Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nove imunološke i masene spektrometrijske metode za kompleksnu analizu postojanih oligosaharida u kukuruznom prašniku prethodno tretiranom AFEX-om.Lignocelulozna biomasa je održiva alternativa fosilnim gorivima i naširoko se koristi za razvoj biotehnologija za proizvodnju proizvoda kao što su hrana, hrana za životinje, goriva i kemikalije.Ključ ovih tehnologija je razvoj troškovno konkurentnih procesa za pretvaranje složenih ugljikohidrata prisutnih u stjenkama biljnih stanica u jednostavne šećere kao što su glukoza, ksiloza i arabinoza.Budući da je lignocelulozna biomasa vrlo tvrdoglava, mora se podvrgnuti termokemijskim obradama (npr. eksfolijacija vlakana amonijakom (AFEX), razrijeđene kiseline (DA), ionske tekućine (IL)) i biološkim obradama (npr. enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija) u kombinaciji kako bi se dobio željeni proizvod..Međutim, kada se u procesu hidrolize koriste komercijalni gljivični enzimi, samo 75-85% nastalih topivih šećera su monosaharidi, a preostalih 15-25% su topivi, tvrdokorni oligosaharidi, koji nisu uvijek dostupni mikroorganizmima.Prethodno smo uspješno izolirali i pročistili topljive tvrdokorne oligosaharide koristeći kombinaciju odvajanja ugljika i dijatomejske zemlje i kromatografije za isključivanje veličine, a također smo istraživali njihova svojstva inhibicije enzima.Otkrili smo da je oligosaharide koji sadrže supstitucije metilirane uronske kiseline višeg stupnja polimerizacije (DP) teže obraditi komercijalnim mješavinama enzima nego oligosaharide s niskim DP i neutralne oligosaharide.Ovdje izvješćujemo o upotrebi nekoliko dodatnih metoda, uključujući profiliranje glikana upotrebom monoklonskih antitijela (mAbs) specifičnih za glikane biljne biomase za karakterizaciju glikanskih veza u stjenkama biljnih stanica i enzimskim hidrolizatima, lasersku desorpcijsku ionizaciju uz pomoć matrice, masenu spektrometriju vremena leta..MALDI-TOF-MS) koristi strukturno-informativne dijagnostičke pikove dobivene spektroskopijom nakon sekundarnog raspada negativnih iona, plinskom kromatografijom i spektrometrijom mase (GC-MS) za karakterizaciju oligosaharidnih veza sa i bez derivatizacije.Zbog male veličine oligosaharida (DP 4-20), te je molekule teško koristiti za vezanje i karakterizaciju mAb.Kako bismo prevladali ovaj problem, primijenili smo novu metodu imobilizacije oligosaharida temeljenu na konjugaciji biotina koja je uspješno označila većinu oligosaharida topivih s niskim DP na površini mikropločice, koja je zatim korištena u sustavu mAb visoke propusnosti za specifičnu analizu ligacije.Ova nova metoda olakšat će razvoj naprednijih visoko propusnih testova glikoma u budućnosti koji se mogu koristiti za izolaciju i karakterizaciju oligosaharida prisutnih u biomarkerima u dijagnostičke svrhe.
Lignocelulozna biomasa, sastavljena od poljoprivrednih, šumskih, travnatih i drvenih materijala, potencijalna je sirovina za proizvodnju proizvoda na biološkoj osnovi, uključujući hranu, hranu za životinje, gorivo i kemijske prekursore za proizvodnju proizvoda veće vrijednosti1.Ugljikohidrati (kao što su celuloza i hemiceluloza) prisutni u stijenkama biljnih stanica depolimeriziraju se u monosaharide kemijskom preradom i biotransformacijom (kao što je enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija).Uobičajeni predtretmani uključuju ekspanziju vlakana amonijakom (AFEX), razrijeđenu kiselinu (DA), ionsku tekućinu (IL) i eksploziju pare (SE), koji koriste kombinaciju kemikalija i topline za smanjenje proizvodnje lignoceluloze otvaranjem staničnih stijenki biljaka3,4.tvrdoglavost tvari, 5. Enzimska hidroliza provodi se pri visokom opterećenju krutim tvarima korištenjem komercijalnih enzima koji sadrže aktivne ugljikohidrate (CAZymes) i mikrobnom fermentacijom pomoću transgenih kvasaca ili bakterija za proizvodnju biogoriva i kemikalija 6 .
