Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Jaunas imunoloģiskās un masas spektrometriskās metodes noturīgu oligosaharīdu kompleksai analīzei kukurūzas katlā, kas iepriekš apstrādāts ar AFEX.Lignocelulozes biomasa ir ilgtspējīga alternatīva fosilajam kurināmajam, un to plaši izmanto, lai izstrādātu biotehnoloģijas tādu produktu ražošanai kā pārtika, barība, degviela un ķīmiskās vielas.Šo tehnoloģiju atslēga ir izmaksu ziņā konkurētspējīgu procesu izstrāde augu šūnu sieniņās esošo komplekso ogļhidrātu pārvēršanai vienkāršos cukuros, piemēram, glikozē, ksilozē un arabinozē.Tā kā lignocelulozes biomasa ir ļoti noturīga, tā ir jāpakļauj termoķīmiskai apstrādei (piemēram, amonjaka šķiedru atslāņošanai (AFEX), atšķaidītām skābēm (DA), jonu šķidrumiem (IL)) un bioloģiskai apstrādei (piemēram, fermentatīvā hidrolīze un mikrobu fermentācija), lai iegūtu vēlamo produktu..Tomēr, ja hidrolīzes procesā tiek izmantoti komerciāli sēnīšu enzīmi, tikai 75-85% no izveidotajiem šķīstošajiem cukuriem ir monosaharīdi, bet atlikušie 15-25% ir šķīstoši, grūti ārstējami oligosaharīdi, kas ne vienmēr ir pieejami mikroorganismiem.Iepriekš mēs esam veiksmīgi izolējuši un attīrījuši šķīstošos noturīgos oligosaharīdus, izmantojot oglekļa un diatomīta zemes atdalīšanas un izmēra izslēgšanas hromatogrāfiju, kā arī pētījām to enzīmu inhibējošās īpašības.Mēs esam noskaidrojuši, ka oligosaharīdus, kas satur augstākas polimerizācijas pakāpes (DP) metilētās uronskābes aizvietotājus, ir grūtāk apstrādāt ar komerciāliem enzīmu maisījumiem nekā ar zemu DP un neitrālus oligosaharīdus.Šeit mēs ziņojam par vairāku papildu metožu izmantošanu, tostarp glikānu profilēšanu, izmantojot monoklonālās antivielas (mAb), kas raksturīgas augu biomasas glikāniem, lai raksturotu glikānu saites augu šūnu sienās un fermentatīvos hidrolizātos, lāzera desorbcijas jonizāciju ar matricu, lidojuma laika masas spektrometriju..MALDI-TOF-MS) izmanto struktūru informatīvos diagnostikas pīķus, kas iegūti ar spektroskopiju pēc negatīvo jonu sekundārās sabrukšanas, gāzu hromatogrāfijā un masas spektrometrijā (GC-MS), lai raksturotu oligosaharīdu saites ar atvasinājumu un bez tās.Oligosaharīdu (DP 4–20) mazā izmēra dēļ šīs molekulas ir grūti izmantot mAb saistīšanai un raksturošanai.Lai pārvarētu šo problēmu, mēs izmantojām jaunu, uz biotīna konjugāciju balstītu oligosaharīdu imobilizācijas metodi, kas veiksmīgi iezīmēja lielāko daļu zemas DP šķīstošo oligosaharīdu uz mikroplates virsmas, ko pēc tam izmantoja augstas caurlaidības mAb sistēmā specifiskai ligācijas analīzei.Šī jaunā metode veicinās progresīvāku augstas caurlaidības glikomu testu izstrādi nākotnē, ko var izmantot, lai diagnostikas nolūkos izolētu un raksturotu biomarķieros esošos oligosaharīdus.
Lignocelulozes biomasa, kas sastāv no lauksaimniecības, mežsaimniecības, zāles un koksnes materiāliem, ir potenciāls izejmateriāls bioloģisko produktu, tostarp pārtikas, barības, degvielas un ķīmisko prekursoru, ražošanai, lai ražotu augstākas vērtības produktus1.Ogļhidrāti (piemēram, celuloze un hemiceluloze), kas atrodas augu šūnu sieniņās, tiek depolimerizēti monosaharīdos ķīmiskās apstrādes un biotransformācijas (piemēram, fermentatīvās hidrolīzes un mikrobu fermentācijas) ceļā.Kopējā pirmapstrāde ietver amonjaka šķiedras izplešanos (AFEX), atšķaidītu skābi (DA), jonu šķidrumu (IL) un tvaika eksploziju (SE), kas izmanto ķīmisku vielu un siltuma kombināciju, lai samazinātu lignocelulozes ražošanu, atverot augu šūnu sienas3,4.vielas spītīgums, 5. Enzīmu hidrolīzi veic pie lielas cietvielu slodzes, izmantojot komerciālus aktīvos ogļhidrātus saturošus enzīmus (CAZymes) un mikrobu fermentāciju, izmantojot transgēnus raugus vai baktērijas, lai ražotu bioloģisko degvielu un ķīmiskās vielas 6 .
