Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణకు పరిమిత CSS మద్దతు ఉంది.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).ఈ సమయంలో, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా రెండర్ చేస్తాము.
కార్న్ స్టోవర్‌లోని నిరంతర ఒలిగోశాకరైడ్‌ల సంక్లిష్ట విశ్లేషణ కోసం కొత్త ఇమ్యునోలాజికల్ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రిక్ పద్ధతులు AFEXతో ముందే చికిత్స చేయబడ్డాయి.లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ అనేది శిలాజ ఇంధనాలకు స్థిరమైన ప్రత్యామ్నాయం మరియు ఆహారం, ఫీడ్, ఇంధనాలు మరియు రసాయనాల వంటి ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తికి బయోటెక్నాలజీలను అభివృద్ధి చేయడానికి విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది.మొక్కల కణ గోడలలో ఉండే సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్‌లను గ్లూకోజ్, జిలోజ్ మరియు అరబినోస్ వంటి సాధారణ చక్కెరలుగా మార్చడానికి ఖర్చుతో కూడిన పోటీ ప్రక్రియల అభివృద్ధి ఈ సాంకేతికతలకు కీలకం.లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్ చాలా మొండిగా ఉంటుంది కాబట్టి, కావలసిన ఉత్పత్తిని పొందేందుకు అది తప్పనిసరిగా థర్మోకెమికల్ చికిత్సలకు (ఉదా, అమ్మోనియా ఫైబర్ ఎక్స్‌ఫోలియేషన్ (AFEX), డైల్యూట్ యాసిడ్‌లు (DA), అయానిక్ లిక్విడ్‌లు (IL)) మరియు బయోలాజికల్ ట్రీట్‌మెంట్‌లకు (ఉదా, ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ మరియు సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియ) లోబడి ఉండాలి..అయినప్పటికీ, జలవిశ్లేషణ ప్రక్రియలో వాణిజ్య శిలీంధ్ర ఎంజైమ్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు, ఏర్పడిన కరిగే చక్కెరలలో 75-85% మాత్రమే మోనోశాకరైడ్‌లు, మరియు మిగిలిన 15-25% కరిగే, ఇంట్రాక్టబుల్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు, ఇవి ఎల్లప్పుడూ సూక్ష్మజీవులకు అందుబాటులో ఉండవు.ఇంతకుముందు, కార్బన్ మరియు డయాటోమాసియస్ ఎర్త్ సెపరేషన్ మరియు సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ కలయికను ఉపయోగించి మేము కరిగే మొండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను విజయవంతంగా వేరుచేసి శుద్ధి చేసాము మరియు వాటి ఎంజైమ్ నిరోధక లక్షణాలను కూడా పరిశోధించాము.అధిక స్థాయి పాలిమరైజేషన్ (DP) మిథైలేటెడ్ యురోనిక్ యాసిడ్ ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌లు తక్కువ DP మరియు న్యూట్రల్ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కంటే వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలతో ప్రాసెస్ చేయడం చాలా కష్టమని మేము కనుగొన్నాము.మొక్కల కణ గోడలు మరియు ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లలో గ్లైకాన్ బాండ్‌లను వర్గీకరించడానికి మొక్కల బయోమాస్ గ్లైకాన్‌లకు ప్రత్యేకమైన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (mAbs) ఉపయోగించి గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్‌తో సహా అనేక అదనపు పద్ధతుల వినియోగాన్ని మేము ఇక్కడ నివేదిస్తాము మరియు ఎంజైమాటిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లు, మ్యాట్రిక్స్-సహాయక లేజర్ నిర్జలీకరణ అయనీకరణం, టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్-స్పెక్ట్రోమెట్రీ..MALDI-TOF-MS) ప్రతికూల అయాన్లు, గ్యాస్ క్రోమాటోగ్రఫీ మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (GC-MS) యొక్క ద్వితీయ క్షయం తర్వాత స్పెక్ట్రోస్కోపీ ద్వారా పొందిన స్ట్రక్చర్-ఇన్ఫర్మేటివ్ డయాగ్నస్టిక్ పీక్‌లను డెరివేటైజేషన్‌తో మరియు లేకుండా ఒలిగోశాకరైడ్ బంధాలను వర్గీకరించడానికి ఉపయోగిస్తుంది.ఒలిగోశాకరైడ్‌ల (DP 4–20) యొక్క చిన్న పరిమాణం కారణంగా, ఈ అణువులను mAb బైండింగ్ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ కోసం ఉపయోగించడం కష్టం.ఈ సమస్యను అధిగమించడానికి, మేము మైక్రోప్లేట్ ఉపరితలంపై తక్కువ DP కరిగే ఒలిగోశాకరైడ్‌లను విజయవంతంగా లేబుల్ చేసే కొత్త బయోటిన్ సంయోగం-ఆధారిత ఒలిగోసాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని వర్తింపజేసాము, ఇది నిర్దిష్ట బంధన విశ్లేషణ కోసం అధిక నిర్గమాంశ mAb సిస్టమ్‌లో ఉపయోగించబడింది.రోగనిర్ధారణ ప్రయోజనాల కోసం బయోమార్కర్లలో ఉన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి భవిష్యత్తులో మరింత అధునాతనమైన అధిక నిర్గమాంశ గ్లైకోమ్ పరీక్షల అభివృద్ధిని ఈ కొత్త పద్ధతి సులభతరం చేస్తుంది.
