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Neue immunologische und massenspektrometrische Methoden zur komplexen Analyse persistenter Oligosaccharide in mit AFEX vorbehandeltem Maisstroh.Lignozellulose-Biomasse ist eine nachhaltige Alternative zu fossilen Brennstoffen und wird häufig zur Entwicklung von Biotechnologien für die Herstellung von Produkten wie Lebensmitteln, Futtermitteln, Kraftstoffen und Chemikalien eingesetzt.Der Schlüssel zu diesen Technologien ist die Entwicklung kostengünstiger Verfahren zur Umwandlung komplexer Kohlenhydrate in pflanzlichen Zellwänden in einfache Zucker wie Glucose, Xylose und Arabinose.Da Lignozellulose-Biomasse sehr hartnäckig ist, muss sie thermochemischen Behandlungen (z. B. Ammoniakfaser-Peeling (AFEX), verdünnte Säuren (DA), ionische Flüssigkeiten (IL)) und biologischen Behandlungen (z. B. enzymatische Hydrolyse und mikrobielle Fermentation) in Kombination unterzogen werden, um das gewünschte Produkt zu erhalten..Wenn jedoch kommerzielle Pilzenzyme im Hydrolyseprozess verwendet werden, sind nur 75–85 % der gebildeten löslichen Zucker Monosaccharide und die restlichen 15–25 % sind lösliche, hartnäckige Oligosaccharide, die für Mikroorganismen nicht immer verfügbar sind.Zuvor haben wir lösliche hartnäckige Oligosaccharide mithilfe einer Kombination aus Kohlenstoff- und Kieselgurtrennung und Größenausschlusschromatographie erfolgreich isoliert und gereinigt und auch ihre enzymhemmenden Eigenschaften untersucht.Wir haben herausgefunden, dass Oligosaccharide, die methylierte Uronsäuresubstitutionen mit höherem Polymerisationsgrad (DP) enthalten, mit kommerziellen Enzymmischungen schwieriger zu verarbeiten sind als Oligosaccharide mit niedrigem DP und neutrale Oligosaccharide.Hier berichten wir über den Einsatz mehrerer zusätzlicher Methoden, darunter Glykanprofilierung mit monoklonalen Antikörpern (mAbs), die spezifisch für Glykane pflanzlicher Biomasse sind, um Glykanbindungen in pflanzlichen Zellwänden und enzymatischen Hydrolysaten zu charakterisieren, Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisation und Flugzeit-Massenspektrometrie..MALDI-TOF-MS) nutzt strukturinformative diagnostische Peaks, die durch Spektroskopie nach Sekundärzerfall negativer Ionen, Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC-MS) erhalten werden, um Oligosaccharidbindungen mit und ohne Derivatisierung zu charakterisieren.Aufgrund der geringen Größe von Oligosacchariden (DP 4–20) sind diese Moleküle schwierig für die Bindung und Charakterisierung von mAb zu verwenden.Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine neue, auf Biotin-Konjugation basierende Oligosaccharid-Immobilisierungsmethode angewendet, die den Großteil der löslichen Oligosaccharide mit niedrigem DP auf der Mikroplattenoberfläche erfolgreich markierte und diese dann in einem mAb-System mit hohem Durchsatz für die spezifische Ligationsanalyse verwendete.Diese neue Methode wird in Zukunft die Entwicklung fortschrittlicherer Hochdurchsatz-Glykom-Assays erleichtern, die zur Isolierung und Charakterisierung von in Biomarkern vorhandenen Oligosacchariden für diagnostische Zwecke verwendet werden können.
Lignozellulose-Biomasse, bestehend aus land- und forstwirtschaftlichen sowie Gras- und Holzmaterialien, ist ein potenzieller Rohstoff für die Herstellung biobasierter Produkte, einschließlich Lebensmittel, Futtermittel, Kraftstoffe und chemischer Vorläufer zur Herstellung hochwertigerer Produkte1.In Pflanzenzellwänden vorhandene Kohlenhydrate (wie Cellulose und Hemicellulose) werden durch chemische Verarbeitung und Biotransformation (wie enzymatische Hydrolyse und mikrobielle Fermentation) zu Monosacchariden depolymerisiert.Zu den üblichen Vorbehandlungen gehören Ammoniakfaserexpansion (AFEX), verdünnte Säure (DA), ionische Flüssigkeit (IL) und Dampfexplosion (SE), bei denen eine Kombination aus Chemikalien und Wärme eingesetzt wird, um die Lignozelluloseproduktion durch Öffnen pflanzlicher Zellwände zu reduzieren3,4.Hartnäckigkeit der Materie, 5. Die enzymatische Hydrolyse wird bei hoher Feststoffbelastung unter Verwendung kommerzieller aktiver kohlenhydrathaltiger Enzyme (CAZymes) und mikrobielle Fermentation unter Verwendung transgener Hefen oder Bakterien zur Herstellung biobasierter Kraftstoffe und Chemikalien durchgeführt 6 .
