Faleminderit që vizituat Nature.com. Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar CSS. Për përvojën më të mirë, ne ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose të çaktivizoni Modalitetin e Përputhshmërisë në Internet Explorer). Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta paraqesim faqen pa stile dhe JavaScript.
Metoda të reja imunologjike dhe spektrometrike masive për analizën komplekse të oligosakarideve persistente në kokrrat e misrit të para-trajtuara me AFEX. Biomasa lignocelulozike është një alternativë e qëndrueshme ndaj lëndëve djegëse fosile dhe përdoret gjerësisht për të zhvilluar bioteknologji për prodhimin e produkteve të tilla si ushqimi, ushqimi për kafshët, lëndët djegëse dhe kimikatet. Çelësi i këtyre teknologjive është zhvillimi i proceseve konkurruese në kosto për shndërrimin e karbohidrateve komplekse të pranishme në muret qelizore të bimëve në sheqerna të thjeshtë si glukoza, ksiloza dhe arabinoza. Meqenëse biomasa lignocelulozike është shumë kokëfortë, ajo duhet t'i nënshtrohet trajtimeve termokimike (p.sh., eksfolimi i fibrave të amoniakut (AFEX), acidet e holluara (DA), lëngjet jonike (IL)) dhe trajtimeve biologjike (p.sh., hidroliza enzimatike dhe fermentimi mikrobik) në kombinim për të marrë produktin e dëshiruar. Megjithatë, kur enzimat komerciale kërpudhore përdoren në procesin e hidrolizës, vetëm 75-85% e sheqernave të tretshëm të formuar janë monosakaride, dhe 15-25% e mbetura janë oligosakaride të tretshme, të pazgjidhshme, të cilat nuk janë gjithmonë të disponueshme për mikroorganizmat. Më parë, ne kemi izoluar dhe pastruar me sukses oligosakaride kokëforta të tretshme duke përdorur një kombinim të kromatografisë së ndarjes dhe përjashtimit të madhësisë së karbonit dhe tokës diatomace, dhe gjithashtu kemi hetuar vetitë e tyre frenuese të enzimave. Ne kemi zbuluar se oligosakaridet që përmbajnë zëvendësime të acidit uronik të metiluar me shkallë më të lartë të polimerizimit (DP) janë më të vështira për t'u përpunuar me përzierje enzimash komerciale sesa oligosakaridet me DP të ulët dhe oligosakaridet neutrale. Këtu raportojmë përdorimin e disa metodave shtesë, duke përfshirë profilizimin e glikanit duke përdorur antitrupa monoklonalë (mAbs) specifikë për glikanet e biomasës së bimëve për të karakterizuar lidhjet e glikanit në muret qelizore të bimëve dhe hidrolizat enzimatike, jonizimin e desorbimit me lazer të asistuar nga matrica, spektrometrinë masive me kohë fluturimi. . MALDI-TOF-MS) përdor maja diagnostikuese informative për strukturën të marra nga spektroskopia pas zbërthimit sekondar të joneve negative, kromatografinë e gazit dhe spektrometrinë masive (GC-MS) për të karakterizuar lidhjet e oligosakarideve me dhe pa derivatizim. Për shkak të madhësisë së vogël të oligosakarideve (DP 4-20), këto molekula janë të vështira për t'u përdorur për lidhjen dhe karakterizimin e mAb. Për të kapërcyer këtë problem, ne aplikuam një metodë të re imobilizimi të oligosakarideve të bazuara në konjugimin e biotinës që etiketoi me sukses shumicën e oligosakarideve të tretshme me DP të ulët në sipërfaqen e mikropllakës, e cila më pas u përdor në një sistem mAb me rendiment të lartë për analizë specifike të ligacionit. Kjo metodë e re do të lehtësojë zhvillimin e analizave më të avancuara të glikomes me rendiment të lartë në të ardhmen që mund të përdoren për të izoluar dhe karakterizuar oligosakaridet e pranishme në biomarkues për qëllime diagnostikuese.
Biomasa lignocelulozike, e përbërë nga materiale bujqësore, pyjore, barishtore dhe drunore, është një lëndë e parë potenciale për prodhimin e produkteve me bazë bio, duke përfshirë ushqimin, kafshët për kafshë, karburantin dhe pararendësit kimikë për të prodhuar produkte me vlerë më të lartë1. Karbohidratet (si celuloza dhe hemiceluloza) të pranishme në muret qelizore të bimëve depolimerizohen në monosakaride me anë të përpunimit kimik dhe biotransformimit (si hidroliza enzimatike dhe fermentimi mikrobik). Para-trajtimet e zakonshme përfshijnë zgjerimin e fibrave të amoniakut (AFEX), acidin e holluar (DA), lëngun jonik (IL) dhe shpërthimin me avull (SE), të cilat përdorin një kombinim të kimikateve dhe nxehtësisë për të zvogëluar prodhimin e lignocelulozës duke hapur muret qelizore të bimëve3,4. kokëfortësia e materies, 5. Hidroliza enzimatike kryhet në një ngarkesë të lartë të lëndëve të ngurta duke përdorur enzima komerciale aktive që përmbajnë karbohidrate (CAZymes) dhe fermentim mikrobik duke përdorur maja ose baktere transgjenike për të prodhuar karburante dhe kimikate me bazë bio6.
