Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn rendro'r wefan heb arddulliau a JavaScript.
Dulliau imiwnolegol a sbectrometrig màs newydd ar gyfer dadansoddi cymhleth oligosacaridau parhaus mewn corn wedi'i rag-drin ag AFEX. Mae biomas lignocellulosig yn ddewis arall cynaliadwy yn lle tanwydd ffosil ac fe'i defnyddir yn helaeth i ddatblygu biotechnolegau ar gyfer cynhyrchu cynhyrchion fel bwyd, porthiant, tanwyddau a chemegau. Yr allwedd i'r technolegau hyn yw datblygu prosesau cost-gystadleuol ar gyfer trosi carbohydradau cymhleth sydd i'w cael mewn waliau celloedd planhigion yn siwgrau syml fel glwcos, xylos ac arabinose. Gan fod biomas lignocellulosig yn ystyfnig iawn, rhaid ei destun triniaethau thermocemegol (e.e., plicio ffibr amonia (AFEX), asidau gwanedig (DA), hylifau ïonig (IL)) a thriniaethau biolegol (e.e., hydrolysis ensymatig ac eplesu microbaidd) ar y cyd i gael y cynnyrch a ddymunir. . Fodd bynnag, pan ddefnyddir ensymau ffwngaidd masnachol yn y broses hydrolysis, dim ond 75-85% o'r siwgrau hydawdd a ffurfir yw monosacaridau, a'r 15-25% sy'n weddill yw oligosacaridau hydawdd, anorchfygol, nad ydynt bob amser ar gael i ficro-organebau. Yn flaenorol, rydym wedi llwyddo i ynysu a phuro oligosacaridau ystyfnig hydawdd gan ddefnyddio cyfuniad o gromatograffaeth wahanu carbon a phridd diatomaceous a chromatograffaeth eithrio maint, ac wedi ymchwilio hefyd i'w priodweddau ataliol ensymau. Rydym wedi canfod bod oligosacaridau sy'n cynnwys amnewidiadau asid wronig methyledig gradd uwch o bolymerization (DP) yn anoddach i'w prosesu gyda chymysgeddau ensymau masnachol nag oligosacaridau DP isel a niwtral. Yma rydym yn adrodd ar y defnydd o sawl dull ychwanegol, gan gynnwys proffilio glycan gan ddefnyddio gwrthgyrff monoclonal (mAbs) sy'n benodol i glycanau biomas planhigion i nodweddu bondiau glycan mewn waliau celloedd planhigion a hydrolysadau ensymatig, ïoneiddio dadsugno laser â chymorth matrics, sbectrometreg màs amser-hedfan. . Mae MALDI-TOF-MS) yn defnyddio copaon diagnostig sy'n gwybod am strwythur a geir trwy sbectrosgopeg ar ôl pydredd eilaidd ïonau negatif, cromatograffaeth nwy a sbectrometreg màs (GC-MS) i nodweddu bondiau oligosacarid gyda a heb ddeilliad. Oherwydd maint bach oligosacaridau (DP 4–20), mae'r moleciwlau hyn yn anodd eu defnyddio ar gyfer rhwymo a nodweddu mAb. I oresgyn y broblem hon, fe wnaethom gymhwyso dull immobileiddio oligosacaridau newydd yn seiliedig ar gyfuniad biotin a labelodd y rhan fwyaf o'r oligosacaridau hydawdd DP isel ar wyneb y microplât yn llwyddiannus, a ddefnyddiwyd wedyn mewn system mAb trwybwn uchel ar gyfer dadansoddiad clymu penodol. Bydd y dull newydd hwn yn hwyluso datblygiad asesiadau glycome trwybwn uchel mwy datblygedig yn y dyfodol y gellir eu defnyddio i ynysu a nodweddu oligosacaridau sy'n bresennol mewn biomarcwyr at ddibenion diagnostig.
Mae biomas lignocellwlosig, sy'n cynnwys deunyddiau amaethyddol, coedwigaeth, glaswellt a phrennaidd, yn ddeunydd crai posibl ar gyfer cynhyrchu cynhyrchion bio-seiliedig, gan gynnwys bwyd, porthiant, tanwydd a rhagflaenwyr cemegol i gynhyrchu cynhyrchion gwerth uwch1. Mae carbohydradau (megis cellwlos a hemicellulose) sy'n bresennol mewn waliau celloedd planhigion yn cael eu dadpolymeru'n monosacaridau trwy brosesu cemegol a biodrawsnewid (megis hydrolysis ensymatig ac eplesu microbaidd). Mae rhag-driniaethau cyffredin yn cynnwys ehangu ffibr amonia (AFEX), asid gwanedig (DA), hylif ïonig (IL), a ffrwydrad stêm (SE), sy'n defnyddio cyfuniad o gemegau a gwres i leihau cynhyrchiad lignocellwlos trwy agor waliau celloedd planhigion3,4. ystyfnigrwydd mater, 5. Cynhelir hydrolysis ensymatig ar lwyth solidau uchel gan ddefnyddio ensymau masnachol sy'n cynnwys carbohydradau gweithredol (CAZymes) ac eplesu microbaidd gan ddefnyddio burumau neu facteria trawsgenig i gynhyrchu tanwyddau a chemegau bio-seiliedig6.
Mae ensymau CAZymau mewn ensymau masnachol yn cynnwys cymysgedd cymhleth o ensymau sy'n hollti bondiau cymhleth carbohydrad-siwgr yn synergaidd i ffurfio monosacaridau2,7. Fel y gwnaethom adrodd yn gynharach, mae'r rhwydwaith cymhleth o bolymerau aromatig lignin gyda charbohydradau yn eu gwneud yn anodd iawn eu trin, sy'n arwain at drosi siwgr anghyflawn, gan gronni 15-25% o oligosacaridau rhyw nad ydynt yn cael eu cynhyrchu yn ystod hydrolysis ensymatig y biomas wedi'i drin ymlaen llaw. Mae hon yn broblem gyffredin gyda gwahanol ddulliau rhag-drin biomas. Mae rhai rhesymau dros y tagfeydd hyn yn cynnwys atal ensymau yn ystod hydrolysis, neu absenoldeb neu lefelau isel o ensymau hanfodol hanfodol sydd eu hangen i dorri bondiau siwgr mewn biomas planhigion. Bydd deall cyfansoddiad a nodweddion strwythurol siwgrau, fel y bondiau siwgr mewn oligosacaridau, yn ein helpu i wella trosi siwgr yn ystod hydrolysis, gan wneud prosesau biotechnolegol yn gystadleuol o ran cost gyda chynhyrchion sy'n deillio o betroliwm.
