Faleminderit që vizituat Nature.com.Versioni i shfletuesit që po përdorni ka mbështetje të kufizuar për CSS.Për përvojën më të mirë, ju rekomandojmë të përdorni një shfletues të përditësuar (ose çaktivizoni modalitetin e përputhshmërisë në Internet Explorer).Ndërkohë, për të siguruar mbështetje të vazhdueshme, ne do ta bëjmë faqen pa stile dhe JavaScript.
Metodat e reja imunologjike dhe spektrometrike të masës për analizën komplekse të oligosakarideve persistente në stofin e misrit të paratrajtuar me AFEX.Biomasa lignocelulozike është një alternativë e qëndrueshme ndaj lëndëve djegëse fosile dhe përdoret gjerësisht për zhvillimin e bioteknologjive për prodhimin e produkteve të tilla si ushqimi, ushqimi, lëndët djegëse dhe kimikatet.Çelësi i këtyre teknologjive është zhvillimi i proceseve me kosto konkurruese për konvertimin e karbohidrateve komplekse të pranishme në muret e qelizave bimore në sheqerna të thjeshta si glukoza, ksiloza dhe arabinoza.Për shkak se biomasa lignocelulozike është shumë kokëfortë, ajo duhet t'i nënshtrohet trajtimeve termokimike (p.sh., eksfolimi i fibrave të amoniakut (AFEX), acidet e holluara (DA), lëngjet jonike (IL)) dhe trajtimet biologjike (p.sh. hidroliza enzimatike dhe fermentimi mikrobial) në kombinim për të marrë produktin e dëshiruar..Megjithatë, kur enzimat kërpudhore komerciale përdoren në procesin e hidrolizës, vetëm 75-85% e sheqernave të tretshme të formuara janë monosakaride, dhe 15-25% e mbetur janë oligosakaride të tretshme, të patrajtueshme, të cilat nuk janë gjithmonë të disponueshme për mikroorganizmat.Më parë, ne kemi izoluar dhe pastruar me sukses oligosakaridet kokëfortë të tretshëm duke përdorur një kombinim të ndarjes së karbonit dhe tokës diatomike dhe kromatografisë me përjashtim të madhësisë, dhe gjithashtu kemi hetuar vetitë e tyre frenuese të enzimës.Ne kemi zbuluar se oligosakaridet që përmbajnë zëvendësime të acidit uronik të metiluar të shkallës më të lartë të polimerizimit (DP) janë më të vështira për t'u përpunuar me përzierje enzimash komerciale sesa oligosakaridet me DP të ulët dhe neutral.Këtu ne raportojmë përdorimin e disa metodave shtesë, duke përfshirë profilizimin e glikanit duke përdorur antitrupa monoklonale (mAbs) specifike për glikanet e biomasës së bimëve për të karakterizuar lidhjet glikanike në muret e qelizave bimore dhe hidrolizat enzimatike, jonizimin e desorbimit me lazer me ndihmën e matricës, spektrometrinë e masës së kohës së fluturimit..MALDI-TOF-MS) përdor majat diagnostike struktura-informative të marra nga spektroskopia pas zbërthimit sekondar të joneve negative, kromatografia e gazit dhe spektrometria e masës (GC-MS) për të karakterizuar lidhjet oligosakaride me dhe pa derivatizim.Për shkak të madhësisë së vogël të oligosakarideve (DP 4-20), këto molekula janë të vështira për t'u përdorur për lidhjen dhe karakterizimin e mAb.Për të kapërcyer këtë problem, ne aplikuam një metodë të re të imobilizimit të oligosakarideve të bazuar në konjugimin e biotinës, e cila etiketoi me sukses shumicën e oligosakarideve të tretshme me DP të ulët në sipërfaqen e mikropllakës, e cila më pas u përdor në një sistem mAb me xhiro të lartë për analiza specifike të lidhjes.Kjo metodë e re do të lehtësojë zhvillimin e analizave më të avancuara të glikomit me kapacitet të lartë në të ardhmen që mund të përdoren për të izoluar dhe karakterizuar oligosakaridet e pranishme në biomarkerët për qëllime diagnostikuese.
Biomasa lignocelulozike, e përbërë nga materiale bujqësore, pyjore, bari dhe drunore, është një lëndë fillestare e mundshme për prodhimin e produkteve me bazë bio, duke përfshirë ushqimin, ushqimin, lëndët djegëse dhe prekursorët kimikë për të prodhuar produkte me vlerë më të lartë1.Karbohidratet (të tilla si celuloza dhe hemiceluloza) të pranishme në muret e qelizave bimore depolimerizohen në monosakaride nga përpunimi kimik dhe biotransformimi (si hidroliza enzimatike dhe fermentimi mikrobial).Para-trajtimet e zakonshme përfshijnë zgjerimin e fibrës së amoniakut (AFEX), acidin e holluar (DA), lëngun jonik (IL) dhe shpërthimin me avull (SE), të cilat përdorin një kombinim kimikatesh dhe nxehtësie për të reduktuar prodhimin e lignocelulozës duke hapur muret e qelizave bimore3,4.kokëfortësia e materies, 5. Hidroliza enzimatike kryhet me një ngarkesë të lartë të lëndëve të ngurta duke përdorur enzima komerciale aktive që përmbajnë karbohidrate (CAZymes) dhe fermentim mikrobik duke përdorur maja ose baktere transgjenike për të prodhuar lëndë djegëse dhe kimikate me bazë bio6.