వ్యవసాయ, అటవీ, గడ్డి మరియు కలప పదార్థాలతో కూడిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్, అధిక విలువైన ఉత్పత్తులను ఉత్పత్తి చేయడానికి ఆహారం, ఫీడ్, ఇంధనం మరియు రసాయన పూర్వగాములతో సహా బయో-ఆధారిత ఉత్పత్తుల ఉత్పత్తికి సంభావ్య ఫీడ్‌స్టాక్.మొక్కల కణ గోడలలో ఉండే కార్బోహైడ్రేట్‌లు (సెల్యులోజ్ మరియు హెమిసెల్యులోజ్ వంటివి) రసాయన ప్రాసెసింగ్ మరియు బయో ట్రాన్స్‌ఫర్మేషన్ (ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ మరియు సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియ వంటివి) ద్వారా మోనోశాకరైడ్‌లుగా డిపోలిమరైజ్ చేయబడతాయి.సాధారణ ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్‌లలో అమ్మోనియా ఫైబర్ విస్తరణ (AFEX), డైల్యూట్ యాసిడ్ (DA), అయానిక్ లిక్విడ్ (IL) మరియు ఆవిరి పేలుడు (SE), ఇవి మొక్కల కణ గోడలను తెరవడం ద్వారా లిగ్నోసెల్యులోజ్ ఉత్పత్తిని తగ్గించడానికి రసాయనాలు మరియు వేడి కలయికను ఉపయోగిస్తాయి3,4.పదార్థం యొక్క మొండితనం, 5. ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ అనేది కమర్షియల్ యాక్టివ్ కార్బోహైడ్రేట్-కలిగిన ఎంజైమ్‌లను (CAZymes) ఉపయోగించి అధిక ఘనపదార్థాల లోడ్‌లో నిర్వహించబడుతుంది మరియు జీవ-ఆధారిత ఇంధనాలు మరియు రసాయనాలను ఉత్పత్తి చేయడానికి ట్రాన్స్‌జెనిక్ ఈస్ట్‌లు లేదా బ్యాక్టీరియాను ఉపయోగించి సూక్ష్మజీవుల కిణ్వ ప్రక్రియ 6 .
వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లలోని CAZymes ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమంతో కూడి ఉంటాయి, ఇవి సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్-షుగర్ బాండ్‌లను సినర్జిస్టిక్‌గా విడదీసి మోనోశాకరైడ్‌లను ఏర్పరుస్తాయి2,7.మేము ఇంతకు ముందే నివేదించినట్లుగా, కార్బోహైడ్రేట్‌లతో కూడిన లిగ్నిన్ యొక్క సుగంధ పాలిమర్‌ల సంక్లిష్ట నెట్‌వర్క్ వాటిని చాలా అస్పష్టంగా చేస్తుంది, ఇది అసంపూర్తిగా చక్కెర మార్పిడికి దారితీస్తుంది, ప్రీ-ట్రీట్ చేయబడిన బయోమాస్ యొక్క ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఉత్పత్తి చేయని 15-25% సెక్స్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు పేరుకుపోతాయి.వివిధ బయోమాస్ ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్ పద్ధతులతో ఇది ఒక సాధారణ సమస్య.ఈ అడ్డంకికి కొన్ని కారణాలు జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఎంజైమ్ నిరోధం లేదా మొక్కల బయోమాస్‌లో చక్కెర బంధాలను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి అవసరమైన ముఖ్యమైన ఎంజైమ్‌ల లేకపోవడం లేదా తక్కువ స్థాయిలు.ఒలిగోశాకరైడ్‌లలోని చక్కెర బంధాలు వంటి చక్కెరల కూర్పు మరియు నిర్మాణ లక్షణాలను అర్థం చేసుకోవడం, జలవిశ్లేషణ సమయంలో చక్కెర మార్పిడిని మెరుగుపరచడంలో మాకు సహాయపడుతుంది, బయోటెక్నాలజీ ప్రక్రియలను పెట్రోలియం-ఉత్పన్న ఉత్పత్తులతో ఖర్చు-పోటీగా చేస్తుంది.
కార్బోహైడ్రేట్ల నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడం సవాలుతో కూడుకున్నది మరియు లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (LC)11,12, న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (NMR)13, క్యాపిల్లరీ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ (CE)14,15,16 మరియు మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS)17 వంటి పద్ధతుల కలయిక అవసరం.,పద్దెనిమిది.మాతృక (MALDI-TOF-MS) ఉపయోగించి లేజర్ నిర్జలీకరణ మరియు అయనీకరణతో టైమ్-ఆఫ్-ఫ్లైట్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ వంటి MS పద్ధతులు కార్బోహైడ్రేట్ నిర్మాణాలను గుర్తించడానికి ఒక బహుముఖ పద్ధతి.ఇటీవల, ఒలిగోసాకరైడ్ అటాచ్‌మెంట్ స్థానాలు, అనోమెరిక్ కాన్ఫిగరేషన్‌లు, సీక్వెన్సులు మరియు బ్రాంచింగ్ పొజిషన్‌లు 20, 21కి సంబంధించిన వేలిముద్రలను గుర్తించడానికి సోడియం అయాన్ అడక్ట్‌ల తాకిడి-ప్రేరిత డిస్సోసియేషన్ (CID) టాండమ్ MS చాలా విస్తృతంగా ఉపయోగించబడింది.
గ్లైకాన్ విశ్లేషణ అనేది కార్బోహైడ్రేట్ బాండ్ల యొక్క లోతైన గుర్తింపు కోసం ఒక అద్భుతమైన సాధనం22.ఈ పద్ధతి సంక్లిష్ట కార్బోహైడ్రేట్ అనుసంధానాలను అర్థం చేసుకోవడానికి ప్రోబ్స్‌గా ప్లాంట్ సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (mAbs)ని ఉపయోగిస్తుంది.ప్రపంచవ్యాప్తంగా 250 mAbs కంటే ఎక్కువ అందుబాటులో ఉన్నాయి, వివిధ సాకరైడ్‌లను ఉపయోగించి వివిధ లీనియర్ మరియు బ్రాంచ్డ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు వ్యతిరేకంగా రూపొందించబడ్డాయి24.మొక్కల కణ గోడ యొక్క నిర్మాణం, కూర్పు మరియు మార్పులను వర్గీకరించడానికి అనేక mAbs విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి, ఎందుకంటే మొక్కల కణ రకం, అవయవం, వయస్సు, అభివృద్ధి దశ మరియు పెరుగుదల వాతావరణంపై ఆధారపడి ముఖ్యమైన తేడాలు ఉన్నాయి25,26.ఇటీవల, ఈ పద్ధతిని వృక్ష మరియు జంతు వ్యవస్థలలో వెసికిల్ జనాభాను అర్థం చేసుకోవడానికి మరియు గ్లైకాన్ రవాణాలో వాటి పాత్రలను ఉపకణ గుర్తులు, అభివృద్ధి దశలు లేదా పర్యావరణ ఉద్దీపనల ద్వారా నిర్ణయించడం మరియు ఎంజైమాటిక్ కార్యకలాపాలను నిర్ణయించడం కోసం ఉపయోగించబడింది.పెక్టిన్ (P), జిలాన్ (X), మన్నన్ (M), xyloglucans (XylG), మిక్స్‌డ్ బాండ్ గ్లూకాన్‌లు (MLG), అరబినోక్సిలాన్ (ArbX), గెలాక్టోమన్నన్ (GalG) , గ్లుకురోనాక్సిలాన్ (Glucuronic) మరియు Glucuronic యాసిడ్ (GA)అరాబ్యాక్సిలాన్ (A)-అరాబినాక్సిలాన్ యాసిడ్ (GA) 9.