CAZymes komerciālajos fermentos sastāv no sarežģīta enzīmu maisījuma, kas sinerģiski sašķeļ kompleksās ogļhidrātu-cukura saites, veidojot monosaharīdus2,7.Kā mēs ziņojām iepriekš, sarežģītais lignīna aromātisko polimēru tīkls ar ogļhidrātiem padara tos ļoti grūti atrisināmus, kas noved pie nepilnīgas cukura konversijas, uzkrājot 15–25% dzimuma oligosaharīdu, kas netiek ražoti iepriekš apstrādātas biomasas fermentatīvās hidrolīzes laikā.Tā ir izplatīta problēma ar dažādām biomasas pirmapstrādes metodēm.Daži šīs vājās vietas iemesli ir enzīmu inhibīcija hidrolīzes laikā vai būtisku būtisku enzīmu trūkums vai zems līmenis, kas nepieciešami, lai pārrautu cukura saites augu biomasā.Cukuru sastāva un strukturālo īpašību izpratne, piemēram, oligosaharīdos esošās cukura saites, palīdzēs mums uzlabot cukura konversiju hidrolīzes laikā, padarot biotehnoloģiskos procesus izmaksu ziņā konkurētspējīgus ar no naftas iegūtiem produktiem.
Ogļhidrātu struktūras noteikšana ir sarežģīta, un ir nepieciešama tādu metožu kombinācija kā šķidruma hromatogrāfija (LC)11,12, kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopija (NMR)13, kapilārā elektroforēze (CE)14,15,16 un masas spektrometrija (MS)17., astoņpadsmit.MS metodes, piemēram, lidojuma laika masas spektrometrija ar lāzera desorbciju un jonizāciju, izmantojot matricu (MALDI-TOF-MS), ir daudzpusīga metode ogļhidrātu struktūru identificēšanai.Pēdējā laikā visplašāk tika izmantots nātrija jonu adduktu sadursmes izraisītās disociācijas (CID) tandēma MS, lai identificētu pirkstu nospiedumus, kas atbilst oligosaharīdu piestiprināšanas pozīcijām, anomēru konfigurācijām, secībām un sazarojuma pozīcijām 20, 21 .
Glikāna analīze ir lielisks līdzeklis ogļhidrātu saišu padziļinātai identificēšanai22.Šī metode izmanto monoklonālās antivielas (mAb), kas vērstas uz augu šūnu sienas glikānu kā zondi, lai izprastu sarežģītās ogļhidrātu saites.Visā pasaulē ir pieejami vairāk nekā 250 mAb, kas izstrādāti pret dažādiem lineāriem un sazarotiem oligosaharīdiem, izmantojot dažādus saharīdus24.Vairāki mAb ir plaši izmantoti, lai raksturotu augu šūnu sienas struktūru, sastāvu un modifikācijas, jo pastāv būtiskas atšķirības atkarībā no augu šūnu veida, orgāna, vecuma, attīstības stadijas un augšanas vides25, 26.Pavisam nesen šī metode tika izmantota, lai izprastu vezikulu populācijas augu un dzīvnieku sistēmās un to attiecīgo lomu glikāna transportēšanā, ko nosaka subcelulārie marķieri, attīstības stadijas vai vides stimuli, un lai noteiktu fermentatīvo aktivitāti.Dažas no dažādajām glikānu un ksilānu struktūrām, kas ir identificētas, ir pektīns (P), ksilāns (X), mannāns (M), ksiloglukāni (XylG), jauktās saites glikāni (MLG), arabinoksilāns (ArbX), galaktomannāns (GalG), glikuronskābe-arabinoksilāns (GArb-G) un arabinoksilāns (GArbX)2.
Tomēr, neskatoties uz visiem šiem pētniecības centieniem, tikai daži pētījumi ir vērsti uz oligosaharīdu uzkrāšanās raksturu augstas cietvielu slodzes (HSL) hidrolīzes laikā, tostarp oligosaharīdu izdalīšanos, oligomēru ķēdes garuma izmaiņām hidrolīzes laikā, dažādiem zemas DP polimēriem un to līknēm.sadalījumi 30,31,32.Tikmēr, lai gan glikāna analīze ir izrādījusies noderīgs instruments visaptverošai glikāna struktūras analīzei, ir grūti novērtēt ūdenī šķīstošos zemas DP oligosaharīdus, izmantojot antivielu metodes.Mazāki DP oligosaharīdi, kuru molekulmasa ir mazāka par 5-10 kDa, nesaistās ar ELISA plāksnēm 33, 34 un tiek nomazgāti pirms antivielu pievienošanas.
Šeit pirmo reizi mēs demonstrējam ELISA testu ar avidīnu pārklātām plāksnēm, izmantojot monoklonālās antivielas, apvienojot vienpakāpes biotinilēšanas procedūru šķīstošiem ugunsizturīgiem oligosaharīdiem ar glikoma analīzi.Mūsu pieeja glikoma analīzei tika apstiprināta ar MALDI-TOF-MS un GC-MS balstītu komplementāru oligosaharīdu saišu analīzi, izmantojot hidrolizētu cukura kompozīciju trimetilsilil (TMS) derivatizāciju.Šo novatorisko pieeju nākotnē var izstrādāt kā augstas caurlaidības metodi un atrast plašāku pielietojumu biomedicīnas pētījumos35.
Fermentu un antivielu pēctranslācijas modifikācijas, piemēram, glikozilācija36, ietekmē to bioloģisko aktivitāti.Piemēram, seruma proteīnu glikozilācijas izmaiņām ir svarīga loma iekaisuma artrīta gadījumā, un glikozilācijas izmaiņas tiek izmantotas kā diagnostikas marķieri37.Literatūrā ir ziņots, ka dažādi glikāni viegli parādās dažādās slimībās, ieskaitot hroniskas kuņģa-zarnu trakta un aknu iekaisuma slimības, vīrusu infekcijas, olnīcu, krūts un prostatas vēzi38, 39, 40.Glikānu struktūras izpratne, izmantojot uz antivielām balstītas glikāna ELISA metodes, sniegs papildu pārliecību slimības diagnostikā, neizmantojot sarežģītas MS metodes.