CAZyme in kommerziellen Enzymen bestehen aus einer komplexen Mischung von Enzymen, die komplexe Kohlenhydrat-Zucker-Bindungen synergistisch spalten, um Monosaccharide zu bilden2,7.Wie wir bereits früher berichteten, macht das komplexe Netzwerk aromatischer Ligninpolymere mit Kohlenhydraten diese äußerst schwer zu verarbeiten, was zu einer unvollständigen Zuckerumwandlung führt und 15–25 % der Sexualoligosaccharide ansammelt, die bei der enzymatischen Hydrolyse der vorbehandelten Biomasse nicht entstehen.Dies ist ein häufiges Problem bei verschiedenen Biomasse-Vorbehandlungsmethoden.Zu den Gründen für diesen Engpass zählen unter anderem die Enzymhemmung während der Hydrolyse oder das Fehlen bzw. die geringe Konzentration essentieller Enzyme, die zum Aufbrechen von Zuckerbindungen in der Pflanzenbiomasse erforderlich sind.Das Verständnis der Zusammensetzung und der strukturellen Eigenschaften von Zuckern, wie z. B. der Zuckerbindungen in Oligosacchariden, wird uns helfen, die Zuckerumwandlung während der Hydrolyse zu verbessern und biotechnologische Prozesse kostenmäßig mit aus Erdöl gewonnenen Produkten konkurrenzfähig zu machen.
Die Bestimmung der Struktur von Kohlenhydraten ist eine Herausforderung und erfordert eine Kombination von Methoden wie Flüssigkeitschromatographie (LC)11,12, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)13, Kapillarelektrophorese (CE)14,15,16 und Massenspektrometrie (MS)17.,achtzehn.MS-Methoden wie die Flugzeitmassenspektrometrie mit Laserdesorption und Ionisierung mittels Matrix (MALDI-TOF-MS) sind eine vielseitige Methode zur Identifizierung von Kohlenhydratstrukturen.Kürzlich wurde die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID)-Tandem-MS von Natriumionenaddukten am häufigsten verwendet, um Fingerabdrücke zu identifizieren, die Oligosaccharid-Anbindungspositionen, anomeren Konfigurationen, Sequenzen und Verzweigungspositionen entsprechen 20, 21.
Die Glykananalyse ist ein hervorragendes Werkzeug zur detaillierten Identifizierung von Kohlenhydratbindungen22.Bei dieser Methode werden monoklonale Antikörper (mAbs), die gegen pflanzliche Zellwandglykane gerichtet sind, als Sonden verwendet, um komplexe Kohlenhydratverknüpfungen zu verstehen.Weltweit sind mehr als 250 mAbs erhältlich, die gegen verschiedene lineare und verzweigte Oligosaccharide unter Verwendung verschiedener Saccharide entwickelt wurden24.Mehrere mAbs wurden häufig zur Charakterisierung der Struktur, Zusammensetzung und Modifikationen der Pflanzenzellwand verwendet, da es je nach Pflanzenzelltyp, Organ, Alter, Entwicklungsstadium und Wachstumsumgebung erhebliche Unterschiede gibt25,26.In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um Vesikelpopulationen in pflanzlichen und tierischen Systemen und ihre jeweiligen Rollen beim Glykantransport zu verstehen, die durch subzelluläre Marker, Entwicklungsstadien oder Umweltreize bestimmt werden, und um die enzymatische Aktivität zu bestimmen.Zu den unterschiedlichen Strukturen von Glykanen und Xylanen, die identifiziert wurden, gehören Pektin (P), Xylan (X), Mannan (M), Xyloglucane (XylG), gemischt gebundene Glucane (MLG), Arabinoxylan (ArbX), Galactomannan (GalG), Glucuronsäure-Arabinoxylan (GArbX) und Arabino-Galactan (ArbG)29.
Trotz all dieser Forschungsbemühungen haben sich jedoch nur wenige Studien auf die Art der Oligosaccharidakkumulation während der Hydrolyse mit hoher Feststoffbelastung (High Solids Load, HSL) konzentriert, einschließlich der Oligosaccharidfreisetzung, Änderungen der oligomeren Kettenlänge während der Hydrolyse, verschiedener Polymere mit niedrigem DP und deren Kurven.Ausschüttungen 30,31,32.Obwohl sich die Glykananalyse als nützliches Werkzeug für eine umfassende Analyse der Glykanstruktur erwiesen hat, ist es mittlerweile schwierig, wasserlösliche Oligosaccharide mit niedrigem DP mithilfe von Antikörpermethoden zu bewerten.Kleinere DP-Oligosaccharide mit einem Molekulargewicht von weniger als 5–10 kDa binden nicht an ELISA-Platten 33, 34 und werden vor der Antikörperzugabe abgewaschen.
Hier demonstrieren wir zum ersten Mal einen ELISA-Assay auf Avidin-beschichteten Platten unter Verwendung monoklonaler Antikörper, der ein einstufiges Biotinylierungsverfahren für lösliche refraktäre Oligosaccharide mit einer Glykomanalyse kombiniert.Unser Ansatz zur Glykomanalyse wurde durch MALDI-TOF-MS- und GC-MS-basierte Analyse komplementärer Oligosaccharidbindungen mithilfe der Trimethylsilyl (TMS)-Derivatisierung hydrolysierter Zuckerzusammensetzungen validiert.Dieser innovative Ansatz kann in Zukunft als Hochdurchsatzmethode weiterentwickelt werden und breitere Anwendung in der biomedizinischen Forschung finden35.
Posttranslationale Modifikationen von Enzymen und Antikörpern, wie etwa die Glykosylierung,36 beeinflussen deren biologische Aktivität.Beispielsweise spielen Veränderungen in der Glykosylierung von Serumproteinen eine wichtige Rolle bei entzündlicher Arthritis und Veränderungen in der Glykosylierung werden als diagnostische Marker verwendet37.In der Literatur wurde berichtet, dass verschiedene Glykane leicht bei einer Vielzahl von Krankheiten auftreten, darunter chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts und der Leber, Virusinfektionen, Eierstock-, Brust- und Prostatakrebs38,39,40.Das Verständnis der Struktur von Glykanen mithilfe antikörperbasierter Glykan-ELISA-Methoden wird zusätzliche Sicherheit bei der Krankheitsdiagnose ohne den Einsatz komplexer MS-Methoden bieten.