అయినప్పటికీ, ఈ పరిశోధన ప్రయత్నాలన్నీ ఉన్నప్పటికీ, కొన్ని అధ్యయనాలు మాత్రమే అధిక ఘనపదార్థాల లోడ్ (HSL) జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోశాకరైడ్ చేరడం యొక్క స్వభావంపై దృష్టి సారించాయి, వీటిలో ఒలిగోశాకరైడ్ విడుదల, జలవిశ్లేషణ సమయంలో ఒలిగోమెరిక్ చైన్ పొడవు మార్పులు, వివిధ తక్కువ DP పాలిమర్‌లు మరియు వాటి వక్రతలు ఉన్నాయి.పంపిణీలు 30,31,32.ఇంతలో, గ్లైకాన్ నిర్మాణం యొక్క సమగ్ర విశ్లేషణ కోసం గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడినప్పటికీ, యాంటీబాడీ పద్ధతులను ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే తక్కువ DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లను అంచనా వేయడం కష్టం.5-10 kDa కంటే తక్కువ పరమాణు బరువు కలిగిన చిన్న DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లు 33, 34కి కట్టుబడి ఉండవు మరియు యాంటీబాడీ చేరికకు ముందు కొట్టుకుపోతాయి.
ఇక్కడ, మొదటిసారిగా, గ్లైకోమ్ విశ్లేషణతో కరిగే వక్రీభవన ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కోసం ఒక-దశ బయోటైనిలేషన్ విధానాన్ని కలిపి, మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్‌ని ఉపయోగించి అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్‌లపై మేము ELISA పరీక్షను ప్రదర్శిస్తాము.గ్లైకోమ్ విశ్లేషణకు మా విధానం హైడ్రోలైజ్డ్ షుగర్ కంపోజిషన్‌ల ట్రిమెథైల్‌సిలిల్ (TMS) డెరివేటైజేషన్‌ని ఉపయోగించి కాంప్లిమెంటరీ ఒలిగోసాకరైడ్ లింకేజ్‌ల MALDI-TOF-MS మరియు GC-MS ఆధారిత విశ్లేషణ ద్వారా ధృవీకరించబడింది.ఈ వినూత్న విధానాన్ని భవిష్యత్తులో అధిక-నిర్గమాంశ పద్ధతిగా అభివృద్ధి చేయవచ్చు మరియు బయోమెడికల్ పరిశోధనలో విస్తృత అనువర్తనాన్ని కనుగొనవచ్చు.
గ్లైకోసైలేషన్ వంటి ఎంజైమ్‌లు మరియు ప్రతిరోధకాల యొక్క అనువాద అనంతర మార్పులు, 36 వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రభావితం చేస్తాయి.ఉదాహరణకు, సీరం ప్రోటీన్ల గ్లైకోసైలేషన్‌లో మార్పులు ఇన్‌ఫ్లమేటరీ ఆర్థరైటిస్‌లో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయి మరియు గ్లైకోసైలేషన్‌లో మార్పులు డయాగ్నస్టిక్ మార్కర్‌లుగా ఉపయోగించబడతాయి.జీర్ణశయాంతర ప్రేగు మరియు కాలేయం యొక్క దీర్ఘకాలిక శోథ వ్యాధులు, వైరల్ ఇన్ఫెక్షన్లు, అండాశయాలు, రొమ్ము మరియు ప్రోస్టేట్ క్యాన్సర్లతో సహా వివిధ రకాల వ్యాధులలో వివిధ గ్లైకాన్‌లు సులభంగా కనిపిస్తాయని సాహిత్యంలో నివేదించబడింది38,39,40.యాంటీబాడీ-ఆధారిత గ్లైకాన్ ELISA పద్ధతులను ఉపయోగించి గ్లైకాన్‌ల నిర్మాణాన్ని అర్థం చేసుకోవడం సంక్లిష్ట MS పద్ధతులను ఉపయోగించకుండా వ్యాధి నిర్ధారణలో అదనపు విశ్వాసాన్ని అందిస్తుంది.
మా మునుపటి అధ్యయనం ముందస్తు చికిత్స మరియు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ (మూర్తి 1) తర్వాత మొండి పట్టుదలగల ఒలిగోశాకరైడ్‌లు హైడ్రోలైజ్ చేయబడలేదని చూపించింది.మా మునుపు ప్రచురించిన పనిలో, మేము AFEX-ప్రీట్రీటెడ్ కార్న్ స్టోవర్ హైడ్రోలైజేట్ (ACSH)8 నుండి ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరుచేయడానికి సక్రియం చేయబడిన బొగ్గు ఘన-దశ వెలికితీత పద్ధతిని అభివృద్ధి చేసాము.ప్రారంభ వెలికితీత మరియు విభజన తర్వాత, ఒలిగోసాకరైడ్‌లు సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా మరింత విభజించబడ్డాయి మరియు పరమాణు బరువు క్రమంలో సేకరించబడ్డాయి.వివిధ ముందస్తు చికిత్సల నుండి విడుదలైన షుగర్ మోనోమర్‌లు మరియు ఒలిగోమర్‌లు చక్కెర కూర్పు విశ్లేషణ ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి.వివిధ ప్రీ-ట్రీట్‌మెంట్ పద్ధతుల ద్వారా పొందిన చక్కెర ఒలిగోమర్‌ల కంటెంట్‌ను పోల్చినప్పుడు, బయోమాస్‌ను మోనోశాకరైడ్‌లుగా మార్చడంలో మొండి పట్టుదలగల ఒలిగోశాకరైడ్‌ల ఉనికి ఒక సాధారణ సమస్య మరియు చక్కెర దిగుబడిని కనీసం 10-15% మరియు 18% వరకు తగ్గించడానికి దారితీస్తుంది.USఈ పద్ధతి ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నాల యొక్క మరింత పెద్ద-స్థాయి ఉత్పత్తికి ఉపయోగించబడుతుంది.ఈ పనిలో ఒలిగోశాకరైడ్‌ల వర్గీకరణ కోసం వివిధ పరమాణు బరువులతో ఏర్పడిన ACH మరియు దాని తదుపరి భిన్నాలు ప్రయోగాత్మక పదార్థంగా ఉపయోగించబడ్డాయి.