CAZimet në enzimat komerciale përbëhen nga një përzierje komplekse enzimash që copëtojnë në mënyrë sinergjike lidhjet komplekse karbohidrate-sheqer për të formuar monosakaride2,7. Siç raportuam më parë, rrjeti kompleks i polimereve aromatike të ligninës me karbohidrate i bën ato shumë të vështira për t'u trajtuar, gjë që çon në shndërrim jo të plotë të sheqerit, duke grumbulluar 15-25% të oligosakarideve seksuale që nuk prodhohen gjatë hidrolizës enzimatike të biomasës së paratrajtuar. Ky është një problem i zakonshëm me metoda të ndryshme të paratrajtimit të biomasës. Disa arsye për këtë bllokim përfshijnë frenimin e enzimave gjatë hidrolizës, ose mungesën ose nivelet e ulëta të enzimave thelbësore thelbësore që kërkohen për të thyer lidhjet e sheqerit në biomasën e bimëve. Kuptimi i përbërjes dhe karakteristikave strukturore të sheqernave, të tilla si lidhjet e sheqerit në oligosakaride, do të na ndihmojë të përmirësojmë shndërrimin e sheqerit gjatë hidrolizës, duke i bërë proceset bioteknologjike konkurruese në kosto me produktet e derivuara nga nafta.
Përcaktimi i strukturës së karbohidrateve është sfidues dhe kërkon një kombinim metodash të tilla si kromatografia e lëngshme (LC)11,12, spektroskopia e rezonancës magnetike bërthamore (NMR)13, elektroforeza kapilare (CE)14,15,16 dhe spektrometria masive (MS)17. ,tetëmbëdhjetë. Metodat MS të tilla si spektrometria masive e kohës së fluturimit me desorbim dhe jonizim me lazer duke përdorur një matricë (MALDI-TOF-MS) janë një metodë e gjithanshme për identifikimin e strukturave të karbohidrateve. Kohët e fundit, MS në tandem me Disociim të Induktuar nga Përplasja (CID) e adukteve të joneve të natriumit është përdorur më gjerësisht për të identifikuar gjurmët e gishtërinjve që korrespondojnë me pozicionet e lidhjes së oligosakarideve, konfigurimet anomere, sekuencat dhe pozicionet e degëzimit 20, 21.
Analiza e glikanit është një mjet i shkëlqyer për identifikimin e thelluar të lidhjeve të karbohidrateve22. Kjo metodë përdor antitrupa monoklonalë (mAb) të drejtuar ndaj glikanit të murit qelizor të bimëve si sonda për të kuptuar lidhjet komplekse të karbohidrateve. Më shumë se 250 mAb janë të disponueshme në të gjithë botën, të projektuara kundër oligosakarideve të ndryshme lineare dhe të degëzuara duke përdorur sakaride të ndryshme24. Disa mAb janë përdorur gjerësisht për të karakterizuar strukturën, përbërjen dhe modifikimet e murit qelizor të bimëve, pasi ka dallime të konsiderueshme në varësi të llojit të qelizës bimore, organit, moshës, fazës së zhvillimit dhe mjedisit të rritjes25,26. Kohët e fundit, kjo metodë është përdorur për të kuptuar popullatat e fshikëzave në sistemet bimore dhe shtazore dhe rolet e tyre përkatëse në transportin e glikanit siç përcaktohet nga shënuesit nënqelizorë, fazat e zhvillimit ose stimujt mjedisorë, dhe për të përcaktuar aktivitetin enzimatik. Disa nga strukturat e ndryshme të glikaneve dhe ksilaneve që janë identifikuar përfshijnë pektinën (P), ksilanin (X), mananin (M), ksiloglukanet (XylG), glukanet me lidhje të përziera (MLG), arabinoksilanin (ArbX), galaktomananin (GalG), acidin glukuronik-arabinoksilanin (GArbX) dhe arabino-galaktanin (ArbG)29.
Megjithatë, pavarësisht të gjitha këtyre përpjekjeve kërkimore, vetëm disa studime janë përqendruar në natyrën e akumulimit të oligosakarideve gjatë hidrolizës së ngarkesës së lartë të lëndëve të ngurta (HSL), duke përfshirë çlirimin e oligosakarideve, ndryshimet e gjatësisë së zinxhirit oligomerik gjatë hidrolizës, polimere të ndryshme me DP të ulët dhe kurbat e tyre të shpërndarjes 30,31,32. Ndërkohë, megjithëse analiza e glikanit ka provuar të jetë një mjet i dobishëm për një analizë gjithëpërfshirëse të strukturës së glikanit, është e vështirë të vlerësohen oligosakaridet me DP të ulët të tretshme në ujë duke përdorur metoda antitrupash. Oligosakaridet më të vogla DP me një peshë molekulare më të vogël se 5-10 kDa nuk lidhen me pllakat ELISA 33, 34 dhe lahen para shtimit të antitrupave.
Këtu, për herë të parë, ne demonstrojmë një analizë ELISA në pllaka të veshura me avidinë duke përdorur antitrupa monoklonalë, duke kombinuar një procedurë biotinilimi me një hap për oligosakaridet refraktare të tretshme me analizën e glikomes. Qasja jonë ndaj analizës së glikomes u validua nga analiza e bazuar në MALDI-TOF-MS dhe GC-MS e lidhjeve plotësuese të oligosakarideve duke përdorur derivatizimin trimetilsilil (TMS) të përbërjeve të sheqerit të hidrolizuar. Kjo qasje inovative mund të zhvillohet si një metodë me rendiment të lartë në të ardhmen dhe të gjejë zbatim më të gjerë në kërkimin biomjekësor35.