Unsere vorherige Studie zeigte, dass hartnäckige Oligosaccharide nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse unhydrolysiert blieben (Abbildung 1).In unserer zuvor veröffentlichten Arbeit haben wir eine Aktivkohle-Festphasenextraktionsmethode entwickelt, um Oligosaccharide aus AFEX-vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH)8 zu isolieren.Nach der anfänglichen Extraktion und Trennung wurden die Oligosaccharide durch Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter fraktioniert und in der Reihenfolge ihres Molekulargewichts gesammelt.Zuckermonomere und -oligomere, die aus verschiedenen Vorbehandlungen freigesetzt wurden, wurden durch Analyse der Zuckerzusammensetzung analysiert.Beim Vergleich des Gehalts an Zuckeroligomeren, die durch verschiedene Vorbehandlungsmethoden erhalten werden, ist das Vorhandensein hartnäckiger Oligosaccharide ein häufiges Problem bei der Umwandlung von Biomasse in Monosaccharide und kann zu einer Verringerung der Zuckerausbeute um mindestens 10–15 % und sogar bis zu 18 % führen.UNS.Dieses Verfahren wird zur weiteren großtechnischen Produktion von Oligosaccharidfraktionen verwendet.Das resultierende ACH und seine nachfolgenden Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden in dieser Arbeit als experimentelles Material für die Charakterisierung von Oligosacchariden verwendet.
Nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse blieben persistente Oligosaccharide unhydrolysiert.Hier ist (A) eine Oligosaccharid-Trennmethode, bei der Oligosaccharide aus AFEX-vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH) unter Verwendung eines gepackten Betts aus Aktivkohle und Kieselgur isoliert werden;(B) Methode zur Trennung von Oligosacchariden.Die Oligosaccharide wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter getrennt;(C) Saccharidmonomere und -oligomere, die aus verschiedenen Vorbehandlungen freigesetzt wurden (verdünnte Säure: DA, ionische Flüssigkeit: IL und AFEX).Enzymatische Hydrolysebedingungen: hohe Feststoffbeladung von 25 % (w/w) (ca. 8 % Glucanbeladung), 96 Stunden Hydrolyse, 20 mg/g kommerzielle Enzymbeladung (Verhältnis Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) und (D) Zuckermonomere und -oligomere von Glucose, Xylose und Arabinose, freigesetzt aus AFEX-vorbehandeltem Maisstroh (ACS).
Die Glykananalyse hat sich als nützliches Werkzeug für eine umfassende Strukturanalyse von Glykanen in Extrakten erwiesen, die aus festen Biomasserückständen isoliert wurden.Allerdings sind wasserlösliche Saccharide bei dieser herkömmlichen Methode41 unterrepräsentiert, da Oligosaccharide mit niedrigem Molekulargewicht auf ELISA-Platten nur schwer zu immobilisieren sind und vor der Antikörperzugabe ausgewaschen werden.Daher wurde zur Antikörperbindung und -charakterisierung eine einstufige Biotinylierungsmethode verwendet, um lösliche, nicht konforme Oligosaccharide auf mit Avidin beschichtete ELISA-Platten zu beschichten.Diese Methode wurde mit unserem zuvor hergestellten ACSH und einer Fraktion basierend auf seinem Molekulargewicht (oder Polymerisationsgrad, DP) getestet.Eine einstufige Biotinylierung wurde verwendet, um die Oligosaccharid-Bindungsaffinität durch Zugabe von Biotin-LC-Hydrazid an das reduzierende Ende des Kohlenhydrats zu erhöhen (Abb. 2).In Lösung reagiert die Halbacetalgruppe am reduzierenden Ende mit der Hydrazidgruppe von Biotin-LC-Hydrazid unter Bildung einer Hydrazonbindung.In Gegenwart des Reduktionsmittels NaCNBH3 wird die Hydrazonbindung zu einem stabilen biotinylierten Endprodukt reduziert.Durch die Modifikation des zuckerreduzierenden Endes wurde die Bindung von Oligosacchariden mit niedrigem DP an ELISA-Platten möglich, und in unserer Studie wurde dies auf Avidin-beschichteten Platten unter Verwendung von auf Glykan gerichteten mAbs durchgeführt.
Screening monoklonaler Antikörper basierend auf ELISA für biotinylierte Oligosaccharide.Hier (A) kombinierte Biotinylierung von Oligosacchariden und anschließendes ELISA-Screening mit Glykan-gerichteten mAbs auf NeutrAvidin-beschichteten Platten und (B) zeigt ein einstufiges Verfahren zur Biotinylierung von Reaktionsprodukten.
Avidinbeschichtete Platten mit Oligosaccharid-konjugierten Antikörpern wurden dann zu den primären und sekundären Antikörpern hinzugefügt und in einem licht- und zeitempfindlichen Medium gewaschen.Nachdem die Antikörperbindung abgeschlossen ist, fügen Sie TMB-Substrat hinzu, um die Platte zu inkubieren.Die Reaktion wurde schließlich mit Schwefelsäure gestoppt.Die inkubierten Platten wurden mit einem ELISA-Lesegerät analysiert, um die Bindungsstärke jedes Antikörpers zu bestimmen und eine antikörperspezifische Vernetzung nachzuweisen.Einzelheiten und Parameter des Experiments finden Sie im entsprechenden Abschnitt „Materialien und Methoden“.