CAZimi u komercijalnim enzimima sastoje se od složene mješavine enzima koji sinergistički cijepaju složene veze ugljikohidrata i šećera u monosaharide2,7.Kao što smo ranije izvijestili, složena mreža aromatskih polimera lignina s ugljikohidratima čini ih vrlo nepopustljivima, što dovodi do nepotpune pretvorbe šećera, nakupljajući 15-25% spolnih oligosaharida koji nisu proizvedeni tijekom enzimske hidrolize prethodno tretirane biomase.Ovo je čest problem kod raznih metoda predobrade biomase.Neki od razloga za ovo usko grlo uključuju inhibiciju enzima tijekom hidrolize ili odsutnost ili niske razine esencijalnih esencijalnih enzima koji su potrebni za razbijanje veza šećera u biljnoj biomasi.Razumijevanje sastava i strukturnih karakteristika šećera, kao što su šećerne veze u oligosaharidima, pomoći će nam poboljšati pretvorbu šećera tijekom hidrolize, čineći biotehnološke procese troškovno konkurentnim proizvodima dobivenim od nafte.
Određivanje strukture ugljikohidrata je izazovno i zahtijeva kombinaciju metoda kao što su tekućinska kromatografija (LC)11,12, spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 i masena spektrometrija (MS)17.,osamnaest.MS metode kao što je time-of-flight masena spektrometrija s laserskom desorpcijom i ionizacijom pomoću matrice (MALDI-TOF-MS) svestrana su metoda za identifikaciju struktura ugljikohidrata.Nedavno je tandem MS adukata natrijevih iona izazvan sudarom (CID) najčešće korišten za identifikaciju otisaka prstiju koji odgovaraju položajima vezivanja oligosaharida, anomernim konfiguracijama, sekvencama i položajima grananja 20, 21.
Analiza glikana izvrstan je alat za dubinsku identifikaciju veza ugljikohidrata22.Ova metoda koristi monoklonska protutijela (mAbs) usmjerena na glikan biljnih staničnih stijenki kao sonde za razumijevanje složenih veza ugljikohidrata.Više od 250 mAb dostupno je diljem svijeta, dizajniranih protiv različitih linearnih i razgranatih oligosaharida pomoću različitih saharida24.Nekoliko mAb naširoko se koristi za karakterizaciju strukture, sastava i modifikacija stanične stijenke biljke, budući da postoje značajne razlike ovisno o tipu biljne stanice, organu, dobi, razvojnom stadiju i okruženju rasta25,26.Nedavno je ova metoda korištena za razumijevanje populacija vezikula u biljnim i životinjskim sustavima i njihove uloge u transportu glikana kako je određeno substaničnim markerima, razvojnim fazama ili podražajima iz okoliša, te za određivanje enzimske aktivnosti.Neke od različitih struktura glikana i ksilana koje su identificirane uključuju pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), glukane miješanih veza (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsku kiselinu-arabinoksilan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Međutim, usprkos svim ovim istraživačkim naporima, samo se nekoliko studija usredotočilo na prirodu nakupljanja oligosaharida tijekom hidrolize s visokim opterećenjem krutim tvarima (HSL), uključujući otpuštanje oligosaharida, promjene duljine oligomernog lanca tijekom hidrolize, razne polimere s niskim DP-om i njihove krivulje.raspodjele 30,31,32.U međuvremenu, iako se analiza glikana pokazala korisnim alatom za sveobuhvatnu analizu strukture glikana, teško je procijeniti vodotopive oligosaharide s niskim DP-om korištenjem metoda antitijela.Manji DP oligosaharidi s molekulskom težinom manjom od 5-10 kDa ne vežu se na ELISA ploče 33, 34 i ispiru se prije dodavanja antitijela.
Ovdje po prvi put demonstriramo ELISA test na pločama obloženim avidinom koristeći monoklonska protutijela, kombinirajući postupak biotinilacije u jednom koraku za topive refraktorne oligosaharide s analizom glikoma.Naš pristup analizi glikoma potvrđen je MALDI-TOF-MS i GC-MS analizom komplementarnih oligosaharidnih veza korištenjem trimetilsilil (TMS) derivatizacije hidroliziranih šećernih sastava.Ovaj inovativni pristup može se razviti kao visokoučinkovita metoda u budućnosti i naći širu primjenu u biomedicinskim istraživanjima35.
Posttranslacijske modifikacije enzima i antitijela, kao što je glikozilacija,36 utječu na njihovu biološku aktivnost.Na primjer, promjene u glikozilaciji serumskih proteina igraju važnu ulogu u upalnom artritisu, a promjene u glikozilaciji koriste se kao dijagnostički markeri37.U literaturi se navodi da se različiti glikani lako pojavljuju u raznim bolestima, uključujući kronične upalne bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre, virusne infekcije, rak jajnika, dojke i prostate38,39,40.Razumijevanje strukture glikana korištenjem glikanskih ELISA metoda temeljenih na antitijelima pružit će dodatnu sigurnost u dijagnozi bolesti bez upotrebe složenih MS metoda.
