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Neue immunologische und massenspektrometrische Methoden zur komplexen Analyse persistenter Oligosaccharide in mit AFEX vorbehandeltem Maisstroh. Lignocellulose-Biomasse ist eine nachhaltige Alternative zu fossilen Brennstoffen und wird häufig zur Entwicklung biotechnologischer Verfahren für die Herstellung von Produkten wie Lebensmitteln, Futtermitteln, Kraftstoffen und Chemikalien eingesetzt. Der Schlüssel zu diesen Technologien liegt in der Entwicklung kostengünstiger Verfahren zur Umwandlung komplexer Kohlenhydrate aus pflanzlichen Zellwänden in Einfachzucker wie Glucose, Xylose und Arabinose. Da Lignocellulose-Biomasse sehr widerstandsfähig ist, muss sie zur Gewinnung des gewünschten Produkts einer Kombination aus thermochemischen (z. B. Ammoniak-Faser-Exfoliation (AFEX), verdünnten Säuren (DA), ionischen Flüssigkeiten (IL)) und biologischen Verfahren (z. B. enzymatischer Hydrolyse und mikrobieller Fermentation) unterzogen werden. Bei der Hydrolyse mit kommerziellen Pilzenzymen entstehen jedoch nur 75–85 % der löslichen Zucker als Monosaccharide, während die restlichen 15–25 % lösliche, schwer spaltbare Oligosaccharide sind, die für Mikroorganismen nicht immer verfügbar sind. Wir haben bereits erfolgreich lösliche, schwer spaltbare Oligosaccharide mittels einer Kombination aus Kohlenstoff- und Kieselgur-Trennung sowie Größenausschlusschromatographie isoliert und gereinigt und deren enzymhemmende Eigenschaften untersucht. Dabei zeigte sich, dass Oligosaccharide mit einem höheren Polymerisationsgrad (DP) und methylierten Uronsäuresubstitutionen mit kommerziellen Enzymmischungen schwieriger zu verarbeiten sind als Oligosaccharide mit niedrigem DP und neutrale Oligosaccharide. Hier berichten wir über die Anwendung mehrerer zusätzlicher Methoden, darunter die Glykanprofilierung mittels monoklonaler Antikörper (mAbs) spezifisch für pflanzliche Biomasse-Glykane zur Charakterisierung von Glykanbindungen in pflanzlichen Zellwänden und enzymatischen Hydrolysaten, Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF-MS). MALDI-TOF-MS nutzt strukturinformative diagnostische Peaks, die durch Spektroskopie nach dem sekundären Zerfall negativer Ionen gewonnen werden, sowie Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) zur Charakterisierung von Oligosaccharidbindungen mit und ohne Derivatisierung. Aufgrund der geringen Größe von Oligosacchariden (DP 4–20) sind diese Moleküle für die mAb-Bindung und -Charakterisierung schwierig zu verwenden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine neue, auf Biotin-Konjugation basierende Methode zur Oligosaccharid-Immobilisierung angewendet. Diese markierte erfolgreich die meisten löslichen Oligosaccharide mit niedrigem Polymerisationsgrad auf der Oberfläche von Mikrotiterplatten. Anschließend wurde sie in einem Hochdurchsatz-mAb-System für die spezifische Ligationsanalyse eingesetzt. Diese neue Methode wird zukünftig die Entwicklung fortschrittlicherer Hochdurchsatz-Glykom-Assays erleichtern, mit denen Oligosaccharide in Biomarkern für diagnostische Zwecke isoliert und charakterisiert werden können.
Lignocellulosehaltige Biomasse, bestehend aus landwirtschaftlichen, forstwirtschaftlichen, grasbewachsenen und holzigen Materialien, ist ein potenzieller Rohstoff für die Herstellung biobasierter Produkte, darunter Lebensmittel, Futtermittel, Kraftstoffe und chemische Vorprodukte zur Herstellung höherwertiger Produkte¹. Kohlenhydrate (wie Cellulose und Hemicellulose) in pflanzlichen Zellwänden werden durch chemische Verfahren und Biotransformation (z. B. enzymatische Hydrolyse und mikrobielle Fermentation) in Monosaccharide depolymerisiert. Gängige Vorbehandlungen umfassen die Ammoniak-Faser-Expansion (AFEX), die Behandlung mit verdünnter Säure (DA), ionischen Flüssigkeiten (IL) und die Dampfexplosion (SE). Diese Verfahren nutzen eine Kombination aus Chemikalien und Wärme, um die Lignocelluloseproduktion durch Öffnen der pflanzlichen Zellwände zu reduzieren^3,4.⁵ Die enzymatische Hydrolyse wird mit hoher Feststoffbelastung unter Verwendung kommerzieller aktiver kohlenhydrathaltiger Enzyme (CAZymes) durchgeführt, und die mikrobielle Fermentation erfolgt mit transgenen Hefen oder Bakterien zur Herstellung biobasierter Kraftstoffe und Chemikalien⁶.