CAZymet në enzimat komerciale përbëhen nga një përzierje komplekse enzimash që në mënyrë sinergjike çajnë lidhjet komplekse karbohidrate-sheqer për të formuar monosakaride2,7.Siç u raportua më herët, rrjeti kompleks i polimereve aromatike të linjinës me karbohidratet i bën ato shumë të papërshkueshme, gjë që çon në konvertimin jo të plotë të sheqerit, duke grumbulluar 15-25% të oligosakarideve seksuale që nuk prodhohen gjatë hidrolizës enzimatike të biomasës së paratrajtuar.Ky është një problem i zakonshëm me metoda të ndryshme të paratrajtimit të biomasës.Disa arsye për këtë pengesë përfshijnë frenimin e enzimës gjatë hidrolizës, ose mungesën ose nivelet e ulëta të enzimeve thelbësore thelbësore që kërkohen për të thyer lidhjet e sheqerit në biomasën e bimëve.Të kuptuarit e përbërjes dhe karakteristikave strukturore të sheqernave, të tilla si lidhjet e sheqerit në oligosakaridet, do të na ndihmojë të përmirësojmë konvertimin e sheqerit gjatë hidrolizës, duke i bërë proceset bioteknologjike me kosto konkurruese me produktet me prejardhje nafte.
Përcaktimi i strukturës së karbohidrateve është sfidues dhe kërkon një kombinim metodash si kromatografia e lëngshme (LC) 11,12, spektroskopia e rezonancës magnetike bërthamore (NMR)13, elektroforeza kapilare (CE)14,15,16 dhe spektrometria e masës (MS)17., tetëmbëdhjetë.Metodat MS të tilla si spektrometria e masës së kohës së fluturimit me desorbimin dhe jonizimin me lazer duke përdorur një matricë (MALDI-TOF-MS) janë një metodë e gjithanshme për identifikimin e strukturave të karbohidrateve.Kohët e fundit, MS-ja e bashku me disociim të nxitur nga përplasja (CID) të addukteve të joneve të natriumit është përdorur më gjerësisht për të identifikuar gjurmët e gishtërinjve që korrespondojnë me pozicionet e lidhjes së oligosakarideve, konfigurimet anomerike, sekuencat dhe pozicionet e degëzimit 20, 21.
Analiza e glikanit është një mjet i shkëlqyer për identifikimin e thellë të lidhjeve karbohidrate22.Kjo metodë përdor antitrupa monoklonale (mAbs) të drejtuara ndaj glikanit të murit qelizor të bimëve si sonda për të kuptuar lidhjet komplekse të karbohidrateve.Më shumë se 250 mAbs janë të disponueshëm në mbarë botën, të dizajnuara kundër oligosakarideve të ndryshme lineare dhe të degëzuara duke përdorur saharide të ndryshme24.Disa mAb janë përdorur gjerësisht për të karakterizuar strukturën, përbërjen dhe modifikimet e murit qelizor bimor, pasi ka dallime domethënëse në varësi të llojit të qelizave bimore, organit, moshës, fazës së zhvillimit dhe mjedisit të rritjes25,26.Kohët e fundit, kjo metodë është përdorur për të kuptuar popullatat e vezikulave në sistemet e bimëve dhe kafshëve dhe rolet e tyre përkatëse në transportin e glikanit siç përcaktohet nga shënuesit nënqelizor, fazat e zhvillimit ose stimujt mjedisorë dhe për të përcaktuar aktivitetin enzimatik.Disa nga strukturat e ndryshme të glikaneve dhe ksilaneve që janë identifikuar përfshijnë pektinën (P), ksilanin (X), mananin (M), ksiloglukanet (XylG), glukanet e lidhjeve të përziera (MLG), arabinoksilanin (ArbX), galaktomananin (GalG) , acidin glukuronik-arabinoksilan (GA).
Megjithatë, përkundër të gjitha këtyre përpjekjeve kërkimore, vetëm disa studime janë fokusuar në natyrën e akumulimit të oligosakarideve gjatë hidrolizës me ngarkesë të lartë të lëndëve të ngurta (HSL), duke përfshirë çlirimin e oligosakarideve, ndryshimet e gjatësisë së zinxhirit oligomerik gjatë hidrolizës, polimerët e ndryshëm me DP të ulët dhe kthesat e tyre.shpërndarjet 30,31,32.Ndërkohë, megjithëse analiza e glikanit ka rezultuar të jetë një mjet i dobishëm për një analizë gjithëpërfshirëse të strukturës së glikanit, është e vështirë të vlerësohen oligosakaridet me DP të ulët të tretshëm në ujë duke përdorur metodat e antitrupave.Oligosakaridet më të vogla DP me një peshë molekulare më të vogël se 5-10 kDa nuk lidhen me pllakat ELISA 33, 34 dhe lahen përpara shtimit të antitrupave.
Këtu, për herë të parë, ne demonstrojmë një analizë ELISA në pllaka të veshura me avidin duke përdorur antitrupa monoklonale, duke kombinuar një procedurë biotinilimi me një hap për oligosakaridet refraktare të tretshme me analizën e glikomit.Qasja jonë ndaj analizës së glikomës u vërtetua nga analiza e bazuar në MALDI-TOF-MS dhe GC-MS e lidhjeve plotësuese të oligosakarideve duke përdorur derivatizimin e trimetilsililit (TMS) të përbërjeve të sheqerit të hidrolizuar.Kjo qasje inovative mund të zhvillohet si një metodë me performancë të lartë në të ardhmen dhe të gjejë zbatim më të gjerë në kërkimin biomjekësor35.
