Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Dulliau sbectrometrig imiwnolegol a màs newydd ar gyfer dadansoddiad cymhleth o oligosaccharides parhaus mewn stofwr ŷd wedi'i drin ymlaen llaw ag AFEX.Mae biomas lignocellulosig yn ddewis amgen cynaliadwy i danwydd ffosil ac fe'i defnyddir yn eang i ddatblygu biotechnolegau ar gyfer cynhyrchu cynhyrchion fel bwyd, porthiant, tanwydd a chemegau.Yr allwedd i'r technolegau hyn yw datblygu prosesau cost-gystadleuol ar gyfer trosi carbohydradau cymhleth sy'n bresennol mewn cellfuriau planhigion yn siwgrau syml fel glwcos, xylose ac arabinose.Oherwydd bod biomas lignocellulosig yn ystyfnig iawn, rhaid iddo fod yn destun triniaethau thermocemegol (ee, diblisgo ffibr amonia (AFEX), asidau gwanedig (DA), hylifau ïonig (IL)) a thriniaethau biolegol (ee, hydrolysis ensymatig a eplesu microbaidd) ar y cyd i gael y cynnyrch a ddymunir..Fodd bynnag, pan ddefnyddir ensymau ffwngaidd masnachol yn y broses hydrolysis, dim ond 75-85% o'r siwgrau hydawdd a ffurfiwyd sy'n monosacaridau, ac mae'r 15-25% sy'n weddill yn oligosacaridau hydawdd, anhydrin, nad ydynt bob amser ar gael i ficro-organebau.Yn flaenorol, rydym wedi ynysu a phuro oligosaccharidau ystyfnig hydawdd yn llwyddiannus gan ddefnyddio cyfuniad o wahanu carbon a daear diatomaceous a chromatograffaeth allgáu maint, a hefyd wedi ymchwilio i'w priodweddau ataliol ensymau.Rydym wedi canfod bod oligosacaridau sy'n cynnwys amnewidiadau asid wronig methyledig lefel uwch o bolymeru (DP) yn fwy anodd eu prosesu gyda chyfuniadau ensymau masnachol nag oligosacaridau DP isel ac niwtral.Yma rydym yn adrodd ar y defnydd o sawl dull ychwanegol, gan gynnwys proffilio glycan gan ddefnyddio gwrthgyrff monoclonaidd (mAbs) sy'n benodol i glycanau biomas planhigion i nodweddu bondiau glycan mewn cellfuriau planhigion a hydrolysadau ensymatig, ïoneiddiad dadsugniad laser â chymorth matrics, sbectrometreg màs amser hedfan..Mae MALDI-TOF-MS) yn defnyddio copaon diagnostig strwythur-addysgiadol a geir trwy sbectrosgopeg ar ôl dadfeiliad eilaidd ïonau negyddol, cromatograffaeth nwy a sbectrometreg màs (GC-MS) i nodweddu bondiau oligosaccharid gyda a heb ddeilliad.Oherwydd maint bach oligosacaridau (DP 4-20), mae'r moleciwlau hyn yn anodd eu defnyddio ar gyfer rhwymo a nodweddu mAb.Er mwyn goresgyn y broblem hon, fe wnaethom gymhwyso dull atal symud oligosaccharid seiliedig ar gyfuniad biotin a labelodd y mwyafrif o oligosacaridau hydawdd DP isel ar wyneb y microplate yn llwyddiannus, a ddefnyddiwyd wedyn mewn system mAb trwybwn uchel ar gyfer dadansoddiad ligation penodol.Bydd y dull newydd hwn yn hwyluso datblygiad profion glycome trwybwn uchel mwy datblygedig yn y dyfodol y gellir eu defnyddio i ynysu a nodweddu oligosacaridau sy'n bresennol mewn biomarcwyr at ddibenion diagnostig.
Mae biomas lignocellulosig, sy'n cynnwys deunyddiau amaethyddol, coedwigaeth, glaswellt a phren, yn borthiant posibl ar gyfer cynhyrchu cynhyrchion bio-seiliedig, gan gynnwys bwyd, porthiant, tanwydd a rhagsylweddion cemegol i gynhyrchu cynhyrchion gwerth uwch1.Mae carbohydradau (fel cellwlos a hemicellwlos) sy'n bresennol mewn cellfuriau planhigion yn cael eu dadbolimereiddio i mewn i monosacaridau trwy brosesu cemegol a biodrawsnewid (fel hydrolysis ensymatig ac eplesu microbaidd).Mae rhag-driniaethau cyffredin yn cynnwys ehangu ffibr amonia (AFEX), asid gwanedig (DA), hylif ïonig (IL), a ffrwydrad stêm (SE), sy'n defnyddio cyfuniad o gemegau a gwres i leihau cynhyrchiad lignocellwlos trwy agor cellfuriau planhigion3,4.ystyfnigrwydd mater, 5. Mae hydrolysis ensymatig yn cael ei wneud ar lwyth solidau uchel gan ddefnyddio ensymau gweithredol masnachol sy'n cynnwys carbohydradau (CAZymes) ac eplesu microbaidd gan ddefnyddio burumau trawsgenig neu facteria i gynhyrchu tanwyddau bio-seiliedig a chemegau 6 .
Mae CAZymes mewn ensymau masnachol yn cynnwys cymysgedd cymhleth o ensymau sy'n hollti bondiau carbohydrad-siwgr cymhleth yn synergyddol i ffurfio monosacaridau2,7.Fel y dywedasom yn gynharach, mae'r rhwydwaith cymhleth o bolymerau aromatig o lignin â charbohydradau yn eu gwneud yn anhydrin iawn, sy'n arwain at drosi siwgr anghyflawn, gan gronni 15-25% o oligosacaridau rhyw nad ydynt yn cael eu cynhyrchu yn ystod hydrolysis enzymatig o'r biomas sydd wedi'i drin ymlaen llaw.Mae hon yn broblem gyffredin gyda gwahanol ddulliau rhag-drin biomas.Mae rhai rhesymau dros y dagfa hon yn cynnwys ataliad ensymau yn ystod hydrolysis, neu absenoldeb neu lefelau isel o ensymau hanfodol hanfodol sydd eu hangen i dorri bondiau siwgr mewn biomas planhigion.Bydd deall cyfansoddiad a nodweddion strwythurol siwgrau, megis y bondiau siwgr mewn oligosaccharides, yn ein helpu i wella trosi siwgr yn ystod hydrolysis, gan wneud prosesau biotechnolegol yn gost-gystadleuol gyda chynhyrchion sy'n deillio o petrolewm.