Mae pennu strwythur carbohydradau yn heriol ac mae angen cyfuniad o ddulliau megis cromatograffaeth hylif (LC)11,12, sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR)13, electrofforesis capilarïaidd (CE)14,15,16 a sbectrometreg màs (MS)17. ,deunaw. Mae dulliau MS megis sbectrometreg màs amser-hedfan gyda dad-amsugno laser ac ïoneiddio gan ddefnyddio matrics (MALDI-TOF-MS) yn ddull amlbwrpas ar gyfer nodi strwythurau carbohydrad. Yn ddiweddar, defnyddiwyd MS tandem Daduniad a Achosir gan Wrthdrawiad (CID) o adductau ïon sodiwm yn fwyaf eang i nodi olion bysedd sy'n cyfateb i safleoedd atodi oligosacarid, cyfluniadau anomerig, dilyniannau, a safleoedd canghennu 20, 21.
Mae dadansoddi glycan yn offeryn rhagorol ar gyfer adnabod bondiau carbohydrad yn fanwl22. Mae'r dull hwn yn defnyddio gwrthgyrff monoclonal (mAbs) wedi'u cyfeirio at glycan wal celloedd planhigion fel chwiliedyddion i ddeall cysylltiadau carbohydrad cymhleth. Mae mwy na 250 o mAbs ar gael ledled y byd, wedi'u cynllunio yn erbyn amrywiol oligosacaridau llinol a changhennog gan ddefnyddio amrywiol sacaridau24. Defnyddiwyd sawl mAb yn helaeth i nodweddu strwythur, cyfansoddiad ac addasiadau wal celloedd planhigion, gan fod gwahaniaethau sylweddol yn dibynnu ar fath celloedd planhigion, organ, oedran, cam datblygu ac amgylchedd twf25,26. Yn fwy diweddar, defnyddiwyd y dull hwn i ddeall poblogaethau fesigl mewn systemau planhigion ac anifeiliaid a'u rolau priodol mewn cludo glycan fel y'u pennir gan farcwyr isgellog, camau datblygu neu ysgogiadau amgylcheddol, ac i bennu gweithgaredd ensymatig. Mae rhai o'r gwahanol strwythurau glycanau a xylanau sydd wedi'u hadnabod yn cynnwys pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucanau (XylG), glwcanau bond cymysg (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), asid glwcuronig-arabinoxylan (GArbX) ac arabino-galactan (ArbG)29.
Fodd bynnag, er gwaethaf yr holl ymdrechion ymchwil hyn, dim ond ychydig o astudiaethau sydd wedi canolbwyntio ar natur cronni oligosacaridau yn ystod hydrolysis llwyth solidau uchel (HSL), gan gynnwys rhyddhau oligosacaridau, newidiadau hyd cadwyn oligomerig yn ystod hydrolysis, amrywiol bolymerau DP isel, a'u cromliniau. dosraniadau 30,31,32. Yn y cyfamser, er bod dadansoddiad glycan wedi profi i fod yn offeryn defnyddiol ar gyfer dadansoddiad cynhwysfawr o strwythur glycan, mae'n anodd gwerthuso oligosacaridau DP isel hydawdd mewn dŵr gan ddefnyddio dulliau gwrthgyrff. Nid yw oligosacaridau DP llai gyda phwysau moleciwlaidd o lai na 5-10 kDa yn rhwymo i blatiau ELISA 33, 34 ac maent yn cael eu golchi i ffwrdd cyn ychwanegu gwrthgyrff.
Yma, am y tro cyntaf, rydym yn dangos assay ELISA ar blatiau wedi'u gorchuddio ag avidin gan ddefnyddio gwrthgyrff monoclonal, gan gyfuno gweithdrefn biotinylation un cam ar gyfer oligosacaridau anhydrin hydawdd â dadansoddiad glycome. Dilyswyd ein dull o ddadansoddi glycome gan ddadansoddiad yn seiliedig ar MALDI-TOF-MS a GC-MS o gysylltiadau oligosacarid cyflenwol gan ddefnyddio deilliad trimethylsilyl (TMS) o gyfansoddiadau siwgr wedi'u hydrolysu. Gellir datblygu'r dull arloesol hwn fel dull trwybwn uchel yn y dyfodol a dod o hyd i gymhwysiad ehangach mewn ymchwil biofeddygol35.
Mae addasiadau ôl-gyfieithiadol o ensymau ac gwrthgyrff, fel glycosylation,36 yn effeithio ar eu gweithgaredd biolegol. Er enghraifft, mae newidiadau mewn glycosylation proteinau serwm yn chwarae rhan bwysig mewn arthritis llidiol, a defnyddir newidiadau mewn glycosylation fel marcwyr diagnostig37. Mae amryw o glycanau wedi'u hadrodd yn y llenyddiaeth i ymddangos yn rhwydd mewn amrywiaeth o afiechydon, gan gynnwys afiechydon llidiol cronig y llwybr gastroberfeddol a'r afu, heintiau firaol, canserau'r ofari, y fron a'r prostad38,39,40. Bydd deall strwythur glycanau gan ddefnyddio dulliau ELISA glycan sy'n seiliedig ar wrthgyrff yn rhoi hyder ychwanegol mewn diagnosis o afiechydon heb ddefnyddio dulliau MS cymhleth.