Modifikimet post-translationale të enzimave dhe antitrupave, siç është glikozilimi,36 ndikojnë në aktivitetin e tyre biologjik. Për shembull, ndryshimet në glikozilimin e proteinave të serumit luajnë një rol të rëndësishëm në artritin inflamator, dhe ndryshimet në glikozilim përdoren si shënjues diagnostikues37. Në literaturë është raportuar se glikane të ndryshme shfaqen lehtësisht në një sërë sëmundjesh, duke përfshirë sëmundjet kronike inflamatore të traktit gastrointestinal dhe mëlçisë, infeksionet virale, kancerin e vezoreve, të gjirit dhe të prostatës38,39,40. Të kuptuarit e strukturës së glikaneve duke përdorur metodat ELISA të glikanit të bazuara në antitrupa do të ofrojë besim shtesë në diagnostikimin e sëmundjes pa përdorimin e metodave komplekse të MS.
Studimi ynë i mëparshëm tregoi se oligosakaridet kokëforta mbetën të pahidrolizuara pas para-trajtimit dhe hidrolizës enzimatike (Figura 1). Në punën tonë të botuar më parë, ne zhvilluam një metodë nxjerrjeje në fazë të ngurtë me qymyr aktiv për të izoluar oligosakaridet nga hidrolizati i misrit të pjekur (ACSH) i para-trajtuar me AFEX8. Pas nxjerrjes dhe ndarjes fillestare, oligosakaridet u fraksionuan më tej me kromatografinë e përjashtimit të madhësisë (SEC) dhe u mblodhën sipas peshës molekulare. Monomerët e sheqerit dhe oligomerët e lëshuar nga para-trajtime të ndryshme u analizuan me anë të analizës së përbërjes së sheqerit. Kur krahasohet përmbajtja e oligomerëve të sheqerit të përftuar nga metoda të ndryshme para-trajtimi, prania e oligosakarideve kokëforta është një problem i zakonshëm në shndërrimin e biomasës në monosakaride dhe mund të çojë në një ulje të rendimentit të sheqerit prej të paktën 10-15% dhe madje deri në 18%. SHBA. Kjo metodë përdoret për prodhim të mëtejshëm në shkallë të gjerë të fraksioneve të oligosakarideve. ACH që rezultoi dhe fraksionet e tij pasuese me pesha të ndryshme molekulare u përdorën si material eksperimental për karakterizimin e oligosakarideve në këtë punim.
Pas paratrajtimit dhe hidrolizës enzimatike, oligosakaridet persistente mbetën të pahidrolizuara. Këtu (A) është një metodë ndarjeje e oligosakarideve në të cilën oligosakaridet izolohen nga hidrolizati i misrit të paratrajtuar me AFEX (ACSH) duke përdorur një shtrat të paketuar karboni të aktivizuar dhe tokë diatomace; (B) Metoda për ndarjen e oligosakarideve. Oligosakaridet u ndanë më tej me kromatografi përjashtimi të madhësisë (SEC); (C) Monomere dhe oligomere sakaride të çliruara nga paratrajtime të ndryshme (acid i holluar: DA, lëng jonik: IL dhe AFEX). Kushtet e hidrolizës enzimatike: ngarkesë e lartë e lëndëve të ngurta prej 25% (p/p) (afërsisht 8% ngarkesë glukani), hidrolizë 96 orë, ngarkesë enzimatike komerciale 20 mg/g (raporti Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dhe (D) Monomere dhe oligomere sheqeri të glukozës, ksilozës dhe arabinozës të çliruara nga misri i paratrajtuar me AFEX (ACS).
Analiza e glikanit ka rezultuar të jetë një mjet i dobishëm për një analizë gjithëpërfshirëse strukturore të glikaneve në ekstrakte të izoluara nga mbetjet e ngurta të biomasës. Megjithatë, sakaridet e tretshme në ujë janë të nën-përfaqësuara duke përdorur këtë metodë tradicionale41 sepse oligosakaridet me peshë të ulët molekulare janë të vështira për t'u imobilizuar në pllakat ELISA dhe lahen para shtimit të antitrupave. Prandaj, për lidhjen dhe karakterizimin e antitrupave, u përdor një metodë biotinilimi me një hap për të veshur oligosakaridet e tretshme, jo-pajtueshme në pllakat ELISA të veshura me avidinë. Kjo metodë u testua duke përdorur ACSH-në tonë të prodhuar më parë dhe një fraksion bazuar në peshën e saj molekulare (ose shkallën e polimerizimit, DP). Biotinilimi me një hap u përdor për të rritur afinitetin e lidhjes së oligosakarideve duke shtuar biotinë-LC-hidrazid në skajin reduktues të karbohidratit (Fig. 2). Në tretësirë, grupi hemiacetal në skajin reduktues reagon me grupin hidrazid të biotinë-LC-hidrazid për të formuar një lidhje hidrazone. Në prani të agjentit reduktues NaCNBH3, lidhja e hidrazonit reduktohet në një produkt përfundimtar të qëndrueshëm të biotiniluar. Me modifikimin e skajit reduktues të sheqerit, lidhja e oligosakarideve me DP të ulët në pllakat ELISA u bë e mundur, dhe në studimin tonë kjo u bë në pllaka të veshura me avidinë duke përdorur mAb të synuara ndaj glikanit.
Shqyrtimi i antitrupave monoklonalë bazuar në ELISA për oligosakaride të biotiniluara. Këtu (A) kombinohet biotinilimi i oligosakarideve dhe shqyrtimi pasues ELISA me mAbs të synuara nga glikani në pllaka të veshura me NeutrAvidin dhe (B) tregohet një procedurë me një hap për biotinilimin e produkteve të reagimit.