Naša prethodna studija pokazala je da su tvrdokorni oligosaharidi ostali nehidrolizirani nakon predtretmana i enzimske hidrolize (Slika 1).U našem prethodno objavljenom radu razvili smo metodu čvrste faze ekstrakcije aktivnim ugljenom za izolaciju oligosaharida iz hidrolizata kukuruza (ACSH) prethodno tretiranog AFEX-om.Nakon početne ekstrakcije i odvajanja, oligosaharidi su dalje frakcionirani kromatografijom isključenja veličine (SEC) i sakupljeni prema molekularnoj težini.Šećerni monomeri i oligomeri oslobođeni iz različitih predtretmana analizirani su analizom sastava šećera.Uspoređujući sadržaj oligomera šećera dobivenih različitim metodama predtretmana, prisutnost tvrdokornih oligosaharida čest je problem u pretvorbi biomase u monosaharide i može dovesti do smanjenja prinosa šećera od najmanje 10-15%, pa čak i do 18%.NAS.Ova metoda se koristi za daljnju proizvodnju frakcija oligosaharida u velikim količinama.Rezultirajući ACH i njegove naknadne frakcije s različitim molekulskim težinama korišteni su kao eksperimentalni materijal za karakterizaciju oligosaharida u ovom radu.
Nakon prethodne obrade i enzimske hidrolize, postojani oligosaharidi ostali su nehidrolizirani.Ovdje (A) je metoda odvajanja oligosaharida u kojoj se oligosaharidi izoliraju iz hidrolizata kuhanog kukuruza prethodno tretiranog AFEX-om (ACSH) korištenjem napunjenog sloja aktivnog ugljena i dijatomejske zemlje;(B) Metoda odvajanja oligosaharida.Oligosaharidi su dalje odvojeni kromatografijom isključenja veličine (SEC);(C) Saharidni monomeri i oligomeri oslobođeni različitim prethodnim obradama (razrijeđena kiselina: DA, ionska tekućina: IL i AFEX).Uvjeti enzimske hidrolize: visoko opterećenje krutine od 25% (w/w) (otprilike 8% glukana), hidroliza od 96 sati, komercijalno opterećenje enzima od 20 mg/g (omjer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Šećerni monomeri i oligomeri glukoze, ksiloze i arabinoze oslobođeni iz AFEX prethodno tretiranog kukuruza ( ACS).
Analiza glikana se pokazala kao koristan alat za sveobuhvatnu strukturnu analizu glikana u ekstraktima izoliranim iz krutih ostataka biomase.Međutim, saharidi topivi u vodi nedovoljno su zastupljeni korištenjem ove tradicionalne metode41 jer je oligosaharide niske molekularne težine teško imobilizirati na ELISA pločama i isperu se prije dodavanja protutijela.Stoga je za vezanje protutijela i karakterizaciju korištena metoda biotinilacije u jednom koraku za oblaganje topivih, nesukladnih oligosaharida na ELISA pločama obloženim avidinom.Ova je metoda testirana pomoću našeg prethodno proizvedenog ACSH i frakcije temeljene na njegovoj molekularnoj težini (ili stupnju polimerizacije, DP).Biotinilacija u jednom koraku korištena je za povećanje afiniteta vezanja oligosaharida dodavanjem biotin-LC-hidrazida na reducirajući kraj ugljikohidrata (slika 2).U otopini, poluacetalna skupina na reducirajućem kraju reagira s hidrazidnom skupinom biotin-LC-hidrazida kako bi se stvorila hidrazonska veza.U prisutnosti redukcijskog agensa NaCNBH3, hidrazonska veza se reducira do stabilnog biotiniliranog krajnjeg produkta.S modifikacijom kraja koji reducira šećer, postalo je moguće vezanje oligosaharida s niskim DP na ELISA ploče, a u našoj studiji to je učinjeno na pločama obloženim avidinom pomoću mAb-a ciljanih na glikan.
Probir monoklonskih protutijela temeljen na ELISA testu za biotinilirane oligosaharide.Ovdje (A) kombinirana biotinilacija oligosaharida i naknadni ELISA probir s mAbs usmjerenim na glikan na pločama obloženim NeutrAvidinom i (B) prikazuje postupak u jednom koraku za biotinilaciju produkata reakcije.
Ploče obložene avidinom s antitijelima konjugiranim s oligosaharidima zatim su dodane primarnim i sekundarnim antitijelima i isprane u mediju osjetljivom na svjetlo i vrijeme.Nakon što je vezanje protutijela završeno, dodajte TMB supstrat za inkubaciju ploče.Reakcija je konačno zaustavljena sumpornom kiselinom.Inkubirane ploče su analizirane korištenjem ELISA čitača kako bi se odredila snaga vezanja svakog antitijela kako bi se otkrilo unakrsno povezivanje specifično za antitijelo.Za pojedinosti i parametre eksperimenta, pogledajte odgovarajući odjeljak “Materijali i metode”.