Wir demonstrieren den Nutzen dieser neu entwickelten Methode für spezifische Anwendungen, indem wir die löslichen Oligosaccharide charakterisieren, die in ACSH sowie in rohen und gereinigten Oligosaccharidfraktionen vorhanden sind, die aus Lignocellulosehydrolysaten isoliert wurden.Wie in Abbildung 3 dargestellt, sind die häufigsten epitopsubstituierten Xylane, die in ACSH mit bioacylierten Glykom-Assay-Methoden identifiziert wurden, normalerweise Uronsäure (U) oder Methyluronsäure (MeU) und pektische Arabinogalactane.Die meisten davon wurden auch in unserer vorherigen Studie zur Analyse von Glykanen nicht hydrolysierter Feststoffe (UHS) gefunden43.
Nachweis widerspenstiger Oligosaccharidepitope mithilfe eines monoklonalen Antikörpers, der gegen das Zellwandglycan gerichtet ist.Die „neutrale“ Fraktion ist die ACN-Fraktion und die „saure“ Fraktion ist die FA-Fraktion.Hellere Rottöne auf der Heatmap weisen auf einen höheren Epitopgehalt hin, und hellere Blautöne weisen auf einen leeren Hintergrund hin.Die Farbwerte auf der Skala basieren auf rohen OD-Werten für Formulierungen N=2.Die wichtigsten von den Antikörpern erkannten Epitope sind rechts dargestellt.
Diese Nicht-Zellulose-Strukturen konnten von den häufigsten Cellulasen und Hemicellulasen in der getesteten kommerziellen Enzymmischung, die die am häufigsten verwendeten kommerziellen Enzyme umfasst, nicht gespalten werden.Für ihre Hydrolyse sind daher neue Hilfsenzyme erforderlich.Ohne die notwendigen, nicht aus Zellulose bestehenden akzessorischen Enzyme verhindern diese Nicht-Zellulose-Bindungen eine vollständige Umwandlung in Monosaccharide, selbst wenn ihre Ausgangszuckerpolymere weitgehend in kürzere Fragmente hydrolysiert und mit kommerziellen Enzymmischungen aufgelöst werden.
Weitere Untersuchungen der Signalverteilung und ihrer Bindungsstärke zeigten, dass die Bindungsepitope in Zuckerfraktionen mit hohem DP (A, B, C, DP bis zu 20+) geringer waren als in Fraktionen mit niedrigem DP (D, E, F, DP) in Dimeren (Abb. 1).Säurefragmente kommen in Nicht-Cellulose-Epitopen häufiger vor als neutrale Fragmente.Diese Phänomene stimmen mit dem in unserer vorherigen Studie beobachteten Muster überein, bei dem hohe DP- und Säureeinheiten resistenter gegen enzymatische Hydrolyse waren.Daher kann das Vorhandensein von Nicht-Celluloseglycan-Epitopen sowie U- und MeU-Substitutionen erheblich zur Stabilität der Oligosaccharide beitragen.Es ist zu beachten, dass die Bindungs- und Nachweiseffizienz für Oligosaccharide mit niedrigem DP problematisch sein kann, insbesondere wenn das Epitop ein dimeres oder trimeres Oligosaccharid ist.Dies kann mit kommerziellen Oligosacchariden unterschiedlicher Länge getestet werden, die jeweils nur ein Epitop enthalten, das an einen bestimmten mAb bindet.
So konnte der Einsatz strukturspezifischer Antikörper bestimmte Arten widerspenstiger Bindungen aufdecken.Abhängig von der Art des verwendeten Antikörpers, dem geeigneten Ligationsmuster und der Stärke des von ihm erzeugten Signals (am häufigsten und am seltensten), können neue Enzyme identifiziert und halbquantitativ zur Enzymmischung hinzugefügt werden, um eine vollständigere Glykokonversion zu erreichen.Am Beispiel der Analyse von ACSH-Oligosacchariden können wir eine Datenbank mit Glykanbindungen für jedes Biomassematerial erstellen.Hierbei ist zu beachten, dass die unterschiedliche Affinität von Antikörpern zu berücksichtigen ist und wenn deren Affinität unbekannt ist, führt dies zu gewissen Schwierigkeiten beim Vergleich der Signale verschiedener Antikörper.Darüber hinaus funktioniert der Vergleich der Glykanbindungen möglicherweise am besten zwischen Proben für denselben Antikörper.Diese hartnäckigen Bindungen können dann mit der CAZyme-Datenbank verknüpft werden, aus der wir Enzyme identifizieren, Kandidatenenzyme auswählen und auf bindungsbrechende Enzyme testen oder mikrobielle Systeme entwickeln können, um diese Enzyme für den Einsatz in Bioraffinerien zu exprimieren44.
Um zu bewerten, wie immunologische Methoden alternative Methoden zur Charakterisierung von Oligosacchariden mit niedrigem Molekulargewicht in Lignocellulosehydrolysaten ergänzen, führten wir MALDI (Abb. 4, S1-S8) und eine Analyse von TMS-abgeleiteten Sacchariden basierend auf GC-MS am gleichen Oligosaccharidteil des Panels (Abb. 5) durch.MALDI wird verwendet, um zu vergleichen, ob die Massenverteilung von Oligosaccharidmolekülen mit der beabsichtigten Struktur übereinstimmt.Auf Abb.4 zeigt die MC der neutralen Komponenten ACN-A und ACN-B.Die ACN-A-Analyse bestätigte eine Reihe von Pentosezuckern im Bereich von DP 4–8 (Abb. 4) bis DP 22 (Abb. S1), deren Gewichte MeU-Xylan-Oligosacchariden entsprechen.Die ACN-B-Analyse bestätigte die Pentose- und Glucoxylan-Reihe mit DP 8–15.In ergänzendem Material wie Abbildung S3 zeigen FA-C-Säureeinheiten-Massenverteilungskarten eine Reihe von (Me)U-substituierten Pentosezuckern mit einem DP von 8–15, die mit den substituierten Xylanen übereinstimmen, die im ELISA-basierten mAb-Screening gefunden wurden.Die Epitope sind konsistent.