Mae pennu strwythur carbohydradau yn heriol ac mae angen cyfuniad o ddulliau megis cromatograffaeth hylifol (LC)11,12, sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR)13, electrofforesis capilari (CE)14,15,16 a sbectrometreg màs (MS)17., deunaw.Mae dulliau MS fel sbectrometreg màs amser-hedfan gyda dadsugniad laser ac ïoneiddiad gan ddefnyddio matrics (MALDI-TOF-MS) yn ddull amlbwrpas ar gyfer adnabod strwythurau carbohydradau.Yn ddiweddar, mae MS tandem Daduniad a Achosir gan Wrthdrawiad (CID) o adducts ïon sodiwm wedi'i ddefnyddio fwyaf i nodi olion bysedd sy'n cyfateb i safleoedd ymlyniad oligosacarid, ffurfweddau anomerig, dilyniannau, a safleoedd canghennog 20, 21 .
Mae dadansoddiad Glycan yn arf ardderchog ar gyfer adnabod bondiau carbohydradau yn fanwl22.Mae'r dull hwn yn defnyddio gwrthgyrff monoclonaidd (mAbs) wedi'u cyfeirio at blannu glycan cellfur fel stilwyr i ddeall cysylltiadau carbohydradau cymhleth.Mae mwy na 250 mAbs ar gael ledled y byd, wedi'u cynllunio yn erbyn oligosacaridau llinol a changhennog amrywiol gan ddefnyddio sacaridau amrywiol24.Mae sawl mAbs wedi'u defnyddio'n helaeth i nodweddu strwythur, cyfansoddiad, ac addasiadau wal gell planhigion, gan fod gwahaniaethau sylweddol yn dibynnu ar y math o gell planhigyn, organ, oedran, cyfnod datblygu, a'r amgylchedd twf25,26.Yn fwy diweddar, defnyddiwyd y dull hwn i ddeall poblogaethau fesigl mewn systemau planhigion ac anifeiliaid a'u rolau priodol mewn cludo glycan fel y'u pennir gan farcwyr isgellog, cyfnodau datblygiadol, neu ysgogiadau amgylcheddol, ac i bennu gweithgaredd ensymatig.Mae rhai o'r gwahanol strwythurau glycanau a xylans a nodwyd yn cynnwys pectin (P), xylan (X), manan (M), xyloglucans (XylG), glwcanau bond cymysg (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), asid glucuronig-arabinoxylan (GArbXGactan) ac arabino.
Fodd bynnag, er gwaethaf yr holl ymdrechion ymchwil hyn, dim ond ychydig o astudiaethau sydd wedi canolbwyntio ar natur cronni oligosacarid yn ystod hydrolysis llwyth solidau uchel (HSL), gan gynnwys rhyddhau oligosacarid, newidiadau hyd cadwyn oligomerig yn ystod hydrolysis, amrywiol bolymerau DP isel, a'u cromliniau.dosraniadau 30,31,32.Yn y cyfamser, er bod dadansoddiad glycan wedi bod yn offeryn defnyddiol ar gyfer dadansoddiad cynhwysfawr o strwythur glycan, mae'n anodd gwerthuso oligosaccharides DP isel sy'n hydoddi mewn dŵr gan ddefnyddio dulliau gwrthgorff.Nid yw oligosacaridau DP llai gyda phwysau moleciwlaidd o lai na 5-10 kDa yn rhwymo i blatiau ELISA 33, 34 ac yn cael eu golchi i ffwrdd cyn ychwanegu gwrthgyrff.
Yma, am y tro cyntaf, rydym yn dangos assay ELISA ar blatiau wedi'u gorchuddio ag avidin gan ddefnyddio gwrthgyrff monoclonaidd, gan gyfuno gweithdrefn biotinylation un cam ar gyfer oligosacaridau anhydrin hydawdd â dadansoddiad glycom.Dilyswyd ein dull o ddadansoddi glycome gan ddadansoddiad yn seiliedig ar MALDI-TOF-MS a GC-MS o gysylltiadau oligosaccharid cyflenwol gan ddefnyddio deilliad trimethylsilyl (TMS) o gyfansoddiadau siwgr hydrolyzed.Gellir datblygu’r dull arloesol hwn fel dull trwybwn uchel yn y dyfodol a chael ei gymhwyso’n ehangach mewn ymchwil biofeddygol35.
Mae addasiadau ôl-gyfieithu o ensymau a gwrthgyrff, megis glycosylation,36 yn effeithio ar eu gweithgaredd biolegol.Er enghraifft, mae newidiadau mewn glycosyleiddiad proteinau serwm yn chwarae rhan bwysig mewn arthritis llidiol, a defnyddir newidiadau mewn glycosyleiddiad fel marcwyr diagnostig37.Mae'r llenyddiaeth wedi nodi bod glycanau amrywiol yn ymddangos yn hawdd mewn amrywiaeth o afiechydon, gan gynnwys clefydau llidiol cronig y llwybr gastroberfeddol a'r afu, heintiau firaol, canser yr ofari, y fron a chanser y prostad38,39,40.Bydd deall strwythur glycanau gan ddefnyddio dulliau ELISA glycan sy'n seiliedig ar wrthgyrff yn rhoi hyder ychwanegol wrth wneud diagnosis o glefydau heb ddefnyddio dulliau MS cymhleth.