Mūsu iepriekšējais pētījums parādīja, ka noturīgie oligosaharīdi pēc pirmapstrādes un fermentatīvās hidrolīzes palika nehidrolizēti (1. attēls).Iepriekš publicētajā darbā mēs izstrādājām aktīvās ogles cietās fāzes ekstrakcijas metodi, lai izolētu oligosaharīdus no AFEX iepriekš apstrādāta kukurūzas katla hidrolizāta (ACSH)8.Pēc sākotnējās ekstrakcijas un atdalīšanas oligosaharīdi tika tālāk frakcionēti ar lieluma izslēgšanas hromatogrāfiju (SEC) un savākti molekulmasas secībā.Cukura monomēri un oligomēri, kas atbrīvoti no dažādām pirmapstrādes metodēm, tika analizēti ar cukura sastāva analīzi.Salīdzinot ar dažādām pirmapstrādes metodēm iegūto cukura oligomēru saturu, noturīgu oligosaharīdu klātbūtne ir izplatīta problēma biomasas pārvēršanā monosaharīdos un var izraisīt cukura iznākuma samazināšanos vismaz par 10-15% un pat līdz 18%.ASV.Šo metodi izmanto tālākai liela mēroga oligosaharīdu frakciju ražošanai.Iegūtais ACH un tā sekojošās frakcijas ar atšķirīgu molekulmasu tika izmantotas kā eksperimentāls materiāls oligosaharīdu raksturošanai šajā darbā.
Pēc pirmapstrādes un fermentatīvās hidrolīzes noturīgie oligosaharīdi palika nehidrolizēti.Šeit (A) ir oligosaharīdu atdalīšanas metode, kurā oligosaharīdus izdala no iepriekš apstrādāta kukurūzas hidrolizāta (ACSH), izmantojot aktīvās ogles un diatomīta zemi;(B) Oligosaharīdu atdalīšanas metode.Oligosaharīdi tika tālāk atdalīti ar izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (SEC);(C) Saharīdu monomēri un oligomēri, kas atbrīvoti no dažādām pirmapstrādes metodēm (atšķaidīta skābe: DA, jonu šķidrums: IL un AFEX).Fermentatīvās hidrolīzes apstākļi: augsta cietvielu slodze 25% (w/w) (apmēram 8% glikāna slodze), 96 stundu hidrolīze, 20 mg/g komerciāla enzīmu slodze (attiecība Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) un (D) Cukura monomēri un oligomēri (no korozētās akronozes un arorēzes izdalītā AFBīnglikozera EX). S).
Glikāna analīze ir izrādījusies noderīgs instruments visaptverošai glikānu strukturālai analīzei ekstraktos, kas izolēti no cietajām biomasas atliekām.Tomēr, izmantojot šo tradicionālo metodi, ūdenī šķīstošie saharīdi ir nepietiekami pārstāvēti41, jo zemas molekulmasas oligosaharīdus ir grūti imobilizēt uz ELISA plāksnēm, un tie tiek izskaloti pirms antivielu pievienošanas.Tāpēc antivielu saistīšanai un raksturošanai tika izmantota vienpakāpes biotinilēšanas metode, lai pārklātu šķīstošus, neatbilstošus oligosaharīdus ar avidīnu pārklātām ELISA plāksnēm.Šī metode tika pārbaudīta, izmantojot mūsu iepriekš ražoto ACSH un frakciju, pamatojoties uz tā molekulmasu (vai polimerizācijas pakāpi, DP).Vienpakāpes biotinilēšana tika izmantota, lai palielinātu oligosaharīdu saistīšanās afinitāti, pievienojot biotīna-LC-hidrazīdu ogļhidrāta reducējošajam galam (2. att.).Šķīdumā pusacetāla grupa reducējošajā galā reaģē ar biotīna-LC-hidrazīda hidrazīda grupu, veidojot hidrazona saiti.Reducētāja NaCNBH3 klātbūtnē hidrazona saite tiek reducēta līdz stabilam biotinilētam galaproduktam.Pārveidojot cukura reducējošo galu, kļuva iespējama zema DP oligosaharīdu saistīšanās ar ELISA plāksnēm, un mūsu pētījumā tas tika darīts uz plāksnēm, kas pārklātas ar avidīnu, izmantojot glikāna mērķa mAb.
Monoklonālo antivielu skrīnings, pamatojoties uz ELISA biotinilētu oligosaharīdu noteikšanai.Šeit (A) kombinētā oligosaharīdu biotinilēšana un sekojošā ELISA skrīnings ar glikānu mērķētiem mAb uz NeutrAvidin pārklātām plāksnēm un (B) parāda vienpakāpes procedūru reakcijas produktu biotinilēšanai.
Pēc tam primārajām un sekundārajām antivielām tika pievienotas ar avidīnu pārklātas plāksnes ar oligosaharīdu konjugētām antivielām un mazgātas gaismas un laika jutīgā vidē.Kad antivielu saistīšanās ir pabeigta, pievienojiet TMB substrātu, lai inkubētu plāksni.Reakcija beidzot tika apturēta ar sērskābi.Inkubētās plāksnes tika analizētas, izmantojot ELISA lasītāju, lai noteiktu katras antivielas saistīšanās stiprumu, lai noteiktu antivielām specifisku šķērssavienojumu.Sīkāku informāciju un eksperimenta parametrus skatiet attiecīgajā sadaļā “Materiāli un metodes”.