Modifikimet pas përkthimit të enzimave dhe antitrupave, si p.sh. glikozilimi,36 ndikojnë në aktivitetin e tyre biologjik.Për shembull, ndryshimet në glikozilimin e proteinave të serumit luajnë një rol të rëndësishëm në artritin inflamator dhe ndryshimet në glikozilim përdoren si shënues diagnostikues37.Glikane të ndryshme janë raportuar në literaturë që shfaqen lehtësisht në një sërë sëmundjesh, duke përfshirë sëmundjet inflamatore kronike të traktit gastrointestinal dhe mëlçisë, infeksionet virale, kancerin e vezoreve, të gjirit dhe të prostatës38,39,40.Kuptimi i strukturës së glikaneve duke përdorur metodat ELISA të glikanit të bazuar në antitrupa do të sigurojë besim shtesë në diagnostikimin e sëmundjes pa përdorimin e metodave komplekse të MS.
Studimi ynë i mëparshëm tregoi se oligosakaridet kokëfortë mbetën të pahidrolizuar pas paratrajtimit dhe hidrolizës enzimatike (Figura 1).Në punën tonë të botuar më parë, ne zhvilluam një metodë ekstraktimi me qymyr të aktivizuar në fazën e ngurtë për të izoluar oligosakaridet nga hidrolizati i para-trajtuar me AFEX (ACSH)8.Pas nxjerrjes dhe ndarjes fillestare, oligosakaridet u ndanë më tej me anë të kromatografisë me përjashtim të madhësisë (SEC) dhe u mblodhën sipas peshës molekulare.Monomerët dhe oligomerët e sheqerit të çliruar nga paratrajtime të ndryshme u analizuan me analizën e përbërjes së sheqerit.Kur krahasojmë përmbajtjen e oligomerëve të sheqerit të marra me metoda të ndryshme paratrajtimi, prania e oligosakarideve kokëfortë është një problem i zakonshëm në shndërrimin e biomasës në monosakaride dhe mund të çojë në një reduktim të rendimentit të sheqerit prej të paktën 10-15% dhe madje deri në 18%.SHBA.Kjo metodë përdoret për prodhimin e mëtejshëm në shkallë të gjerë të fraksioneve oligosakaride.ACH që rezulton dhe fraksionet e tij pasuese me pesha të ndryshme molekulare u përdorën si material eksperimental për karakterizimin e oligosakarideve në këtë punë.
Pas trajtimit paraprak dhe hidrolizës enzimatike, oligosakaridet persistente mbetën të pahidrolizuara.Këtu (A) është një metodë e ndarjes së oligosakarideve në të cilën oligosakaridet izolohen nga hidrolizati i ruajtjes së misrit të paratrajtuar me AFEX (ACSH) duke përdorur një shtrat të mbushur me karbon aktiv dhe tokë diatomike;(B) Metoda për ndarjen e oligosakarideve.Oligosakaridet u ndanë më tej me kromatografi me përjashtim të madhësisë (SEC);(C) Monomerët dhe oligomerët e sakarideve të çliruara nga paratrajtime të ndryshme (acidi i holluar: DA, lëngu jonik: IL dhe AFEX).Kushtet e hidrolizës enzimatike: ngarkim i lartë i lëndëve të ngurta prej 25% (w/w) (përafërsisht 8% ngarkim glukani), 96 orë hidrolizë, 20 mg/g ngarkim komercial me enzimë (raporti Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) dhe (D) monomere sheqeri dhe oligoaranoza-koronazë të liruara nga st. mbi (ACS).
Analiza e glikanit është provuar të jetë një mjet i dobishëm për një analizë strukturore gjithëpërfshirëse të glikaneve në ekstrakte të izoluara nga mbetjet e ngurta të biomasës.Megjithatë, saharidet e tretshme në ujë janë të nënpërfaqësuara duke përdorur këtë metodë tradicionale41 sepse oligosakaridet me peshë të ulët molekulare janë të vështira për t'u imobilizuar në pllaka ELISA dhe lahen përpara shtimit të antitrupave.Prandaj, për lidhjen dhe karakterizimin e antitrupave, u përdor një metodë biotinilimi me një hap për të veshur oligosakaridet e tretshme dhe jo në përputhje në pllakat ELISA të veshura me avidin.Kjo metodë u testua duke përdorur ACSH-në tonë të prodhuar më parë dhe një fraksion të bazuar në peshën e saj molekulare (ose shkallën e polimerizimit, DP).Biotinilimi me një hap u përdor për të rritur afinitetin e lidhjes së oligosakarideve duke shtuar biotin-LC-hidrazid në fundin reduktues të karbohidratit (Fig. 2).Në tretësirë, grupi hemiacetal në skajin reduktues reagon me grupin hidrazid të biotin-LC-hidrazidit për të formuar një lidhje hidrazoni.Në prani të agjentit reduktues NaCNBH3, lidhja e hidrozonit reduktohet në një produkt përfundimtar të qëndrueshëm të biotiniluar.Me modifikimin e skajit reduktues të sheqerit, lidhja e oligosakarideve të ulët DP me pllaka ELISA u bë e mundur dhe në studimin tonë kjo u bë në pllaka të veshura me avidin duke përdorur mAb të synuar nga glikani.
Ekzaminimi i antitrupave monoklonal bazuar në ELISA për oligosakaride të biotiniluara.Këtu (A) biotinilimi i kombinuar i oligosakarideve dhe ekzaminimi i mëvonshëm ELISA me mAbs të synuara nga glikani në pllaka të veshura me NeutrAvidin dhe (B) tregon një procedurë me një hap për biotinilimin e produkteve të reaksionit.