ముందస్తు చికిత్స మరియు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత, నిరంతర ఒలిగోశాకరైడ్‌లు జలవిశ్లేషణ చేయబడవు.ఇక్కడ (A) ఒలిగోశాకరైడ్ వేరుచేసే పద్ధతి, దీనిలో ఒలిగోశాకరైడ్‌లు AFEX-ప్రీట్రీటెడ్ కార్న్ స్టోవర్ హైడ్రోలైజేట్ (ACSH) నుండి సక్రియం చేయబడిన కార్బన్ మరియు డయాటోమాసియస్ ఎర్త్‌తో కూడిన ప్యాక్ బెడ్‌ను ఉపయోగించి వేరుచేయబడతాయి;(B) ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేరు చేసే పద్ధతి.సైజ్ ఎక్స్‌క్లూజన్ క్రోమాటోగ్రఫీ (SEC) ద్వారా ఒలిగోశాకరైడ్‌లు మరింతగా వేరు చేయబడ్డాయి;(C) వివిధ ముందస్తు చికిత్సల నుండి విడుదలైన సాకరైడ్ మోనోమర్‌లు మరియు ఒలిగోమర్‌లు (పలచన ఆమ్లం: DA, అయానిక్ ద్రవం: IL మరియు AFEX).ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ పరిస్థితులు: 25% (w/w) అధిక ఘనపదార్థాలు లోడ్ అవుతాయి (సుమారు 8% గ్లూకాన్ లోడింగ్), 96 గంటల జలవిశ్లేషణ, 20 mg/g వాణిజ్య ఎంజైమ్ లోడింగ్ (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 నిష్పత్తి) మరియు (D) షుగర్ మోనోమర్‌లు మరియు గ్లుగోరోస్-ఎక్స్ నుండి విడుదలైన షుగర్ మోనోమర్‌లు ఎటెడ్ కార్న్ స్టోవర్ (ACS).
గ్లైకాన్ విశ్లేషణ ఘన బయోమాస్ అవశేషాల నుండి వేరు చేయబడిన సారాలలో గ్లైకాన్‌ల యొక్క సమగ్ర నిర్మాణ విశ్లేషణకు ఉపయోగకరమైన సాధనంగా నిరూపించబడింది.అయినప్పటికీ, ఈ సాంప్రదాయ పద్ధతిని ఉపయోగించి నీటిలో కరిగే శాకరైడ్‌లు తక్కువగా ప్రాతినిధ్యం వహిస్తాయి, ఎందుకంటే తక్కువ పరమాణు బరువు కలిగిన ఒలిగోశాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లపై స్థిరీకరించడం కష్టం మరియు యాంటీబాడీ చేరికకు ముందు కడిగివేయబడతాయి.అందువల్ల, యాంటీబాడీ బైండింగ్ మరియు క్యారెక్టరైజేషన్ కోసం, అవిడిన్-కోటెడ్ ELISA ప్లేట్‌లపై కరిగే, నాన్-కాంప్లైంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను పూయడానికి ఒక-దశ బయోటైనిలేషన్ పద్ధతి ఉపయోగించబడింది.ఈ పద్ధతి మా మునుపు ఉత్పత్తి చేయబడిన ACSH మరియు దాని పరమాణు బరువు (లేదా పాలిమరైజేషన్ డిగ్రీ, DP) ఆధారంగా కొంత భాగాన్ని ఉపయోగించి పరీక్షించబడింది.కార్బోహైడ్రేట్ (Fig. 2) యొక్క తగ్గింపు ముగింపుకు బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్‌ను జోడించడం ద్వారా ఒలిగోసాకరైడ్ బైండింగ్ అనుబంధాన్ని పెంచడానికి ఒక-దశ బయోటైనిలేషన్ ఉపయోగించబడింది.ద్రావణంలో, తగ్గించే ముగింపులో హెమియాసెటల్ సమూహం బయోటిన్-LC-హైడ్రాజైడ్ యొక్క హైడ్రాజైడ్ సమూహంతో చర్య జరిపి హైడ్రాజోన్ బంధాన్ని ఏర్పరుస్తుంది.తగ్గించే ఏజెంట్ NaCNBH3 సమక్షంలో, హైడ్రాజోన్ బంధం స్థిరమైన బయోటైనిలేటెడ్ తుది ఉత్పత్తికి తగ్గించబడుతుంది.చక్కెర తగ్గింపు ముగింపు యొక్క మార్పుతో, ELISA ప్లేట్‌లకు తక్కువ DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లను బంధించడం సాధ్యమైంది మరియు మా అధ్యయనంలో ఇది గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ mAbs ఉపయోగించి అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్‌లపై జరిగింది.
బయోటైనిలేటెడ్ ఒలిగోసాకరైడ్‌ల కోసం ELISA ఆధారంగా మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ స్క్రీనింగ్.ఇక్కడ (A) ఒలిగోశాకరైడ్‌ల మిశ్రమ బయోటైనిలేషన్ మరియు న్యూట్రాఅవిడిన్ కోటెడ్ ప్లేట్‌లపై గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ mAbsతో తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్ మరియు (B) ప్రతిచర్య ఉత్పత్తుల బయోటైనిలేషన్ కోసం ఒక-దశ విధానాన్ని చూపుతుంది.