Mēs demonstrējam šīs jaunizveidotās metodes lietderību specifiskiem lietojumiem, raksturojot šķīstošos oligosaharīdus, kas atrodas ACSH, kā arī neapstrādātās un attīrītās oligosaharīdu frakcijās, kas izolētas no lignocelulozes hidrolizātiem.Kā parādīts 3. attēlā, visizplatītākie epitopu aizvietotie ksilāni, kas identificēti ACSH, izmantojot bioacilētās glikomas noteikšanas metodes, parasti ir uronskābes (U) vai metiluronskābes (MeU) un pektīna arabinogalaktāni.Lielākā daļa no tiem tika atrasti arī mūsu iepriekšējā pētījumā par nehidrolizētu cietvielu (UHS) glikānu analīzi43.
Nepatīkamu oligosaharīdu epitopu noteikšana, izmantojot monoklonālu antivielu, kas vērsta uz šūnu sienas glikānu.“Neitrāla” frakcija ir ACN frakcija, un “skābā” frakcija ir FA frakcija.Spilgtāki sarkanie toņi siltuma kartē norāda uz augstāku epitopu saturu, bet gaišāki zilie norāda uz tukšu fonu.Krāsu vērtības skalā ir balstītas uz neapstrādātām OD vērtībām preparātiem N=2.Galvenie epitopi, ko atpazīst antivielas, ir parādīti labajā pusē.
Šīs necelulozes struktūras nevarēja šķelt visbiežāk izmantotās celulāzes un hemicelulāzes pārbaudītajā komerciālajā enzīmu maisījumā, kas ietver visbiežāk izmantotos komerciālos fermentus.Tāpēc to hidrolīzei ir nepieciešami jauni palīgenzīmi.Bez nepieciešamajiem necelulozes palīgenzīmiem šīs necelulozes saites novērš pilnīgu pārvēršanos monosaharīdos, pat ja to pamatcukura polimēri tiek plaši hidrolizēti īsākos fragmentos un izšķīdināti, izmantojot komerciālus enzīmu maisījumus.
Turpmākie signāla sadalījuma un tā saistīšanās stipruma pētījumi parādīja, ka saistīšanās epitopi bija zemāki augstas DP cukura frakcijās (A, B, C, DP līdz 20+) nekā zemas DP frakcijās (D, E, F, DP) dimēros) (1. att.).Skābes fragmenti ir biežāk sastopami necelulozes epitopos nekā neitrālie fragmenti.Šīs parādības atbilst mūsu iepriekšējā pētījumā novērotajam modelim, kur augstas DP un skābes daļas bija izturīgākas pret fermentatīvo hidrolīzi.Tāpēc necelulozes glikāna epitopu klātbūtne un U un MeU aizvietojumi var ievērojami veicināt oligosaharīdu stabilitāti.Jāatzīmē, ka saistīšanās un noteikšanas efektivitāte var būt problemātiska zema DP oligosaharīdiem, īpaši, ja epitops ir dimērs vai trimērisks oligosaharīds.To var pārbaudīt, izmantojot komerciālus dažāda garuma oligosaharīdus, no kuriem katrs satur tikai vienu epitopu, kas saistās ar konkrētu mAb.
Tādējādi struktūrai raksturīgu antivielu izmantošana atklāja noteikta veida nepaklausīgas saites.Atkarībā no izmantotās antivielas veida, atbilstošā ligācijas modeļa un tā radītā signāla stipruma (visvairāk un vismazāk), jaunus fermentus var identificēt un daļēji kvantitatīvi pievienot fermentu maisījumam, lai nodrošinātu pilnīgāku glikonversiju.Ņemot par piemēru ACSH oligosaharīdu analīzi, mēs varam izveidot glikānu saišu datu bāzi katram biomasas materiālam.Šeit jāatzīmē, ka jāņem vērā antivielu atšķirīgā afinitāte, un, ja to afinitāte nav zināma, tas radīs zināmas grūtības, salīdzinot dažādu antivielu signālus.Turklāt glikānu saišu salīdzināšana var vislabāk darboties starp vienas un tās pašas antivielas paraugiem.Pēc tam šīs noturīgās saites var saistīt ar CAZyme datu bāzi, no kuras mēs varam identificēt fermentus, atlasīt kandidātenzīmus un pārbaudīt saites saraujošus enzīmus vai izstrādāt mikrobu sistēmas, lai izteiktu šos fermentus izmantošanai biorafinēšanas rūpnīcās44.
Lai novērtētu, kā imunoloģiskās metodes papildina alternatīvās metodes zemas molekulmasas oligosaharīdu raksturošanai lignocelulozes hidrolizātos, mēs veicām MALDI (4. att., S1-S8) un no TMS iegūto saharīdu analīzi, pamatojoties uz GC-MS, tajā pašā paneļa (5. att.) oligosaharīda daļā.MALDI izmanto, lai salīdzinātu, vai oligosaharīdu molekulu masas sadalījums atbilst iecerētajai struktūrai.Uz att.4 parāda neitrālo komponentu ACN-A un ACN-B MC.ACN-A analīze apstiprināja virkni pentozes cukuru, sākot no DP 4–8 (4. att.) līdz DP 22 (S1. att.), kuru svars atbilst MeU-ksilāna oligosaharīdiem.ACN-B analīze apstiprināja pentozes un glikoksilāna sērijas ar DP 8-15.Papildu materiālā, piemēram, S3 attēlā, FA-C skābo daļu masas sadalījuma kartes parāda virkni (Me)U aizvietotu pentozes cukuru ar DP no 8 līdz 15, kas atbilst aizvietotajiem ksilāniem, kas konstatēti uz ELISA balstītā mAb skrīningā.Epitopi ir konsekventi.