Pllakat e veshura me avidinë me antitrupa të konjuguar me oligosakaride iu shtuan më pas antitrupave parësorë dhe sekondarë dhe u lanë në një mjedis të ndjeshëm ndaj dritës dhe kohës.Pasi të përfundojë lidhja e antitrupave, shtoni substrat TMB për të inkubuar pllakën.Reagimi më në fund u ndal me acid sulfurik.Pllakat e inkubuara u analizuan duke përdorur një lexues ELISA për të përcaktuar forcën lidhëse të çdo antitrupi për të zbuluar lidhjen e kryqëzuar specifike të antitrupave.Për detaje dhe parametra të eksperimentit, shihni seksionin përkatës "Materialet dhe Metodat".
Ne demonstrojmë dobinë e kësaj metode të zhvilluar rishtazi për aplikime specifike duke karakterizuar oligosakaridet e tretshme të pranishme në ACSH si dhe në fraksionet oligosakaride të papërpunuara dhe të pastruara të izoluara nga hidrolizat lignocelulozike.Siç tregohet në figurën 3, ksilanet më të zakonshme të zëvendësuara me epitop të identifikuar në ACSH duke përdorur metodat e analizës së glikomit bioaciluar janë zakonisht arabinogalaktanet uronike (U) ose metiluronik (MeU) dhe pektikë.Shumica e tyre u gjetën gjithashtu në studimin tonë të mëparshëm mbi analizën e glikaneve të lëndëve të ngurta jo të hidrolizuara (UHS)43.
Zbulimi i epitopeve oligosakaride rezistente duke përdorur një antitrup monoklonal të drejtuar në glikanin e murit qelizor.Fraksioni "neutral" është fraksioni ACN dhe fraksioni "acid" është fraksioni FA.E kuqja më e ndezur në hartën e nxehtësisë tregon përmbajtje më të lartë të epitopit dhe bluja më e ndritshme tregon një sfond të zbrazët.Vlerat e ngjyrave në shkallë bazohen në vlerat e papërpunuara të OD për formulimet N=2.Epitopet kryesore të njohura nga antitrupat tregohen në të djathtë.
Këto struktura jo-celuloze nuk mund të ndaheshin nga celulazat dhe hemicelulazat më të zakonshme në përzierjen e testuar të enzimës komerciale, e cila përfshin enzimat komerciale më të përdorura.Prandaj, nevojiten enzima të reja ndihmëse për hidrolizën e tyre.Pa enzimat e nevojshme ndihmëse joceluloze, këto lidhje jo-celuloze parandalojnë shndërrimin e plotë në monosakaride, edhe nëse polimerët e tyre të sheqerit mëmë hidrolizohen gjerësisht në fragmente më të shkurtra dhe treten duke përdorur përzierje enzimash komerciale.
Studimi i mëtejshëm i shpërndarjes së sinjalit dhe fuqisë së tij lidhëse tregoi se epitopet lidhëse ishin më të ulëta në fraksionet e sheqerit me DP të lartë (A, B, C, DP deri në 20+) sesa në fraksionet e ulëta DP (D, E, F, DP) në dimerët) (Fig. 1).Fragmentet acide janë më të zakonshme në epitopet joceluloze sesa fragmentet neutrale.Këto dukuri janë në përputhje me modelin e vëzhguar në studimin tonë të mëparshëm, ku pjesët e larta të DP dhe acidit ishin më rezistente ndaj hidrolizës enzimatike.Prandaj, prania e epitopeve të glikanit jo-celuloz dhe zëvendësimet U dhe MeU mund të kontribuojnë shumë në stabilitetin e oligosakarideve.Duhet të theksohet se efikasiteti i lidhjes dhe zbulimit mund të jetë problematik për oligosakaridet me DP të ulët, veçanërisht nëse epitopi është një oligosakarid dimerik ose trimerik.Kjo mund të testohet duke përdorur oligosakaride komerciale me gjatësi të ndryshme, ku secili përmban vetëm një epitop që lidhet me një mAb specifik.
Kështu, përdorimi i antitrupave specifikë të strukturës zbuloi disa lloje të lidhjeve kundërshtuese.Në varësi të llojit të antitrupit të përdorur, modelit të përshtatshëm të lidhjes dhe fuqisë së sinjalit që prodhon (më së shumti dhe më pak i bollshëm), enzimat e reja mund të identifikohen dhe të shtohen gjysmë sasior në përzierjen e enzimës për një glikokonvertim më të plotë.Duke marrë si shembull analizën e oligosakarideve ACSH, ne mund të krijojmë një bazë të dhënash të lidhjeve të glikanit për çdo material të biomasës.Këtu duhet theksuar se duhet pasur parasysh afiniteti i ndryshëm i antitrupave dhe nëse afiniteti i tyre nuk dihet, kjo do të krijojë vështirësi të caktuara gjatë krahasimit të sinjaleve të antitrupave të ndryshëm.Për më tepër, krahasimi i lidhjeve glikane mund të funksionojë më mirë midis mostrave për të njëjtin antitrup.Këto lidhje kokëfortë mund të lidhen më pas me bazën e të dhënave CAZyme, nga e cila ne mund të identifikojmë enzimat, të zgjedhim enzimat kandidate dhe të testojmë për enzima që thyejnë lidhjet, ose të zhvillojmë sisteme mikrobike për të shprehur këto enzima për përdorim në biorefineri44.