Dangosodd ein hastudiaeth flaenorol fod oligosacaridau ystyfnig yn parhau heb eu hydroleiddio ar ôl rhag-driniaeth a hydrolysis ensymatig (Ffigur 1).Yn ein gwaith a gyhoeddwyd yn flaenorol, rydym wedi datblygu dull echdynnu cyfnod solet siarcol wedi'i actifadu i ynysu oligosacaridau o hydrolyzate stofwr ŷd wedi'i drin ymlaen llaw gan AFEX (ACSH)8.Ar ôl echdynnu a gwahanu cychwynnol, cafodd yr oligosacaridau eu ffracsiynu ymhellach gan gromatograffaeth eithrio maint (SEC) a'u casglu yn nhrefn pwysau moleciwlaidd.Dadansoddwyd monomerau siwgr ac oligomers a ryddhawyd o rag-driniaethau amrywiol trwy ddadansoddi cyfansoddiad siwgr.Wrth gymharu cynnwys oligomers siwgr a geir trwy amrywiol ddulliau rhag-drin, mae presenoldeb oligosacaridau ystyfnig yn broblem gyffredin wrth drosi biomas yn monosacaridau a gall arwain at ostyngiad mewn cynnyrch siwgr o 10-15% o leiaf a hyd yn oed hyd at 18%.U.S.Defnyddir y dull hwn ar gyfer cynhyrchu mwy o ffracsiynau oligosacarid ar raddfa fawr.Defnyddiwyd yr ACH canlyniadol a'i ffracsiynau dilynol gyda phwysau moleciwlaidd gwahanol fel deunydd arbrofol ar gyfer nodweddu oligosacaridau yn y gwaith hwn.
Ar ôl cyn-driniaeth a hydrolysis ensymatig, arhosodd oligosacaridau parhaus heb eu hydrolysu.Yma (A) mae dull gwahanu oligosacarid lle mae oligosaccharides yn cael eu hynysu o hydrolysate stofwr ŷd sydd wedi'i drin ymlaen llaw gan AFEX (ACSH) gan ddefnyddio gwely llawn carbon wedi'i actifadu a daear diatomaceous;(B) Dull ar gyfer gwahanu oligosacaridau.Gwahanwyd yr oligosacaridau ymhellach gan gromatograffeg eithrio maint (SEC);(C) Monomerau saccharid ac oligomers rhyddhau o pretreatments amrywiol (asid gwanedig: DA, hylif ïonig: IL a AFEX).Amodau hydrolysis ensymatig: llwythiad solidau uchel o 25% (w/w) (tua 8% o lwythiad glwcan), hydrolysis 96 awr, llwytho ensymau masnachol 20 mg/g (cymhareb Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) Monomerau siwgr ac oligomers glwcos, xylose-treatment ac araEXAC wedi'i ryddhau o stôf corn-cyn-araexAC.
Mae dadansoddiad glycan wedi bod yn arf defnyddiol ar gyfer dadansoddiad strwythurol cynhwysfawr o glycanau mewn echdynion wedi'u hynysu o weddillion biomas solet.Fodd bynnag, mae sacaridau sy'n hydoddi mewn dŵr yn cael eu tangynrychioli gan ddefnyddio'r dull traddodiadol hwn41 oherwydd ei bod yn anodd atal symud oligosacaridau â phwysau moleciwlaidd isel ar blatiau ELISA a chânt eu golchi allan cyn ychwanegu gwrthgyrff.Felly, ar gyfer rhwymo a nodweddu gwrthgyrff, defnyddiwyd dull biotinylation un cam i orchuddio oligosacaridau hydawdd, nad ydynt yn cydymffurfio ar blatiau ELISA wedi'u gorchuddio ag avidin.Profwyd y dull hwn gan ddefnyddio ein ACSH a gynhyrchwyd yn flaenorol a ffracsiwn yn seiliedig ar ei bwysau moleciwlaidd (neu radd polymerization, DP).Defnyddiwyd biotinylation un cam i gynyddu affinedd rhwymo oligosacarid trwy ychwanegu biotin-LC-hydrazide i ddiwedd lleihau'r carbohydrad (Ffig. 2).Mewn hydoddiant, mae'r grŵp hemiasetol ar y pen lleihäwr yn adweithio â'r grŵp hydrasid o biotin-LC-hydrasid i ffurfio bond hydrazone.Ym mhresenoldeb yr asiant lleihau NaCNBH3, mae'r bond hydrazone yn cael ei leihau i gynnyrch terfynol biotinylated sefydlog.Gydag addasiad y pen lleihau siwgr, daeth yn bosibl rhwymo oligosacaridau DP isel i blatiau ELISA, ac yn ein hastudiaeth gwnaed hyn ar blatiau wedi'u gorchuddio ag avidin gan ddefnyddio mAbs wedi'u targedu â glycan.
Sgrinio gwrthgyrff monoclonaidd yn seiliedig ar ELISA ar gyfer oligosacaridau biotinylated.Yma (A) biotinylation cyfunol o oligosacaridau a sgrinio dilynol ELISA gyda mAbs wedi'u targedu glycan ar blatiau gorchuddio NeutraAvidin a (B) yn dangos gweithdrefn un cam ar gyfer biotinylation cynhyrchion adwaith.
Yna ychwanegwyd platiau wedi'u gorchuddio ag avidin â gwrthgyrff cyfun oligosacarid at wrthgyrff cynradd ac eilaidd a'u golchi mewn cyfrwng sy'n sensitif i olau ac amser.Ar ôl cwblhau'r rhwymiad gwrthgyrff, ychwanegwch y swbstrad TMB i ddeor y plât.Cafodd yr adwaith ei atal o'r diwedd gydag asid sylffwrig.Dadansoddwyd y platiau deor gan ddefnyddio darllenydd ELISA i bennu cryfder rhwymol pob gwrthgorff i ganfod croesgysylltu gwrthgyrff penodol.Am fanylion a pharamedrau'r arbrawf, gweler yr adran gyfatebol "Deunyddiau a Dulliau".