MALDI-MS-Spektrum löslicher, nicht konformer Oligosaccharide, die in ACS vorhanden sind.Hier (A) ACN-A-Fraktionen im niedrigen Gewichtsbereich, die mit methylierter Uronsäure (DP 4–8) substituierte Glucuroxylan-Oligosaccharide enthalten, und (B) ACN-B-Xylan und methylierte Uronsäure-Oligosaccharide, die mit Glucuroxylan (DP 8–15) substituiert sind.
Analyse der Zusammensetzung des Glykanrests feuerfester Oligosaccharide.Hier (A) TMS-Saccharidzusammensetzung verschiedener Oligosaccharidfraktionen, erhalten mittels GC-MS-Analyse.(B) Strukturen verschiedener TMS-abgeleiteter Zucker, die in Oligosacchariden vorhanden sind.ACN – Acetonitril-Fraktion mit neutralen Oligosacchariden und FA – Ferulasäure-Fraktion mit sauren Oligosacchariden.
Eine weitere interessante Schlussfolgerung wurde aus der LC-MS-Analyse der Oligosaccharidfraktion gezogen, wie in Abbildung S9 dargestellt (Methoden sind im elektronischen Zusatzmaterial zu sehen).Während der Ligation der ACN-B-Fraktion wurden wiederholt Fragmente von Hexose- und -OAc-Gruppen beobachtet.Dieser Befund bestätigt nicht nur die in der Glykom- und MALDI-TOF-Analyse beobachtete Fragmentierung, sondern liefert auch neue Informationen über mögliche Kohlenhydratderivate in vorbehandelter Lignozellulose-Biomasse.
Wir haben auch die Zuckerzusammensetzung der Oligosaccharidfraktion mithilfe der TMS-Zuckerderivatisierung analysiert.Mittels GC-MS haben wir die Zusammensetzung neuraler (nicht abgeleiteter) und saurer Zucker (GluA und GalA) in der Oligosaccharidfraktion bestimmt (Abb. 5).Glucuronsäure kommt in den sauren Komponenten C und D vor, während Galacturonsäure in den sauren Komponenten A und B vorkommt, die beide Komponenten saurer Zucker mit hohem DP sind.Diese Ergebnisse bestätigen nicht nur unsere ELISA- und MALDI-Daten, sondern stimmen auch mit unseren früheren Studien zur Oligosaccharidakkumulation überein.Daher glauben wir, dass moderne immunologische Methoden, die die Biotinylierung von Oligosacchariden und das anschließende ELISA-Screening nutzen, ausreichen, um lösliche widerspenstige Oligosaccharide in verschiedenen biologischen Proben nachzuweisen.
Da ELISA-basierte mAb-Screening-Methoden durch verschiedene Methoden validiert wurden, wollten wir das Potenzial dieser neuen quantitativen Methode weiter untersuchen.Zwei kommerzielle Oligosaccharide, Xylohexasaccharid-Oligosaccharid (XHE) und 23-α-L-Arabinofuranosyl-Xylotriose (A2XX), wurden gekauft und mit einem neuen mAb-Ansatz getestet, der auf das Zellwandglycan abzielt.Abbildung 6 zeigt eine lineare Korrelation zwischen dem biotinylierten Bindungssignal und der logarithmischen Konzentration der Oligosaccharidkonzentration, was auf ein mögliches Langmuir-Adsorptionsmodell schließen lässt.Unter den mAbs korrelierten CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 und CCRC-M151 mit XHE und CCRC-M108, CCRC-M109 und LM11 mit A2XX über einen Bereich von 1 nm bis 100 Nanometer.Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Antikörpern während des Experiments wurden mit jeder Oligosaccharidkonzentration begrenzte Experimente durchgeführt.Hierbei ist zu beachten, dass einige Antikörper sehr unterschiedlich auf dasselbe Oligosaccharid als Substrat reagieren, vermutlich weil sie an leicht unterschiedliche Epitope binden und sehr unterschiedliche Bindungsaffinitäten aufweisen können.Die Mechanismen und Auswirkungen einer genauen Epitopidentifizierung werden viel komplexer sein, wenn der neue mAb-Ansatz auf reale Proben angewendet wird.
Zwei kommerzielle Oligosaccharide wurden verwendet, um den Nachweisbereich verschiedener auf Glykane abzielender mAbs zu bestimmen.Hier zeigen lineare Korrelationen mit der logarithmischen Konzentration der Oligosaccharidkonzentration Langmuir-Adsorptionsmuster für (A) XHE mit mAb und (B) A2XX mit mAb.Die entsprechenden Epitope geben die Strukturen der kommerziellen Oligosaccharide an, die im Assay als Substrate verwendet werden.