Dangosodd ein hastudiaeth flaenorol fod oligosacaridau ystyfnig yn parhau i fod heb eu hydrolysu ar ôl triniaeth ymlaen llaw a hydrolysis ensymatig (Ffigur 1). Yn ein gwaith a gyhoeddwyd yn flaenorol, fe wnaethom ddatblygu dull echdynnu cyfnod solet siarcol wedi'i actifadu i ynysu oligosacaridau o hydrolysad stocer corn wedi'i drin ymlaen llaw ag AFEX (ACSH)8. Ar ôl echdynnu a gwahanu cychwynnol, cafodd yr oligosacaridau eu ffracsiynu ymhellach trwy gromatograffaeth eithrio maint (SEC) a'u casglu yn nhrefn pwysau moleciwlaidd. Dadansoddwyd monomerau ac oligomerau siwgr a ryddhawyd o wahanol driniaethau ymlaen llaw trwy ddadansoddi cyfansoddiad siwgr. Wrth gymharu cynnwys oligomerau siwgr a gafwyd trwy wahanol ddulliau triniaeth ymlaen llaw, mae presenoldeb oligosacaridau ystyfnig yn broblem gyffredin wrth drosi biomas yn monosacaridau a gall arwain at ostyngiad mewn cynnyrch siwgr o leiaf 10-15% a hyd yn oed hyd at 18%. Defnyddir y dull hwn ar gyfer cynhyrchu ymhellach ar raddfa fawr o ffracsiynau oligosacarid. Defnyddiwyd yr ACH canlyniadol a'i ffracsiynau dilynol â phwysau moleciwlaidd gwahanol fel deunydd arbrofol ar gyfer nodweddu oligosacaridau yn y gwaith hwn.
Ar ôl triniaeth ymlaen llaw a hydrolysis ensymatig, arhosodd oligosacaridau parhaus heb eu hydrolysu. Yma (A) mae dull gwahanu oligosacaridau lle mae oligosacaridau'n cael eu hynysu o hydrolysad corn stover wedi'i drin ymlaen llaw ag AFEX (ACSH) gan ddefnyddio gwely wedi'i bacio o garbon wedi'i actifadu a phridd diatomaceous; (B) Dull ar gyfer gwahanu oligosacaridau. Gwahanwyd yr oligosacaridau ymhellach trwy gromatograffaeth eithrio maint (SEC); (C) Monomerau ac oligomerau sacarid a ryddhawyd o wahanol driniaethau ymlaen llaw (asid gwanedig: DA, hylif ïonig: IL ac AFEX). Amodau hydrolysis ensymatig: llwyth solidau uchel o 25% (w/w) (llwyth glwcan tua 8%), hydrolysis 96 awr, llwyth ensym masnachol 20 mg/g (cymhareb Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) Monomerau ac oligomerau siwgr o glwcos, xylos ac arabinose a ryddhawyd o corn stover wedi'i drin ymlaen llaw ag AFEX (ACS).
Mae dadansoddiad glycan wedi profi i fod yn offeryn defnyddiol ar gyfer dadansoddiad strwythurol cynhwysfawr o glycanau mewn dyfyniad a ynyswyd o weddillion biomas solet. Fodd bynnag, mae saccharidau hydawdd mewn dŵr yn cael eu tangynrychioli gan ddefnyddio'r dull traddodiadol hwn41 oherwydd bod oligosacaridau pwysau moleciwlaidd isel yn anodd eu sefydlogi ar blatiau ELISA ac maent yn cael eu golchi allan cyn ychwanegu gwrthgyrff. Felly, ar gyfer rhwymo a nodweddu gwrthgyrff, defnyddiwyd dull biotinylation un cam i orchuddio oligosacaridau hydawdd, anghydffurfiol ar blatiau ELISA wedi'u gorchuddio ag avidin. Profwyd y dull hwn gan ddefnyddio ein ACSH a gynhyrchwyd yn flaenorol a ffracsiwn yn seiliedig ar ei bwysau moleciwlaidd (neu radd polymerization, DP). Defnyddiwyd biotinylation un cam i gynyddu affinedd rhwymo oligosacarid trwy ychwanegu biotin-LC-hydrasid at ben lleihau'r carbohydrad (Ffig. 2). Mewn toddiant, mae'r grŵp hemiacetal ar y pen lleihau yn adweithio â grŵp hydrasid biotin-LC-hydrasid i ffurfio bond hydrazone. Ym mhresenoldeb yr asiant lleihau NaCNBH3, mae'r bond hydrazone yn cael ei leihau i gynnyrch terfynol biotinylated sefydlog. Gyda newid y pen lleihau siwgr, daeth rhwymo oligosacaridau DP isel i blatiau ELISA yn bosibl, ac yn ein hastudiaeth ni gwnaed hyn ar blatiau wedi'u gorchuddio ag avidin gan ddefnyddio mAbs wedi'u targedu at glycan.
Sgrinio gwrthgyrff monoclonaidd yn seiliedig ar ELISA ar gyfer oligosacaridau biotinyleiddiedig. Yma (A) cyfuniad o biotinyleiddiad oligosacaridau a sgrinio ELISA dilynol gydag mAbs wedi'u targedu gan glycan ar blatiau wedi'u gorchuddio â NeutrAvidin a (B) yn dangos gweithdrefn un cam ar gyfer biotinyleiddiad cynhyrchion adwaith.
Yna ychwanegwyd platiau wedi'u gorchuddio ag avidin gydag gwrthgyrff cysylltiedig ag oligosacarid at wrthgyrff cynradd ac eilaidd a'u golchi mewn cyfrwng sy'n sensitif i olau ac amser. Ar ôl i'r rhwymo gwrthgyrff gael ei gwblhau, ychwanegwch swbstrad TMB i ddeori'r plât. Stopiwyd yr adwaith yn y pen draw gydag asid sylffwrig. Dadansoddwyd y platiau wedi'u deori gan ddefnyddio darllenydd ELISA i bennu cryfder rhwymo pob gwrthgorff i ganfod croesgysylltu gwrthgyrff-benodol. Am fanylion a pharamedrau'r arbrawf, gweler yr adran gyfatebol "Deunyddiau a Dulliau".