Šķīstošo neatbilstīgo oligosaharīdu MALDI-MS spektrs, kas atrodas ACS.Šeit ir (A) ACN-A zema svara diapazona frakcijas, kas satur metilētu uronskābi (DP 4-8) aizvietotus glikuoksilāna oligosaharīdus un (B) ACN-B ksilānu un metilētas uronskābes oligosaharīdus, kas aizvietoti ar glikuoksilānu (DP 8-15).
Ugunsizturīgo oligosaharīdu glikāna atlikuma sastāva analīze.Šeit (A) dažādu oligosaharīdu frakciju TMS saharīdu sastāvs, kas iegūts, izmantojot GC-MS analīzi.(B) oligosaharīdos esošo dažādu TMS atvasinātu cukuru struktūras.ACN – acetonitrila frakcija, kas satur neitrālus oligosaharīdus un FA – ferulīnskābes frakcija, kas satur skābos oligosaharīdus.
Vēl viens interesants secinājums tika izdarīts no oligosaharīdu frakcijas LC-MS analīzes, kā parādīts S9 attēlā (metodes var redzēt elektroniskajā papildu materiālā).ACN-B frakcijas ligācijas laikā tika atkārtoti novēroti heksozes un -OAc grupu fragmenti.Šis atklājums ne tikai apstiprina glikoma un MALDI-TOF analīzē novēroto sadrumstalotību, bet arī sniedz jaunu informāciju par iespējamiem ogļhidrātu atvasinājumiem iepriekš apstrādātā lignocelulozes biomasā.
Mēs arī analizējām oligosaharīdu frakcijas cukura sastāvu, izmantojot TMS cukura atvasinājumu.Izmantojot GC-MS, noteicām neirālo (neatvasināto) un skābo cukuru (GluA un GalA) sastāvu oligosaharīdu frakcijā (5. att.).Glikuronskābe ir atrodama skābajos komponentos C un D, ​​savukārt galakturonskābe ir atrodama skābajos komponentos A un B, kas abi ir skābo cukuru komponenti ar augstu DP.Šie rezultāti ne tikai apstiprina mūsu ELISA un MALDI datus, bet arī atbilst mūsu iepriekšējiem pētījumiem par oligosaharīdu uzkrāšanos.Tāpēc mēs uzskatām, ka mūsdienu imunoloģiskās metodes, izmantojot oligosaharīdu biotinilēšanu un sekojošu ELISA skrīningu, ir pietiekamas, lai dažādos bioloģiskajos paraugos noteiktu šķīstošos nepakļāvīgos oligosaharīdus.
Tā kā uz ELISA balstītas mAb skrīninga metodes ir apstiprinātas ar vairākām dažādām metodēm, mēs vēlējāmies sīkāk izpētīt šīs jaunās kvantitatīvās metodes potenciālu.Divi komerciāli oligosaharīdi, ksiloheksasaharīda oligosaharīds (XHE) un 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioze (A2XX), tika iegādāti un pārbaudīti, izmantojot jaunu mAb pieeju, kas vērsta uz šūnu sienas glikānu.6. attēlā parādīta lineāra korelācija starp biotinilēto saistīšanās signālu un oligosaharīdu koncentrācijas logaritmisko koncentrāciju, kas liecina par iespējamu Langmuir adsorbcijas modeli.Starp mAb CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 un CCRC-M151 korelēja ar XHE, un CCRC-M108, CCRC-M109 un LM11 korelēja ar A2XX diapazonā no 100 nm.Sakarā ar ierobežoto antivielu pieejamību eksperimenta laikā, tika veikti ierobežoti eksperimenti ar katru oligosaharīda koncentrāciju.Šeit jāatzīmē, ka dažas antivielas ļoti atšķirīgi reaģē uz vienu un to pašu oligosaharīdu kā substrātu, iespējams, tāpēc, ka tās saistās ar nedaudz atšķirīgiem epitopiem un tām var būt ļoti atšķirīga saistīšanās afinitāte.Precīzas epitopu identificēšanas mehānismi un sekas būs daudz sarežģītākas, ja jaunā mAb pieeja tiks piemērota reāliem paraugiem.
Lai noteiktu dažādu uz glikānu orientētu mAb noteikšanas diapazonu, tika izmantoti divi komerciāli oligosaharīdi.Šeit lineāras korelācijas ar oligosaharīdu koncentrācijas logaritmisko koncentrāciju norāda uz Langmuir adsorbcijas modeļiem (A) XHE ar mAb un (B) A2XX ar mAb.Atbilstošie epitopi norāda komerciālo oligosaharīdu struktūras, ko testā izmanto kā substrātus.
Uz glikānu orientētu monoklonālo antivielu izmantošana (glikokomiskā analīze vai uz ELISA balstīta mAb skrīnings) ir spēcīgs instruments, lai padziļināti raksturotu lielāko daļu galveno šūnu sienas glikānu, kas veido augu biomasu.Tomēr klasiskā glikāna analīze raksturo tikai lielākus šūnu sienas glikānus, jo lielākā daļa oligosaharīdu nav efektīvi imobilizēti uz ELISA plāksnēm.Šajā pētījumā ar AFEX iepriekš apstrādāta kukurūzas plīts tika fermentatīvi hidrolizēta ar augstu cietvielu saturu.Cukura analīze tika izmantota, lai noteiktu nepastāvīgo šūnu sienas ogļhidrātu sastāvu hidrolizātā.Tomēr mazāku oligosaharīdu mAb analīze hidrolizātos ir nepietiekami novērtēta, un ir nepieciešami papildu rīki, lai efektīvi imobilizētu oligosaharīdus uz ELISA plāksnēm.