Die Verwendung von auf Glykane gerichteten monoklonalen Antikörpern (glykokomische Analyse oder ELISA-basiertes mAb-Screening) ist ein leistungsstarkes Instrument zur detaillierten Charakterisierung der meisten wichtigen Zellwandglykane, aus denen sich Pflanzenbiomasse zusammensetzt.Allerdings charakterisiert die klassische Glykananalyse nur größere Zellwandglykane, da die meisten Oligosaccharide nicht effizient auf ELISA-Platten immobilisiert werden.In dieser Studie wurde mit AFEX vorbehandelter Maisstroh enzymatisch bei einem hohen Feststoffgehalt hydrolysiert.Mithilfe der Zuckeranalyse wurde die Zusammensetzung widerspenstiger Zellwandkohlenhydrate im Hydrolysat bestimmt.Allerdings wird die mAb-Analyse kleinerer Oligosaccharide in Hydrolysaten unterschätzt und es sind zusätzliche Werkzeuge erforderlich, um Oligosaccharide effektiv auf ELISA-Platten zu immobilisieren.
Wir berichten hier über eine neuartige und effiziente Oligosaccharid-Immobilisierungsmethode für das mAb-Screening durch die Kombination von Oligosaccharid-Biotinylierung und anschließendem ELISA-Screening auf NeutrAvidin™-beschichteten Platten.Die immobilisierten biotinylierten Oligosaccharide zeigten eine ausreichende Affinität zum Antikörper, um einen schnellen und effizienten Nachweis widerspenstiger Oligosaccharide zu ermöglichen.Die Analyse der Zusammensetzung dieser hartnäckigen Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie bestätigte die Ergebnisse dieses neuen Ansatzes zum Immunscreening.Somit zeigen diese Studien, dass die Kombination aus Oligosaccharid-Biotinylierung und ELISA-Screening mit auf Glykane gerichteten monoklonalen Antikörpern zum Nachweis von Vernetzungen in Oligosacchariden verwendet werden kann und in großem Umfang in anderen biochemischen Studien zur Charakterisierung der Struktur von Oligosacchariden eingesetzt werden kann.
Diese auf Biotin basierende Glykan-Profilierungsmethode ist der erste Bericht, der in der Lage ist, die widerspenstigen Kohlenhydratbindungen löslicher Oligosaccharide in pflanzlicher Biomasse zu untersuchen.Dies hilft zu verstehen, warum manche Teile der Biomasse bei der Biokraftstoffproduktion so hartnäckig sind.Diese Methode schließt eine wichtige Lücke in den Glykomanalysemethoden und erweitert ihre Anwendung auf ein breiteres Spektrum von Substraten über pflanzliche Oligosaccharide hinaus.In Zukunft werden wir möglicherweise Robotik für die Biotinylierung einsetzen und die von uns entwickelte Methode zur Hochdurchsatzanalyse von Proben mittels ELISA verwenden.
Maisstroh (CS), das aus Pioneer 33A14-Hybridsamen gewachsen ist, wurde 2010 von Kramer Farms in Ray, Colorado, geerntet.Mit Genehmigung des Grundstückseigentümers kann diese Biomasse für Forschungszwecke genutzt werden. Die Proben wurden trocken < 6 % Feuchtigkeit in Zip-Lock-Beuteln bei Raumtemperatur gelagert. Die Proben wurden trocken < 6 % Feuchtigkeit in Zip-Lock-Beuteln bei Raumtemperatur gelagert. Die Lieferung erfolgt mit weniger als 6 % Versandgewicht in der Packung bei normaler Temperatur. Die Proben wurden trocken bei <6 % Luftfeuchtigkeit in Beuteln mit Reißverschluss bei Raumtemperatur gelagert.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Die Lieferung erfolgt in Paketen mit einer Temperatur von < 6 %. Die Proben werden in Reißverschlussbeuteln bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von < 6 % gelagert.Die Studie entsprach lokalen und nationalen Richtlinien.Die Zusammensetzungsanalyse wurde unter Verwendung des NREL-Protokolls durchgeführt.Es wurde festgestellt, dass die Zusammensetzung 31,4 % Glucan, 18,7 % Xylan, 3,3 % Arabinan, 1,2 % Galactan, 2,2 % Acetyl, 14,3 % Lignin, 1,7 % Protein und 13,4 % Asche enthielt.
Cellic® CTec2 (138 mg Protein/ml, Charge VCNI 0001) ist eine komplexe Mischung aus Cellulase, β-Glucosidase und Cellic® HTec2 (157 mg Protein/ml, Charge VHN00001) von Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg Protein/ml), eine komplexe Mischung aus Pektin abbauenden Enzymen, wurde von DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) gespendet.Die Enzymproteinkonzentrationen wurden durch Schätzung des Proteingehalts (und Abzug des Beitrags von Nicht-Protein-Stickstoff) mithilfe der Kjeldahl-Stickstoffanalyse (AOAC-Methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) bestimmt.Kieselgur 545 wurde von EMD Millipore (Billerica, MA) bezogen.Aktivkohle (DARCO, 100-Mesh-Granulat), Avicel (PH-101), Buchen-Xylan und alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen.
Die AFEX-Vorbehandlung wurde am GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) durchgeführt.Die Vorbehandlung erfolgte 15 Minuten lang bei 140°C.46 Verweilzeit bei einem Verhältnis von wasserfreiem Ammoniak zu Biomasse von 1:1 bei 60 % (Gew./Gew.) Beladung in einem Tischreaktor aus rostfreiem Stahl (Parr Instruments Company).Es dauerte 30 Minuten.Der Reaktor wurde auf 140 °C gebracht und das Ammoniak wurde schnell freigesetzt, sodass die Biomasse schnell auf Raumtemperatur zurückkehren konnte.Die Zusammensetzung des mit AFEX vorbehandelten Maisstrohs (ACS) ähnelte der von unbehandeltem Maisstroh (UT-CS).