Kommerzielle Enzyme mit CAZymen bestehen aus einem komplexen Enzymgemisch, das synergistisch komplexe Kohlenhydrat-Zucker-Bindungen spaltet und so Monosaccharide bildet^2,7. Wie bereits berichtet, erschwert das komplexe Netzwerk aromatischer Polymere des Lignins in Verbindung mit Kohlenhydraten deren Weiterverarbeitung. Dies führt zu einer unvollständigen Zuckerumwandlung und zur Akkumulation von 15–25 % Oligosacchariden, die bei der enzymatischen Hydrolyse der vorbehandelten Biomasse nicht entstehen. Dieses Problem tritt häufig bei verschiedenen Biomasse-Vorbehandlungsmethoden auf. Gründe für diesen Engpass sind unter anderem die Enzymhemmung während der Hydrolyse sowie das Fehlen oder die geringe Menge an essentiellen Enzymen, die für die Spaltung der Zuckerbindungen in pflanzlicher Biomasse erforderlich sind. Das Verständnis der Zusammensetzung und der Strukturmerkmale von Zuckern, wie beispielsweise der Zuckerbindungen in Oligosacchariden, trägt dazu bei, die Zuckerumwandlung während der Hydrolyse zu verbessern und biotechnologische Verfahren wettbewerbsfähig gegenüber erdölbasierten Produkten zu machen.
Die Strukturaufklärung von Kohlenhydraten ist anspruchsvoll und erfordert eine Kombination verschiedener Methoden wie Flüssigkeitschromatographie (LC)^11,12, Kernspinresonanzspektroskopie (NMR)¹³, Kapillarelektrophorese (CE)^14,15,16 und Massenspektrometrie (MS)^17,18. MS-Methoden wie die Flugzeitmassenspektrometrie mit Laserdesorption und -ionisation unter Verwendung einer Matrix (MALDI-TOF-MS) sind vielseitig einsetzbar zur Identifizierung von Kohlenhydratstrukturen. In jüngster Zeit hat sich die Tandem-Massenspektrometrie mit kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) von Natriumionenaddukten als besonders geeignet erwiesen, um Fingerabdrücke zu identifizieren, die Oligosaccharid-Anknüpfungsstellen, anomeren Konfigurationen, Sequenzen und Verzweigungspositionen entsprechen^20,21.
Die Glykananalyse ist ein hervorragendes Werkzeug zur detaillierten Identifizierung von Kohlenhydratbindungen²². Diese Methode nutzt monoklonale Antikörper (mAbs) gegen pflanzliche Zellwandglykane als Sonden, um komplexe Kohlenhydratverknüpfungen zu untersuchen. Weltweit sind über 250 mAbs verfügbar, die gegen verschiedene lineare und verzweigte Oligosaccharide unter Verwendung unterschiedlicher Saccharide entwickelt wurden²⁴. Mehrere mAbs werden häufig zur Charakterisierung der Struktur, Zusammensetzung und Modifikationen der pflanzlichen Zellwand eingesetzt, da signifikante Unterschiede je nach Pflanzenzelltyp, Organ, Alter, Entwicklungsstadium und Wachstumsbedingungen bestehen^25,26. In jüngerer Zeit wird diese Methode auch verwendet, um Vesikelpopulationen in pflanzlichen und tierischen Systemen und ihre jeweilige Rolle beim Glykantransport – bestimmt durch subzelluläre Marker, Entwicklungsstadien oder Umweltreize – zu untersuchen sowie die enzymatische Aktivität zu bestimmen. Zu den verschiedenen Strukturen von Glykanen und Xylanen, die identifiziert wurden, gehören Pektin (P), Xylan (X), Mannan (M), Xyloglucane (XylG), gemischte Bindungsglucane (MLG), Arabinoxylan (ArbX), Galactomannan (GalG), Glucuronsäure-Arabinoxylan (GArbX) und Arabino-Galactan (ArbG)29.
Trotz dieser Forschungsbemühungen konzentrierten sich bisher nur wenige Studien auf die Art der Oligosaccharid-Akkumulation während der Hydrolyse mit hoher Feststoffbelastung (HSL). Dies betrifft unter anderem die Oligosaccharid-Freisetzung, die Veränderungen der Oligomerkettenlänge während der Hydrolyse, verschiedene Polymere mit niedrigem Polymerisationsgrad (DP) und deren Verteilungskurven^30,31,32. Obwohl sich die Glykananalyse als nützliches Werkzeug für die umfassende Untersuchung der Glykanstruktur erwiesen hat, ist die Auswertung wasserlöslicher Oligosaccharide mit niedrigem DP mittels Antikörpermethoden schwierig. Oligosaccharide mit einem DP von unter 5–10 kDa binden nicht an ELISA-Platten^33,34 und werden vor der Antikörperzugabe abgewaschen.
Hier demonstrieren wir erstmals einen ELISA-Test auf Avidin-beschichteten Platten mit monoklonalen Antikörpern. Dieser Test kombiniert eine einstufige Biotinylierung löslicher, schwer abbaubarer Oligosaccharide mit einer Glykomanalyse. Unser Ansatz zur Glykomanalyse wurde mittels MALDI-TOF-MS und GC-MS validiert. Hierfür wurden hydrolysierte Zuckerverbindungen mit Trimethylsilyl (TMS) derivatisiert. Dieser innovative Ansatz kann zukünftig zu einer Hochdurchsatzmethode weiterentwickelt werden und in der biomedizinischen Forschung breitere Anwendung finden.³⁵
Posttranslationale Modifikationen von Enzymen und Antikörpern, wie die Glykosylierung³⁶, beeinflussen deren biologische Aktivität. So spielen beispielsweise Veränderungen der Glykosylierung von Serumproteinen eine wichtige Rolle bei entzündlicher Arthritis und dienen als diagnostische Marker³⁷. Verschiedene Glykane wurden in der Literatur als häufiges Auftreten bei einer Vielzahl von Erkrankungen beschrieben, darunter chronisch-entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts und der Leber, Virusinfektionen sowie Eierstock-, Brust- und Prostatakrebs^38,39,40. Die Aufklärung der Glykanstruktur mithilfe von antikörperbasierten Glykan-ELISA-Methoden ermöglicht eine zuverlässigere Krankheitsdiagnostik ohne den Einsatz komplexer massenspektrometrischer Verfahren.