Rydym yn dangos defnyddioldeb y dull hwn sydd newydd ei ddatblygu ar gyfer cymwysiadau penodol trwy nodweddu'r oligosacaridau hydawdd sy'n bresennol yn ACSH yn ogystal ag mewn ffracsiynau oligosaccharid crai a phuro wedi'u hynysu o hydrolysadau lignocellulosig.Fel y dangosir yn Ffigur 3, y xylans amnewidiol epitop mwyaf cyffredin a nodir yn ACSH gan ddefnyddio dulliau assay glycome bioacylated fel arfer yw wronig (U) neu methyluronig (MeU) ac arabinogalactanau pectig.Canfuwyd y rhan fwyaf ohonynt hefyd yn ein hastudiaeth flaenorol ar ddadansoddi glycanau o solidau nad ydynt yn hydrolysu (UHS)43.
Canfod epitopau oligosacarid ysbeidiol gan ddefnyddio gwrthgorff monoclonaidd wedi'i gyfeirio at glycan y cellfur.Y ffracsiwn “niwtral” yw'r ffracsiwn ACN a'r ffracsiwn "asidig" yw'r ffracsiwn FA.Mae coch mwy disglair ar y map gwres yn dynodi cynnwys epitope uwch, ac mae glas llachar yn dynodi cefndir gwag.Mae gwerthoedd lliw ar y raddfa yn seiliedig ar werthoedd OD amrwd ar gyfer fformwleiddiadau N=2.Mae'r prif epitopau a gydnabyddir gan y gwrthgyrff i'w gweld ar y dde.
Ni allai'r adeileddau di-cellwlos hyn gael eu hollti gan y cellulasau a'r hemicellwlasau mwyaf cyffredin yn y cymysgedd ensymau masnachol a brofwyd, sy'n cynnwys yr ensymau masnachol a ddefnyddir amlaf.Felly, mae angen ensymau ategol newydd ar gyfer eu hydrolysis.Heb yr ensymau affeithiwr di-cellwlos angenrheidiol, mae'r bondiau di-cellwlos hyn yn atal trosi'n llwyr i monosacaridau, hyd yn oed os yw eu rhiant-bolymerau siwgr yn cael eu hydrolysu'n helaeth yn ddarnau byrrach a'u diddymu gan ddefnyddio cymysgeddau ensymau masnachol.
Dangosodd astudiaeth bellach o ddosbarthiad signal a'i gryfder rhwymo fod epitopau rhwymo yn is mewn ffracsiynau siwgr DP uchel (A, B, C, DP hyd at 20+) nag mewn ffracsiynau DP isel (D, E, F, DP) mewn dimers) (Ffig. 1).Mae darnau asid yn fwy cyffredin mewn epitopau nad ydynt yn cellwlos na darnau niwtral.Mae'r ffenomenau hyn yn gyson â'r patrwm a welwyd yn ein hastudiaeth flaenorol, lle'r oedd lefelau uchel o DP ac asid yn fwy ymwrthol i hydrolysis ensymatig.Felly, gall presenoldeb epitopau glycan nad ydynt yn cellwlos ac amnewidion U a MeU gyfrannu'n fawr at sefydlogrwydd yr oligosacaridau.Dylid nodi y gall effeithlonrwydd rhwymo a chanfod fod yn broblemus ar gyfer oligosacaridau DP isel, yn enwedig os yw'r epitope yn oligosaccharid dimeric neu trimeric.Gellir profi hyn gan ddefnyddio oligosacaridau masnachol o wahanol hyd, pob un yn cynnwys dim ond un epitop sy'n clymu i mAb penodol.
Felly, datgelodd y defnydd o wrthgyrff strwythur-benodol rai mathau o fondiau ystyfnig.Yn dibynnu ar y math o wrthgorff a ddefnyddir, y patrwm ligation priodol, a chryfder y signal y mae'n ei gynhyrchu (mwyaf a lleiaf toreithiog), gellir nodi ensymau newydd a'u hychwanegu'n lled-feintiol i'r cymysgedd ensymau ar gyfer glycoconversion mwy cyflawn.Gan gymryd y dadansoddiad o oligosaccharides ACSH fel enghraifft, gallwn greu cronfa ddata o fondiau glycan ar gyfer pob deunydd biomas.Dylid nodi yma y dylid ystyried gwahanol affinedd gwrthgyrff, ac os nad yw eu haffinedd yn hysbys, bydd hyn yn creu rhai anawsterau wrth gymharu signalau gwahanol wrthgyrff.Yn ogystal, gall cymharu bondiau glycan weithio orau rhwng samplau ar gyfer yr un gwrthgorff.Yna gellir cysylltu'r bondiau ystyfnig hyn â chronfa ddata CAZyme, lle gallwn nodi ensymau, dewis ensymau ymgeisiol a phrofi am ensymau sy'n torri bond, neu ddatblygu systemau microbaidd i fynegi'r ensymau hyn i'w defnyddio mewn bioburfeydd44.
Er mwyn gwerthuso sut mae dulliau imiwnolegol yn ategu dulliau amgen ar gyfer nodweddu oligosaccharides pwysau moleciwlaidd isel sy'n bresennol mewn hydrolysadau lignocellulosig, gwnaethom berfformio MALDI (Ffig. 4, S1-S8) a dadansoddiad o sacaridau sy'n deillio o TMS yn seiliedig ar GC-MS ar yr un panel (Ffig. 5) rhan oligosaccharid.Defnyddir MALDI i gymharu a yw dosbarthiad màs moleciwlau oligosacarid yn cyfateb i'r strwythur arfaethedig.Ar ffig.Mae 4 yn dangos MC y cydrannau niwtral ACN-A ac ACN-B.Cadarnhaodd dadansoddiad ACN-A ystod o siwgrau pentos yn amrywio o DP 4-8 (Ffig. 4) i DP 22 (Ffig. S1), y mae eu pwysau'n cyfateb i oligosaccharides MeU-xylan.Cadarnhaodd dadansoddiad ACN-B y gyfres pentose a glucoxylan gyda DP 8-15.Mewn deunydd atodol fel Ffigur S3, mae mapiau dosbarthiad màs moiety asidig FA-C yn dangos ystod o (Me)U siwgrau pentos amnewid gyda DP o 8-15 sy'n gyson â'r xylans amnewidiol a geir mewn sgrinio mAb ar sail ELISA.Mae'r epitopau yn gyson.