Për të vlerësuar sesi metodat imunologjike plotësojnë metodat alternative për karakterizimin e oligosakarideve me peshë të ulët molekulare të pranishme në hidrolizat lignocelulozike, ne kryem MALDI (Fig. 4, S1-S8) dhe analiza të sakarideve të derivuara nga TMS bazuar në GC-MS në të njëjtin panel (Fig. 5) pjesë oligosakaride.MALDI përdoret për të krahasuar nëse shpërndarja masive e molekulave të oligosakarideve përputhet me strukturën e synuar.Në fig.4 tregon MC-në e komponentëve neutralë ACN-A dhe ACN-B.Analiza ACN-A konfirmoi një sërë sheqernash pentozë që variojnë nga DP 4-8 (Fig. 4) në DP 22 (Fig. S1), pesha e të cilave korrespondon me oligosakaridet MeU-ksilan.Analiza ACN-B konfirmoi serinë e pentozës dhe glukoksilanit me DP 8-15.Në materialin shtesë si Figura S3, hartat e shpërndarjes së masës së pjesës acidike FA-C tregojnë një sërë sheqernash pentozë të zëvendësuar (Me)U me një DP prej 8-15 që janë në përputhje me ksilanet e zëvendësuara të gjetura në ekzaminimin e mAb me bazë ELISA.Epitopet janë konsistente.
Spektri MALDI-MS i oligosakarideve të tretshme jo-përputhëse të pranishme në ACS.Këtu, (A) fraksionet e diapazonit të peshës së ulët ACN-A që përmbajnë acid uronik të metiluar (DP 4-8) zëvendësojnë oligosakaridet glukuroksilane dhe (B) ksilanin ACN-B dhe oligosakaridet e acidit uronik të metiluar të zëvendësuar me glukuroksilan (DP 8-15).
Analiza e përbërjes së mbetjes së glikanit të oligosakarideve refraktare.Këtu (A) përbërja e sakarideve TMS e fraksioneve të ndryshme oligosakaride të marra duke përdorur analizën GC-MS.(B) Strukturat e sheqernave të ndryshme që rrjedhin nga TMS të pranishme në oligosakaride.ACN – fraksion acetonitrili që përmban oligosakaride neutrale dhe FA – fraksion i acidit ferulik që përmban oligosakaride acide.
Një tjetër përfundim interesant u nxor nga analiza LC-MS e fraksionit oligosakarid, siç tregohet në figurën S9 (metodat mund të shihen në materialin suplementar elektronik).Fragmente të grupeve heksoze dhe -OAc janë vërejtur në mënyrë të përsëritur gjatë lidhjes së fraksionit ACN-B.Ky zbulim jo vetëm që konfirmon fragmentimin e vërejtur në analizën e glikomes dhe MALDI-TOF, por gjithashtu ofron informacion të ri në lidhje me derivatet e mundshëm të karbohidrateve në biomasën lignoceluloze të paratrajtuar.
Ne analizuam gjithashtu përbërjen e sheqerit të fraksionit oligosakarid duke përdorur derivatizimin e sheqerit TMS.Duke përdorur GC-MS, ne përcaktuam përbërjen e sheqernave nervore (jo derivative) dhe acidike (GluA dhe GalA) në fraksionin oligosakarid (Fig. 5).Acidi glukuronik gjendet në përbërësit acidikë C dhe D, ndërsa acidi galakturonik gjendet në përbërësit acidikë A dhe B, të cilët të dy janë përbërës të lartë DP të sheqernave acidike.Këto rezultate jo vetëm që konfirmojnë të dhënat tona ELISA dhe MALDI, por janë gjithashtu në përputhje me studimet tona të mëparshme të akumulimit të oligosakarideve.Prandaj, ne besojmë se metodat imunologjike moderne që përdorin biotinilimin e oligosakarideve dhe ekzaminimin pasues ELISA janë të mjaftueshme për të zbuluar oligosakaridet rezistente të tretshme në mostra të ndryshme biologjike.
Meqenëse metodat e shqyrtimit të mAb të bazuara në ELISA janë vërtetuar me disa metoda të ndryshme, ne donim të eksploronim më tej potencialin e kësaj metode të re sasiore.Dy oligosakaride komerciale, oligosakaride ksiloheksasakaride (XHE) dhe 23-α-L-arabinofuranosil-ksilotrioze (A2XX), u blenë dhe u testuan duke përdorur një qasje të re mAb që synon glikanin e murit qelizor.Figura 6 tregon një korrelacion linear midis sinjalit lidhës të biotiniluar dhe përqendrimit log të përqendrimit të oligosakarideve, duke sugjeruar një model të mundshëm adsorbimi Langmuir.NdërmAb-të, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 dhe CCRC-M151 korreluan me XHE, dhe CCRC-M108, CCRC-M109 dhe LM11 korreluan me A2XX nm deri në 10.Për shkak të disponueshmërisë së kufizuar të antitrupave gjatë eksperimentit, u kryen eksperimente të kufizuara me çdo përqendrim oligosakarid.Duhet të theksohet këtu se disa antitrupa reagojnë shumë ndryshe ndaj të njëjtit oligosakarid si një substrat, me sa duket sepse ato lidhen me epitope paksa të ndryshme dhe mund të kenë afinitete lidhëse shumë të ndryshme.Mekanizmat dhe implikimet e identifikimit të saktë të epitopit do të jenë shumë më komplekse kur qasja e re mAb të zbatohet në mostrat reale.