Pllakat e veshura me avidinë me antitrupa të konjuguar me oligosakaride iu shtuan më pas antitrupave primarë dhe sekondarë dhe u lanë në një mjedis të ndjeshëm ndaj dritës dhe kohës. Pasi të përfundojë lidhja e antitrupave, shtoni substratin TMB për të inkubuar pllakën. Reaksioni u ndalua përfundimisht me acid sulfurik. Pllakat e inkubuara u analizuan duke përdorur një lexues ELISA për të përcaktuar forcën e lidhjes së secilit antitrup për të zbuluar lidhjen kryq specifike të antitrupave. Për detaje dhe parametra të eksperimentit, shihni seksionin përkatës "Materialet dhe Metodat".
Ne demonstrojmë dobinë e kësaj metode të zhvilluar rishtazi për aplikime specifike duke karakterizuar oligosakaridet e tretshme të pranishme në ACSH, si dhe në fraksionet e oligosakarideve të papërpunuara dhe të pastruara të izoluara nga hidrolizat lignocelulozike. Siç tregohet në Figurën 3, ksilanet më të zakonshme të zëvendësuara me epitop të identifikuara në ACSH duke përdorur metoda të analizës së glikomes bioaciluar janë zakonisht arabinogalaktanet uronike (U) ose metiluronik (MeU) dhe pektike. Shumica e tyre u gjetën edhe në studimin tonë të mëparshëm mbi analizën e glikaneve të lëndëve të ngurta jo të hidrolizuara (UHS)43.
Zbulimi i epitopeve të oligosakarideve rezistente duke përdorur një antitrup monoklonal të drejtuar ndaj glikanit të murit qelizor. Fraksioni "neutral" është fraksioni ACN dhe fraksioni "acid" është fraksioni FA. E kuqja më e ndritshme në hartën e nxehtësisë tregon përmbajtje më të lartë të epitopeve, dhe bluja më e ndritshme tregon një sfond bosh. Vlerat e ngjyrave në shkallë bazohen në vlerat e papërpunuara OD për formulimet N=2. Epitopet kryesore të njohura nga antitrupat tregohen në të djathtë.
Këto struktura jo-celuloze nuk mund të copëtoheshin nga celulazat dhe hemicelulat më të zakonshme në përzierjen enzimatike komerciale të testuar, e cila përfshin enzimat komerciale më të përdorura. Prandaj, për hidrolizën e tyre kërkohen enzima të reja ndihmëse. Pa enzimat ndihmëse të nevojshme jo-celuloze, këto lidhje jo-celuloze parandalojnë shndërrimin e plotë në monosakaride, edhe nëse polimerët e tyre mëmë të sheqerit hidrolizohen gjerësisht në fragmente më të shkurtra dhe treten duke përdorur përzierje enzimatike komerciale.
Studimi i mëtejshëm i shpërndarjes së sinjalit dhe fuqisë së tij të lidhjes tregoi se epitopet e lidhjes ishin më të ulëta në fraksionet e sheqerit me DP të lartë (A, B, C, DP deri në 20+) sesa në fraksionet me DP të ulët (D, E, F, DP) në dimere (Fig. 1). Fragmentet acide janë më të zakonshme në epitopet jo-celuloze sesa në fragmentet neutrale. Këto fenomene janë në përputhje me modelin e vërejtur në studimin tonë të mëparshëm, ku DP e lartë dhe pjesët acide ishin më rezistente ndaj hidrolizës enzimatike. Prandaj, prania e epitopeve të glikanit jo-celuloz dhe zëvendësimeve U dhe MeU mund të kontribuojë shumë në stabilitetin e oligosakarideve. Duhet të theksohet se efikasiteti i lidhjes dhe zbulimit mund të jetë problematik për oligosakaridet me DP të ulët, veçanërisht nëse epitopi është një oligosakarid dimerik ose trimerik. Kjo mund të testohet duke përdorur oligosakaride komerciale me gjatësi të ndryshme, secila prej të cilave përmban vetëm një epitop që lidhet me një mAb specifik.
Kështu, përdorimi i antitrupave specifikë të strukturës zbuloi lloje të caktuara të lidhjeve rezistente. Në varësi të llojit të antitrupit të përdorur, modelit të përshtatshëm të ligacionit dhe forcës së sinjalit që prodhon (më i bollshëm dhe më pak i bollshëm), enzima të reja mund të identifikohen dhe shtohen në mënyrë gjysmë-sasiore në përzierjen e enzimave për glikokonvertim më të plotë. Duke marrë si shembull analizën e oligosakarideve ACSH, ne mund të krijojmë një bazë të dhënash të lidhjeve glikane për secilin material biomase. Duhet të theksohet këtu se afiniteti i ndryshëm i antitrupave duhet të merret në konsideratë, dhe nëse afiniteti i tyre është i panjohur, kjo do të krijojë vështirësi të caktuara kur krahasohen sinjalet e antitrupave të ndryshëm. Përveç kësaj, krahasimi i lidhjeve glikane mund të funksionojë më mirë midis mostrave për të njëjtin antitrup. Këto lidhje kokëforta mund të lidhen më pas me bazën e të dhënave CAZyme, nga e cila ne mund të identifikojmë enzimat, të zgjedhim enzimat kandidate dhe të testojmë për enzima që prishin lidhjet, ose të zhvillojmë sisteme mikrobike për të shprehur këto enzima për përdorim në biorefineri44.