Sbectrwm MALDI-MS o oligosacaridau hydawdd nad ydynt yn cydymffurfio yn bresennol yn ACS.Yma, (A) ffracsiynau ystod pwysau isel ACN-A sy'n cynnwys asid wronig methylated (DP 4-8) amnewidiwyd oligosaccharides glucuroxylan a (B) xylan ACN-B ac oligosacaridau asid wronig methyl wedi'u hamnewid â glucuroxylan (DP 8-15).
Dadansoddiad o gyfansoddiad y gweddillion glycan o oligosaccharides anhydrin.Yma (A) cyfansoddiad saccharid TMS o wahanol ffracsiynau oligosacarid a gafwyd gan ddefnyddio dadansoddiad GC-MS.(B) Adeileddau gwahanol siwgrau sy'n deillio o TMS sy'n bresennol mewn oligosacaridau.ACN – ffracsiwn acetonitrile sy'n cynnwys oligosacaridau niwtral ac FA – ffracsiwn asid ferulig sy'n cynnwys oligosacaridau asid.
Daethpwyd i gasgliad diddorol arall o ddadansoddiad LC-MS o'r ffracsiwn oligosacarid, fel y dangosir yn Ffigur S9 (gellir gweld dulliau yn y deunydd atodol electronig).Arsylwyd darnau o grwpiau hecsos a -OAc dro ar ôl tro yn ystod clymu'r ffracsiwn ACN-B.Mae'r canfyddiad hwn nid yn unig yn cadarnhau'r darnio a welwyd mewn dadansoddiad glycome a MALDI-TOF, ond mae hefyd yn darparu gwybodaeth newydd am ddeilliadau carbohydrad posibl mewn biomas lignocellwlosig sydd wedi'i drin ymlaen llaw.
Gwnaethom hefyd ddadansoddi cyfansoddiad siwgr y ffracsiwn oligosacarid gan ddefnyddio deilliad siwgr TMS.Gan ddefnyddio GC-MS, fe wnaethom bennu cyfansoddiad siwgrau niwral (nad ydynt yn ddeilliadol) ac asidig (GluA a GalA) yn y ffracsiwn oligosacarid (Ffig. 5).Mae asid glucuronic i'w gael mewn cydrannau asidig C a D, tra bod asid galacturonig i'w gael mewn cydrannau asidig A a B, y ddau ohonynt yn gydrannau DP uchel o siwgrau asidig.Mae'r canlyniadau hyn nid yn unig yn cadarnhau ein data ELISA a MALDI, ond maent hefyd yn gyson â'n hastudiaethau blaenorol o groniad oligosacarid.Felly, credwn fod dulliau imiwnolegol modern sy'n defnyddio biotinylation o oligosaccharides a sgrinio dilynol ELISA yn ddigonol i ganfod oligosaccharidau ystyfnig hydawdd mewn samplau biolegol amrywiol.
Gan fod dulliau sgrinio mAb sy'n seiliedig ar ELISA wedi'u dilysu gan nifer o wahanol ddulliau, roeddem am archwilio ymhellach i botensial y dull meintiol newydd hwn.Prynwyd a phrofwyd dau oligosaccharid masnachol, oligosaccharide xylohexasaccharide (XHE) a 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), gan ddefnyddio dull mAb newydd sy'n targedu glycan y wal gell.Mae Ffigur 6 yn dangos cydberthynas llinol rhwng y signal rhwymo biotinylated a chrynodiad log crynodiad oligosacarid, gan awgrymu model arsugniad Langmuir posibl.Ymhlith y mAbs, roedd CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, a CCRC-M151 yn cydberthyn â XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109, a LM11 yn cydberthyn ag A2XX dros ystod o 1 nm i 100 nano.Oherwydd argaeledd cyfyngedig gwrthgyrff yn ystod yr arbrawf, cynhaliwyd arbrofion cyfyngedig gyda phob crynodiad oligosacarid.Dylid nodi yma bod rhai gwrthgyrff yn adweithio'n wahanol iawn i'r un oligosaccharid fel swbstrad, yn ôl pob tebyg oherwydd eu bod yn rhwymo i epitopau ychydig yn wahanol a gallant fod â chysylltiadau rhwymol gwahanol iawn.Bydd mecanweithiau a goblygiadau adnabod epitope yn gywir yn llawer mwy cymhleth pan fydd y dull mAb newydd yn cael ei gymhwyso i samplau go iawn.
Defnyddiwyd dau oligosacaridau masnachol i bennu ystod canfod gwahanol famau sy'n targedu glycan.Yma, mae cydberthynas llinol â chrynodiad log o grynodiad oligosacarid yn nodi patrymau arsugniad Langmuir ar gyfer (A) XHE gyda mAb a (B) A2XX â mAb.Mae'r epitopau cyfatebol yn nodi adeileddau'r oligosacaridau masnachol a ddefnyddir fel swbstradau yn yr assay.