Dy oligosakaride komerciale u përdorën për të përcaktuar gamën e zbulimit të mAb-ve të ndryshëm që synojnë glikanin.Këtu, korrelacionet lineare me përqendrimin log të përqendrimit të oligosakarideve tregojnë modelet e adsorbimit të Langmuir për (A) XHE me mAb dhe (B) A2XX me mAb.Epitopet përkatëse tregojnë strukturat e oligosakarideve komerciale të përdorura si substrate në analizë.
Përdorimi i antitrupave monoklonal të synuar nga glikani (analiza glikokomike ose ekzaminimi i mAb i bazuar në ELISA) është një mjet i fuqishëm për karakterizimin e thellë të shumicës së glikaneve kryesore të murit qelizor që përbëjnë biomasën bimore.Megjithatë, analiza klasike e glikanit karakterizon vetëm glikanet më të mëdha të murit qelizor, pasi shumica e oligosakarideve nuk imobilizohen në mënyrë efikase në pllaka ELISA.Në këtë studim, ushqimi i misrit i para-trajtuar me AFEX u hidrolizua enzimatikisht në një përmbajtje të lartë të lëndëve të ngurta.Analiza e sheqerit u përdor për të përcaktuar përbërjen e karbohidrateve rezistente të murit qelizor në hidrolizat.Megjithatë, analiza mAb e oligosakarideve më të vogla në hidrolizate është nënvlerësuar dhe nevojiten mjete shtesë për të imobilizuar në mënyrë efektive oligosakaridet në pllaka ELISA.
Ne raportojmë këtu një metodë të re dhe efikase të imobilizimit të oligosakarideve për shqyrtimin e mAb duke kombinuar biotinilimin e oligosakarideve të ndjekur nga ekzaminimi ELISA në pllaka të veshura me NeutrAvidin™.Oligosakaridet e imobilizuara të biotiniluara treguan afinitet të mjaftueshëm për antitrupin për të mundësuar zbulimin e shpejtë dhe efikas të oligosakarideve rezistente.Analiza e përbërjes së këtyre oligosakarideve kokëfortë bazuar në spektrometrinë e masës konfirmoi rezultatet e kësaj qasjeje të re për imunoscreening.Kështu, këto studime tregojnë se kombinimi i biotinilimit të oligosakarideve dhe ekzaminimit ELISA me antitrupat monoklonalë të synuar nga glikani mund të përdoret për të zbuluar lidhjet e kryqëzuara në oligosakaridet dhe mund të zbatohet gjerësisht në studime të tjera biokimike që karakterizojnë strukturën e oligosakarideve.
Kjo metodë e profilizimit të glikanit me bazë biotinë është raporti i parë i aftë për të hetuar lidhjet karbohidrate rezistente të oligosakarideve të tretshëm në biomasën e bimëve.Kjo ndihmon për të kuptuar pse disa pjesë të biomasës janë kaq kokëfortë kur bëhet fjalë për prodhimin e biokarburanteve.Kjo metodë plotëson një boshllëk të rëndësishëm në metodat e analizës së glikomës dhe shtrin aplikimin e saj në një gamë më të gjerë substratesh përtej oligosakarideve bimore.Në të ardhmen, ne mund të përdorim robotikën për biotinilimin dhe të përdorim metodën që kemi zhvilluar për analizat me performancë të lartë të mostrave duke përdorur ELISA.
Kashta e misrit (CS) e rritur nga farat hibride Pioneer 33A14 u korr në vitin 2010 nga Kramer Farms në Ray, Kolorado.Me lejen e pronarit të tokës, kjo biomasë mund të përdoret për kërkime. Mostrat u ruajtën të thata < 6% lagështi në thasë me zinxhir në temperaturë dhome. Mostrat u ruajtën të thata < 6% lagështi në thasë me zinxhir në temperaturë dhome. Obrazцы храниль сухими при влажности < 6% në paketat me përстежкой-молнией при комнатной температура. Mostrat u ruajtën të thata me lagështi <6% në thasë me zinxhir në temperaturën e dhomës.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazцы хранят в пакетах со застежкой-молнией при комнатной температура со влажностью < 6%. Mostrat ruhen në thasë me zinxhir në temperaturë dhome me lagështirë < 6%.Studimi ishte në përputhje me udhëzimet lokale dhe kombëtare.Analiza e përbërjes është kryer duke përdorur protokollin NREL.Përbërja u zbulua se përmban 31.4% glukan, 18.7% ksilan, 3.3% arabinan, 1.2% galaktan, 2.2% acetil, 14.3% lignin, 1.7% proteina dhe 13.4% hi.
Cellic® CTec2 (138 mg proteinë/ml, sasia VCNI 0001) është një përzierje komplekse e celulazës, β-glukozidazës dhe Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, shumë VHN00001) nga Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), një përzierje komplekse e enzimave degraduese të pektinës, u dhurua nga DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Përqendrimet e proteinave enzimë u përcaktuan duke vlerësuar përmbajtjen e proteinave (dhe duke zbritur kontributin e azotit jo proteinik) duke përdorur analizën e azotit Kjeldahl (metoda AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Toka diatomike 545 u ble nga EMD Millipore (Billerica, MA).Karboni i aktivizuar (DARCO, granula me 100 rrjetë), Avicel (PH-101), ksilan ahu dhe të gjitha kimikatet e tjera u blenë nga Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Para-trajtimi AFEX u krye në GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Trajtimi paraprak u krye në 140°C për 15 minuta.Koha e qëndrimit 46 në raportin 1:1 të amoniakut anhidrik ndaj biomasës me ngarkesë 60% (w/w) në një reaktor grupi prej çeliku inox (Parr Instruments Company).U deshën 30 minuta.Reaktori u soll në 140°C dhe amoniaku u lirua me shpejtësi, duke lejuar që biomasa të kthehej shpejt në temperaturën e dhomës.Përbërja e furrës së misrit të para-trajtuar (ACS) me AFEX ishte e ngjashme me atë të stofit të misrit të patrajtuar (UT-CS).