ఒలిగోసాకరైడ్-కంజుగేటెడ్ యాంటీబాడీస్‌తో అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్లు అప్పుడు ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలకు జోడించబడ్డాయి మరియు కాంతి మరియు సమయ-సెన్సిటివ్ మాధ్యమంలో కడుగుతారు.యాంటీబాడీ బైండింగ్ పూర్తయిన తర్వాత, ప్లేట్‌ను పొదిగేలా చేయడానికి TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ని జోడించండి.సల్ఫ్యూరిక్ యాసిడ్‌తో ప్రతిచర్య చివరకు నిలిపివేయబడింది.యాంటీబాడీ-నిర్దిష్ట క్రాస్-లింకింగ్‌ను గుర్తించడానికి ప్రతి యాంటీబాడీ యొక్క బైండింగ్ బలాన్ని నిర్ణయించడానికి పొదిగిన ప్లేట్‌లను ELISA రీడర్‌ని ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.ప్రయోగం యొక్క వివరాలు మరియు పారామితుల కోసం, సంబంధిత విభాగాన్ని “మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్” చూడండి.
ACSHలో ఉన్న కరిగే ఒలిగోశాకరైడ్‌లను అలాగే లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్‌ల నుండి వేరుచేయబడిన ముడి మరియు శుద్ధి చేయబడిన ఒలిగోశాకరైడ్ భిన్నాలను వర్గీకరించడం ద్వారా నిర్దిష్ట అనువర్తనాల కోసం కొత్తగా అభివృద్ధి చేసిన ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రయోజనాన్ని మేము ప్రదర్శిస్తాము.మూర్తి 3లో చూపినట్లుగా, బయోఎసిలేటెడ్ గ్లైకోమ్ అస్సే పద్ధతులను ఉపయోగించి ACSHలో గుర్తించబడిన అత్యంత సాధారణ ఎపిటోప్-ప్రత్యామ్నాయ జిలాన్‌లు సాధారణంగా యురోనిక్ (U) లేదా మిథైలురోనిక్ (MeU) మరియు పెక్టిక్ అరబినోగలాక్టాన్‌లు.నాన్-హైడ్రోలైజ్డ్ సాలిడ్స్ (UHS) 43 యొక్క గ్లైకాన్‌ల విశ్లేషణపై మా మునుపటి అధ్యయనంలో వాటిలో చాలా వరకు కనుగొనబడ్డాయి.
సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీని ఉపయోగించి రికల్సిట్రెంట్ ఒలిగోసాకరైడ్ ఎపిటోప్‌లను గుర్తించడం."తటస్థ" భిన్నం ACN భిన్నం మరియు "ఆమ్ల" భిన్నం FA భిన్నం.హీట్‌మ్యాప్‌లోని ప్రకాశవంతమైన ఎరుపు రంగులు అధిక ఎపిటోప్ కంటెంట్‌ను సూచిస్తాయి మరియు ప్రకాశవంతమైన బ్లూస్ ఖాళీ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తాయి.స్కేల్‌పై రంగు విలువలు N=2 సూత్రీకరణల కోసం ముడి OD విలువలపై ఆధారపడి ఉంటాయి.ప్రతిరోధకాలచే గుర్తించబడిన ప్రధాన ఎపిటోప్‌లు కుడివైపున చూపబడ్డాయి.
ఈ నాన్-సెల్యులోజ్ నిర్మాణాలు పరీక్షించిన వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమంలో అత్యంత సాధారణ సెల్యులేస్‌లు మరియు హెమిసెల్యులేస్‌ల ద్వారా విడదీయబడవు, ఇందులో ఎక్కువగా ఉపయోగించే వాణిజ్య ఎంజైమ్‌లు ఉంటాయి.అందువల్ల, వాటి జలవిశ్లేషణకు కొత్త సహాయక ఎంజైమ్‌లు అవసరం.అవసరమైన నాన్-సెల్యులోజ్ అనుబంధ ఎంజైమ్‌లు లేకుండా, ఈ నాన్-సెల్యులోజ్ బంధాలు మోనోశాకరైడ్‌లుగా పూర్తిగా మారడాన్ని నిరోధిస్తాయి, వాటి పేరెంట్ షుగర్ పాలిమర్‌లు విస్తృతంగా చిన్న శకలాలుగా హైడ్రోలైజ్ చేయబడి, వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాలను ఉపయోగించి కరిగిపోయినప్పటికీ.
సిగ్నల్ డిస్ట్రిబ్యూషన్ మరియు దాని బైండింగ్ బలం యొక్క తదుపరి అధ్యయనంలో బైండింగ్ ఎపిటోప్‌లు అధిక DP చక్కెర భిన్నాలలో (A, B, C, DP వరకు 20+) తక్కువ DP భిన్నాలు (D, E, F, DP) డైమర్‌లలో కంటే తక్కువగా ఉన్నాయని తేలింది (Fig. 1).తటస్థ శకలాలు కంటే నాన్-సెల్యులోజ్ ఎపిటోప్‌లలో యాసిడ్ శకలాలు ఎక్కువగా కనిపిస్తాయి.ఈ దృగ్విషయాలు మా మునుపటి అధ్యయనంలో గమనించిన నమూనాకు అనుగుణంగా ఉంటాయి, ఇక్కడ అధిక DP మరియు యాసిడ్ కదలికలు ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణకు మరింత నిరోధకతను కలిగి ఉంటాయి.అందువల్ల, సెల్యులోజ్ కాని గ్లైకాన్ ఎపిటోప్‌లు మరియు U మరియు MeU ప్రత్యామ్నాయాల ఉనికి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల స్థిరత్వానికి బాగా దోహదపడుతుంది.తక్కువ DP ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు బైండింగ్ మరియు డిటెక్షన్ సామర్థ్యం సమస్యాత్మకంగా ఉంటుందని గమనించాలి, ప్రత్యేకించి ఎపిటోప్ డైమెరిక్ లేదా ట్రిమెరిక్ ఒలిగోశాకరైడ్ అయితే.వివిధ పొడవులు కలిగిన వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లను ఉపయోగించి దీనిని పరీక్షించవచ్చు, ప్రతి ఒక్కటి నిర్దిష్ట mAbతో బంధించే ఒక ఎపిటోప్‌ను మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది.