Pokazujemo korisnost ove novorazvijene metode za specifične primjene karakterizacijom topivih oligosaharida prisutnih u ACSH kao i u sirovim i pročišćenim frakcijama oligosaharida izoliranih iz lignoceluloznih hidrolizata.Kao što je prikazano na slici 3, najčešći epitopom supstituirani ksilani identificirani u ACSH pomoću metoda ispitivanja bioaciliranog glikoma obično su uronski (U) ili metiluronski (MeU) i pektinski arabinogalaktani.Većina ih je također pronađena u našoj prethodnoj studiji o analizi glikana nehidroliziranih krutih tvari (UHS)43.
Detekcija neposlušnih oligosaharidnih epitopa pomoću monoklonskog antitijela usmjerenog na glikan stanične stijenke."Neutralna" frakcija je ACN frakcija, a "kisela" frakcija je FA frakcija.Svjetlije crvene na toplinskoj karti označavaju veći sadržaj epitopa, a svjetlije plave označavaju praznu pozadinu.Vrijednosti boja na ljestvici temelje se na sirovim vrijednostima OD za formulacije N=2.Glavni epitopi koje prepoznaju antitijela prikazani su desno.
Ove necelulozne strukture nisu mogle biti cijepane najčešćim celulazama i hemicelulazama u testiranoj komercijalnoj mješavini enzima, koja uključuje najčešće korištene komercijalne enzime.Stoga su za njihovu hidrolizu potrebni novi pomoćni enzimi.Bez potrebnih neceluloznih pomoćnih enzima, ove necelulozne veze sprječavaju potpunu pretvorbu u monosaharide, čak i ako su njihovi matični šećerni polimeri ekstenzivno hidrolizirani u kraće fragmente i otopljeni korištenjem komercijalnih mješavina enzima.
Daljnje istraživanje distribucije signala i njegove snage vezanja pokazalo je da su vezni epitopi niži u frakcijama šećera s visokim DP (A, B, C, DP do 20+) nego u frakcijama s niskim DP (D, E, F, DP) u dimerima) (Slika 1).Kiseli fragmenti su češći u neceluloznim epitopima nego neutralni fragmenti.Ovi fenomeni su u skladu s uzorkom uočenim u našoj prethodnoj studiji, gdje su visoki DP i kiseli dijelovi bili otporniji na enzimatsku hidrolizu.Stoga, prisutnost neceluloznih glikanskih epitopa i U i MeU supstitucija može uvelike pridonijeti stabilnosti oligosaharida.Treba napomenuti da učinkovitost vezivanja i detekcije može biti problematična za oligosaharide s niskim DP, posebno ako je epitop dimerni ili trimerni oligosaharid.To se može testirati korištenjem komercijalnih oligosaharida različitih duljina, od kojih svaki sadrži samo jedan epitop koji se veže na specifično mAb.
Stoga je uporaba strukturno specifičnih protutijela otkrila određene vrste neposlušnih veza.Ovisno o vrsti upotrijebljenog antitijela, odgovarajućem obrascu povezivanja i snazi ​​signala koji proizvodi (najviše i najmanje obilan), novi enzimi mogu se identificirati i dodati polukvantitativno u smjesu enzima za potpuniju glikokonverziju.Uzimajući analizu ACSH oligosaharida kao primjer, možemo stvoriti bazu podataka glikanskih veza za svaki materijal biomase.Ovdje treba napomenuti da treba uzeti u obzir različit afinitet protutijela, a ako je njihov afinitet nepoznat, to će stvoriti određene poteškoće pri usporedbi signala različitih protutijela.Osim toga, usporedba glikanskih veza može najbolje funkcionirati između uzoraka za isto protutijelo.Te tvrdoglave veze zatim se mogu povezati s bazom podataka CAZyme, iz koje možemo identificirati enzime, odabrati enzime kandidate i testirati enzime koji razbijaju veze ili razviti mikrobne sustave za ekspresiju ovih enzima za upotrebu u biorafinerijama44.
Kako bismo procijenili kako imunološke metode nadopunjuju alternativne metode za karakterizaciju oligosaharida niske molekularne težine prisutnih u lignoceluloznim hidrolizatima, proveli smo MALDI (Sl. 4, S1-S8) i analizu saharida izvedenih iz TMS-a na temelju GC-MS na istom panelu (Sl. 5) oligosaharidnog dijela.MALDI se koristi za usporedbu odgovara li raspodjela mase molekula oligosaharida predviđenoj strukturi.Na sl.Slika 4 prikazuje MC neutralnih komponenti ACN-A i ACN-B.ACN-A analiza potvrdila je niz pentoznih šećera u rasponu od DP 4–8 (Slika 4) do DP 22 (Slika S1), čije težine odgovaraju MeU-ksilan oligosaharidima.ACN-B analiza potvrdila je seriju pentoze i glukoksilana s DP 8-15.U dodatnom materijalu kao što je slika S3, mape distribucije mase kiselog dijela FA-C pokazuju niz (Me)U supstituiranih pentoznih šećera s DP od 8-15 koji su u skladu sa supstituiranim ksilanima pronađenim u probiru mAb temeljenom na ELISA.Epitopi su konzistentni.