Unsere vorherige Studie zeigte, dass hartnäckige Oligosaccharide nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse unhydrolysiert blieben (Abbildung 1). In einer zuvor veröffentlichten Arbeit entwickelten wir eine Festphasenextraktionsmethode mit Aktivkohle zur Isolierung von Oligosacchariden aus AFEX-vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH)⁸. Nach der ersten Extraktion und Trennung wurden die Oligosaccharide mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter fraktioniert und nach Molekulargewicht geordnet gesammelt. Die aus verschiedenen Vorbehandlungen freigesetzten Zuckermonomere und -oligomere wurden mittels Zuckerzusammensetzungsanalyse untersucht. Beim Vergleich des Gehalts an Zuckeroligomeren, die durch verschiedene Vorbehandlungsmethoden gewonnen wurden, zeigte sich, dass das Vorhandensein hartnäckiger Oligosaccharide ein häufiges Problem bei der Umwandlung von Biomasse in Monosaccharide darstellt und zu einer Verringerung der Zuckerausbeute um mindestens 10–15 % und sogar bis zu 18 % führen kann. Diese Methode wird für die weitere großtechnische Herstellung von Oligosaccharidfraktionen eingesetzt. Das so erhaltene ACH und seine nachfolgenden Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden in dieser Arbeit als experimentelles Material zur Charakterisierung von Oligosacchariden verwendet.
Nach Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse blieben persistente Oligosaccharide unhydrolysiert. Abbildung (A) zeigt eine Methode zur Oligosaccharid-Trennung, bei der Oligosaccharide aus AFEX-vorbehandeltem Maisstrohhydrolysat (ACSH) mittels eines Festbetts aus Aktivkohle und Kieselgur isoliert werden; Abbildung (B) zeigt ein Verfahren zur Trennung der Oligosaccharide. Die Oligosaccharide wurden anschließend mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter aufgetrennt; Abbildung (C) zeigt Saccharidmonomere und -oligomere, die durch verschiedene Vorbehandlungen (verdünnte Säure: DA, ionische Flüssigkeit: IL und AFEX) freigesetzt wurden. Bedingungen der enzymatischen Hydrolyse: hoher Feststoffgehalt von 25 % (w/w) (ca. 8 % Glucangehalt), 96 Stunden Hydrolyse, 20 mg/g kommerzielle Enzymbeladung (Verhältnis Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) und ( D) Zuckermonomere und -oligomere von Glucose, Xylose und Arabinose, die aus AFEX-vorbehandeltem Maisstroh (ACS) freigesetzt wurden.
Die Glykananalyse hat sich als nützliches Werkzeug für die umfassende Strukturanalyse von Glykanen in Extrakten aus festen Biomasse-Rückständen erwiesen. Wasserlösliche Saccharide werden mit dieser traditionellen Methode jedoch unterrepräsentiert⁴¹, da niedermolekulare Oligosaccharide schwer auf ELISA-Platten zu immobilisieren sind und vor der Antikörperzugabe ausgewaschen werden. Daher wurde für die Antikörperbindung und -charakterisierung eine einstufige Biotinylierungsmethode eingesetzt, um lösliche, nicht-konforme Oligosaccharide auf Avidin-beschichteten ELISA-Platten zu beschichten. Diese Methode wurde mit unserem zuvor hergestellten ACSH und einer Fraktion basierend auf seinem Molekulargewicht (bzw. Polymerisationsgrad, DP) getestet. Die einstufige Biotinylierung diente der Erhöhung der Oligosaccharid-Bindungsaffinität durch Anfügen von Biotin-LC-Hydrazid an das reduzierende Ende des Kohlenhydrats (Abb. 2). In Lösung reagiert die Halbacetalgruppe am reduzierenden Ende mit der Hydrazidgruppe des Biotin-LC-Hydrazids unter Bildung einer Hydrazonbindung. In Gegenwart des Reduktionsmittels NaCNBH₃ wird die Hydrazonbindung zu einem stabilen biotinylierten Endprodukt reduziert. Durch die Modifizierung des reduzierenden Zuckerendes wurde die Bindung von Oligosacchariden mit niedrigem Polymerisationsgrad an ELISA-Platten möglich. In unserer Studie erfolgte dies auf Avidin-beschichteten Platten mithilfe von Glykan-gerichteten monoklonalen Antikörpern.
Screening monoklonaler Antikörper mittels ELISA für biotinylierte Oligosaccharide. Abbildung (A) zeigt die kombinierte Biotinylierung von Oligosacchariden und das anschließende ELISA-Screening mit glykanspezifischen mAbs auf NeutrAvidin-beschichteten Platten, Abbildung (B) ein einstufiges Verfahren zur Biotinylierung von Reaktionsprodukten.
Avidinbeschichtete Platten mit Oligosaccharid-konjugierten Antikörpern wurden anschließend mit primären und sekundären Antikörpern versetzt und in einem licht- und zeitempfindlichen Medium gewaschen. Nach vollständiger Antikörperbindung wurde TMB-Substrat zugegeben und die Platte inkubiert. Die Reaktion wurde abschließend mit Schwefelsäure gestoppt. Die inkubierten Platten wurden mittels ELISA-Reader analysiert, um die Bindungsstärke jedes Antikörpers zum Nachweis antikörperspezifischer Vernetzungen zu bestimmen. Details und Parameter des Experiments finden sich im entsprechenden Abschnitt „Materialien und Methoden“.