అందువలన, నిర్మాణం-నిర్దిష్ట ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించడం వలన కొన్ని రకాల రికల్సిట్రెంట్ బాండ్లు వెల్లడయ్యాయి.ఉపయోగించిన యాంటీబాడీ రకం, తగిన బంధన నమూనా మరియు అది ఉత్పత్తి చేసే సిగ్నల్ యొక్క బలం (అత్యంత మరియు తక్కువ సమృద్ధిగా) ఆధారంగా, కొత్త ఎంజైమ్‌లను గుర్తించవచ్చు మరియు మరింత పూర్తి గ్లైకోకన్వర్షన్ కోసం ఎంజైమ్ మిశ్రమానికి సెమీ-క్వాంటిటేటివ్‌గా జోడించవచ్చు.ACSH ఒలిగోశాకరైడ్‌ల విశ్లేషణను ఉదాహరణగా తీసుకుంటే, మనం ప్రతి బయోమాస్ మెటీరియల్‌కు గ్లైకాన్ బాండ్ల డేటాబేస్‌ను సృష్టించవచ్చు.ప్రతిరోధకాల యొక్క విభిన్న అనుబంధాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకోవాలని ఇక్కడ గమనించాలి మరియు వాటి అనుబంధం తెలియకపోతే, వివిధ ప్రతిరోధకాల సంకేతాలను పోల్చినప్పుడు ఇది కొన్ని ఇబ్బందులను సృష్టిస్తుంది.అదనంగా, గ్లైకాన్ బంధాల పోలిక అదే యాంటీబాడీ కోసం నమూనాల మధ్య ఉత్తమంగా పని చేస్తుంది.ఈ మొండి బంధాలను CAZyme డేటాబేస్‌కు అనుసంధానించవచ్చు, దీని నుండి మనం ఎంజైమ్‌లను గుర్తించవచ్చు, అభ్యర్థి ఎంజైమ్‌లను ఎంచుకోవచ్చు మరియు బాండ్-బ్రేకింగ్ ఎంజైమ్‌ల కోసం పరీక్షించవచ్చు లేదా బయోఫైనరీలలో ఉపయోగం కోసం ఈ ఎంజైమ్‌లను వ్యక్తీకరించడానికి సూక్ష్మజీవుల వ్యవస్థలను అభివృద్ధి చేయవచ్చు.
లిగ్నోసెల్యులోసిక్ హైడ్రోలైసేట్‌లలో ఉండే తక్కువ మాలిక్యులర్ వెయిట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వర్గీకరించడానికి ఇమ్యునోలాజికల్ పద్ధతులు ప్రత్యామ్నాయ పద్ధతులను ఎలా పూరిస్తాయో విశ్లేషించడానికి, మేము MALDI (Fig. 4, S1-S8) మరియు GC-MS ఆధారంగా TMS-ఉత్పన్నమైన శాకరైడ్‌ల విశ్లేషణను అదే ప్యానెల్‌పై (Fig. 5) oligos.ఒలిగోశాకరైడ్ అణువుల ద్రవ్యరాశి పంపిణీ ఉద్దేశించిన నిర్మాణంతో సరిపోలుతుందో లేదో పోల్చడానికి MALDI ఉపయోగించబడుతుంది.అంజీర్ న.4 తటస్థ భాగాల ACN-A మరియు ACN-B యొక్క MCని చూపుతుంది.ACN-A విశ్లేషణ DP 4–8 (Fig. 4) నుండి DP 22 (Fig. S1) వరకు పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని నిర్ధారించింది, దీని బరువులు MeU-xylan ఒలిగోసాకరైడ్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.ACN-B విశ్లేషణ DP 8-15తో పెంటోస్ మరియు గ్లూకోక్సిలాన్ సిరీస్‌లను నిర్ధారించింది.Figure S3 వంటి సప్లిమెంటరీ మెటీరియల్‌లో, FA-C యాసిడిక్ మోయిటీ మాస్ డిస్ట్రిబ్యూషన్ మ్యాప్‌లు ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్‌లో కనిపించే ప్రత్యామ్నాయ జిలాన్‌లకు అనుగుణంగా ఉండే 8-15 DPతో (Me)U ప్రత్యామ్నాయ పెంటోస్ చక్కెరల శ్రేణిని చూపుతాయి.ఎపిటోప్స్ స్థిరంగా ఉంటాయి.
ACSలో ఉన్న కరిగే నాన్-కాంప్లైంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌ల MALDI-MS స్పెక్ట్రమ్.ఇక్కడ, (A) మిథైలేటెడ్ యూరోనిక్ యాసిడ్ (DP 4-8) కలిగిన ACN-A తక్కువ బరువు శ్రేణి భిన్నాలు గ్లూకురోక్సిలాన్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు మరియు (B) ACN-B జిలాన్ మరియు మిథైలేటెడ్ యూరోనిక్ యాసిడ్ ఒలిగోసాకరైడ్‌లు (గ్లూకురాక్సీలాన్-1తో ప్రత్యామ్నాయం) (DPP85).
వక్రీభవన ఒలిగోసాకరైడ్ల గ్లైకాన్ అవశేషాల కూర్పు యొక్క విశ్లేషణ.ఇక్కడ (A) GC-MS విశ్లేషణను ఉపయోగించి పొందిన వివిధ ఒలిగోశాకరైడ్ భిన్నాల యొక్క TMS శాకరైడ్ కూర్పు.(B) ఒలిగోశాకరైడ్‌లలో ఉండే వివిధ TMS-ఉత్పన్న చక్కెరల నిర్మాణాలు.ACN - అసిటోనిట్రైల్ భిన్నం తటస్థ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను కలిగి ఉంటుంది మరియు FA - యాసిడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఫెరులిక్ యాసిడ్ భిన్నం.
మూర్తి S9లో చూపిన విధంగా ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నం యొక్క LC-MS విశ్లేషణ నుండి మరొక ఆసక్తికరమైన ముగింపు తీసుకోబడింది (పద్ధతులు ఎలక్ట్రానిక్ అనుబంధ పదార్థంలో చూడవచ్చు).ACN-B భిన్నం యొక్క బంధన సమయంలో హెక్సోస్ మరియు -OAc సమూహాల శకలాలు పదేపదే గమనించబడ్డాయి.ఈ అన్వేషణ గ్లైకోమ్ మరియు MALDI-TOF విశ్లేషణలో గమనించిన ఫ్రాగ్మెంటేషన్‌ను నిర్ధారించడమే కాకుండా, ముందుగా చికిత్స చేయబడిన లిగ్నోసెల్యులోసిక్ బయోమాస్‌లో సంభావ్య కార్బోహైడ్రేట్ ఉత్పన్నాల గురించి కొత్త సమాచారాన్ని అందిస్తుంది.