MALDI-MS spektar topivih nesukladnih oligosaharida prisutnih u ACS-u.Ovdje (A) ACN-A frakcije niske težine koje sadrže metilirane uronske kiseline (DP 4-8) supstituirane glukuroksilanske oligosaharide i (B) ACN-B ksilan i metilirane uronske oligosaharide supstituirane s glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sastava glikanskog ostatka refraktornih oligosaharida.Ovdje (A) TMS sastav saharida različitih frakcija oligosaharida dobiven korištenjem GC-MS analize.(B) Strukture različitih šećera izvedenih iz TMS-a prisutnih u oligosaharidima.ACN – frakcija acetonitrila koja sadrži neutralne oligosaharide i FA – frakcija ferulinske kiseline koja sadrži kisele oligosaharide.
Još jedan zanimljiv zaključak izvučen je iz LC-MS analize frakcije oligosaharida, kao što je prikazano na slici S9 (metode se mogu vidjeti u elektroničkom dodatnom materijalu).Fragmenti heksoznih i -OAc skupina opetovano su promatrani tijekom ligacije ACN-B frakcije.Ovaj nalaz ne samo da potvrđuje fragmentaciju opaženu u glikomu i MALDI-TOF analizi, već također pruža nove informacije o potencijalnim derivatima ugljikohidrata u prethodno tretiranoj lignoceluloznoj biomasi.
Također smo analizirali sastav šećera frakcije oligosaharida pomoću TMS derivatizacije šećera.Pomoću GC-MS odredili smo sastav neuralnih (nederivativnih) i kiselih šećera (GluA i GalA) u frakciji oligosaharida (slika 5).Glukuronska kiselina se nalazi u kiselim komponentama C i D, dok se galakturonska kiselina nalazi u kiselim komponentama A i B, a obje su komponente kiselih šećera s visokim DP-om.Ovi rezultati ne samo da potvrđuju naše ELISA i MALDI podatke, već su i u skladu s našim prethodnim studijama nakupljanja oligosaharida.Stoga vjerujemo da su moderne imunološke metode koje koriste biotinilaciju oligosaharida i naknadni ELISA probir dovoljne za otkrivanje topljivih neposlušnih oligosaharida u različitim biološkim uzorcima.
Budući da su metode probira mAb temeljene na ELISA-i potvrđene pomoću nekoliko različitih metoda, željeli smo dodatno istražiti potencijal ove nove kvantitativne metode.Dva komercijalna oligosaharida, ksiloheksasaharid oligosaharid (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioza (A2XX), kupljena su i testirana korištenjem novog mAb pristupa koji cilja na glikan stanične stijenke.Slika 6 prikazuje linearnu korelaciju između biotiniliranog signala vezanja i logaritemske koncentracije koncentracije oligosaharida, sugerirajući mogući Langmuirov model adsorpcije.Među mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelirali su s XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelirali su s A2XX u rasponu od 1 nm do 100 nano.Zbog ograničene dostupnosti protutijela tijekom eksperimenta, ograničeni eksperimenti su izvedeni sa svakom koncentracijom oligosaharida.Ovdje treba napomenuti da neka protutijela vrlo različito reagiraju na isti oligosaharid kao supstrat, vjerojatno zato što se vežu na nešto drugačije epitope i mogu imati vrlo različite afinitete vezanja.Mehanizmi i implikacije točne identifikacije epitopa bit će puno složeniji kada se novi pristup mAb primijeni na stvarne uzorke.
Dva komercijalna oligosaharida korištena su za određivanje raspona detekcije različitih mAb-a koji ciljaju glikan.Ovdje linearne korelacije s logaritamskom koncentracijom koncentracije oligosaharida ukazuju na Langmuirove obrasce adsorpcije za (A) XHE s mAb i (B) A2XX s mAb.Odgovarajući epitopi ukazuju na strukture komercijalnih oligosaharida korištenih kao supstrati u analizi.