Wir demonstrieren die Nützlichkeit dieser neu entwickelten Methode für spezifische Anwendungen, indem wir die in ACSH sowie in rohen und gereinigten Oligosaccharidfraktionen aus Lignocellulosehydrolysaten vorhandenen löslichen Oligosaccharide charakterisieren. Wie in Abbildung 3 dargestellt, handelt es sich bei den häufigsten Epitop-substituierten Xylanen, die in ACSH mittels bioacylierter Glykom-Assay-Methoden identifiziert wurden, üblicherweise um Uronsäure- (U) oder Methyluronsäure- (MeU) und Pektin-Arabinogalactane. Die meisten davon wurden auch in unserer früheren Studie zur Analyse von Glykanen nicht-hydrolysierter Feststoffe (UHS)⁴³ gefunden.
Nachweis von schwer abbaubaren Oligosaccharid-Epitopen mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen das Zellwand-Glykan. Die „neutrale“ Fraktion entspricht der ACN-Fraktion, die „saure“ Fraktion der FA-Fraktion. Hellere Rottöne in der Heatmap weisen auf einen höheren Epitopgehalt hin, hellere Blautöne auf einen leeren Hintergrund. Die Farbwerte basieren auf den Roh-OD-Werten für Formulierungen mit N=2. Die wichtigsten von den Antikörpern erkannten Epitope sind rechts dargestellt.
Diese Nicht-Cellulose-Strukturen konnten durch die gängigsten Cellulasen und Hemicellulasen der getesteten kommerziellen Enzymmischung, die die am häufigsten verwendeten kommerziellen Enzyme enthält, nicht gespalten werden. Daher sind neue Hilfsenzyme für ihre Hydrolyse erforderlich. Ohne die notwendigen Nicht-Cellulose-Hilfsenzyme verhindern diese Nicht-Cellulose-Bindungen die vollständige Umwandlung in Monosaccharide, selbst wenn ihre Ausgangszuckerpolymere mithilfe kommerzieller Enzymmischungen weitgehend in kürzere Fragmente hydrolysiert und gelöst werden.
Weitere Untersuchungen der Signalverteilung und ihrer Bindungsstärke zeigten, dass die Bindungsepitope in hochmolekularen Zuckerfraktionen (A, B, C, DP bis zu 20+) schwächer ausgeprägt waren als in niedrigmolekularen Fraktionen (D, E, F, DP in Dimeren) (Abb. 1). Saure Fragmente sind in Nicht-Cellulose-Epitopen häufiger als neutrale Fragmente. Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen unserer vorherigen Studie überein, in der hochmolekulare und saure Gruppen resistenter gegenüber enzymatischer Hydrolyse waren. Daher können das Vorhandensein von Nicht-Cellulose-Glycan-Epitopen sowie U- und MeU-Substitutionen wesentlich zur Stabilität der Oligosaccharide beitragen. Es ist zu beachten, dass die Bindungs- und Detektionseffizienz bei niedrigmolekularen Oligosacchariden problematisch sein kann, insbesondere wenn es sich bei dem Epitop um ein dimeres oder trimeres Oligosaccharid handelt. Dies lässt sich mit kommerziellen Oligosacchariden unterschiedlicher Länge testen, die jeweils nur ein Epitop enthalten, das an einen spezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) bindet.
Die Verwendung strukturspezifischer Antikörper ermöglichte die Identifizierung bestimmter Arten von schwer spaltbaren Bindungen. Abhängig vom verwendeten Antikörpertyp, dem geeigneten Ligationsmuster und der Signalstärke (stärkste und schwächste Signale) lassen sich neue Enzyme identifizieren und semiquantitativ der Enzymmischung für eine vollständigere Glykokonversion hinzufügen. Am Beispiel der Analyse von ACSH-Oligosacchariden kann eine Datenbank mit Glykanbindungen für jedes Biomassematerial erstellt werden. Dabei ist die unterschiedliche Affinität der Antikörper zu berücksichtigen. Ist diese unbekannt, erschwert dies den Vergleich der Signale verschiedener Antikörper. Zudem ist der Vergleich von Glykanbindungen zwischen Proben mit demselben Antikörper am effektivsten. Diese schwer spaltbaren Bindungen können anschließend mit der CAZyme-Datenbank verknüpft werden. Aus dieser Datenbank lassen sich Enzyme identifizieren, Kandidatenenzyme auswählen und auf bindungsspaltende Enzyme testen oder mikrobielle Systeme zur Expression dieser Enzyme für den Einsatz in Bioraffinerien entwickeln.⁴⁴
Um zu evaluieren, wie immunologische Methoden alternative Methoden zur Charakterisierung niedermolekularer Oligosaccharide in Lignocellulosehydrolysaten ergänzen, führten wir MALDI (Abb. 4, S1–S8) und eine GC-MS-Analyse von TMS-abgeleiteten Sacchariden am selben Oligosaccharidanteil durch (Abb. 5). MALDI dient dem Vergleich der Massenverteilung der Oligosaccharidmoleküle mit der erwarteten Struktur. Abb. 4 zeigt die Massenverteilung der neutralen Komponenten ACN-A und ACN-B. Die Analyse von ACN-A bestätigte ein Spektrum an Pentosen mit Polymerisationsgraden (DP) von 4–8 (Abb. 4) bis 22 (Abb. S1), deren Molekulargewichte MeU-Xylan-Oligosacchariden entsprechen. Die Analyse von ACN-B bestätigte die Pentosen- und Glucoxylanreihe mit DP 8–15. In ergänzenden Materialien wie Abbildung S3 zeigen die Massenverteilungskarten der sauren FA-C-Gruppe eine Reihe von (Me)U-substituierten Pentosen mit einem Polymerisationsgrad (DP) von 8–15, die mit den in ELISA-basierten mAb-Screenings gefundenen substituierten Xylanen übereinstimmen. Die Epitope sind konsistent.