మేము TMS షుగర్ డెరివేటైజేషన్ ఉపయోగించి ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నం యొక్క చక్కెర కూర్పును కూడా విశ్లేషించాము.GC-MS ఉపయోగించి, మేము ఒలిగోసాకరైడ్ భిన్నం (Fig. 5)లో నాడీ (నాన్-డెరివేటివ్) మరియు ఆమ్ల చక్కెరల (GluA మరియు GalA) కూర్పును నిర్ణయించాము.గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు C మరియు D లలో కనుగొనబడింది, అయితే గెలాక్టురోనిక్ ఆమ్లం ఆమ్ల భాగాలు A మరియు B లలో కనుగొనబడింది, ఈ రెండూ ఆమ్ల చక్కెరల యొక్క అధిక DP భాగాలు.ఈ ఫలితాలు మా ELISA మరియు MALDI డేటాను నిర్ధారించడమే కాకుండా, ఒలిగోశాకరైడ్ చేరడంపై మా మునుపటి అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.అందువల్ల, వివిధ జీవ నమూనాలలో కరిగే రీకాల్‌సిట్రాంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను గుర్తించడానికి ఒలిగోశాకరైడ్‌ల బయోటైనిలేషన్ మరియు తదుపరి ELISA స్క్రీనింగ్‌ని ఉపయోగించి ఆధునిక రోగనిరోధక పద్ధతులు సరిపోతాయని మేము నమ్ముతున్నాము.
ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్ పద్ధతులు అనేక విభిన్న పద్ధతుల ద్వారా ధృవీకరించబడినందున, మేము ఈ కొత్త పరిమాణాత్మక పద్ధతి యొక్క సామర్థ్యాన్ని మరింత అన్వేషించాలనుకుంటున్నాము.రెండు వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లు, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) మరియు 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకుని కొత్త mAb విధానాన్ని ఉపయోగించి కొనుగోలు చేసి పరీక్షించబడ్డాయి.మూర్తి 6 బయోటైనిలేటెడ్ బైండింగ్ సిగ్నల్ మరియు ఒలిగోసాకరైడ్ ఏకాగ్రత యొక్క లాగ్ ఏకాగ్రత మధ్య సరళ సహసంబంధాన్ని చూపుతుంది, ఇది సాధ్యమయ్యే లాంగ్‌ముయిర్ అధిశోషణ నమూనాను సూచిస్తుంది.mAbsలో, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, మరియు CCRC-M151లు XHEతో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి మరియు CCRC-M108, CCRC-M109 మరియు LM11లు A2X0n పరిధిలోని A2X0n పరిధిలో ఉన్నాయి.ప్రయోగం సమయంలో ప్రతిరోధకాల పరిమిత లభ్యత కారణంగా, ప్రతి ఒలిగోసాకరైడ్ ఏకాగ్రతతో పరిమిత ప్రయోగాలు జరిగాయి.కొన్ని ప్రతిరోధకాలు ఉపరితలం వలె ఒకే ఒలిగోశాకరైడ్‌కు చాలా భిన్నంగా ప్రతిస్పందిస్తాయని ఇక్కడ గమనించాలి, బహుశా అవి కొద్దిగా భిన్నమైన ఎపిటోప్‌లతో బంధిస్తాయి మరియు చాలా భిన్నమైన బైండింగ్ అనుబంధాలను కలిగి ఉంటాయి.కొత్త mAb విధానాన్ని నిజమైన నమూనాలకు వర్తింపజేసినప్పుడు ఖచ్చితమైన ఎపిటోప్ గుర్తింపు యొక్క యంత్రాంగాలు మరియు చిక్కులు చాలా క్లిష్టంగా ఉంటాయి.
వివిధ గ్లైకాన్-టార్గెటింగ్ mAbs యొక్క గుర్తింపు పరిధిని నిర్ణయించడానికి రెండు వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి.ఇక్కడ, ఒలిగోసాకరైడ్ ఏకాగ్రత యొక్క లాగ్ ఏకాగ్రతతో సరళ సహసంబంధాలు (A) mAbతో XHE మరియు (B) MAbతో A2XX కోసం లాంగ్‌ముయిర్ శోషణ నమూనాలను సూచిస్తాయి.సంబంధిత ఎపిటోప్‌లు అస్సేలో సబ్‌స్ట్రేట్‌లుగా ఉపయోగించే వాణిజ్య ఒలిగోశాకరైడ్‌ల నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి.
గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ (గ్లైకోకోమిక్ అనాలిసిస్ లేదా ELISA-ఆధారిత mAb స్క్రీనింగ్) వాడకం అనేది మొక్కల బయోమాస్‌ను తయారు చేసే చాలా ప్రధాన సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌ల యొక్క లోతైన వర్గీకరణకు ఒక శక్తివంతమైన సాధనం.అయినప్పటికీ, క్లాసికల్ గ్లైకాన్ విశ్లేషణ పెద్ద సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌లను మాత్రమే వర్గీకరిస్తుంది, ఎందుకంటే చాలా ఒలిగోసాకరైడ్‌లు ELISA ప్లేట్‌లపై సమర్ధవంతంగా స్థిరీకరించబడవు.ఈ అధ్యయనంలో, AFEX- ప్రీ-ట్రీట్ చేయబడిన మొక్కజొన్న స్టోవర్ అధిక ఘన పదార్థాలతో ఎంజైమ్‌గా హైడ్రోలైజ్ చేయబడింది.హైడ్రోలైజేట్‌లోని రీకాల్సిట్రెంట్ సెల్ వాల్ కార్బోహైడ్రేట్‌ల కూర్పును నిర్ణయించడానికి చక్కెర విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది.అయినప్పటికీ, హైడ్రోలైసేట్‌లలోని చిన్న ఒలిగోశాకరైడ్‌ల యొక్క mAb విశ్లేషణ తక్కువగా అంచనా వేయబడింది మరియు ELISA ప్లేట్‌లపై ఒలిగోశాకరైడ్‌లను సమర్థవంతంగా స్థిరీకరించడానికి అదనపు సాధనాలు అవసరం.