Rydym yn dangos defnyddioldeb y dull newydd hwn ar gyfer cymwysiadau penodol trwy nodweddu'r oligosacaridau hydawdd sy'n bresennol yn ACSH yn ogystal ag mewn ffracsiynau oligosacarid crai a phuredig a ynyswyd o hydrolysadau lignocellwlosig. Fel y dangosir yn Ffigur 3, y xylanau epitop-amnewidiol mwyaf cyffredin a nodwyd yn ACSH gan ddefnyddio dulliau assay glycome bioasylated fel arfer yw arabinogalactanau wronig (U) neu fethylwronig (MeU) a phectig. Canfuwyd y rhan fwyaf ohonynt hefyd yn ein hastudiaeth flaenorol ar ddadansoddi glycanau solidau heb eu hydrolysu (UHS)43.
Canfod epitopau oligosacarid ystyfnig gan ddefnyddio gwrthgorff monoclonal wedi'i gyfeirio at glycan wal y gell. Y ffracsiwn "niwtral" yw'r ffracsiwn ACN a'r ffracsiwn "asidig" yw'r ffracsiwn FA. Mae cochion mwy disglair ar y map gwres yn dynodi cynnwys epitop uwch, ac mae glasion mwy disglair yn dynodi cefndir gwag. Mae gwerthoedd lliw ar y raddfa yn seiliedig ar werthoedd OD crai ar gyfer fformwleiddiadau N=2. Dangosir y prif epitopau a adnabyddir gan yr gwrthgyrff ar y dde.
Ni ellid hollti'r strwythurau di-selwlos hyn gan y seliwlasau a'r hemiceliwlasau mwyaf cyffredin yn y cymysgedd ensymau masnachol a brofwyd, sy'n cynnwys yr ensymau masnachol a ddefnyddir amlaf. Felly, mae angen ensymau ategol newydd ar gyfer eu hydrolysis. Heb yr ensymau ategol di-selwlos angenrheidiol, mae'r bondiau di-selwlos hyn yn atal trosi'n llwyr i monosacaridau, hyd yn oed os yw eu polymerau siwgr gwreiddiol yn cael eu hydrolysu'n helaeth yn ddarnau byrrach a'u diddymu gan ddefnyddio cymysgeddau ensymau masnachol.
Dangosodd astudiaeth bellach o ddosbarthiad signal a'i gryfder rhwymo fod epitopau rhwymo yn is mewn ffracsiynau siwgr DP uchel (A, B, C, DP hyd at 20+) nag mewn ffracsiynau DP isel (D, E, F, DP) mewn dimerau) (Ffig. 1). Mae darnau asid yn fwy cyffredin mewn epitopau nad ydynt yn seliwlos na darnau niwtral. Mae'r ffenomenau hyn yn gyson â'r patrwm a welwyd yn ein hastudiaeth flaenorol, lle'r oedd DP uchel a rhannau asid yn fwy gwrthsefyll hydrolysis ensymatig. Felly, gall presenoldeb epitopau glycan nad ydynt yn seliwlos ac amnewidiadau U a MeU gyfrannu'n fawr at sefydlogrwydd yr oligosacaridau. Dylid nodi y gall effeithlonrwydd rhwymo a chanfod fod yn broblemus ar gyfer oligosacaridau DP isel, yn enwedig os yw'r epitop yn oligosacarid dimerig neu drimerig. Gellir profi hyn gan ddefnyddio oligosacaridau masnachol o wahanol hydau, pob un yn cynnwys un epitop yn unig sy'n rhwymo i mAb penodol.
Felly, datgelodd y defnydd o wrthgyrff penodol i strwythur rai mathau o fondiau ystyfnig. Yn dibynnu ar y math o wrthgorff a ddefnyddir, y patrwm clymu priodol, a chryfder y signal y mae'n ei gynhyrchu (y mwyaf a'r lleiaf niferus), gellir nodi ensymau newydd a'u hychwanegu'n lled-feintiol at y cymysgedd ensymau ar gyfer glyco-drosi mwy cyflawn. Gan gymryd dadansoddiad o oligosacaridau ACSH fel enghraifft, gallwn greu cronfa ddata o fondiau glycan ar gyfer pob deunydd biomas. Dylid nodi yma y dylid ystyried gwahanol affinedd gwrthgyrff, ac os nad yw eu affinedd yn hysbys, bydd hyn yn creu rhai anawsterau wrth gymharu signalau gwahanol wrthgyrff. Yn ogystal, efallai y bydd cymharu bondiau glycan yn gweithio orau rhwng samplau ar gyfer yr un gwrthgorff. Yna gellir cysylltu'r bondiau ystyfnig hyn â chronfa ddata CAZyme, lle gallwn nodi ensymau, dewis ensymau ymgeisydd a phrofi am ensymau sy'n torri bondiau, neu ddatblygu systemau microbaidd i fynegi'r ensymau hyn i'w defnyddio mewn bioburfeydd44.
Er mwyn gwerthuso sut mae dulliau imiwnolegol yn ategu dulliau amgen ar gyfer nodweddu oligosacaridau pwysau moleciwlaidd isel sy'n bresennol mewn hydrolysadau lignocellwlosig, fe wnaethom gynnal MALDI (Ffig. 4, S1-S8) a dadansoddiad o sacaridau sy'n deillio o TMS yn seiliedig ar GC-MS ar yr un panel (Ffig. 5) rhan oligosacarid. Defnyddir MALDI i gymharu a yw dosbarthiad màs moleciwlau oligosacarid yn cyd-fynd â'r strwythur a fwriadwyd. Ar Ffig. 4 dangosir MC y cydrannau niwtral ACN-A ac ACN-B. Cadarnhaodd dadansoddiad ACN-A ystod o siwgrau pentos yn amrywio o DP 4–8 (Ffig. 4) i DP 22 (Ffig. S1), y mae eu pwysau'n cyfateb i oligosacaridau MeU-xylan. Cadarnhaodd dadansoddiad ACN-B y gyfres pentos a glwcocsylan gyda DP 8-15. Mewn deunydd atodol fel Ffigur S3, mae mapiau dosbarthiad màs rhan asidig FA-C yn dangos ystod o siwgrau pentos wedi'u hamnewid â (Me)U gyda DP o 8-15 sy'n gyson â'r xylans wedi'u hamnewid a geir mewn sgrinio mAb yn seiliedig ar ELISA. Mae'r epitopau'n gyson.