MALDI-MS-Spektrum von löslichen, nicht-konformen Oligosacchariden in ACS. Hierbei handelt es sich um (A) ACN-A-Fraktionen im niedrigen Molekulargewichtsbereich, die methylierte Uronsäure (DP 4-8)-substituierte Glucuroxylan-Oligosaccharide enthalten, und (B) ACN-B-Xylan- und methylierte Uronsäure-Oligosaccharide, die mit Glucuroxylan (DP 8-15) substituiert sind.
Analyse der Zusammensetzung der Glykanreste refraktärer Oligosaccharide. Hier (A) TMS-Saccharidzusammensetzung verschiedener Oligosaccharidfraktionen, gewonnen mittels GC-MS-Analyse. (B) Strukturen verschiedener TMS-abgeleiteter Zucker in Oligosacchariden. ACN – Acetonitrilfraktion mit neutralen Oligosacchariden und FA – Ferulasäurefraktion mit sauren Oligosacchariden.
Eine weitere interessante Schlussfolgerung ergab sich aus der LC-MS-Analyse der Oligosaccharidfraktion (siehe Abb. S9; Methodenbeschreibung im elektronischen Zusatzmaterial). Bei der Ligation der ACN-B-Fraktion wurden wiederholt Fragmente von Hexose- und -OAc-Gruppen beobachtet. Dieser Befund bestätigt nicht nur die in der Glykom- und MALDI-TOF-Analyse beobachtete Fragmentierung, sondern liefert auch neue Erkenntnisse über potenzielle Kohlenhydratderivate in vorbehandelter lignocellulosehaltiger Biomasse.
Wir analysierten die Zuckerzusammensetzung der Oligosaccharidfraktion mittels TMS-Zuckerderivatisierung. Mittels GC-MS bestimmten wir die Zusammensetzung der neutralen (nicht-derivatisierten) und sauren Zucker (GluA und GalA) in der Oligosaccharidfraktion (Abb. 5). Glucuronsäure findet sich in den sauren Komponenten C und D, während Galacturonsäure in den sauren Komponenten A und B vorkommt, die beide hochmolekulare Komponenten der sauren Zucker darstellen. Diese Ergebnisse bestätigen nicht nur unsere ELISA- und MALDI-Daten, sondern stimmen auch mit unseren früheren Untersuchungen zur Oligosaccharidakkumulation überein. Daher sind wir überzeugt, dass moderne immunologische Methoden, die auf der Biotinylierung von Oligosacchariden und dem anschließenden ELISA-Screening basieren, ausreichend sind, um lösliche, schwer abbaubare Oligosaccharide in verschiedenen biologischen Proben nachzuweisen.
Da ELISA-basierte mAb-Screeningmethoden bereits durch verschiedene Verfahren validiert wurden, wollten wir das Potenzial dieser neuen quantitativen Methode weiter untersuchen. Zwei kommerzielle Oligosaccharide, Xylohexasaccharid-Oligosaccharid (XHE) und 23-α-L-Arabinofuranosyl-Xylotriose (A2XX), wurden erworben und mit einem neuen mAb-Ansatz, der auf Zellwandglykane abzielt, getestet. Abbildung 6 zeigt eine lineare Korrelation zwischen dem biotinylierten Bindungssignal und der logarithmischen Oligosaccharidkonzentration, was auf ein mögliches Langmuir-Adsorptionsmodell hindeutet. Von den mAbs korrelierten CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 und CCRC-M151 mit XHE und CCRC-M108, CCRC-M109 und LM11 mit A2XX im Bereich von 1 nm bis 100 nm. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von Antikörpern während des Experiments konnten nur wenige Versuche mit jeder Oligosaccharidkonzentration durchgeführt werden. Hierbei ist zu beachten, dass einige Antikörper sehr unterschiedlich auf dasselbe Oligosaccharid als Substrat reagieren, vermutlich weil sie an leicht unterschiedliche Epitope binden und daher sehr unterschiedliche Bindungsaffinitäten aufweisen können. Die Mechanismen und Implikationen einer präzisen Epitopidentifizierung werden deutlich komplexer sein, wenn der neue mAb-Ansatz auf reale Proben angewendet wird.
Zwei kommerzielle Oligosaccharide wurden verwendet, um den Nachweisbereich verschiedener glykanspezifischer monoklonaler Antikörper (mAbs) zu bestimmen. Lineare Korrelationen mit der logarithmischen Oligosaccharidkonzentration zeigen Langmuir-Adsorptionsmuster für (A) XHE mit mAb und (B) A2XX mit mAb. Die entsprechenden Epitope geben die Strukturen der als Substrate im Assay verwendeten kommerziellen Oligosaccharide wieder.