Korištenje monoklonskih protutijela usmjerenih na glikan (glikokomska analiza ili ELISA-bazirani mAb skrining) snažan je alat za dubinsku karakterizaciju većine glavnih glikana stanične stijenke koji čine biljnu biomasu.Međutim, klasična analiza glikana karakterizira samo veće glikane stanične stijenke, jer većina oligosaharida nije učinkovito imobilizirana na ELISA pločama.U ovoj studiji, AFEX prethodno tretirana kukuruzna peć je enzimatski hidrolizirana uz visok sadržaj krutine.Analiza šećera korištena je za određivanje sastava otpornih ugljikohidrata stanične stijenke u hidrolizatu.Međutim, mAb analiza manjih oligosaharida u hidrolizatima je podcijenjena i potrebni su dodatni alati za učinkovito imobiliziranje oligosaharida na ELISA pločama.
Ovdje izvješćujemo o novoj i učinkovitoj metodi imobilizacije oligosaharida za mAb probir kombiniranjem biotinilacije oligosaharida nakon čega slijedi ELISA probir na pločama obloženim NeutrAvidinom™.Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi pokazali su dovoljan afinitet za protutijela da omoguće brzo i učinkovito otkrivanje neposlušnih oligosaharida.Analiza sastava ovih tvrdokornih oligosaharida temeljena na spektrometriji mase potvrdila je rezultate ovog novog pristupa imunopregledu.Stoga ove studije pokazuju da se kombinacija biotinilacije oligosaharida i ELISA testa s monoklonskim antitijelima usmjerenim na glikan može koristiti za otkrivanje poprečnih veza u oligosaharidima i može se široko primijeniti u drugim biokemijskim studijama koje karakteriziraju strukturu oligosaharida.
Ova metoda profiliranja glikana temeljena na biotinu prvo je izvješće koje može istražiti otporne ugljikohidratne veze topivih oligosaharida u biljnoj biomasi.To pomaže razumjeti zašto su neki dijelovi biomase tako tvrdoglavi kada je riječ o proizvodnji biogoriva.Ova metoda popunjava važnu prazninu u metodama analize glikoma i proširuje svoju primjenu na širi raspon supstrata izvan biljnih oligosaharida.U budućnosti bismo mogli koristiti robotiku za biotinilaciju i koristiti metodu koju smo razvili za visokoučinkovitu analizu uzoraka pomoću ELISA-e.
Kukuruzna slama (CS) uzgojena iz hibridnog sjemena Pioneer 33A14 požnjevena je 2010. s Kramer Farms u Rayu, Colorado.Uz dopuštenje vlasnika zemljišta, ova se biomasa može koristiti za istraživanje. Uzorci su pohranjeni na suhom < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni na suhom < 6% vlage u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Obrazci su se hranili suhim pri vlažnosti < 6% u paketima sa zastežkoj-molnijom pri sobnoj temperaturi. Uzorci su pohranjeni na suhom pri <6% vlažnosti u vrećicama s patentnim zatvaračem na sobnoj temperaturi.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazac hrane u paketu sa zastežkoj-molnijem pri sobnoj temperaturi s vlagom < 6%. Uzorci se čuvaju u vrećicama sa patentnim zatvaračem na sobnoj temperaturi s vlagom < 6%.Studija je bila u skladu s lokalnim i nacionalnim smjernicama.Analiza sastava provedena je korištenjem NREL protokola.Utvrđeno je da sastav sadrži 31,4% glukana, 18,7% ksilana, 3,3% arabinana, 1,2% galaktana, 2,2% acetila, 14,3% lignina, 1,7% proteina i 13,4% pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, lot VCNI 0001) složena je mješavina celulaze, β-glukozidaze i Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, lot VHN00001) tvrtke Novozymes (Franklinton, NC, SAD)).Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), složenu mješavinu enzima koji razgrađuju pektin, donirao je DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SAD).Koncentracije proteina enzima određene su procjenom sadržaja proteina (i oduzimanjem doprinosa neproteinskog dušika) pomoću Kjeldahl analize dušika (AOAC metoda 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Dijatomejska zemlja 545 je kupljena od EMD Millipore (Billerica, MA).Aktivni ugljen (DARCO, 100 mesh granule), Avicel (PH-101), bukov ksilan i sve druge kemikalije kupljene su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Predtretman AFEX-om obavljen je u GLBRC (Laboratorij za istraživanje pretvorbe biomase, MSU, Lansing, MI, SAD).Predobrada je provedena na 140°C tijekom 15 minuta.46 vrijeme zadržavanja pri omjeru 1:1 bezvodnog amonijaka prema biomasi pri 60% (w/w) punjenja u stacionarnom šaržnom reaktoru od nehrđajućeg čelika (Parr Instruments Company).Trajalo je 30 minuta.Reaktor je zagrijan na 140°C i amonijak je brzo otpušten, omogućujući biomasi da se brzo vrati na sobnu temperaturu.Sastav AFEX prethodno obrađene kukuruzne peći (ACS) bio je sličan onom neobrađene kukuruzne peći (UT-CS).
