47.
تجزیه و تحلیل الیگوساکارید جریان هیدرولیز در مقیاس 2 میلی لیتر با استفاده از روش هیدرولیز اسید مبتنی بر اتوکلاو انجام شد.نمونه هیدرولیز را با 7/69 میکرولیتر اسید سولفوریک 72 درصد در یک لوله کشت 10 میلی لیتری درپوش پیچی مخلوط کرده و به مدت 1 ساعت روی یک میز در دمای 121 درجه سانتیگراد انکوبه کنید، روی یخ خنک کنید و در ویال کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) فیلتر کنید.غلظت الیگوساکاریدها با کم کردن غلظت مونوساکاریدها در نمونه هیدرولیز نشده از غلظت کل قند در نمونه اسید هیدرولیز شده تعیین شد.
غلظت گلوکز، زایلوز و آرابینوز در زیست توده اسیدی هیدرولیز شده با استفاده از یک سیستم HPLC Shimadzu مجهز به نمونه‌بردار خودکار، بخاری ستونی، پمپ ایزوکراتیک و آشکارساز ضریب شکست بر روی ستون Bio-Rad Aminex HPX-87H مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.ستون در دمای 50 درجه سانتی گراد نگهداری شد و با 0.6 میلی لیتر در دقیقه 5 میلی مولار H2SO4 در آب شسته شد.جریان.
مایع رویی هیدرولیز رقیق شد و از نظر محتوای مونومر و الیگوساکارید مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.قندهای مونومر به دست آمده پس از هیدرولیز آنزیمی توسط HPLC مجهز به ستون Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P و یک ستون محافظ خاکستر تجزیه و تحلیل شدند.دمای ستون در 80 درجه سانتیگراد حفظ شد، آب به عنوان فاز متحرک با سرعت جریان 0.6 میلی لیتر در دقیقه استفاده شد.الیگوساکاریدها با هیدرولیز در اسید رقیق در 121 درجه سانتی گراد با توجه به روش های شرح داده شده در refs تعیین شدند.41، 48، 49.
تجزیه و تحلیل ساکارید بر روی خام، AFEX از پیش تیمار شده و تمام باقیمانده‌های زیست توده غیرهیدرولیز شده (از جمله تولید عصاره‌های دیواره سلولی سریال و غربالگری mAb آن‌ها) با استفاده از روش‌هایی که قبلاً توضیح داده شد، انجام شد.برای تجزیه و تحلیل گلیکوم، بقایای نامحلول در الکل از مواد دیواره سلولی گیاهی از بقایای زیست توده تهیه می‌شود و با معرف‌های تهاجمی فزاینده‌ای مانند اگزالات آمونیوم (50 میلی‌مولار)، کربنات سدیم (50 میلی‌مولار و 0.5 درصد وزنی بر حجم)، CON استخراج می‌شوند.(1M و 4M، هر دو با 1% w/v سدیم بوروهیدرید) و کلریت اسید همانطور که قبلاً توضیح داده شد 52،53.سپس عصاره‌ها در مقابل یک پانل پیچیده از mAb50 که به گلیکان دیواره سلولی هدایت می‌شوند، تحت الایزا قرار گرفتند و واکنش‌های اتصال mAb به عنوان یک نقشه حرارتی ارائه شد.mAbs که گلیکان دیواره سلولی گیاه را هدف قرار می دهند از انبارهای آزمایشگاهی (سری CCRC، JIM و MAC) خریداری شدند.
بیوتینیلاسیون یک مرحله ای الیگوساکاریدها.کونژوگه کربوهیدرات ها با بیوتین-LC-هیدرازید با استفاده از روش زیر انجام شد.بیوتین-LC-هیدرازید (4.6 میلی گرم/12 میکرومول) در دی متیل سولفوکسید (DMSO، 70 میکرولیتر) با هم زدن شدید و حرارت دادن در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه حل شد.اسید استیک یخبندان (30 میکرولیتر) اضافه شد و مخلوط روی سیانوبرو هیدرید سدیم (6.4 میلی گرم در 100 میکرومول) ریخته شد و پس از حرارت دادن در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت حدود 1 دقیقه کاملاً حل شد.سپس، از 5 تا 8 میکرولیتر از مخلوط واکنش به الیگوساکارید خشک شده (100-1 نانومول) اضافه شد تا 10 برابر یا بیشتر مولر اضافی برچسب روی انتهای کاهنده به دست آید.واکنش در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت انجام شد و پس از آن نمونه ها بلافاصله خالص شدند.در آزمایش‌های برچسب‌گذاری بدون احیا از سیانوبروهیدرید سدیم استفاده نشد و نمونه‌ها در دمای 65 درجه سانتی‌گراد به مدت 2.5 ساعت واکنش نشان دادند.
پوشش ELISA و شستشوی نمونه های الیگوساکاریدهای بیوتینیله.25 میکرولیتر از نمونه های بیوتینیله (100 میکرولیتر از هر نمونه غلیظ رقیق شده در 5 میلی لیتر محلول بافر تریس 0.1 مولار (TBS)) به هر چاه صفحه پوشش داده شده با آویدین اضافه شد.چاه های شاهد با 50 میکرولیتر بیوتین با غلظت 10 میکروگرم بر میلی لیتر در 0.1 مولار TBS پوشانده شدند.آب دیونیزه شده به عنوان پوششی برای اندازه گیری های خالی استفاده شد.قرص به مدت 2 ساعت در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد.بشقاب را با استفاده از برنامه شماره 3 بار با 0.1% شیر بدون چربی در 0.1 M TBS بشوئید.11 برای آپارتمان Grenier 3A.