Mae'r defnydd o wrthgyrff monoclonaidd wedi'u targedu gan glycan (dadansoddiad glycocomig neu sgrinio mAb yn seiliedig ar ELISA) yn arf pwerus ar gyfer nodweddu'r rhan fwyaf o'r prif glycanau cellfuriau sy'n ffurfio biomas planhigion yn fanwl.Fodd bynnag, mae dadansoddiad glycan clasurol yn nodweddu glycanau cellfur mwy yn unig, gan nad yw'r rhan fwyaf o oligosacaridau yn cael eu hansymudol yn effeithlon ar blatiau ELISA.Yn yr astudiaeth hon, cafodd stofwr ŷd wedi'i drin ymlaen llaw gan AFEX ei hydrolysu'n enzymatically ar gynnwys solidau uchel.Defnyddiwyd dadansoddiad siwgr i bennu cyfansoddiad carbohydradau cellfur ysbeidiol yn yr hydrolysad.Fodd bynnag, mae dadansoddiad mAb o oligosacaridau llai mewn hydrolysadau yn cael ei danamcangyfrif, ac mae angen offer ychwanegol i atal oligosaccharides rhag symud yn effeithiol ar blatiau ELISA.
Rydym yn adrodd yma am ddull atal symud oligosacarid newydd ac effeithlon ar gyfer sgrinio mAb trwy gyfuno biotinyleiddiad oligosaccharid ac yna sgrinio ELISA ar blatiau wedi'u gorchuddio â NeutrAvidin™.Roedd yr oligosacaridau biotinylated ansymudol yn dangos digon o affinedd i'r gwrthgorff i alluogi canfod oligosaccharidau anhydrin yn gyflym ac yn effeithlon.Cadarnhaodd dadansoddiad o gyfansoddiad yr oligosacaridau ystyfnig hyn yn seiliedig ar sbectrometreg màs ganlyniadau'r dull newydd hwn o sgrinio imiwno.Felly, mae'r astudiaethau hyn yn dangos y gellir defnyddio'r cyfuniad o fiotinyleiddiad oligosacarid a sgrinio ELISA â gwrthgyrff monoclonaidd wedi'u targedu gan glycan i ganfod croesgysylltiadau mewn oligosacaridau a gellir eu cymhwyso'n eang mewn astudiaethau biocemegol eraill sy'n nodweddu strwythur oligosacaridau.
Y dull proffilio glycan hwn sy'n seiliedig ar fiotin yw'r adroddiad cyntaf sy'n gallu ymchwilio i fondiau carbohydrad ysbeidiol oligosacaridau hydawdd mewn biomas planhigion.Mae hyn yn helpu i ddeall pam mae rhai rhannau o fio-màs mor ystyfnig o ran cynhyrchu biodanwydd.Mae'r dull hwn yn llenwi bwlch pwysig mewn dulliau dadansoddi glycome ac yn ymestyn ei gymhwysiad i ystod ehangach o swbstradau y tu hwnt i oligosacaridau planhigion.Yn y dyfodol, efallai y byddwn yn defnyddio roboteg ar gyfer biotinylation a defnyddio'r dull yr ydym wedi'i ddatblygu ar gyfer dadansoddiad trwybwn uchel o samplau gan ddefnyddio ELISA.
Cynaeafwyd gwellt ŷd (CS) a dyfwyd o hadau hybrid Pioneer 33A14 yn 2010 o Kramer Farms yn Ray, Colorado.Gyda chaniatâd perchennog y tir, gellir defnyddio'r biomas hwn ar gyfer ymchwil. Roedd y samplau'n cael eu storio'n sych <6% o leithder mewn bagiau clo sip ar dymheredd yr ystafell. Roedd y samplau'n cael eu storio'n sych <6% o leithder mewn bagiau clo sip ar dymheredd yr ystafell. Образцы хранились сухими при влажности < 6% yn y pecyn ac застежкой-молнией при комнатной темет. Roedd samplau'n cael eu storio'n sych ar <6% o leithder mewn bagiau â zipper ar dymheredd ystafell.样品在室温下以干燥<6%的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Mae samplau yn cael eu storio mewn bagiau zipper ar dymheredd ystafell gyda lleithder <6%.Roedd yr astudiaeth yn cydymffurfio â chanllawiau lleol a chenedlaethol.Perfformiwyd dadansoddiad cyfansoddiadol gan ddefnyddio protocol NREL.Canfuwyd bod y cyfansoddiad yn cynnwys 31.4% glwcan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protein a 13. 4% lludw.
Mae Cellic® CTec2 (138 mg o brotein/ml, lot VCNI 0001) yn gymysgedd cymhleth o cellwlas, β-glucosidase a Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) o Novozymes (Franklinton, NC, UDA)).Rhoddwyd Multifect Pectinase® (72 mg o brotein/mL), cyfuniad cymhleth o ensymau diraddiol pectin, gan DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, UDA).Pennwyd crynodiadau protein ensymau trwy amcangyfrif cynnwys protein (a thynnu cyfraniad nitrogen di-brotein) gan ddefnyddio dadansoddiad nitrogen Kjeldahl (dull AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, UDA).Prynwyd daear diatomaceous 545 gan EMD Millipore (Billerica, MA).Prynwyd carbon wedi'i actifadu (DARCO, 100 o ronynnau rhwyll), Avicel (PH-101), xylan ffawydd, a'r holl gemegau eraill gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Perfformiwyd rhag-driniaeth AFEX yn GLBRC (Labordy Ymchwil Trosi Biomas, MSU, Lansing, MI, UDA).Cynhaliwyd y rhag-driniaeth ar 140 ° C. am 15 munud.46 amser preswylio ar gymhareb 1:1 o amonia anhydrus i fiomas ar 60% (w/w) yn llwytho mewn adweithydd swp benchtop dur di-staen (Parr Instruments Company).Cymerodd 30 munud.Daethpwyd â'r adweithydd i 140 ° C a rhyddhawyd yr amonia yn gyflym, gan ganiatáu i'r biomas ddychwelyd yn gyflym i dymheredd ystafell.Roedd cyfansoddiad stofwr ŷd wedi'i drin ymlaen llaw AFEX (ACS) yn debyg i gyfansoddiad stofwr ŷd heb ei drin (UT-CS).