Për të vlerësuar se si metodat imunologjike plotësojnë metodat alternative për karakterizimin e oligosakarideve me peshë të ulët molekulare të pranishme në hidrolizat lignocelulozike, ne kryem MALDI (Fig. 4, S1-S8) dhe analizën e sakarideve të derivuara nga TMS bazuar në GC-MS në të njëjtën pjesë të oligosakarideve të panelit (Fig. 5). MALDI përdoret për të krahasuar nëse shpërndarja masive e molekulave të oligosakarideve përputhet me strukturën e synuar. Në fig. 4 tregohet MC e komponentëve neutralë ACN-A dhe ACN-B. Analiza ACN-A konfirmoi një gamë sheqernash pentozë që variojnë nga DP 4-8 (Fig. 4) deri në DP 22 (Fig. S1), peshat e të cilave korrespondojnë me oligosakaridet MeU-ksilan. Analiza ACN-B konfirmoi serinë e pentozës dhe glukoksilanit me DP 8-15. Në materialin plotësues siç është Figura S3, hartat e shpërndarjes masive të pjesës acidike FA-C tregojnë një gamë sheqernash pentozë të zëvendësuara me (Me)U me një DP prej 8-15 që janë në përputhje me ksilanet e zëvendësuara të gjetura në shqyrtimin mAb të bazuar në ELISA. Epitopet janë konsistente.
Spektri MALDI-MS i oligosakarideve të tretshme jo-pajtueshme të pranishme në ACS. Këtu, (A) fraksione me peshë të ulët ACN-A që përmbajnë oligosakaride glukuroksilane të zëvendësuara me acid uronik të metiluar (DP 4-8) dhe (B) oligosakaride ACN-B të ksilanit dhe acidit uronik të metiluar të zëvendësuara me glukuroksilan (DP 8-15).
Analiza e përbërjes së mbetjes së glikanit të oligosakarideve refraktare. Këtu (A) Përbërja e sakarideve TMS të fraksioneve të ndryshme të oligosakarideve të marra duke përdorur analizën GC-MS. (B) Strukturat e sheqernave të ndryshme të derivuara nga TMS të pranishme në oligosakaride. ACN - fraksioni i acetonitrilit që përmban oligosakaride neutrale dhe FA - fraksioni i acidit ferulik që përmban oligosakaride acide.
Një tjetër përfundim interesant u nxor nga analiza LC-MS e fraksionit të oligosakarideve, siç tregohet në Figurën S9 (metodat mund të shihen në materialin plotësues elektronik). Fragmente të grupeve heksoze dhe -OAc u vunë re në mënyrë të përsëritur gjatë lidhjes së fraksionit ACN-B. Ky zbulim jo vetëm që konfirmon fragmentimin e vërejtur në analizën e glikomes dhe MALDI-TOF, por gjithashtu ofron informacione të reja rreth derivateve të mundshme të karbohidrateve në biomasën lignocelulozike të para-trajtuar.
Gjithashtu analizuam përbërjen e sheqerit të fraksionit të oligosakarideve duke përdorur derivatizimin e sheqerit TMS. Duke përdorur GC-MS, përcaktuam përbërjen e sheqernave neurale (jo-derivative) dhe acidike (GluA dhe GalA) në fraksionin e oligosakarideve (Fig. 5). Acidi glukuronik gjendet në përbërësit acidikë C dhe D, ndërsa acidi galakturonik gjendet në përbërësit acidikë A dhe B, të dy prej të cilëve janë përbërës me DP të lartë të sheqernave acidikë. Këto rezultate jo vetëm që konfirmojnë të dhënat tona ELISA dhe MALDI, por janë gjithashtu në përputhje me studimet tona të mëparshme të akumulimit të oligosakarideve. Prandaj, ne besojmë se metodat moderne imunologjike që përdorin biotinilimin e oligosakarideve dhe shqyrtimin pasues ELISA janë të mjaftueshme për të zbuluar oligosakaride të tretshme rezistente në mostra të ndryshme biologjike.
Meqenëse metodat e shqyrtimit të mAb bazuar në ELISA janë validuar me disa metoda të ndryshme, ne donim të eksploronim më tej potencialin e kësaj metode të re sasiore. Dy oligosakaride komerciale, oligosakaridi ksiloheksakarid (XHE) dhe 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioza (A2XX), u blenë dhe u testuan duke përdorur një qasje të re mAb që synon glikanin e murit qelizor. Figura 6 tregon një korrelacion linear midis sinjalit të lidhjes së biotiniluar dhe përqendrimit logaritmik të përqendrimit të oligosakaridit, duke sugjeruar një model të mundshëm të adsorbimit Langmuir. Midis mAb-ve, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 dhe CCRC-M151 korreluan me XHE, dhe CCRC-M108, CCRC-M109 dhe LM11 korreluan me A2XX në një interval prej 1 nm deri në 100 nano. Për shkak të disponueshmërisë së kufizuar të antitrupave gjatë eksperimentit, u kryen eksperimente të kufizuara me secilin përqendrim oligosakaridi. Duhet theksuar këtu se disa antitrupa reagojnë shumë ndryshe ndaj të njëjtit oligosakarid si substrat, me sa duket sepse ato lidhen me epitope paksa të ndryshme dhe mund të kenë afinitete shumë të ndryshme lidhëse. Mekanizmat dhe implikimet e identifikimit të saktë të epitopeve do të jenë shumë më komplekse kur qasja e re e mAb të zbatohet në mostrat reale.
Dy oligosakaride komerciale u përdorën për të përcaktuar diapazonin e zbulimit të mAb-ve të ndryshme që synojnë glikanin. Këtu, korrelacionet lineare me përqendrimin logaritmik të përqendrimit të oligosakarideve tregojnë modelet e adsorbimit Langmuir për (A) XHE me mAb dhe (B) A2XX me mAb. Epitopet përkatëse tregojnë strukturat e oligosakarideve komerciale të përdorura si substrate në analizë.