ACSH s visokim udjelom krutine 25% (w/w) (približno 8% punjenja dekstranom) pripremljen je kao početni materijal za proizvodnju oligosaharida u velikim razmjerima.Enzimska hidroliza ACS-a provedena je pomoću komercijalne mješavine enzima uključujući Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukana (u prethodno tretiranoj biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukana i Multifect Pectinase (Genencor Inc, SAD).).), 5 mg proteina/g dekstrana.Enzimska hidroliza je provedena u bioreaktoru od 5 litara radnog volumena 3 litre, pH 4,8, 50°C i 250 okretaja u minuti.Nakon hidrolize tijekom 96 sati, hidrolizat je sakupljen centrifugiranjem na 6000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta i zatim na 14000 okretaja u minuti tijekom 30 minuta kako bi se uklonile nehidrolizirane krutine.Hidrolizat je zatim podvrgnut sterilnoj filtraciji kroz filtarsku čašu od 0,22 mm.Filtrirani hidrolizat je pohranjen u sterilnim bocama na 4°C i zatim frakcioniran na ugljenu.
Analiza sastava uzoraka biomase na bazi ekstrakta prema postupcima NREL laboratorijske analize: priprema uzoraka za analizu sastava (NREL/TP-510-42620) i određivanje strukturnih ugljikohidrata i lignina u biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligosaharida struje hidrolizata provedena je na skali od 2 ml korištenjem metode kiselinske hidrolize u autoklavu.Pomiješajte uzorak hidrolizata sa 69,7 µl 72% sumporne kiseline u epruveti s kulturom od 10 ml s navojnim poklopcem i inkubirajte 1 h na stolu na 121 °C, ohladite na ledu i filtrirajte u bočicu s tekućinskom kromatografijom visoke učinkovitosti (HPLC).Koncentracija oligosaharida određena je oduzimanjem koncentracije monosaharida u nehidroliziranom uzorku od ukupne koncentracije šećera u kiselo hidroliziranom uzorku.
Koncentracije glukoze, ksiloze i arabinoze u biomasi hidroliziranoj kiselinom analizirane su korištenjem Shimadzu HPLC sustava opremljenog autouzorkovačem, grijačem kolone, izokratskom pumpom i detektorom indeksa loma na Bio-Rad Aminex HPX-87H koloni.Kolona je održavana na 50°C i eluirana s 0,6 ml/min 5 mM H2SO4 u vodi.teći.
Supernatant hidrolizata je razrijeđen i analiziran na sadržaj monomera i oligosaharida.Monomerni šećeri dobiveni nakon enzimske hidrolize analizirani su HPLC-om opremljenim Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonom i kolonom za zaštitu od pepela.Temperatura kolone je održavana na 80°C, voda je korištena kao mobilna faza s protokom od 0,6 ml/min.Oligosaharidi su određeni hidrolizom u razrijeđenoj kiselini na 121°C prema metodama opisanim u referencama.41, 48, 49.
Analiza saharida provedena je na sirovim, AFEX prethodno tretiranim i svim nehidroliziranim ostacima biomase (uključujući proizvodnju serijskih ekstrakata stanične stijenke i njihov mAb screening) korištenjem prethodno opisanih postupaka 27, 43, 50, 51.Za analizu glikoma, u alkoholu netopljivi ostaci materijala biljnih staničnih stijenki pripremaju se iz ostataka biomase i podvrgavaju serijskoj ekstrakciji sa sve agresivnijim reagensima kao što su amonijev oksalat (50 mM), natrijev karbonat (50 mM i 0,5% w/v), CON.(1M i 4M, oba s 1% w/v natrij borohidrida) i kiseli klorit kao što je prethodno opisano52,53.Ekstrakti su zatim podvrgnuti ELISA testu protiv kompleksnog panela mAb50s usmjerenih na glikan stanične stijenke, a reakcije vezanja mAb prikazane su kao toplinska karta.mAbs koji ciljaju glikan stanične stijenke biljaka kupljen je iz laboratorijskih zaliha (CCRC, JIM i MAC serije).
Biotinilacija oligosaharida u jednom koraku.Konjugacija ugljikohidrata s biotin-LC-hidrazidom izvedena je korištenjem sljedećeg postupka.Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) otopljen je u dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) snažnim miješanjem i zagrijavanjem na 65°C tijekom 1 minute.Dodana je ledena octena kiselina (30 ul) i smjesa je izlivena na natrijev cijanoborhidrid (6,4 mg/100 umol) i potpuno otopljena nakon zagrijavanja na 65°C oko 1 minute.Zatim je od 5 do 8 μl reakcijske smjese dodano osušenom oligosaharidu (1-100 nmol) kako bi se dobio 10-struki ili više molarni višak oznake preko reducirajućeg kraja.Reakcija je provedena na 65°C tijekom 2 sata, nakon čega su uzorci odmah pročišćeni.U eksperimentima označavanja nije korišten natrijev cijanoborhidrid bez redukcije, a uzorci su reagirali na 65°C tijekom 2,5 sata.