Die Verwendung glykanspezifischer monoklonaler Antikörper (Glykokomanalyse oder ELISA-basiertes mAb-Screening) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur detaillierten Charakterisierung der meisten wichtigen Zellwandglykane, aus denen pflanzliche Biomasse besteht. Die klassische Glykananalyse charakterisiert jedoch nur größere Zellwandglykane, da die meisten Oligosaccharide nicht effizient auf ELISA-Platten immobilisiert werden. In dieser Studie wurde AFEX-vorbehandeltes Maisstroh bei hohem Feststoffgehalt enzymatisch hydrolysiert. Mittels Zuckeranalyse wurde die Zusammensetzung der schwer abbaubaren Zellwandkohlenhydrate im Hydrolysat bestimmt. Die mAb-Analyse kleinerer Oligosaccharide in Hydrolysaten wird jedoch unterschätzt, und es werden zusätzliche Methoden benötigt, um Oligosaccharide effektiv auf ELISA-Platten zu immobilisieren.
Wir berichten hier über eine neuartige und effiziente Methode zur Oligosaccharid-Immobilisierung für das mAb-Screening. Diese Methode kombiniert die Biotinylierung von Oligosacchariden mit einem anschließenden ELISA-Screening auf NeutrAvidin™-beschichteten Platten. Die immobilisierten biotinylierten Oligosaccharide zeigten eine ausreichende Affinität zum Antikörper, um auch schwer abbaubare Oligosaccharide schnell und effizient nachzuweisen. Die massenspektrometrische Analyse der Zusammensetzung dieser schwer abbaubaren Oligosaccharide bestätigte die Ergebnisse dieses neuen Ansatzes für das Immunoscreening. Diese Studien zeigen somit, dass die Kombination aus Oligosaccharid-Biotinylierung und ELISA-Screening mit glykanspezifischen monoklonalen Antikörpern zum Nachweis von Vernetzungen in Oligosacchariden eingesetzt werden kann und sich für weitere biochemische Untersuchungen zur Strukturaufklärung von Oligosacchariden eignet.
Diese auf Biotin basierende Glykanprofilierungsmethode ist die erste, die die schwer spaltbaren Kohlenhydratbindungen löslicher Oligosaccharide in pflanzlicher Biomasse untersuchen kann. Dies trägt zum Verständnis bei, warum manche Biomassebestandteile bei der Biokraftstoffproduktion so resistent sind. Die Methode schließt eine wichtige Lücke in der Glykomanalyse und erweitert deren Anwendungsbereich auf ein breiteres Spektrum von Substraten jenseits pflanzlicher Oligosaccharide. Zukünftig könnten wir Roboter für die Biotinylierung einsetzen und die entwickelte Methode für die Hochdurchsatzanalyse von Proben mittels ELISA nutzen.
Maisstroh (CS), das aus Pioneer 33A14-Hybridsaatgut gezogen wurde, wurde 2010 auf der Kramer Farm in Ray, Colorado, geerntet. Mit Genehmigung des Landbesitzers kann diese Biomasse für Forschungszwecke verwendet werden. Die Proben wurden bei Raumtemperatur in wiederverschließbaren Beuteln mit einem Feuchtigkeitsgehalt von unter 6 % trocken gelagert. Die Proben wurden bei Raumtemperatur in wiederverschließbaren Beuteln mit einem Feuchtigkeitsgehalt von unter 6 % trocken gelagert. Die Lieferung erfolgt mit weniger als 6 % Versandgewicht in der Packung bei normaler Temperatur. Die Proben wurden trocken bei einer Luftfeuchtigkeit von unter 6 % in wiederverschließbaren Beuteln bei Raumtemperatur gelagert.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6 % Die Lieferung erfolgt in Paketen mit einer Temperatur von < 6 %. Die Proben werden in wiederverschließbaren Beuteln bei Raumtemperatur und einer Luftfeuchtigkeit von unter 6 % gelagert.Die Studie entsprach den lokalen und nationalen Richtlinien. Die Zusammensetzungsanalyse erfolgte gemäß dem NREL-Protokoll. Die Zusammensetzung betrug 31,4 % Glucan, 18,7 % Xylan, 3,3 % Arabinan, 1,2 % Galactan, 2,2 % Acetylgruppen, 14,3 % Lignin, 1,7 % Protein und 13,4 % Asche.
Cellic® CTec2 (138 mg Protein/ml, Charge VCNI 0001) ist ein komplexes Gemisch aus Cellulase, β-Glucosidase und Cellic® HTec2 (157 mg Protein/ml, Charge VHN00001) von Novozymes (Franklinton, NC, USA). Multifect Pectinase® (72 mg Protein/ml), eine komplexe Mischung pektinabbauender Enzyme, wurde von DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA) zur Verfügung gestellt. Die Enzymproteinkonzentrationen wurden durch Bestimmung des Proteingehalts (nach Abzug des Anteils an Nicht-Protein-Stickstoff) mittels Kjeldahl-Stickstoffanalyse (AOAC-Methode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) ermittelt. Kieselgur 545 wurde von EMD Millipore (Billerica, MA) bezogen. Aktivkohle (DARCO, 100 Mesh Granulat), Avicel (PH-101), Buchenxylan und alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen.
Die AFEX-Vorbehandlung wurde im GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA) durchgeführt. Die Vorbehandlung erfolgte bei 140 °C für 15 Minuten. Die Verweilzeit betrug 46 Minuten bei einem Verhältnis von wasserfreiem Ammoniak zu Biomasse von 1:1 und einer Beladung von 60 % (w/w) in einem Edelstahl-Batchreaktor (Parr Instruments Company). Dieser Vorgang dauerte 30 Minuten. Der Reaktor wurde auf 140 °C erhitzt, wodurch das Ammoniak schnell entwich und die Biomasse rasch auf Raumtemperatur abkühlte. Die Zusammensetzung des AFEX-vorbehandelten Maisstrohs (ACS) war vergleichbar mit der von unbehandeltem Maisstroh (UT-CS).