Përdorimi i antitrupave monoklonalë të synuar ndaj glikanit (analiza glikokomike ose shqyrtimi i mAb-ve të bazuara në ELISA) është një mjet i fuqishëm për karakterizimin e thelluar të shumicës së glikaneve kryesore të murit qelizor që përbëjnë biomasën e bimëve. Megjithatë, analiza klasike e glikanit karakterizon vetëm glikanet më të mëdha të murit qelizor, pasi shumica e oligosakarideve nuk imobilizohen në mënyrë efikase në pllakat ELISA. Në këtë studim, misri i pjekur i para-trajtuar me AFEX u hidrolizua enzimatikisht në një përmbajtje të lartë të lëndëve të ngurta. Analiza e sheqerit u përdor për të përcaktuar përbërjen e karbohidrateve të murit qelizor rezistent në hidrolizat. Megjithatë, analiza e mAb-ve të oligosakarideve më të vogla në hidrolizate është nënvlerësuar dhe nevojiten mjete shtesë për të imobilizuar në mënyrë efektive oligosakaridet në pllakat ELISA.
Ne raportojmë këtu një metodë të re dhe efikase të imobilizimit të oligosakarideve për shqyrtimin e mAb duke kombinuar biotinilimin e oligosakarideve të ndjekur nga shqyrtimi ELISA në pllaka të veshura NeutrAvidin™. Oligosakaridet e biotiniluara të imobilizuara treguan afinitet të mjaftueshëm për antitrupin për të mundësuar zbulimin e shpejtë dhe efikas të oligosakarideve rezistente. Analiza e përbërjes së këtyre oligosakarideve kokëforta bazuar në spektrometrinë masive konfirmoi rezultatet e kësaj qasje të re ndaj imunoskriningut. Kështu, këto studime tregojnë se kombinimi i biotinilimit të oligosakarideve dhe shqyrtimit ELISA me antitrupa monoklonalë të synuar ndaj glikanit mund të përdoret për të zbuluar lidhjet kryq në oligosakaride dhe mund të aplikohet gjerësisht në studime të tjera biokimike që karakterizojnë strukturën e oligosakarideve.
Kjo metodë e profilizimit të glikanit me bazë biotinë është raporti i parë i aftë të hetojë lidhjet e forta të karbohidrateve të oligosakarideve të tretshme në biomasën bimore. Kjo ndihmon për të kuptuar pse disa pjesë të biomasës janë kaq kokëforta kur bëhet fjalë për prodhimin e biokarburantit. Kjo metodë mbush një boshllëk të rëndësishëm në metodat e analizës së glikomes dhe zgjeron zbatimin e saj në një gamë më të gjerë substratesh përtej oligosakarideve bimore. Në të ardhmen, ne mund të përdorim robotikën për biotinilimin dhe të përdorim metodën që kemi zhvilluar për analizë me rendiment të lartë të mostrave duke përdorur ELISA.
Kashta e misrit (CS) e rritur nga farat hibride Pioneer 33A14 u korr në vitin 2010 nga Kramer Farms në Ray, Kolorado. Me lejen e pronarit të tokës, kjo biomasë mund të përdoret për kërkime. Mostrat u ruajtën të thata me < 6% lagështirë në qese me mbyllje zip në temperaturë ambienti. Mostrat u ruajtën të thata me < 6% lagështirë në qese me mbyllje zip në temperaturë ambienti. Obrazцы храниль сухими при влажности < 6% në paketat me përстежкой-молнией при комнатной температура. Mostrat u ruajtën të thata me lagështi <6% në qese me zipe në temperaturë ambienti.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Mostrat ruhen në qese me zip në temperaturë ambienti me lagështi < 6%.Studimi u krye në përputhje me udhëzimet lokale dhe kombëtare. Analiza e përbërjes u krye duke përdorur protokollin NREL. U zbulua se përbërja përmbante 31.4% glukan, 18.7% ksilan, 3.3% arabinan, 1.2% galaktan, 2.2% acetil, 14.3% ligninë, 1.7% proteina dhe 13.4% hi.
Cellic® CTec2 (138 mg proteinë/ml, loti VCNI 0001) është një përzierje komplekse e celulazës, β-glukozidazës dhe Cellic® HTec2 (157 mg proteinë/ml, loti VHN00001) nga Novozymes (Franklinton, NC, SHBA)). Multifect Pectinase® (72 mg proteinë/mL), një përzierje komplekse e enzimave që zbërthejnë pektinën, u dhurua nga DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SHBA). Përqendrimet e proteinave enzimatike u përcaktuan duke vlerësuar përmbajtjen e proteinave (dhe duke zbritur kontributin e azotit jo-proteinik) duke përdorur analizën e azotit Kjeldahl (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SHBA). Toka diatomaceze 545 u ble nga EMD Millipore (Billerica, MA). Karboni i aktivizuar (DARCO, granula 100 mesh), Avicel (PH-101), ksilani i ahut dhe të gjitha kimikatet e tjera u blenë nga Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Para-trajtimi me AFEX u krye në GLBRC (Laboratori i Kërkimeve për Konvertimin e Biomasës, MSU, Lansing, MI, SHBA). Para-trajtimi u krye në 140°C për 15 minuta. Koha e qëndrimit në raportin 1:1 të amoniakut anhidrik ndaj biomasës me ngarkesë 60% (p/p) në një reaktor pune prej çeliku inox (Parr Instruments Company). Zgjati 30 minuta. Reaktori u soll në 140°C dhe amoniaku u çlirua me shpejtësi, duke lejuar që biomasa të kthehej shpejt në temperaturën e dhomës. Përbërja e misrit të para-trajtuar (ACS) të AFEX ishte e ngjashme me atë të misrit të patrajtuar (UT-CS).