Sbectrwm MALDI-MS o oligosacaridau hydawdd, anghydffurfiol sy'n bresennol yn ACS. Yma, (A) mae ffracsiynau pwysau isel ACN-A sy'n cynnwys asid wronig methyledig (DP 4-8) wedi amnewid oligosacaridau glwcuroxylan a (B) mae xylan ACN-B ac oligosacaridau asid wronig methyledig wedi'u amnewid â glwcuroxylan (DP 8-15).
Dadansoddiad o gyfansoddiad gweddillion glycan oligosacaridau anhydrin. Yma (A) Cyfansoddiad saccharid TMS o wahanol ffracsiynau oligosacarid a gafwyd gan ddefnyddio dadansoddiad GC-MS. (B) Strwythurau gwahanol siwgrau sy'n deillio o TMS sy'n bresennol mewn oligosacaridau. ACN – ffracsiwn asetonitril sy'n cynnwys oligosacaridau niwtral ac FA – ffracsiwn asid fferwlig sy'n cynnwys oligosacaridau asid.
Daethpwyd i gasgliad diddorol arall o'r dadansoddiad LC-MS o'r ffracsiwn oligosacarid, fel y dangosir yn Ffigur S9 (gellir gweld dulliau yn y deunydd atodol electronig). Gwelwyd darnau o grwpiau hecsos ac -OAc dro ar ôl tro yn ystod clymu'r ffracsiwn ACN-B. Nid yn unig y mae'r canfyddiad hwn yn cadarnhau'r darniad a welwyd mewn dadansoddiad glycome a MALDI-TOF, ond mae hefyd yn darparu gwybodaeth newydd am ddeilliadau carbohydrad posibl mewn biomas lignocellwlosig wedi'i drin ymlaen llaw.
Fe wnaethom hefyd ddadansoddi cyfansoddiad siwgr y ffracsiwn oligosacarid gan ddefnyddio deilliad siwgr TMS. Gan ddefnyddio GC-MS, fe wnaethom bennu cyfansoddiad siwgrau niwral (heb fod yn ddeilliadol) ac asidig (GluA a GalA) yn y ffracsiwn oligosacarid (Ffig. 5). Mae asid glwcuronig i'w gael yn y cydrannau asidig C a D, tra bod asid galacturonig i'w gael yn y cydrannau asidig A a B, sydd ill dau yn gydrannau DP uchel o siwgrau asidig. Mae'r canlyniadau hyn nid yn unig yn cadarnhau ein data ELISA a MALDI, ond maent hefyd yn gyson â'n hastudiaethau blaenorol o gronni oligosacaridau. Felly, credwn fod dulliau imiwnolegol modern gan ddefnyddio biotinylation oligosacaridau a sgrinio ELISA dilynol yn ddigonol i ganfod oligosacaridau hydawdd ystyfnig mewn amrywiol samplau biolegol.
Gan fod dulliau sgrinio mAb sy'n seiliedig ar ELISA wedi'u dilysu gan sawl dull gwahanol, roeddem am archwilio potensial y dull meintiol newydd hwn ymhellach. Prynwyd a phrofwyd dau oligosacarid masnachol, sef oligosacarid xylohexasacarid (XHE) a 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), gan ddefnyddio dull mAb newydd sy'n targedu'r glycan wal gell. Mae Ffigur 6 yn dangos cydberthynas llinol rhwng y signal rhwymo biotinylated a chrynodiad log crynodiad oligosacarid, gan awgrymu model amsugno Langmuir posibl. Ymhlith yr mAbs, roedd CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, a CCRC-M151 yn cydberthyn ag XHE, ac roedd CCRC-M108, CCRC-M109, ac LM11 yn cydberthyn ag A2XX dros ystod o 1 nm i 100 nano. Oherwydd argaeledd cyfyngedig gwrthgyrff yn ystod yr arbrawf, perfformiwyd arbrofion cyfyngedig gyda phob crynodiad oligosacarid. Dylid nodi yma fod rhai gwrthgyrff yn ymateb yn wahanol iawn i'r un oligosacarid fel swbstrad, yn ôl pob tebyg oherwydd eu bod yn rhwymo i epitopau ychydig yn wahanol a gallant fod â chysylltiadau rhwymo gwahanol iawn. Bydd mecanweithiau a goblygiadau adnabod epitopau cywir yn llawer mwy cymhleth pan gymhwysir y dull mAb newydd i samplau go iawn.
Defnyddiwyd dau oligosacarid masnachol i bennu'r ystod ganfod ar gyfer gwahanol mAbs sy'n targedu glycan. Yma, mae cydberthnasau llinol â chrynodiad log crynodiad oligosacarid yn dangos patrymau amsugno Langmuir ar gyfer (A) XHE gydag mAb a (B) A2XX gydag mAb. Mae'r epitopau cyfatebol yn dangos strwythurau'r oligosacaridau masnachol a ddefnyddir fel swbstradau yn yr assay.