Šeit mēs ziņojam par jaunu un efektīvu oligosaharīdu imobilizācijas metodi mAb skrīningam, apvienojot oligosaharīdu biotinilēšanu, kam seko ELISA skrīnings uz NeutrAvidin™ pārklātām plāksnēm.Imobilizētie biotinilētie oligosaharīdi uzrādīja pietiekamu afinitāti pret antivielu, lai varētu ātri un efektīvi noteikt nepaklausīgus oligosaharīdus.Šo spītīgo oligosaharīdu sastāva analīze, pamatojoties uz masas spektrometriju, apstiprināja šīs jaunās imūnskrīninga pieejas rezultātus.Tādējādi šie pētījumi parāda, ka oligosaharīdu biotinilēšanas un ELISA skrīninga kombināciju ar glikānu mērķētām monoklonālām antivielām var izmantot, lai noteiktu oligosaharīdu krusteniskās saites, un to var plaši izmantot citos bioķīmiskos pētījumos, kas raksturo oligosaharīdu struktūru.
Šī uz biotīnu balstītā glikāna profilēšanas metode ir pirmais ziņojums, kas spēj izpētīt šķīstošo oligosaharīdu nepastāvīgās ogļhidrātu saites augu biomasā.Tas palīdz saprast, kāpēc dažas biomasas daļas ir tik spītīgas, kad runa ir par biodegvielas ražošanu.Šī metode aizpilda svarīgu plaisu glikomu analīzes metodēs un paplašina tās pielietojumu plašākam substrātu lokam, ne tikai augu oligosaharīdiem.Nākotnē mēs varam izmantot robotiku biotinilēšanai un izmantot metodi, ko esam izstrādājuši augstas caurlaidības paraugu analīzei, izmantojot ELISA.
Kukurūzas salmi (CS), kas audzēti no Pioneer 33A14 hibrīda sēklām, tika novākti 2010. gadā no Kramer Farms Rejā, Kolorādo.Ar zemes īpašnieka atļauju šo biomasu var izmantot pētniecībai. Paraugi tika uzglabāti sausā < 6% mitruma maisos ar rāvējslēdzēju istabas temperatūrā. Paraugi tika uzglabāti sausā < 6% mitruma maisos ar rāvējslēdzēju istabas temperatūrā. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Paraugi tika uzglabāti sausā veidā ar mitrumu <6% rāvējslēdzēju maisiņos istabas temperatūrā.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Paraugus uzglabā rāvējslēdzēju maisos istabas temperatūrā ar mitrumu < 6%.Pētījums atbilda vietējām un valsts vadlīnijām.Sastāva analīze tika veikta, izmantojot NREL protokolu.Konstatēts, ka sastāvs satur 31,4% glikāna, 18,7% ksilāna, 3,3% arabināna, 1,2% galaktāna, 2,2% acetila, 14,3% lignīna, 1,7% olbaltumvielu un 13,4% pelnu.
Cellic® CTec2 (138 mg proteīna/ml, VCNI 0001 partija) ir komplekss celulāzes, β-glikozidāzes un Cellic® HTec2 (157 mg proteīna/ml, partija VHN00001) maisījums no Novozymes (Franklinton, NC, ASV)).Multifect Pectinase® (72 mg proteīna/ml), sarežģītu pektīnu noārdošo enzīmu maisījumu, ziedoja DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ASV).Fermentu proteīnu koncentrācijas tika noteiktas, novērtējot olbaltumvielu saturu (un atņemot neolbaltumvielu slāpekļa devu), izmantojot Kjeldāla slāpekļa analīzi (AOAC metode 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, ASV).Diatomīta zeme 545 tika iegādāta no EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivētā ogle (DARCO, 100 acu granulas), Avicel (PH-101), dižskābarža ksilāns un visas pārējās ķīmiskās vielas tika iegādātas no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX pirmapstrāde tika veikta GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ASV).Iepriekšēja apstrāde tika veikta 140°C temperatūrā 15 minūtes.46 uzturēšanās laiks bezūdens amonjaka attiecībā pret biomasu 1:1 pie 60% (w/w) iekraušanas nerūsējošā tērauda galda batch reaktorā (Parr Instruments Company).Pagāja 30 minūtes.Reaktors tika uzsildīts līdz 140 ° C, un amonjaks tika ātri atbrīvots, ļaujot biomasai ātri atgriezties istabas temperatūrā.AFEX iepriekš apstrādātas kukurūzas katla (ACS) sastāvs bija līdzīgs neapstrādātas kukurūzas katla (UT-CS) sastāvam.