ACSH me përmbajtje të lartë të lëndëve të ngurta 25% (p/p) (afërsisht 8% ngarkesë dekstrani) u përgatit si material fillestar për prodhimin në shkallë të gjerë të oligosakarideve. Hidroliza enzimatike e ACS u krye duke përdorur një përzierje enzimash komerciale që përfshin Cellic® Ctec2 10 mg proteinë/g glukan (në biomasë të para-trajtuar), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteinë/g glukan, dhe Multifect Pectinase (Genencor Inc, SHBA). ), 5 mg proteinë/g dekstran. Hidroliza enzimatike u krye në një bioreaktor 5 litrash me një vëllim pune prej 3 litrash, pH 4.8, 50°C dhe 250 rpm. Pas hidrolizës për 96 orë, hidrolizati u mblodh me anë të centrifugimit në 6000 rpm për 30 minuta dhe më pas në 14000 rpm për 30 minuta për të hequr lëndët e ngurta të pahidrolizuara. Hidrolizati iu nënshtrua më pas filtrimit steril përmes një gote filtri 0.22 mm. Hidrolizati i filtruar u ruajt në shishe sterile në 4°C dhe më pas u fraksionua në karbon.
Analiza e përbërjes së mostrave të biomasës me bazë ekstrakti sipas procedurave të analizës laboratorike NREL: përgatitja e mostrave për analizën e përbërjes (NREL/TP-510-42620) dhe përcaktimi i karbohidrateve strukturore dhe ligninës në biomasë (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza e oligosakarideve të rrjedhës së hidrolizës u krye në një shkallë 2 ml duke përdorur një metodë hidrolize acide të bazuar në autoklavë. Përzieni mostrën e hidrolizës me 69.7 µl acid sulfurik 72% në një tub kulture me kapak vidë 10 ml dhe inkubojeni për 1 orë në një tavolinë pune në 121 °C, ftoheni në akull dhe filtrojeni në një flakon me kromatografi të lëngshme me performancë të lartë (HPLC). Përqendrimi i oligosakarideve u përcaktua duke zbritur përqendrimin e monosakarideve në mostrën e pahidrolizuar nga përqendrimi total i sheqerit në mostrën e hidrolizuar me acid.
Përqendrimet e glukozës, ksilozës dhe arabinozës në biomasën e hidrolizuar me acid u analizuan duke përdorur një sistem Shimadzu HPLC të pajisur me një automompler, ngrohës kolone, pompë izokratike dhe detektor të indeksit të thyerjes në një kolonë Bio-Rad Aminex HPX-87H. Kolona u mbajt në 50°C dhe u elua me 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 në ujë.
Supernatanti i hidrolizatit u hollua dhe u analizua për përmbajtjen e monomerit dhe oligosakarideve. Sheqernat monomerike të marra pas hidrolizës enzimatike u analizuan me anë të HPLC të pajisur me një kolonë Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dhe një kolonë mbrojtëse nga hiri. Temperatura e kolonës u mbajt në 80°C, uji u përdor si fazë e lëvizshme me një shpejtësi rrjedhjeje prej 0.6 ml/min. Oligosakaridet u përcaktuan me anë të hidrolizës në acid të holluar në 121°C sipas metodave të përshkruara në refs. 41, 48, 49.
Analiza e sakarideve u krye në mbetjet e biomasës së papërpunuar, të para-trajtuara me AFEX dhe të gjitha mbetjet e jo-hidrolizuara (duke përfshirë prodhimin e ekstrakteve serike të murit qelizor dhe shqyrtimin e tyre të mAb) duke përdorur procedurat e përshkruara më parë 27, 43, 50, 51. Për analizën e glikomes, mbetjet e patretshme në alkool të materialit të murit qelizor të bimëve përgatiten nga mbetjet e biomasës dhe i nënshtrohen nxjerrjes serike me reagentë gjithnjë e më agresivë si oksalati i amonit (50 mM), karbonati i natriumit (50 mM dhe 0.5% w/v), CON. (1M dhe 4M, të dyja me 1% w/v borohidrid natriumi) dhe kloriti acid siç është përshkruar më parë 52,53. Ekstraktet iu nënshtruan më pas ELISA-s kundrejt një paneli kompleks të mAb50 të drejtuara në glikanin e murit qelizor, dhe reaksionet e lidhjes së mAb u paraqitën si një hartë nxehtësie. mAb-të që synojnë glikanin e murit qelizor të bimëve u blenë nga stoqet laboratorike (seritë CCRC, JIM dhe MAC).
Biotinilimi me një hap i oligosakarideve. Konjugimi i karbohidrateve me biotin-LC-hidrazid u krye duke përdorur procedurën e mëposhtme. Biotin-LC-hidrazid (4.6 mg/12 μmol) u tret në dimetil sulfoksid (DMSO, 70 μl) duke e trazuar dhe ngrohur fuqishëm në 65°C për 1 minutë. U shtua acid acetik akullnajor (30 μl) dhe përzierja u derdh mbi cianoborohidrid natriumi (6.4 mg/100 μmol) dhe u tret plotësisht pas ngrohjes në 65°C për rreth 1 minutë. Pastaj, nga 5 deri në 8 μl të përzierjes së reagimit iu shtuan oligosakarideve të thara (1-100 nmol) për të marrë një tepricë molare 10-fish ose më shumë të etiketës mbi skajin reduktues. Reaksioni u krye në 65°C për 2 orë, pas së cilës mostrat u pastruan menjëherë. Në eksperimentet e etiketimit nuk u përdor cianoborohidrid natriumi pa reduktim dhe mostrat u reaguan në 65°C për 2.5 orë.