افزودن و شستشوی آنتی بادی های اولیه.40 میکرولیتر آنتی بادی اولیه را به هر چاهک اضافه کنید.میکروپلیت را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق در تاریکی انکوبه کنید.سپس صفحات 3 بار با 0.1% شیر در 0.1M TBS با استفاده از برنامه شستشو #11 برای Grenier Flat 3A شسته شدند.
آنتی بادی ثانویه را اضافه کنید و بشویید.50 میکرولیتر آنتی بادی ثانویه موش/موش (رقیق شده 1:5000 در 0.1 درصد شیر در 0.1 M TBS) به هر چاهک اضافه کنید.میکروپلیت را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق در تاریکی انکوبه کنید.سپس میکروپلیت ها 5 بار با 0.1 درصد شیر در 0.1 M TBS با استفاده از برنامه شستشوی صفحه Grenier Flat 5A شماره 12 شسته شدند.
اضافه کردن یک بستر.50 میکرولیتر 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) را به بستر پایه اضافه کنید (با افزودن 2 قطره بافر، 3 قطره TMB، 2 قطره پراکسید هیدروژن به 15 میلی لیتر آب دیونیزه شده).بستر TMB را آماده کنید.و قبل از استفاده گرداب کنید).میکروپلیت را به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.در تاریکی.
مرحله را کامل کنید و تبلت را بخوانید.50 میکرولیتر اسید سولفوریک 1 نیوتن را به هر چاهک اضافه کنید و با استفاده از ELISA Reader میزان جذب را از 450 تا 655 نانومتر ثبت کنید.
محلول های 1 میلی گرم در میلی لیتر از این آنالیت ها را در آب دیونیزه تهیه کنید: آرابینوز، رامنوز، فوکوز، زایلوز، اسید گالاکتورونیک (GalA)، اسید گلوکورونیک (GlcA)، مانوز، گلوکز، گالاکتوز، لاکتوز، N-استیل مانوزامین (manNActylcosam)(glcNAc)، N-acetylgalactosamine (galNAc)، اینوزیتول (استاندارد داخلی).دو استاندارد با افزودن محلول های قندی 1 میلی گرم در میلی لیتر که در جدول 1 نشان داده شده است، تهیه شد. نمونه ها منجمد شده و در دمای 80- درجه سانتی گراد لیوفیلیز می شوند تا زمانی که تمام آب خارج شود (معمولاً حدود 18-12 ساعت).
100-500 میکروگرم نمونه را به لوله های درپوش پیچی روی یک ترازوی تحلیلی اضافه کنید.مقدار اضافه شده را ثبت کنید.بهتر است نمونه را در غلظت معینی از حلال حل کرده و به صورت مایع به لوله اضافه کنید.از 20 میکرولیتر اینوزیتول 1 میلی گرم بر میلی لیتر به عنوان استاندارد داخلی برای هر لوله نمونه استفاده کنید.مقدار استاندارد داخلی اضافه شده به نمونه باید با مقدار استاندارد داخلی اضافه شده به لوله استاندارد برابر باشد.
8 میلی لیتر متانول بدون آب را به یک ویال درپوش پیچی اضافه کنید.سپس 4 میلی لیتر از محلول هیدروکلراید متانولیک 3 نیتروژن، درپوش گذاشته و تکان دهید.در این فرآیند از آب استفاده نمی شود.
500 میکرولیتر محلول متانول 1 مولار HCl را به نمونه های الیگوساکارید و لوله های استاندارد TMS اضافه کنید.نمونه ها به مدت یک شب (168 ساعت) در دمای 80 درجه سانتی گراد در یک بلوک حرارتی انکوبه شدند.محصول متانولیز را در دمای اتاق با استفاده از منیفولد خشک کن خشک کنید.200 میکرولیتر MeOH اضافه کنید و دوباره خشک کنید.این روند دو بار تکرار می شود.200 میکرولیتر متانول، 100 میکرولیتر پیریدین و 100 میکرولیتر انیدرید استیک به نمونه اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.نمونه ها در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند.و خشک کرد.200 میکرولیتر متانول اضافه کنید و دوباره خشک کنید.
200 میکرولیتر Tri-Sil و لوله درپوش حرارتی را به مدت 20 دقیقه اضافه کنید.80 درجه سانتیگراد، سپس تا دمای اتاق خنک شود.برای خشک کردن بیشتر نمونه تا حجم تقریبی 50 میکرولیتر از منیفولد خشک کن استفاده کنید.لازم به ذکر است که ما اجازه ندادیم نمونه ها به طور کامل خشک شوند.
2 میلی لیتر هگزان اضافه کنید و با گرداب خوب مخلوط کنید.نوک پیپت های پاستور (5-8 میلی متر) را با یک تکه پشم شیشه با قرار دادن پشم شیشه روی یک پیپت با قطر 5-3/4 اینچ پر کنید.نمونه ها در 3000 گرم به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شدند.هر گونه باقیمانده نامحلول رسوب می کند.نمونه را تا 100-150 میکرولیتر خشک کنید.حجم تقریباً 1 میکرولیتر در دمای اولیه 80 درجه سانتیگراد و زمان اولیه 2.0 دقیقه به GC-MS تزریق شد (جدول 2).