Paratowyd solidau uchel ACSH 25% (w/w) (tua 8% o lwytho dextran) fel deunydd cychwyn ar gyfer cynhyrchu oligosacaridau ar raddfa fawr.Perfformiwyd hydrolysis ensymatig o ACS gan ddefnyddio cymysgedd ensymau masnachol gan gynnwys Cellic® Ctec2 10 mg protein / g glwcan (mewn biomas wedi'i drin ymlaen llaw), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), protein 5 mg / glwcan g, a Multifect Pectinase (Genencor Inc, UDA).).), 5 mg o brotein/g dextran.Cynhaliwyd hydrolysis ensymatig mewn bio-adweithydd 5-litr gyda chyfaint gweithredol o 3 litr, pH 4.8, 50 ° C a 250 rpm.Ar ôl hydrolysis am 96 awr, casglwyd yr hydrolysad trwy allgyrchiad ar 6000 rpm am 30 munud ac yna ar 14000 rpm am 30 munud i gael gwared ar solidau heb eu hydroleiddio.Yna cafodd yr hydrolysad ei hidlo'n ddi-haint trwy ficer hidlo 0.22 mm.Roedd yr hydrolysad wedi'i hidlo yn cael ei storio mewn poteli di-haint ar 4 ° C. ac yna'n cael ei ffracsiynu ar garbon.
Dadansoddiad o gyfansoddiad samplau biomas yn seiliedig ar echdyniad yn unol â gweithdrefnau dadansoddi labordy NREL: paratoi samplau ar gyfer dadansoddi cyfansoddiad (NREL/TP-510-42620) a phennu carbohydradau adeileddol a lignin mewn biomas (NREL/TP-510 – 42618)47.
Perfformiwyd dadansoddiad oligosacarid o'r ffrwd hydrolysad ar raddfa 2 ml gan ddefnyddio dull hydrolysis asid seiliedig ar awtoclaf.Cymysgwch y sampl hydrolysad gyda 69.7 µl o asid sylffwrig 72% mewn tiwb meithrin cap sgriw 10 ml a'i ddeor am 1 awr ar ben mainc ar 121 °C, oeri ar rew a'i hidlo i ffiol cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC).Pennwyd crynodiad oligosacaridau trwy dynnu'r crynodiad o monosacaridau yn y sampl nad yw'n hydrolyzed o gyfanswm crynodiad y siwgr yn y sampl asid-hydrolyzed.
Dadansoddwyd crynodiadau glwcos, xylose, ac arabinose yn y biomas wedi'i hydroleiddio asid gan ddefnyddio system Shimadzu HPLC wedi'i gyfarparu â autosampler, gwresogydd colofn, pwmp isocratig, a synhwyrydd mynegrif plygiannol ar golofn Bio-Rad Aminex HPX-87H.Roedd y golofn yn cael ei chynnal ar 50 ° C a'i hoelio â 0.6 ml/munud 5 mM H2SO4 mewn dŵr.llif.
Cafodd yr uwchnatant hydrolysad ei wanhau a'i ddadansoddi ar gyfer cynnwys monomer ac oligosacarid.Dadansoddwyd siwgrau monomerig a gafwyd ar ôl hydrolysis enzymatig gan HPLC gyda cholofn Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a cholofn gard lludw.Cynhaliwyd tymheredd y golofn ar 80 ° C, defnyddiwyd dŵr fel y cyfnod symudol gyda chyfradd llif o 0.6 ml / min.Pennwyd oligosacaridau trwy hydrolysis mewn asid gwanedig ar 121 ° C yn unol â'r dulliau a ddisgrifir yn cyf.41, 48, 49.
Perfformiwyd dadansoddiad saccharid ar weddillion biomas amrwd, AFEX wedi'u trin ymlaen llaw a'r holl weddillion biomas nad ydynt wedi'u hydroleiddio (gan gynnwys cynhyrchu echdynion cellfuriau cyfresol a'u sgrinio mAb) gan ddefnyddio gweithdrefnau a ddisgrifiwyd yn flaenorol 27, 43, 50, 51 .Ar gyfer dadansoddiad glycom, mae gweddillion deunydd cellfur planhigion sy'n anhydawdd ag alcohol yn cael eu paratoi o weddillion biomas ac yn destun echdynnu cyfresol gydag adweithyddion cynyddol ymosodol fel amoniwm oxalate (50 mM), sodiwm carbonad (50 mM a 0.5% w / v), CON.(1M a 4M, y ddau gyda 1% w/v sodiwm borohydride) a chlorit asid fel y disgrifiwyd yn flaenorol52,53.Yna rhoddwyd ELISA ar y darnau yn erbyn panel cymhleth o mAb50s a gyfeiriwyd at glycan y cellfur, a chyflwynwyd adweithiau rhwymo'r mAb fel map gwres.Prynwyd mAbs yn targedu glycan cellfur planhigion o stociau labordy (cyfres CCRC, JIM a MAC).
Biotinylation un cam o oligosacaridau.Perfformiwyd y cyfuniad o garbohydradau â biotin-LC-hydrazide gan ddefnyddio'r weithdrefn ganlynol.Diddymwyd biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) mewn dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) trwy ei droi a'i gynhesu'n egnïol ar 65 ° C. am 1 munud.Ychwanegwyd asid asetig rhewlifol (30 µl) a thywalltwyd y cymysgedd ar sodiwm cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) a'i doddi'n llwyr ar ôl gwresogi ar 65 ° C. am tua 1 munud.Yna, ychwanegwyd o 5 i 8 μl o'r cymysgedd adwaith at yr oligosaccharid sych (1-100 nmol) i gael gormodedd molar 10 gwaith neu fwy o'r label dros y pen lleihäwr.Cynhaliwyd yr adwaith ar 65 ° C am 2 h, ac ar ôl hynny cafodd y samplau eu puro ar unwaith.Ni ddefnyddiwyd unrhyw sodiwm cyanoborohydride yn yr arbrofion labelu heb ostyngiad, ac adweithiwyd y samplau ar 65 ° C. am 2.5 awr.