Mae defnyddio gwrthgyrff monoclonal sy'n targedu glycan (dadansoddiad glycocomig neu sgrinio mAb yn seiliedig ar ELISA) yn offeryn pwerus ar gyfer nodweddu'r rhan fwyaf o'r glycanau wal gell mawr sy'n ffurfio biomas planhigion yn fanwl. Fodd bynnag, dim ond glycanau wal gell mwy y mae dadansoddiad glycan clasurol yn eu nodweddu, gan nad yw'r rhan fwyaf o oligosacaridau yn cael eu sefydlogi'n effeithlon ar blatiau ELISA. Yn yr astudiaeth hon, cafodd stover corn wedi'i drin ymlaen llaw ag AFEX ei hydrolysu'n ensymatig ar gynnwys solidau uchel. Defnyddiwyd dadansoddiad siwgr i bennu cyfansoddiad carbohydradau wal gell ystyfnig yn yr hydrolysad. Fodd bynnag, mae dadansoddiad mAb o oligosacaridau llai mewn hydrolysadau wedi'i danamcangyfrif, ac mae angen offer ychwanegol i sefydlogi oligosacaridau'n effeithiol ar blatiau ELISA.
Rydym yn adrodd yma ar ddull imiwno-symudiad oligosacarid newydd ac effeithlon ar gyfer sgrinio mAb trwy gyfuno biotinyleiddio oligosacarid ac yna sgrinio ELISA ar blatiau wedi'u gorchuddio â NeutrAvidin™. Dangosodd yr oligosacaridau biotinyleiddiedig imiwno-symudedig ddigon o affinedd i'r gwrthgorff i alluogi canfod oligosacaridau ystyfnig yn gyflym ac yn effeithlon. Cadarnhaodd dadansoddiad o gyfansoddiad yr oligosacaridau ystyfnig hyn yn seiliedig ar sbectrometreg màs ganlyniadau'r dull newydd hwn o imiwnosgrinio. Felly, mae'r astudiaethau hyn yn dangos y gellir defnyddio'r cyfuniad o biotinyleiddio oligosacarid a sgrinio ELISA gydag gwrthgyrff monoclonaidd wedi'u targedu at glycan i ganfod croesgysylltiadau mewn oligosacaridau a gellir ei gymhwyso'n eang mewn astudiaethau biocemegol eraill sy'n nodweddu strwythur oligosacaridau.
Y dull proffilio glycan sy'n seiliedig ar biotin hwn yw'r adroddiad cyntaf sy'n gallu ymchwilio i'r bondiau carbohydrad anhyblyg oligosacaridau hydawdd mewn biomas planhigion. Mae hyn yn helpu i ddeall pam mae rhai rhannau o fiomas mor ystyfnig o ran cynhyrchu biodanwydd. Mae'r dull hwn yn llenwi bwlch pwysig mewn dulliau dadansoddi glycome ac yn ymestyn ei gymhwysiad i ystod ehangach o swbstradau y tu hwnt i oligosacaridau planhigion. Yn y dyfodol, efallai y byddwn yn defnyddio roboteg ar gyfer biotinylation ac yn defnyddio'r dull rydym wedi'i ddatblygu ar gyfer dadansoddi trwybwn uchel o samplau gan ddefnyddio ELISA.
Cafodd gwellt corn (CS) a dyfwyd o hadau hybrid Pioneer 33A14 ei gynaeafu yn 2010 o Kramer Farms yn Ray, Colorado. Gyda chaniatâd y tirfeddiannwr, gellir defnyddio'r biomas hwn ar gyfer ymchwil. Storiwyd y samplau'n sych < 6% o leithder mewn bagiau clo-zip ar dymheredd ystafell. Storiwyd y samplau'n sych < 6% o leithder mewn bagiau clo-zip ar dymheredd ystafell. Образцы хранились сухими при влажности < 6% yn y pecyn ac застежкой-mолнией при комнатной темет. Storiwyd samplau'n sych ar leithder <6% mewn bagiau â sip ar dymheredd ystafell.样品在室温下以干燥<6%的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Mae samplau'n cael eu storio mewn bagiau sip ar dymheredd ystafell gyda lleithder < 6%.Roedd yr astudiaeth yn cydymffurfio â chanllawiau lleol a chenedlaethol. Perfformiwyd dadansoddiad cyfansoddiadol gan ddefnyddio protocol NREL. Canfuwyd bod y cyfansoddiad yn cynnwys 31.4% glwcan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% asetyl, 14.3% lignin, 1.7% protein a 13.4% lludw.
Mae Cellic® CTec2 (138 mg o brotein/ml, lot VCNI 0001) yn gymysgedd cymhleth o seliwlas, β-glwcosidase a Cellic® HTec2 (157 mg o brotein/ml, lot VHN00001) gan Novozymes (Franklinton, NC, UDA)). Rhoddwyd Multifect Pectinase® (72 mg o brotein/mL), cymysgedd cymhleth o ensymau sy'n diraddio pectin, gan DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, UDA). Penderfynwyd crynodiadau protein ensymau trwy amcangyfrif cynnwys protein (a thynnu cyfraniad nitrogen nad yw'n brotein) gan ddefnyddio dadansoddiad nitrogen Kjeldahl (dull AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, UDA). Prynwyd diatomaceous earth 545 gan EMD Millipore (Billerica, MA). Prynwyd carbon wedi'i actifadu (DARCO, gronynnau 100 rhwyll), Avicel (PH-101), xylan ffawydd, a'r holl gemegau eraill gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Perfformiwyd rhag-driniaeth AFEX yn GLBRC (Labordy Ymchwil Trosi Biomas, MSU, Lansing, MI, UDA). Cynhaliwyd y rhag-driniaeth ar 140°C am 15 munud. Amser preswylio o 46 munud ar gymhareb 1:1 o amonia anhydrus i fiomas ar lwytho 60% (w/w) mewn adweithydd swp benchtop dur di-staen (Parr Instruments Company). Cymerodd 30 munud. Daethpwyd â'r adweithydd i 140°C a rhyddhawyd yr amonia yn gyflym, gan ganiatáu i'r biomas ddychwelyd yn gyflym i dymheredd ystafell. Roedd cyfansoddiad stocer corn wedi'i rag-drin (ACS) AFEX yn debyg i gyfansoddiad stocer corn heb ei drin (UT-CS).