ACSH 25% (w/w) ar augstu cietvielu saturu (apmēram 8% dekstrāna slodze) tika sagatavots kā izejmateriāls liela mēroga oligosaharīdu ražošanai.ACS fermentatīvā hidrolīze tika veikta, izmantojot komerciālu enzīmu maisījumu, tostarp Cellic® Ctec2 10 mg proteīna/g glikāna (iepriekš apstrādātā biomasā), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteīna/g glikāna un Multifect Pectinase (Genencor Inc, ASV).).), 5 mg proteīna/g dekstrāna.Fermentatīvā hidrolīze tika veikta 5 litru bioreaktorā ar darba tilpumu 3 litri, pH 4,8, 50°C un 250 apgr./min.Pēc 96 stundu hidrolīzes hidrolizātu savāca, centrifugējot pie 6000 apgr./min 30 minūtes un pēc tam ar ātrumu 14000 apgr./min 30 minūtes, lai noņemtu nehidrolizētas cietās vielas.Pēc tam hidrolizāts tika pakļauts sterilai filtrēšanai caur 0, 22 mm filtra vārglāzi.Filtrēto hidrolizātu uzglabāja sterilās pudelēs 4 °C temperatūrā un pēc tam frakcionēja uz ogles.
Uz ekstraktu balstītu biomasas paraugu sastāva analīze pēc NREL laboratorijas analīzes procedūrām: paraugu sagatavošana sastāva analīzei (NREL/TP-510-42620) un strukturālo ogļhidrātu un lignīna noteikšana biomasā (NREL/TP-510 – 42618)47.
Hidrolizāta plūsmas oligosaharīdu analīze tika veikta 2 ml mērogā, izmantojot uz autoklāvu balstītu skābes hidrolīzes metodi.Hidrolizāta paraugu sajauc ar 69,7 µl 72% sērskābes 10 ml kultivēšanas mēģenē ar skrūvējamu vāciņu un inkubē 1 stundu uz galda 121 °C temperatūrā, atdzesē uz ledus un filtrē augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) flakonā.Oligosaharīdu koncentrācija tika noteikta, no kopējās cukura koncentrācijas skābi hidrolizētajā paraugā atņemot monosaharīdu koncentrāciju nehidrolizētajā paraugā.
Glikozes, ksilozes un arabinozes koncentrācijas skābi hidrolizētajā biomasā tika analizētas, izmantojot Shimadzu HPLC sistēmu, kas aprīkota ar automātisko paraugu ņemšanas ierīci, kolonnas sildītāju, izokrātisko sūkni un refrakcijas indeksa detektoru uz Bio-Rad Aminex HPX-87H kolonnas.Kolonnu uzturēja 50 °C temperatūrā un eluēja ar 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 ūdenī.plūsma.
Hidrolizāta supernatants tika atšķaidīts un analizēts attiecībā uz monomēru un oligosaharīdu saturu.Monomērie cukuri, kas iegūti pēc fermentatīvās hidrolīzes, tika analizēti ar HPLC, kas aprīkots ar Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonnu un pelnu aizsargkolonnu.Kolonnas temperatūra tika uzturēta 80°C, kā kustīgā fāze tika izmantots ūdens ar plūsmas ātrumu 0,6 ml/min.Oligosaharīdi tika noteikti ar hidrolīzi atšķaidītā skābē 121 ° C temperatūrā saskaņā ar metodēm, kas aprakstītas atsaucē.41, 48, 49.
Saharīdu analīze tika veikta neapstrādātiem, iepriekš apstrādātiem ar AFEX un visiem nehidrolizētiem biomasas atlikumiem (ieskaitot sērijveida šūnu sieniņu ekstraktu ražošanu un to mAb skrīningu), izmantojot iepriekš aprakstītās procedūras 27, 43, 50, 51 .Glikomas analīzei spirtā nešķīstošas ​​augu šūnu sienas materiāla atliekas sagatavo no biomasas atliekām un pakļauj sērijveida ekstrakcijai ar arvien agresīvākiem reaģentiem, piemēram, amonija oksalātu (50 mM), nātrija karbonātu (50 mM un 0,5 % w/v), CON.(1M un 4M, abi ar 1% w/v nātrija borhidrīdu) un skābo hlorītu, kā aprakstīts iepriekš52,53.Pēc tam ekstrakti tika pakļauti ELISA pārbaudei pret sarežģītu mAb50 paneli, kas bija vērsts uz šūnu sienas glikānu, un mAb saistīšanās reakcijas tika parādītas kā siltuma karte.mAb, kuru mērķis ir augu šūnu sienas glikāns, tika iegādāti no laboratorijas krājumiem (CCRC, JIM un MAC sērijas).
Oligosaharīdu vienpakāpes biotinilēšana.Ogļhidrātu konjugācija ar biotīna-LC-hidrazīdu tika veikta, izmantojot šādu procedūru.Biotīna-LC-hidrazīds (4,6 mg/12 μmol) tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO, 70 μl), enerģiski maisot un karsējot 65 °C temperatūrā 1 minūti.Pievienoja ledus etiķskābi (30 µl) un maisījumu ielej nātrija ciānborhidrīdā (6,4 mg/100 µmol) un pilnībā izšķīdināja pēc karsēšanas 65 °C temperatūrā apmēram 1 minūti.Pēc tam no 5 līdz 8 μl reakcijas maisījuma pievienoja žāvētajam oligosaharīdam (1-100 nmol), lai iegūtu 10 reižu vai vairāk molāro pārpalikumu virs reducējošā gala.Reakcija tika veikta 65 ° C temperatūrā 2 stundas, pēc tam paraugi tika nekavējoties attīrīti.Marķēšanas eksperimentos bez reducēšanas neizmantoja nātrija ciānborhidrīdu, un paraugi tika reaģēti 65 ° C temperatūrā 2,5 stundas.