ELISA cotio a golchi samplau o oligosacaridau biotinylated.Ychwanegwyd 25 μl o samplau biotinylated (100 μl o bob sampl crynodedig wedi'i wanhau mewn 5 ml o hydoddiant byffer Tris 0.1 M (TBS)) at bob ffynnon o'r plât wedi'i orchuddio ag avidin.Roedd ffynhonnau rheoli wedi'u gorchuddio â 50 μl o fiotin mewn crynodiad o 10 μg/ml mewn 0.1 M TBS.Defnyddiwyd dŵr deionized fel gorchudd ar gyfer mesuriadau gwag.Deorwyd y dabled am 2 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch.Golchwch y plât 3 gwaith gyda 0.1% o laeth sgim mewn 0.1 M TBS gan ddefnyddio rhaglen rhif.11 ar gyfer fflat Grenier 3A.
Ychwanegu a golchi gwrthgyrff cynradd.Ychwanegwch 40 µl o wrthgorff cynradd i bob ffynnon.Deorwch y microplate am 1 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch.Yna golchwyd y platiau 3 gwaith gyda 0.1% o laeth mewn 0.1M TBS gan ddefnyddio rhaglen olchi #11 ar gyfer Grenier Flat 3A.
Ychwanegu gwrthgorff eilaidd a golchi.Ychwanegu 50 µl o wrthgorff eilaidd llygoden/llygoden fawr (wedi'i wanhau 1:5000 mewn 0.1% llaeth mewn 0.1 M TBS) at bob ffynnon.Deorwch y microplate am 1 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch.Yna golchwyd y microblatiau 5 gwaith gyda 0.1% o laeth mewn 0.1 M TBS gan ddefnyddio rhaglen golchi platiau Grenier Flat 5A #12.
Ychwanegu swbstrad.Ychwanegu 50 µl o 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) i'r swbstrad sylfaen (trwy ychwanegu 2 ddiferyn o glustogfa, 3 diferyn o TMB, 2 ddiferyn o hydrogen perocsid i 15 ml o ddŵr wedi'i ddadïoneiddio).Paratowch y swbstrad TMB.a fortecs cyn ei ddefnyddio).Deorwch y microplate ar dymheredd ystafell am 30 munud.Yn y tywyllwch.
Cwblhewch y cam a darllenwch y dabled.Ychwanegwch 50 µl o 1 N asid sylffwrig at bob ffynnon a chofnodwch yr amsugnedd o 450 i 655 nm gan ddefnyddio darllenydd ELISA.
Paratowch hydoddiannau 1 mg/ml o'r dadansoddiadau hyn mewn dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio: arabinose, rhamnose, ffwcose, xylose, asid galacturonig (GalA), asid glucuronic (GlcA), mannose, glwcos, galactos, lactos, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (safon fewnol).Paratowyd dwy safon trwy ychwanegu'r hydoddiannau siwgr 1 mg/ml a ddangosir yn Nhabl 1. Mae samplau'n cael eu rhewi a'u lyoffileiddio ar -80 ° C. nes bod yr holl ddŵr yn cael ei dynnu (tua 12-18 awr fel arfer).
Ychwanegu 100–500 µg o sampl i diwbiau cap sgriw ar gydbwysedd dadansoddol.Cofnodwch y swm a ychwanegwyd.Y peth gorau yw hydoddi'r sampl mewn crynodiad penodol o doddydd a'i ychwanegu at y tiwb fel aliquot hylif.Defnyddiwch 20 µl o inositol 1 mg/ml fel safon fewnol ar gyfer pob tiwb sampl.Rhaid i faint o safon fewnol a ychwanegir at y sampl fod yr un fath â faint o safon fewnol a ychwanegir at y tiwb safonol.
Ychwanegu 8 ml o fethanol anhydrus i ffiol cap sgriw.Yna 4 ml o hydoddiant HCl methanolig 3 N, wedi'i gapio a'i ysgwyd.Nid yw'r broses hon yn defnyddio dŵr.
Ychwanegu 500 µl o hydoddiant methanol 1 M HCl at y samplau oligosacarid a thiwbiau TMS safonol.Deorwyd samplau dros nos (168 awr) ar 80 ° C. mewn bloc thermol.Sychwch y cynnyrch methanolysis ar dymheredd ystafell gan ddefnyddio manifold sychu.Ychwanegu 200 µl MeOH a sychu eto.Mae'r broses hon yn cael ei hailadrodd ddwywaith.Ychwanegu 200 µl o fethanol, 100 µl o pyridin a 100 µl o anhydrid asetig at y sampl a chymysgu'n dda.Deorwyd samplau ar dymheredd ystafell am 30 munud.a sychu.Ychwanegu 200 µl o fethanol a'i sychu eto.
Ychwanegwch 200 µl o Tri-Sil a chynheswch y tiwb wedi'i gapio am 20 munud.80 ° C, yna oeri i dymheredd ystafell.Defnyddiwch fanifold sychu i sychu'r sampl ymhellach i gyfaint o tua 50 µl.Mae'n bwysig nodi na wnaethom ganiatáu i'r samplau sychu'n llwyr.
Ychwanegu 2 ml o hecsan a'i gymysgu'n dda trwy vortexing.Llenwch flaenau pibedau Pasteur (5-8 mm) gyda darn o wlân gwydr trwy fewnosod y gwlân gwydr ar ben pibed diamedr 5-3/4 modfedd.Cafodd samplau eu centrifugio ar 3000 g am 2 funud.Mae unrhyw weddillion anhydawdd yn cael eu gwaddodi.Sychwch y sampl i 100-150 µl.Chwistrellwyd cyfaint o tua 1 μl i'r GC-MS ar dymheredd cychwynnol o 80 °C ac amser cychwynnol o 2.0 munud (Tabl 2).