Als Ausgangsmaterial für die Produktion von Oligosacchariden im großen Maßstab wurde ACSH mit einem hohen Feststoffgehalt von 25 % (Gew./Gew.) (ca. 8 % Dextranbeladung) hergestellt.Die enzymatische Hydrolyse von ACS wurde unter Verwendung einer kommerziellen Enzymmischung durchgeführt, einschließlich Cellic® Ctec2 10 mg Protein/g Glucan (in vorbehandelter Biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg Protein/g Glucan und Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg Protein/g Dextran.Die enzymatische Hydrolyse wurde in einem 5-Liter-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 3 Litern, pH 4,8, 50 °C und 250 U/min durchgeführt.Nach einer 96-stündigen Hydrolyse wurde das Hydrolysat durch 30-minütige Zentrifugation bei 6000 U/min und anschließend 30 Minuten bei 14000 U/min gesammelt, um nicht hydrolysierte Feststoffe zu entfernen.Anschließend wurde das Hydrolysat einer Sterilfiltration durch einen 0,22 mm Filterbecher unterzogen.Das filtrierte Hydrolysat wurde in sterilen Flaschen bei 4°C gelagert und anschließend an Kohle fraktioniert.
Analyse der Zusammensetzung von extraktbasierten Biomasseproben gemäß NREL-Laboranalyseverfahren: Vorbereitung von Proben für die Zusammensetzungsanalyse (NREL/TP-510-42620) und Bestimmung von strukturellen Kohlenhydraten und Lignin in Biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Die Oligosaccharidanalyse des Hydrolysatstroms wurde im 2-ml-Maßstab unter Verwendung einer autoklavenbasierten Säurehydrolysemethode durchgeführt.Mischen Sie die Hydrolysatprobe mit 69,7 µl 72 %iger Schwefelsäure in einem 10-ml-Kulturröhrchen mit Schraubverschluss und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang auf einem Tisch bei 121 °C, kühlen Sie sie auf Eis ab und filtern Sie sie in ein Fläschchen mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).Die Konzentration der Oligosaccharide wurde bestimmt, indem die Konzentration der Monosaccharide in der nicht hydrolysierten Probe von der Gesamtzuckerkonzentration in der säurehydrolysierten Probe abgezogen wurde.
Die Glucose-, Xylose- und Arabinosekonzentrationen in der säurehydrolysierten Biomasse wurden mit einem Shimadzu HPLC-System analysiert, das mit einem Autosampler, einer Säulenheizung, einer isokratischen Pumpe und einem Brechungsindexdetektor auf einer Bio-Rad Aminex HPX-87H-Säule ausgestattet war.Die Säule wurde bei 50 °C gehalten und mit 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 in Wasser eluiert.Fluss.
Der Hydrolysatüberstand wurde verdünnt und auf seinen Monomer- und Oligosaccharidgehalt analysiert.Nach der enzymatischen Hydrolyse erhaltene Monomerzucker wurden mittels HPLC analysiert, ausgestattet mit einer Aminex HPX-87P-Säule von Bio-Rad (Hercules, CA) und einer Ascheschutzsäule.Die Säulentemperatur wurde bei 80 °C gehalten, Wasser wurde als mobile Phase mit einer Flussrate von 0,6 ml/min verwendet.Oligosaccharide wurden durch Hydrolyse in verdünnter Säure bei 121 °C gemäß den in Lit. beschriebenen Methoden bestimmt.41, 48, 49.
Die Saccharidanalyse wurde an rohen, mit AFEX vorbehandelten und allen nicht hydrolysierten Biomasserückständen (einschließlich der Produktion serieller Zellwandextrakte und deren mAb-Screening) unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren 27, 43, 50, 51 durchgeführt.Für die Glykomanalyse werden alkoholunlösliche Rückstände pflanzlichen Zellwandmaterials aus Biomasserückständen hergestellt und einer seriellen Extraktion mit immer aggressiveren Reagenzien wie Ammoniumoxalat (50 mM), Natriumcarbonat (50 mM und 0,5 % w/v), CON unterzogen.(1M und 4M, beide mit 1 % w/v Natriumborhydrid) und Säurechlorit wie zuvor beschrieben52,53.Die Extrakte wurden dann einem ELISA gegen eine komplexe Gruppe von gegen das Zellwandglycan gerichteten mAb50s unterzogen, und die mAb-Bindungsreaktionen wurden als Wärmekarte dargestellt.mAbs, die auf Pflanzenzellwandglykane abzielen, wurden aus Laborbeständen (CCRC-, JIM- und MAC-Serien) gekauft.
Einstufige Biotinylierung von Oligosacchariden.Die Konjugation von Kohlenhydraten mit Biotin-LC-Hydrazid wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt.Biotin-LC-Hydrazid (4,6 mg/12 μmol) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, 70 μl) durch kräftiges Rühren und 1-minütiges Erhitzen auf 65 °C gelöst.Eisessig (30 µl) wurde zugegeben und die Mischung auf Natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) gegossen und nach etwa 1-minütigem Erhitzen auf 65 °C vollständig aufgelöst.Dann wurden 5 bis 8 μl der Reaktionsmischung zu dem getrockneten Oligosaccharid (1–100 nmol) gegeben, um einen 10-fachen oder mehr molaren Überschuss der Markierung über dem reduzierenden Ende zu erhalten.Die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 65 °C durchgeführt, danach wurden die Proben sofort gereinigt.Bei den Markierungsexperimenten ohne Reduktion wurde kein Natriumcyanoborhydrid verwendet und die Proben wurden 2,5 Stunden lang bei 65°C umgesetzt.