Biotinilēto oligosaharīdu paraugu ELISA pārklājums un mazgāšana.Katrai ar avidīnu pārklātās plāksnes iedobei pievienoja 25 μl biotinilētu paraugu (100 μl katra koncentrētā parauga, kas atšķaidīts ar 5 ml 0,1 M Tris buferšķīduma (TBS)).Kontroles iedobes tika pārklātas ar 50 μl biotīna koncentrācijā 10 μg/ml 0,1 M TBS.Dejonizēts ūdens tika izmantots kā pārklājums tukšajiem mērījumiem.Tableti inkubēja 2 stundas istabas temperatūrā tumsā.Nomazgājiet plāksni 3 reizes ar 0,1% vājpienu 0,1 M TBS, izmantojot programmu Nr.11 Grenjē dzīvoklim 3A.
Primāro antivielu pievienošana un mazgāšana.Katrai iedobei pievieno 40 µl primārās antivielas.Mikroplāksni inkubē 1 stundu istabas temperatūrā tumsā.Pēc tam plāksnes 3 reizes mazgāja ar 0,1% pienu 0,1 M TBS, izmantojot mazgāšanas programmu Nr. 11 Grenier Flat 3A.
Pievienojiet sekundāro antivielu un mazgājiet.Katrai iedobei pievienojiet 50 µl peles/žurkas sekundārās antivielas (atšķaidīta 1:5000 0,1% piena 0,1 M TBS).Mikroplāksni inkubē 1 stundu istabas temperatūrā tumsā.Pēc tam mikroplates 5 reizes mazgāja ar 0,1% pienu 0,1 M TBS, izmantojot Grenier Flat 5A plākšņu mazgāšanas programmu Nr. 12.
Substrāta pievienošana.Pievieno 50 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidīna (TMB) bāzes substrātam (pievienojot 2 pilienus buferšķīduma, 3 pilienus TMB, 2 pilienus ūdeņraža peroksīda 15 ml dejonizēta ūdens).Sagatavojiet TMB substrātu.un pirms lietošanas samaisa).Mikroplati inkubē istabas temperatūrā 30 minūtes.Tumsā.
Pabeidziet darbību un izlasiet planšetdatoru.Katrai iedobei pievieno 50 µl 1 N sērskābes un reģistrē absorbciju no 450 līdz 655 nm, izmantojot ELISA lasītāju.
Sagatavojiet 1 mg/ml šo analizējamo vielu šķīdumus dejonizētā ūdenī: arabinoze, ramnoze, fukoze, ksiloze, galakturonskābe (GalA), glikuronskābe (GlcA), manoze, glikoze, galaktoze, laktoze, N-acetilmannozamīns (manNAc), N-acetilglikozamīns.(glcNAc), N-acetilgalaktozamīns (galNAc), inozīts (iekšējais standarts).Divus standartus sagatavoja, pievienojot 1. tabulā norādītos 1 mg/mL cukura šķīdumus. Paraugus sasaldē un liofilizē -80°C, līdz tiek noņemts viss ūdens (parasti apmēram 12-18 stundas).
Pievienojiet 100–500 µg parauga mēģenēm ar skrūvējamu vāciņu uz analītisko svaru.Pierakstiet pievienoto summu.Vislabāk ir izšķīdināt paraugu noteiktā šķīdinātāja koncentrācijā un pievienot to mēģenē kā šķidruma alikvotu daļu.Katrai parauga mēģenei izmantojiet 20 µl 1 mg/ml inozīta kā iekšējo standartu.Paraugam pievienotā iekšējā standarta daudzumam jābūt tādam pašam kā standarta mēģenē pievienotā iekšējā standarta daudzumam.
Pievienojiet 8 ml bezūdens metanola flakonam ar skrūvējamu vāciņu.Pēc tam 4 ml 3 N HCl šķīduma metanolā, aizvāko un sakrata.Šajā procesā netiek izmantots ūdens.
Oligosaharīdu paraugiem un standarta TMS mēģenēm pievienojiet 500 µl 1 M HCl metanola šķīduma.Paraugus inkubēja nakti (168 stundas) 80 °C temperatūrā termiskā blokā.Metanolīzes produktu žāvē istabas temperatūrā, izmantojot žāvēšanas kolektoru.Pievienojiet 200 µl MeOH un vēlreiz nosusiniet.Šo procesu atkārto divas reizes.Paraugam pievieno 200 µl metanola, 100 µl piridīna un 100 µl etiķskābes anhidrīda un labi samaisa.Paraugus inkubēja istabas temperatūrā 30 minūtes.un žāvē.Pievieno 200 µl metanola un vēlreiz žāvē.
Pievienojiet 200 µl Tri-Sil un 20 minūtes karsējiet cauruli ar vāciņu.80°C, pēc tam atdzesē līdz istabas temperatūrai.Izmantojiet žāvēšanas kolektoru, lai tālāk nosusinātu paraugu līdz apmēram 50 µl tilpumam.Ir svarīgi atzīmēt, ka mēs neļāvām paraugiem pilnībā izžūt.
Pievienojiet 2 ml heksāna un labi samaisiet, maisot.Piepildiet Pasteur pipešu (5–8 mm) galus ar stikla vates gabalu, ievietojot stikla vati virs 5–3/4 collu diametra pipetes.Paraugus centrifugēja pie 3000 g 2 minūtes.Jebkuri nešķīstošie atlikumi tiek nogulsnēti.Izžāvējiet paraugu līdz 100-150 µl.Aptuveni 1 μl tilpums tika ievadīts GC-MS sākotnējā temperatūrā 80 ° C un sākotnējā laikā 2, 0 minūtes (2. tabula).