Veshja dhe larja ELISA e mostrave të oligosakarideve të biotiniluara. 25 μl mostra të biotiniluara (100 μl të secilës mostër të koncentruar të holluar në 5 ml tretësirë ​​tampon Tris 0.1 M (TBS)) u shtuan në secilën pus të pllakës së veshur me avidinë. Puset e kontrollit u veshën me 50 μl biotinë në një përqendrim prej 10 μg/ml në 0.1 M TBS. Uji i deionizuar u përdor si shtresë për matjet bosh. Tableta u inkubua për 2 orë në temperaturë ambienti në errësirë. Lani pllakën 3 herë me qumësht të skremuar 0.1% në 0.1 M TBS duke përdorur programin nr. 11 për Grenier flat 3A.
Shtimi dhe larja e antitrupave primarë. Shtoni 40 µl antitrup primarë në secilën pus. Inkuboni mikropllakën për 1 orë në temperaturë ambienti në errësirë. Pllakat më pas u lanë 3 herë me qumësht 0.1% në 0.1M TBS duke përdorur programin e larjes #11 për Grenier Flat 3A.
Shtoni antitrupin sekondar dhe lajeni. Shtoni 50 µl antitrup sekondar miu/miu (të holluar 1:5000 në qumësht 0.1% në 0.1 M TBS) në secilën pus. Inkuboni mikropllakën për 1 orë në temperaturë ambienti në errësirë. Mikropllakat më pas u lanë 5 herë me qumësht 0.1% në 0.1 M TBS duke përdorur programin e larjes së pllakave Grenier Flat 5A #12.
Shtimi i një substrati. Shtoni 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidinë (TMB) në substratin bazë (duke shtuar 2 pika tampon, 3 pika TMB, 2 pika peroksid hidrogjeni në 15 ml ujë të deionizuar). Përgatitni substratin TMB dhe përziejeni në vorteks para përdorimit). Inkuboni mikropllakën në temperaturë ambienti për 30 minuta. Në errësirë.
Përfundoni hapin dhe lexoni tabletën. Shtoni 50 µl acid sulfurik 1 N në secilën puset dhe regjistroni absorbimin nga 450 në 655 nm duke përdorur një lexues ELISA.
Përgatitni tretësira 1 mg/ml të këtyre analitëve në ujë të deionizuar: arabinozë, ramnozë, fukozë, ksilozë, acid galakturonik (GalA), acid glukuronik (GlcA), manozë, glukozë, galaktozë, laktozë, N-acetilmanozaminë (manNAc), N-acetilglukozaminë (glcNAc), N-acetilgalaktozëminë (galNAc), inozitol (standard i brendshëm). U përgatitën dy standarde duke shtuar tretësirat e sheqerit 1 mg/mL të paraqitura në Tabelën 1. Mostrat ngrihen dhe liofilizohen në -80°C derisa të hiqet i gjithë uji (zakonisht rreth 12-18 orë).
Shtoni 100–500 µg mostër në tubat me kapak vidhos në një peshore analitike. Regjistroni sasinë e shtuar. Është mirë që mostra të tretet në një përqendrim specifik të tretësit dhe të shtohet në tub si alikuot i lëngshëm. Përdorni 20 µl inozitol 1 mg/ml si standard të brendshëm për secilin tub mostre. Sasia e standardit të brendshëm të shtuar në mostër duhet të jetë e njëjtë me sasinë e standardit të brendshëm të shtuar në tubin standard.
Shtoni 8 ml metanol anhidër në një shishe me kapak vidë. Pastaj shtoni 4 ml tretësirë ​​metanolike HCl 3 N, mbylleni kapakun dhe tundeni. Ky proces nuk përdor ujë.
Shtoni 500 µl tretësirë ​​metanoli HCl 1 M në mostrat e oligosakarideve dhe tubat standardë TMS. Mostrat u inkubuan gjatë natës (168 orë) në 80°C në një bllok termik. Thani produktin e metanolizës në temperaturë ambienti duke përdorur një kolektor tharjeje. Shtoni 200 µl MeOH dhe thajeni përsëri. Ky proces përsëritet dy herë. Shtoni 200 µl metanol, 100 µl piridinë dhe 100 µl anhidrid acetik në mostër dhe përzieni mirë. Mostrat u inkubuan në temperaturë ambienti për 30 minuta dhe u thanë. Shtoni 200 µl metanol dhe thajini përsëri.
Shtoni 200 µl Tri-Sil dhe ngrohni tubin me kapak për 20 minuta. 80°C, pastaj ftoheni në temperaturën e dhomës. Përdorni një kolektor tharjeje për të tharë më tej mostrën deri në një vëllim prej afërsisht 50 µl. Është e rëndësishme të theksohet se nuk i lamë mostrat të thahen plotësisht.
Shtoni 2 ml hekzan dhe përzieni mirë duke e përzier në vorteks. Mbushni majat e pipetave Pasteur (5-8 mm) me një copë lesh xhami duke e futur atë sipër një pipete me diametër 5-3/4 inç. Mostrat u centrifuguan në 3000 g për 2 minuta. Çdo mbetje e patretshme precipitoi. Thajeni mostrën deri në 100-150 µl. Një vëllim prej afërsisht 1 μl u injektua në GC-MS në një temperaturë fillestare prej 80 °C dhe një kohë fillestare prej 2.0 minutash (Tabela 2).