Hochfester ACSH (25 % (w/w)) mit ca. 8 % Dextranbeladung wurde als Ausgangsmaterial für die großtechnische Oligosaccharidproduktion hergestellt. Die enzymatische Hydrolyse von ACSH erfolgte mit einem kommerziellen Enzymgemisch, bestehend aus Cellic® Ctec2 (10 mg Protein/g Glucan in vorbehandelter Biomasse), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC, USA, 5 mg Protein/g Glucan) und Multifect Pectinase (Genencor Inc., USA, 5 mg Protein/g Dextran). Die enzymatische Hydrolyse wurde in einem 5-Liter-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 3 Litern bei pH 4,8, 50 °C und 250 U/min durchgeführt. Nach 96 Stunden Hydrolyse wurde das Hydrolysat durch Zentrifugation (30 min bei 6000 U/min und anschließend 30 min bei 14000 U/min) gewonnen, um nicht hydrolysierte Feststoffe zu entfernen. Das Hydrolysat wurde anschließend durch einen 0,22-mm-Filterbecher sterilfiltriert. Das filtrierte Hydrolysat wurde in sterilen Flaschen bei 4 °C gelagert und anschließend an Aktivkohle fraktioniert.
Analyse der Zusammensetzung von Extrakt-basierten Biomasseproben gemäß den Laboranalyseverfahren des NREL: Probenvorbereitung für die Zusammensetzungsanalyse (NREL/TP-510-42620) und Bestimmung von Strukturkohlenhydraten und Lignin in Biomasse (NREL/TP-510 – 42618)47.
Die Oligosaccharidanalyse des Hydrolysats erfolgte im 2-ml-Maßstab mittels autoklavbasierter Säurehydrolyse. Dazu wurde die Hydrolysatprobe mit 69,7 µl 72%iger Schwefelsäure in einem 10-ml-Schraubverschlussröhrchen vermischt und 1 h bei 121 °C auf der Arbeitsfläche inkubiert. Anschließend wurde die Lösung auf Eis gekühlt und in ein HPLC-Fläschchen filtriert. Die Oligosaccharidkonzentration wurde durch Subtraktion der Monosaccharidkonzentration der nicht-hydrolysierten Probe von der Gesamtzuckerkonzentration der säurehydrolysierten Probe bestimmt.
Die Konzentrationen von Glucose, Xylose und Arabinose in der säurehydrolysierten Biomasse wurden mittels HPLC (Shimadzu) analysiert. Das System war mit einem Autosampler, einer Säulenheizung, einer isokratischen Pumpe und einem Brechungsindexdetektor ausgestattet. Als Trennsäule diente eine Bio-Rad Aminex HPX-87H-Säule. Die Säule wurde auf 50 °C temperiert und mit einer Flussrate von 0,6 ml/min 5 mM H₂SO₄ in Wasser eluiert.
Der Hydrolysatüberstand wurde verdünnt und auf seinen Monomer- und Oligosaccharidgehalt analysiert. Die nach enzymatischer Hydrolyse erhaltenen monomeren Zucker wurden mittels HPLC mit einer Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P-Säule und einer Asche-Vorsäule analysiert. Die Säulentemperatur betrug 80 °C, als mobile Phase wurde Wasser mit einer Flussrate von 0,6 ml/min verwendet. Die Oligosaccharide wurden durch Hydrolyse in verdünnter Säure bei 121 °C gemäß den in den Referenzen 41, 48 und 49 beschriebenen Methoden bestimmt.
Die Saccharidanalyse wurde an rohen, AFEX-vorbehandelten und allen nicht hydrolysierten Biomasse-Rückständen (einschließlich der Herstellung von Zellwandextrakten und deren mAb-Screening) nach zuvor beschriebenen Verfahren^27,43,50,51 durchgeführt. Für die Glykomanalyse wurden alkoholunlösliche Rückstände pflanzlichen Zellwandmaterials aus Biomasse-Rückständen gewonnen und einer seriellen Extraktion mit zunehmend aggressiven Reagenzien wie Ammoniumoxalat (50 mM), Natriumcarbonat (50 mM und 0,5 % w/v), CON (1 M und 4 M, jeweils mit 1 % w/v Natriumborhydrid) und saurem Chlorit unterzogen, wie zuvor beschrieben^52,53. Die Extrakte wurden anschließend mittels ELISA gegen ein komplexes Panel von mAb⁵⁰ gegen das Zellwandglykan getestet, und die mAb-Bindungsreaktionen wurden als Heatmap dargestellt. Die gegen pflanzliche Zellwandglykane gerichteten mAbs wurden aus Laborbeständen (CCRC-, JIM- und MAC-Serie) bezogen.
Einstufige Biotinylierung von Oligosacchariden. Die Konjugation von Kohlenhydraten mit Biotin-LC-Hydrazid erfolgte nach folgendem Verfahren: Biotin-LC-Hydrazid (4,6 mg/12 µmol) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, 70 µl) unter kräftigem Rühren und Erhitzen auf 65 °C für 1 min gelöst. Anschließend wurden 30 µl Eisessig zugegeben und die Mischung auf Natriumcyanoborhydrid (6,4 mg/100 µmol) gegossen. Nach kurzem Erhitzen auf 65 °C für ca. 1 min löste sich das Biotin vollständig. Danach wurden 5–8 µl der Reaktionsmischung zu dem getrockneten Oligosaccharid (1–100 nmol) gegeben, um einen mindestens zehnfachen molaren Überschuss des Markers am reduzierenden Ende zu erzielen. Die Reaktion wurde 2 h bei 65 °C durchgeführt, anschließend wurden die Proben sofort gereinigt. Bei den Markierungsexperimenten ohne Reduktion wurde kein Natriumcyanoborhydrid verwendet; die Proben wurden 2,5 h bei 65 °C umgesetzt.