ELISA oblaganje i pranje uzoraka biotiniliranih oligosaharida.25 μl biotiniliranih uzoraka (100 μl svakog koncentriranog uzorka razrijeđenog u 5 ml 0,1 M Tris puferske otopine (TBS)) dodano je u svaku jažicu ploče obložene avidinom.Kontrolne jažice obložene su s 50 μl biotina u koncentraciji od 10 μg/ml u 0,1 M TBS.Deionizirana voda korištena je kao premaz za slijepa mjerenja.Tableta je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku.Operite ploču 3 puta s 0,1% obranim mlijekom u 0,1 M TBS koristeći program br.11 za stan Grenier 3A.
Dodavanje i ispiranje primarnih antitijela.Dodajte 40 µl primarnog antitijela u svaku jažicu.Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku.Ploče su zatim isprane 3 puta s 0,1% mlijekom u 0,1 M TBS koristeći program pranja #11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno antitijelo i isperite.Dodajte 50 µl mišjeg/štakorskog sekundarnog protutijela (razrijeđenog 1:5000 u 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS) u svaku jažicu.Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku.Mikroploče su zatim isprane 5 puta s 0,1% mlijekom u 0,1 M TBS koristeći Grenier Flat 5A program za pranje ploča #12.
Dodavanje supstrata.Dodati 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) osnovnom supstratu (dodavanjem 2 kapi pufera, 3 kapi TMB-a, 2 kapi vodikovog peroksida u 15 ml deionizirane vode).Pripremite TMB supstrat.i promiješajte prije upotrebe).Inkubirajte mikroploču na sobnoj temperaturi 30 minuta.Po mraku.
Dovršite korak i pročitajte tablicu.Dodajte 50 µl 1 N sumporne kiseline u svaku jažicu i zabilježite apsorbanciju od 450 do 655 nm pomoću ELISA čitača.
Pripremite otopine od 1 mg/ml ovih analita u deioniziranoj vodi: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturonska kiselina (GalA), glukuronska kiselina (GlcA), manoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetilmanozamin (manNAc), N-acetilglukozamin.(glcNAc), N-acetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (interni standard).Dva standarda su pripremljena dodavanjem otopina šećera od 1 mg/mL prikazanih u tablici 1. Uzorci su zamrznuti i liofilizirani na -80°C dok se ne ukloni sva voda (obično oko 12-18 sati).
Dodajte 100–500 µg uzorka u epruvete s čepom na navoj na analitičkoj vagi.Zabilježite dodani iznos.Najbolje je otopiti uzorak u određenoj koncentraciji otapala i dodati ga u epruvetu kao tekući alikvot.Upotrijebite 20 µl inozitola od 1 mg/ml kao interni standard za svaku epruvetu s uzorkom.Količina internog standarda dodanog uzorku mora biti jednaka količini internog standarda dodanog u standardnu ​​epruvetu.
Dodajte 8 ml bezvodnog metanola u bočicu s navojnim čepom.Zatim 4 ml 3N metanolne otopine HCl, zatvoriti i protresti.Ovaj proces ne koristi vodu.
Dodajte 500 µl 1 M otopine HCl metanola u uzorke oligosaharida i standardne TMS epruvete.Uzorci su inkubirani preko noći (168 sati) na 80°C u termalnom bloku.Osušite produkt metanolize na sobnoj temperaturi pomoću razvodnika za sušenje.Dodati 200 µl MeOH i ponovno osušiti.Ovaj postupak se ponavlja dva puta.Dodajte 200 µl metanola, 100 µl piridina i 100 µl anhidrida octene kiseline u uzorak i dobro promiješajte.Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 30 minuta.i osušeni.Dodati 200 µl metanola i ponovno osušiti.
Dodajte 200 µl Tri-Sila i zagrijavajte zatvorenu epruvetu 20 minuta.80°C, zatim ohlađen na sobnu temperaturu.Upotrijebite razvodnik za sušenje kako biste dodatno osušili uzorak do volumena od približno 50 µl.Važno je napomenuti da nismo dopustili da se uzorci potpuno osuše.
Dodati 2 ml heksana i dobro promiješati vrtloženjem.Napunite vrhove Pasteurovih pipeta (5-8 mm) komadom staklene vune umetanjem staklene vune na vrh pipete promjera 5-3/4 inča.Uzorci su centrifugirani na 3000 g 2 minute.Svi netopljivi ostaci se talože.Osušiti uzorak do 100-150 µl.Volumen od približno 1 μl ubrizgan je u GC-MS na početnoj temperaturi od 80 °C i početnom vremenu od 2,0 minute (Tablica 2).