ACSH me lëndë të larta të ngurtë 25% (w/w) (përafërsisht 8% ngarkim dekstrani) u përgatit si një material fillestar për prodhimin në shkallë të gjerë të oligosakarideve.Hidroliza enzimatike e ACS u krye duke përdorur një përzierje enzimash komerciale duke përfshirë Cellic® Ctec2 10 mg proteinë/g glukan (në biomasë të paratrajtuar), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteinë/g glukan dhe Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteinë/g dekstran.Hidroliza enzimatike u krye në një bioreaktor 5 litra me vëllim pune 3 litra, pH 4,8, 50°C dhe 250 rpm.Pas hidrolizës për 96 orë, hidroliza u mblodh me centrifugim në 6000 rpm për 30 minuta dhe më pas në 14000 rpm për 30 minuta për të hequr lëndët e ngurta të pahidrolizuara.Hidroliza më pas iu nënshtrua filtrimit steril përmes një gote filtri 0.22 mm.Hidrolizati i filtruar u ruajt në shishe sterile në 4° C. dhe më pas u nda në karbon.
Analiza e përbërjes së mostrave të biomasës me bazë ekstrakti sipas procedurave të analizës laboratorike NREL: përgatitja e mostrave për analizën e përbërjes (NREL/TP-510-42620) dhe përcaktimi i karbohidrateve strukturore dhe linjinës në biomasë (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza e oligosakarideve të rrymës së hidrolizit u krye në një shkallë 2 ml duke përdorur një metodë hidrolize acide të bazuar në autoklavë.Përzieni kampionin e hidrolizit me 69,7 µl acid sulfurik 72% në një tub kulture 10 ml me kapak me vidë dhe inkuboni për 1 orë në një tavolinë në 121 °C, ftohuni në akull dhe filtroni në një shishe me kromatografi të lëngshme me performancë të lartë (HPLC).Përqendrimi i oligosakarideve u përcaktua duke zbritur përqendrimin e monosakarideve në kampionin e pa hidrolizuar nga përqendrimi i përgjithshëm i sheqerit në kampionin e hidrolizuar me acid.
Përqendrimet e glukozës, ksilozës dhe arabinozës në biomasën e hidrolizuar me acid u analizuan duke përdorur një sistem Shimadzu HPLC të pajisur me një kampionues automatik, ngrohës kolone, pompë isokratike dhe detektor të indeksit të thyerjes në një kolonë Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolona u mbajt në 50°C dhe u eluat me 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 në ujë.rrjedhin.
Supernatanti i hidrolizit u hollua dhe u analizua për përmbajtjen e monomerit dhe oligosakaridit.Sheqernat monomerikë të marrë pas hidrolizës enzimatike u analizuan me HPLC të pajisur me një kolonë Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P dhe një kolonë mbrojtëse të hirit.Temperatura e kolonës u mbajt në 80°C, uji u përdor si fazë lëvizëse me një shpejtësi rrjedhjeje prej 0.6 ml/min.Oligosakaridet u përcaktuan me hidrolizë në acid të holluar në 121°C sipas metodave të përshkruara në refs.41, 48, 49.
Analiza e sakarideve u krye në mbetjet e papërpunuara, të para-trajtuara me AFEX dhe të gjitha mbetjet e biomasës jo të hidrolizuara (përfshirë prodhimin e ekstrakteve të murit qelizor serik dhe shqyrtimin e tyre mAb) duke përdorur procedurat e përshkruara më parë 27, 43, 50, 51 .Për analizën e glikomit, mbetjet e patretshme në alkool të materialit të murit qelizor bimor përgatiten nga mbetjet e biomasës dhe i nënshtrohen ekstraktimit serial me reagentë gjithnjë e më agresivë si oksalati i amonit (50 mM), karbonat natriumi (50 mM dhe 0.5% w/v), CON.(1M dhe 4M, të dyja me borohidrid natriumi 1% w/v) dhe klorit acid siç përshkruhet më parë52,53.Më pas, ekstraktet iu nënshtruan ELISA-s kundër një paneli kompleks mAb50 të drejtuar në glikanin e murit qelizor dhe reaksionet e lidhjes së mAb u prezantuan si një hartë nxehtësie.MAB-të që synojnë glikanin e murit qelizor të bimëve u blenë nga stoqet laboratorike (seritë CCRC, JIM dhe MAC).
Biotinilimi me një hap i oligosakarideve.Konjugimi i karbohidrateve me biotin-LC-hidrazid u krye duke përdorur procedurën e mëposhtme.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) u tret në dimetil sulfoksid (DMSO, 70 μl) me nxitje të fuqishme dhe ngrohje në 65° C. për 1 min.U shtua acid acetik akullnajor (30 µl) dhe përzierja u derdh mbi cianoborohidrid natriumi (6.4 mg/100 µmol) dhe u tret plotësisht pas ngrohjes në 65° C për rreth 1 minutë.Më pas, nga 5 deri në 8 μl të përzierjes së reaksionit iu shtuan oligosakaridit të tharë (1-100 nmol) për të marrë një tepricë molare 10-fish ose më shumë të etiketës mbi skajin reduktues.Reagimi u krye në 65°C për 2 orë, pas së cilës mostrat u pastruan menjëherë.Asnjë cianoborohidrid natriumi nuk u përdor në eksperimentet e etiketimit pa reduktim, dhe mostrat u reaguan në 65 ° C. për 2.5 orë.