ELISA-Beschichtung und Waschen von Proben biotinylierter Oligosaccharide. 25 μl der biotinylierten Proben (jeweils 100 μl der konzentrierten Proben, verdünnt in 5 ml 0,1 M Tris-Pufferlösung (TBS)) wurden in jede Vertiefung der Avidin-beschichteten Platte pipettiert. Kontrollvertiefungen wurden mit 50 μl Biotin (10 μg/ml in 0,1 M TBS) beschichtet. Für die Blindwertmessungen wurde deionisiertes Wasser als Beschichtung verwendet. Die Platte wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die Platte dreimal mit 0,1%iger Magermilch in 0,1 M TBS gemäß Programm Nr. 11 für Grenier Flat 3A gewaschen.
Zugabe und Waschen der primären Antikörper. Geben Sie 40 µl primären Antikörper in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend wurden die Platten dreimal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS unter Verwendung des Waschprogramms Nr. 11 für Grenier Flat 3A gewaschen.
Sekundärantikörper zugeben und waschen. 50 µl Maus-/Ratten-Sekundärantikörper (1:5000 verdünnt in 0,1 % Milch in 0,1 M TBS) in jedes Well geben. Die Mikrotiterplatte 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Anschließend die Mikrotiterplatten 5-mal mit 0,1 % Milch in 0,1 M TBS unter Verwendung des Waschprogramms Nr. 12 des Grenier Flat 5A Plattenwaschgeräts gewaschen.
Substrat hinzufügen. 50 µl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) zum Basissubstrat geben (durch Zugabe von 2 Tropfen Puffer, 3 Tropfen TMB und 2 Tropfen Wasserstoffperoxid zu 15 ml deionisiertem Wasser). TMB-Substrat vorbereiten und vor Gebrauch vortexen. Die Mikrotiterplatte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Führen Sie den Schritt durch und lesen Sie die Tablette ab. Geben Sie 50 µl 1 N Schwefelsäure in jede Vertiefung und messen Sie die Absorption im Bereich von 450 bis 655 nm mit einem ELISA-Reader.
Bereiten Sie 1 mg/ml-Lösungen der folgenden Analyten in deionisiertem Wasser vor: Arabinose, Rhamnose, Fucose, Xylose, Galacturonsäure (GalA), Glucuronsäure (GlcA), Mannose, Glucose, Galactose, Lactose, N-Acetylmannosamin (ManNAc), N-Acetylglucosamin (GlcNAc), N-Acetylgalactosamin (GalNAc) und Inositol (interner Standard). Zwei Standards wurden durch Zugabe der in Tabelle 1 aufgeführten 1 mg/ml-Zuckerlösungen hergestellt. Die Proben werden eingefroren und bei -80 °C gefriergetrocknet, bis das gesamte Wasser entfernt ist (in der Regel etwa 12–18 Stunden).
Geben Sie 100–500 µg der Probe in Schraubverschlussröhrchen auf einer Analysenwaage. Notieren Sie die zugegebene Menge. Die Probe sollte idealerweise in einem Lösungsmittel bestimmter Konzentration gelöst und als flüssiges Aliquot in das Röhrchen gegeben werden. Verwenden Sie 20 µl einer 1 mg/ml Inositol-Lösung als internen Standard für jedes Probenröhrchen. Die Menge des zugegebenen internen Standards muss der Menge im Standardröhrchen entsprechen.
Man gibt 8 ml wasserfreies Methanol in ein Schraubdeckelfläschchen. Anschließend fügt man 4 ml 3 N methanolische Salzsäure hinzu, verschließt das Fläschchen und schüttelt es. Für diesen Vorgang wird kein Wasser benötigt.
Geben Sie 500 µl einer 1 M HCl-Methanol-Lösung zu den Oligosaccharidproben und Standard-TMS-Röhrchen. Die Proben wurden über Nacht (168 Stunden) bei 80 °C in einem Thermoblock inkubiert. Trocknen Sie das Methanolyseprodukt bei Raumtemperatur mit einem Trockenverteiler. Geben Sie 200 µl MeOH hinzu und trocknen Sie erneut. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt. Geben Sie 200 µl Methanol, 100 µl Pyridin und 100 µl Essigsäureanhydrid zur Probe und mischen Sie gut. Die Proben wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und getrocknet. Geben Sie 200 µl Methanol hinzu und trocknen Sie erneut.
200 µl Tri-Sil zugeben und das verschlossene Röhrchen 20 Minuten lang auf 80 °C erhitzen, anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Mithilfe eines Trockenverteilers die Probe weiter auf ein Volumen von ca. 50 µl eintrocknen. Wichtig: Die Proben wurden nicht vollständig getrocknet.
2 ml Hexan zugeben und durch Vortexen gut mischen. Die Spitzen von Pasteurpipetten (5–8 mm) mit einem Stück Glaswolle füllen, indem die Glaswolle auf eine Pipette mit 5¾ Zoll Durchmesser aufgesetzt wird. Die Proben wurden 2 Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Unlösliche Rückstände fallen aus. Die Probe auf 100–150 µl eintrocknen. Etwa 1 µl wurde bei einer Anfangstemperatur von 80 °C und einer Anfangszeit von 2,0 Minuten in das GC-MS injiziert (Tabelle 2).