Paratowyd ACSH 25% (w/w) solidau uchel (llwyth dextran tua 8%) fel deunydd cychwyn ar gyfer cynhyrchu oligosacaridau ar raddfa fawr. Perfformiwyd hydrolysis ensymatig ACS gan ddefnyddio cymysgedd ensymau masnachol gan gynnwys Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glwcan (mewn biomas wedi'i drin ymlaen llaw), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glwcan, a Multifect Pectinase (Genencor Inc, UDA). ). ), 5 mg protein/g dextran. Cynhaliwyd hydrolysis ensymatig mewn bio-adweithydd 5 litr gyda chyfaint gweithio o 3 litr, pH 4.8, 50°C a 250 rpm. Ar ôl hydrolysis am 96 awr, casglwyd yr hydrolysad trwy allgyrchu ar 6000 rpm am 30 munud ac yna ar 14000 rpm am 30 munud i gael gwared ar solidau heb eu hydrolysu. Yna cafodd yr hydrolysad ei hidlo'n ddi-haint drwy ficer hidlo 0.22 mm. Cafodd yr hydrolysad wedi'i hidlo ei storio mewn poteli di-haint ar 4°C ac yna ei ffracsiynu ar garbon.
Dadansoddiad o gyfansoddiad samplau biomas sy'n seiliedig ar echdynion yn ôl gweithdrefnau dadansoddi labordy NREL: paratoi samplau ar gyfer dadansoddi cyfansoddiad (NREL/TP-510-42620) a phennu carbohydradau strwythurol a lignin mewn biomas (NREL/TP-510 – 42618)47.
Perfformiwyd dadansoddiad oligosacaridau o'r ffrwd hydrolysad ar raddfa 2 ml gan ddefnyddio dull hydrolysis asid yn seiliedig ar awtoclaf. Cymysgwch y sampl hydrolysad â 69.7 µl o asid sylffwrig 72% mewn tiwb diwylliant cap sgriw 10 ml a'i ddeori am 1 awr ar fainc ar 121 °C, oeri ar rew a hidlwch i mewn i ffiol cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC). Penderfynwyd crynodiad yr oligosacaridau trwy dynnu crynodiad y monosacaridau yn y sampl heb ei hydrolysu o gyfanswm crynodiad y siwgr yn y sampl wedi'i hydrolysu ag asid.
Dadansoddwyd crynodiadau glwcos, xylos, ac arabinose yn y biomas wedi'i hydrolysu gan ddefnyddio system HPLC Shimadzu wedi'i chyfarparu ag awtosampler, gwresogydd colofn, pwmp isocrataidd, a synhwyrydd mynegai plygiannol ar golofn Bio-Rad Aminex HPX-87H. Cadwyd y golofn ar 50°C a'i helutio gyda 0.6 ml/munud 5 mM H2SO4 mewn dŵr. llif.
Cafodd uwchnofiant yr hydrolysad ei wanhau a'i ddadansoddi am gynnwys monomer ac oligosacarid. Dadansoddwyd siwgrau monomerig a gafwyd ar ôl hydrolysis ensymatig gan HPLC wedi'i gyfarparu â cholofn Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a cholofn gwarchod lludw. Cadwyd tymheredd y golofn ar 80°C, defnyddiwyd dŵr fel y cyfnod symudol gyda chyfradd llif o 0.6 ml/mun. Penderfynwyd ar oligosacaridau trwy hydrolysis mewn asid gwanedig ar 121°C yn ôl y dulliau a ddisgrifir yng nghyfeiriadau 41, 48, 49.
Perfformiwyd dadansoddiad saccharid ar weddillion biomas crai, wedi'u trin ymlaen llaw ag AFEX a'r holl weddillion biomas heb eu hydrolysu (gan gynnwys cynhyrchu darnau waliau celloedd cyfresol a'u sgrinio mAb) gan ddefnyddio gweithdrefnau a ddisgrifiwyd yn flaenorol 27, 43, 50, 51. Ar gyfer dadansoddi glycome, paratoir gweddillion deunydd waliau celloedd planhigion sy'n anhydawdd mewn alcohol o weddillion biomas ac fe'u echdynnir yn gyfresol gydag adweithyddion cynyddol ymosodol fel amoniwm ocsalad (50 mM), sodiwm carbonad (50 mM a 0.5% w/v), CON. (1M a 4M, y ddau gyda 1% w/v sodiwm borohydrid) a chlorit asid fel y disgrifiwyd yn flaenorol 52,53. Yna, cafodd y darnau eu profi gan ELISA yn erbyn panel cymhleth o mAb50au a gyfeiriwyd at glycan wal y gell, a chyflwynwyd yr adweithiau rhwymo mAb fel map gwres. Prynwyd mAbs sy'n targedu glycan waliau celloedd planhigion o stociau labordy (cyfres CCRC, JIM a MAC).
Biotinyleiddio oligosacaridau mewn un cam. Perfformiwyd cyfuniad carbohydradau â biotin-LC-hydrasid gan ddefnyddio'r weithdrefn ganlynol. Diddymwyd biotin-LC-hydrasid (4.6 mg/12 μmol) mewn dimethyl sylffocsid (DMSO, 70 μl) trwy ei droi'n egnïol a'i gynhesu ar 65°C am 1 munud. Ychwanegwyd asid asetig rhewlifol (30 µl) a thywalltwyd y cymysgedd ar sodiwm cyanoborohydrid (6.4 mg/100 µmol) a'i ddiddymu'n llwyr ar ôl ei gynhesu ar 65°C am tua 1 munud. Yna, ychwanegwyd o 5 i 8 μl o'r cymysgedd adwaith at yr oligosacarid sych (1-100 nmol) i gael gormodedd molar 10 gwaith neu fwy o'r label dros y pen lleihau. Cynhaliwyd yr adwaith ar 65°C am 2 awr, ac ar ôl hynny purwyd y samplau ar unwaith. Ni ddefnyddiwyd sodiwm cyanoborohydrid yn yr arbrofion labelu heb leihau, ac adweithiwyd y samplau ar 65°C am 2.5 awr.