Veshje ELISA dhe larja e mostrave të oligosakarideve të biotiniluara.25 μl mostra të biotiniluara (100 μl e çdo kampioni të koncentruar të holluar në 5 ml tretësirë ​​tampon Tris 0,1 M (TBS)) u shtuan në çdo pus të pllakës së veshur me avidin.Puset e kontrollit u mbuluan me 50 μl biotinë në një përqendrim prej 10 μg/ml në 0.1 M TBS.Uji i dejonizuar është përdorur si një shtresë për matjet e zbrazëta.Tableta u inkubua për 2 orë në temperaturën e dhomës në errësirë.Lani pjatën 3 herë me qumësht të skremuar 0,1% në 0,1 M TBS duke përdorur programin nr.11 për banesën Grenier 3A.
Shtimi dhe larja e antitrupave parësorë.Shtoni 40 µl antitrup primar në çdo pus.Inkuboni mikropllakën për 1 orë në temperaturën e dhomës në errësirë.Pllakat u lanë më pas 3 herë me 0.1% qumësht në 0.1 M TBS duke përdorur programin larës #11 për Grenier Flat 3A.
Shtoni antitrupa dytësorë dhe lani.Shtoni 50 µl antitrup dytësor miu/miu (i holluar 1:5000 në 0,1% qumësht në 0,1 M TBS) në çdo pus.Inkuboni mikropllakën për 1 orë në temperaturën e dhomës në errësirë.Më pas mikropllakat u lanë 5 herë me 0,1% qumësht në 0,1 M TBS duke përdorur programin e larjes së pllakës Grenier Flat 5A #12.
Shtimi i një substrati.Shtoni 50 µl 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinë (TMB) në substratin bazë (duke shtuar 2 pika bufer, 3 pika TMB, 2 pika peroksid hidrogjeni në 15 ml ujë të dejonizuar).Përgatitni substratin TMB.dhe vorbull para përdorimit).Inkuboni mikropllakën në temperaturën e dhomës për 30 minuta.Në padituri.
Plotësoni hapin dhe lexoni tabletin.Shtoni 50 µl acid sulfurik 1 N në çdo pus dhe regjistroni absorbimin nga 450 në 655 nm duke përdorur një lexues ELISA.
Përgatitni tretësirë ​​1 mg/ml të këtyre analiteve në ujë të deionizuar: arabinozë, ramnozë, fukozë, ksilozë, acid galakturonik (GalA), acid glukuronik (GlcA), manoz, glukozë, galaktozë, laktozë, N-acetilmannozamine (manNAc.glukozëm),(glcNAc), N-acetilgalaktozamine (galNAc), inozitol (standard i brendshëm).Dy standarde u përgatitën duke shtuar solucionet e sheqerit 1 mg/mL të paraqitura në tabelën 1. Mostrat ngrihen dhe liofilizohen në -80° C derisa të hiqet i gjithë uji (zakonisht rreth 12-18 orë).
Shtoni 100–500 µg kampion në tubat e kapakut të vidhosur në një balancë analitike.Regjistroni shumën e shtuar.Është mirë që mostra të shpërndahet në një përqendrim specifik të tretësit dhe të shtohet në tub si një sasi e lëngshme.Përdorni 20 µl inozitol 1 mg/ml si standard të brendshëm për çdo tub mostër.Sasia e standardit të brendshëm të shtuar në kampion duhet të jetë e njëjtë me sasinë e standardit të brendshëm të shtuar në tubin standard.
Shtoni 8 ml metanol anhidrik në një shishkë me kapak me vidë.Më pas 4 ml tretësirë ​​HCl metanolike 3 N., mbyllen me kapak dhe tunden.Ky proces nuk përdor ujë.
Shtoni 500 µl tretësirë ​​metanoli 1 M HCl në mostrat e oligosakarideve dhe tubat standarde TMS.Mostrat u inkubuan gjatë natës (168 orë) në 80° C. në një bllok termik.Thajeni produktin e metanolizës në temperaturën e dhomës duke përdorur një manifold tharjeje.Shtoni 200 µl MeOH dhe thajeni përsëri.Ky proces përsëritet dy herë.Shtoni 200 µl metanol, 100 µl piridinë dhe 100 µl anhidrid acetik në kampion dhe përzieni mirë.Mostrat u inkubuan në temperaturën e dhomës për 30 minuta.dhe të thara.Shtoni 200 µl metanol dhe thajeni përsëri.
Shtoni 200 µl Tri-Sil dhe tubin e mbuluar me ngrohje për 20 minuta.80°C, më pas ftohet në temperaturën e dhomës.Përdorni një kolektor tharjeje për të tharë më tej mostrën në një vëllim prej afërsisht 50 µl.Është e rëndësishme të theksohet se nuk kemi lejuar që mostrat të thahen plotësisht.
Shtojmë 2 ml heksan dhe e përziejmë mirë me vorbull.Mbushni majat e pipetave Pasteur (5-8 mm) me një copë leshi xhami duke futur leshin e xhamit sipër një pipete me diametër 5-3/4 inç.Mostrat u centrifuguan në 3000 g për 2 minuta.Çdo mbetje e patretshme precipitohet.Thajeni kampionin në 100-150 µl.Një vëllim prej afërsisht 1 μl u injektua në GC-MS në një temperaturë fillestare prej 80 °C dhe një kohë fillestare prej 2.0 minutash (Tabela 2).