ELISA-Beschichtung und Waschen von Proben biotinylierter Oligosaccharide.25 μl biotinylierte Proben (100 μl jeder konzentrierten Probe verdünnt in 5 ml 0,1 M Tris-Pufferlösung (TBS)) wurden in jede Vertiefung der mit Avidin beschichteten Platte gegeben.Kontrollvertiefungen wurden mit 50 μl Biotin in einer Konzentration von 10 μg/ml in 0,1 M TBS beschichtet.Als Beschichtung für Blindmessungen wurde entionisiertes Wasser verwendet.Die Tablette wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.Waschen Sie den Teller dreimal mit 0,1 % Magermilch in 0,1 M TBS mit Programm Nr.11 für Grenier Wohnung 3A.
Zugabe und Waschen von Primärantikörpern.40 µl Primärantikörper in jede Vertiefung geben.Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Anschließend wurden die Platten dreimal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS unter Verwendung des Waschprogramms Nr. 11 für Grenier Flat 3A gewaschen.
Sekundärantikörper hinzufügen und waschen.Fügen Sie jeder Vertiefung 50 µl sekundären Maus-/Rattenantikörper (1:5000 verdünnt in 0,1 % Milch in 0,1 M TBS) hinzu.Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Anschließend wurden die Mikroplatten fünfmal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS unter Verwendung des Grenier Flat 5A-Plattenwaschprogramms Nr. 12 gewaschen.
Hinzufügen eines Substrats.50 µl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) zum Grundsubstrat hinzufügen (durch Zugabe von 2 Tropfen Puffer, 3 Tropfen TMB, 2 Tropfen Wasserstoffperoxid zu 15 ml entionisiertem Wasser).Bereiten Sie das TMB-Substrat vor.vor Gebrauch mischen und vortexen).Inkubieren Sie die Mikroplatte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.Im Dunkeln.
Schließen Sie den Schritt ab und lesen Sie die Tafel.Geben Sie 50 µl 1 N Schwefelsäure in jede Vertiefung und zeichnen Sie die Absorption von 450 bis 655 nm mit einem ELISA-Lesegerät auf.
Bereiten Sie 1 mg/ml-Lösungen dieser Analyten in entionisiertem Wasser vor: Arabinose, Rhamnose, Fucose, Xylose, Galacturonsäure (GalA), Glucuronsäure (GlcA), Mannose, Glucose, Galactose, Lactose, N-Acetylmannosamin (manNAc), N-Acetylglucosamin.(glcNAc), N-Acetylgalactosamin (galNAc), Inositol (interner Standard).Zwei Standards wurden durch Zugabe der in Tabelle 1 gezeigten 1-mg/ml-Zuckerlösungen hergestellt. Die Proben werden eingefroren und bei -80 °C lyophilisiert, bis das gesamte Wasser entfernt ist (normalerweise etwa 12–18 Stunden).
Geben Sie 100–500 µg Probe in Röhrchen mit Schraubverschluss auf einer Analysenwaage.Notieren Sie die hinzugefügte Menge.Am besten lösen Sie die Probe in einer bestimmten Lösungsmittelkonzentration auf und geben sie als flüssiges Aliquot in das Röhrchen.Verwenden Sie für jedes Probenröhrchen 20 µl 1 mg/ml Inositol als internen Standard.Die Menge an internem Standard, die der Probe hinzugefügt wird, muss mit der Menge an internem Standard übereinstimmen, die dem Standardröhrchen hinzugefügt wird.
8 ml wasserfreies Methanol in ein Fläschchen mit Schraubverschluss geben.Anschließend werden 4 ml 3 N methanolische HCl-Lösung zugegeben, verschlossen und geschüttelt.Bei diesem Verfahren wird kein Wasser verwendet.
Den Oligosaccharidproben und Standard-TMS-Röhrchen 500 µl 1 M HCl-Methanollösung hinzufügen.Die Proben wurden über Nacht (168 Stunden) bei 80 °C in einem Thermoblock inkubiert.Trocknen Sie das Methanolyseprodukt bei Raumtemperatur mit einem Trocknungsverteiler.200 µl MeOH hinzufügen und erneut trocknen.Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt.200 µl Methanol, 100 µl Pyridin und 100 µl Essigsäureanhydrid zur Probe hinzufügen und gut mischen.Die Proben wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.und getrocknet.200 µl Methanol hinzufügen und erneut trocknen.
200 µl Tri-Sil hinzufügen und das verschlossene Röhrchen 20 Minuten lang erhitzen.80°C, dann auf Raumtemperatur abgekühlt.Verwenden Sie einen Trocknungsverteiler, um die Probe weiter auf ein Volumen von etwa 50 µl zu trocknen.Es ist wichtig zu beachten, dass wir die Proben nicht vollständig trocknen ließen.
2 ml Hexan hinzufügen und durch Vortexen gut vermischen.Füllen Sie die Spitzen von Pasteurpipetten (5–8 mm) mit einem Stück Glaswolle, indem Sie die Glaswolle auf eine Pipette mit 5–3/4 Zoll Durchmesser stecken.Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert.Eventuell unlösliche Rückstände fallen aus.Trocknen Sie die Probe auf 100-150 µl.Bei einer Anfangstemperatur von 80 °C und einer Anfangszeit von 2,0 Minuten wurde ein Volumen von etwa 1 μl in das GC-MS injiziert (Tabelle 2).