Gorchudd ELISA a golchi samplau o oligosacaridau biotinyleiddiedig. Ychwanegwyd 25 μl o samplau biotinyleiddiedig (100 μl o bob sampl crynodedig wedi'i wanhau mewn 5 ml o doddiant byffer Tris 0.1 M (TBS)) at bob ffynnon o'r plât wedi'i orchuddio ag avidin. Gorchuddiwyd y ffynhonnau rheoli â 50 μl o biotin ar grynodiad o 10 μg/ml mewn TBS 0.1 M. Defnyddiwyd dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio fel gorchudd ar gyfer mesuriadau gwag. Deorwyd y dabled am 2 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Golchwch y plât 3 gwaith gyda llaeth sgim 0.1% mewn TBS 0.1 M gan ddefnyddio rhaglen rhif 11 ar gyfer fflat Grenier 3A.
Ychwanegu a golchi gwrthgyrff cynradd. Ychwanegwch 40 µl o wrthgorff cynradd i bob twll. Deorwch y microplât am 1 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Yna golchwyd y platiau 3 gwaith gyda llaeth 0.1% mewn llwy fwrdd 0.1M gan ddefnyddio rhaglen golchi #11 ar gyfer Grenier Flat 3A.
Ychwanegwch wrthgorff eilaidd a golchwch. Ychwanegwch 50 µl o wrthgorff eilaidd llygoden/llygod mawr (wedi'i wanhau 1:5000 mewn llaeth 0.1% mewn llwy fwrdd 0.1 M) i bob twll. Deorwch y microplât am 1 awr ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Yna golchwyd y microplatiau 5 gwaith gyda llaeth 0.1% mewn llwy fwrdd 0.1 M gan ddefnyddio rhaglen golchi platiau Grenier Flat 5A #12.
Ychwanegu swbstrad. Ychwanegwch 50 µl o 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) at y swbstrad sylfaen (trwy ychwanegu 2 ddiferyn o glustog, 3 diferyn o TMB, 2 ddiferyn o hydrogen perocsid at 15 ml o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio). Paratowch y swbstrad TMB a'i fortecsio cyn ei ddefnyddio). Deorwch y microplât ar dymheredd ystafell am 30 munud. Yn y tywyllwch.
Cwblhewch y cam a darllenwch y dabled. Ychwanegwch 50 µl o asid sylffwrig 1 N i bob twll a chofnodwch yr amsugnedd o 450 i 655 nm gan ddefnyddio darllenydd ELISA.
Paratowch doddiannau 1 mg/ml o'r dadansoddion hyn mewn dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio: arabinose, rhamnos, ffwcos, xylos, asid galacturonig (GalA), asid glwcuronig (GlcA), mannos, glwcos, galactos, lactos, N-asetylmannosamin (manNAc), N-asetylglucosamin (glcNAc), N-asetylgalactosamin (galNAc), inositol (safon fewnol). Paratowyd dau safon trwy ychwanegu'r doddiannau siwgr 1 mg/mL a ddangosir yn Nhabl 1. Mae samplau'n cael eu rhewi a'u lyoffilio ar -80°C nes bod yr holl ddŵr wedi'i dynnu (fel arfer tua 12-18 awr).
Ychwanegwch 100–500 µg o sampl at diwbiau cap sgriw ar glorian ddadansoddol. Cofnodwch y swm a ychwanegwyd. Gorau po fwyaf yw diddymu'r sampl mewn crynodiad penodol o doddydd a'i ychwanegu at y tiwb fel aliquot hylif. Defnyddiwch 20 µl o inositol 1 mg/ml fel safon fewnol ar gyfer pob tiwb sampl. Rhaid i faint y safon fewnol a ychwanegir at y sampl fod yr un fath â faint y safon fewnol a ychwanegir at y tiwb safonol.
Ychwanegwch 8 ml o fethanol anhydrus i ffiol â chap sgriw. Yna 4 ml o doddiant HCl methanol 3 N, wedi'i gapio a'i ysgwyd. Nid yw'r broses hon yn defnyddio dŵr.
Ychwanegwch 500 µl o doddiant methanol HCl 1 M at y samplau oligosacarid a'r tiwbiau TMS safonol. Cafodd y samplau eu magu dros nos (168 awr) ar 80°C mewn bloc thermol. Sychwch y cynnyrch methanolisis ar dymheredd ystafell gan ddefnyddio maniffold sychu. Ychwanegwch 200 µl o MeOH a sychwch eto. Ailadroddir y broses hon ddwywaith. Ychwanegwch 200 µl o methanol, 100 µl o pyridin a 100 µl o anhydrid asetig at y sampl a chymysgwch yn dda. Cafodd y samplau eu magu ar dymheredd ystafell am 30 munud a'u sychu. Ychwanegwch 200 µl o methanol a sychwch eto.
Ychwanegwch 200 µl o Tri-Sil a gwreswch y tiwb wedi'i gaeadu am 20 munud. 80°C, yna oeri i dymheredd ystafell. Defnyddiwch faniffold sychu i sychu'r sampl ymhellach i gyfaint o tua 50 µl. Mae'n bwysig nodi na wnaethom adael i'r samplau sychu'n llwyr.
Ychwanegwch 2 ml o hecsan a chymysgwch yn dda trwy fortecsio. Llenwch flaenau pipetau Pasteur (5-8 mm) gyda darn o wlân gwydr trwy fewnosod y gwlân gwydr ar ben piped 5-3/4 modfedd mewn diamedr. Cafodd samplau eu centrifugio ar 3000 g am 2 funud. Mae unrhyw weddillion anhydawdd yn cael eu gwaddodi. Sychwch y sampl i 100-150 µl. Chwistrellwyd cyfaint o tua 1 μl i'r GC-MS ar dymheredd cychwynnol o 80 °C ac amser cychwynnol o 2.0 munud (Tabl 2).