న్యూట్రాఅవిడిన్™ కోటెడ్ ప్లేట్‌లపై ELISA స్క్రీనింగ్ తర్వాత ఒలిగోశాకరైడ్ బయోటైనిలేషన్‌ను కలపడం ద్వారా mAb స్క్రీనింగ్ కోసం ఒక నవల మరియు సమర్థవంతమైన ఒలిగోశాకరైడ్ స్థిరీకరణ పద్ధతిని మేము ఇక్కడ నివేదిస్తాము.నిశ్చలమైన బయోటైనిలేటెడ్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లు యాంటీబాడీకి తగినంత అనుబంధాన్ని చూపించాయి, ఇది రికల్సిట్రాంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లను వేగంగా మరియు సమర్థవంతంగా గుర్తించడానికి వీలు కల్పిస్తుంది.మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ ఆధారంగా ఈ మొండి పట్టుదలగల ఒలిగోశాకరైడ్‌ల కూర్పు యొక్క విశ్లేషణ ఇమ్యునోస్క్రీనింగ్‌కు ఈ కొత్త విధానం యొక్క ఫలితాలను నిర్ధారించింది.అందువల్ల, ఈ అధ్యయనాలు ఒలిగోశాకరైడ్‌లలో క్రాస్‌లింక్‌లను గుర్తించడానికి గ్లైకాన్-టార్గెటెడ్ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్‌తో ఒలిగోశాకరైడ్ బయోటైనిలేషన్ మరియు ELISA స్క్రీనింగ్ కలయికను ఉపయోగించవచ్చని మరియు ఒలిగోశాకరైడ్‌ల నిర్మాణాన్ని వివరించే ఇతర జీవరసాయన అధ్యయనాలలో విస్తృతంగా వర్తించవచ్చని నిరూపిస్తున్నాయి.
ఈ బయోటిన్-ఆధారిత గ్లైకాన్ ప్రొఫైలింగ్ పద్ధతి మొక్కల బయోమాస్‌లో కరిగే ఒలిగోశాకరైడ్‌ల యొక్క రీకాల్‌సిట్రాంట్ కార్బోహైడ్రేట్ బంధాలను పరిశోధించగల మొదటి నివేదిక.జీవ ఇంధన ఉత్పత్తికి సంబంధించి బయోమాస్‌లోని కొన్ని భాగాలు ఎందుకు మొండిగా ఉంటాయో అర్థం చేసుకోవడానికి ఇది సహాయపడుతుంది.ఈ పద్ధతి గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ పద్ధతులలో ఒక ముఖ్యమైన అంతరాన్ని పూరిస్తుంది మరియు ప్లాంట్ ఒలిగోశాకరైడ్‌లకు మించి విస్తృత శ్రేణి ఉపరితలాలకు దాని అప్లికేషన్‌ను విస్తరిస్తుంది.భవిష్యత్తులో, మేము బయోటైనిలేషన్ కోసం రోబోటిక్‌లను ఉపయోగించవచ్చు మరియు ELISAని ఉపయోగించి నమూనాల యొక్క అధిక-నిర్గమాంశ విశ్లేషణ కోసం మేము అభివృద్ధి చేసిన పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు.
పయనీర్ 33A14 హైబ్రిడ్ విత్తనాల నుండి పెరిగిన మొక్కజొన్న స్ట్రా (CS) 2010లో రే, కొలరాడోలోని క్రామెర్ ఫామ్స్ నుండి సేకరించబడింది.భూ యజమాని అనుమతితో, ఈ బయోమాస్ పరిశోధన కోసం ఉపయోగించవచ్చు. నమూనాలు గది ఉష్ణోగ్రతలో జిప్-లాక్ బ్యాగ్‌లలో పొడి <6% తేమగా నిల్వ చేయబడ్డాయి. నమూనాలు గది ఉష్ణోగ్రతలో జిప్-లాక్ బ్యాగ్‌లలో పొడి <6% తేమగా నిల్వ చేయబడ్డాయి. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной темпер. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద జిప్పర్డ్ బ్యాగ్‌లలో <6% తేమ వద్ద నమూనాలు పొడిగా నిల్వ చేయబడ్డాయి.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% ఒబ్రేసియస్ ట్రాన్సక్ టు పాకెట్స్ స్సస్టేజ్కోయ్-మోల్నియయ్ ప్రై కోమ్నట్నోయ్ టెంపరటురే స్ వ్లాగ్నోస్ట్యుర్ <6%. తేమ <6%తో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద జిప్పర్ బ్యాగ్‌లలో నమూనాలు నిల్వ చేయబడతాయి.అధ్యయనం స్థానిక మరియు జాతీయ మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా ఉంది.NREL ప్రోటోకాల్ ఉపయోగించి కంపోజిషనల్ విశ్లేషణ జరిగింది.కూర్పులో 31.4% గ్లూకాన్, 18.7% జిలాన్, 3.3% అరబినాన్, 1.2% గెలాక్టన్, 2.2% ఎసిటైల్, 14.3% లిగ్నిన్, 1.7% ప్రోటీన్ మరియు 13. 4% బూడిద ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది.
Cellic® CTec2 (138 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VCNI 0001) అనేది నోవోజైమ్స్ (ఫ్రాంక్లిన్టన్, NC, USA) నుండి సెల్యులేస్, β-గ్లూకోసిడేస్ మరియు సెల్లిక్ ® HTec2 (157 mg ప్రోటీన్/ml, లాట్ VHN00001) యొక్క సంక్లిష్ట మిశ్రమం.మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్ ® (72 mg ప్రోటీన్/mL), పెక్టిన్ డిగ్రేడింగ్ ఎంజైమ్‌ల సంక్లిష్ట మిశ్రమం, డ్యూపాంట్ ఇండస్ట్రియల్ బయోసైన్సెస్ (పాలో ఆల్టో, CA, USA) ద్వారా అందించబడింది.Kjeldahl నైట్రోజన్ విశ్లేషణ (AOAC పద్ధతి 2001.11, డైరీ వన్ కోఆపరేటివ్ ఇంక్., ఇతాకా, NY, USA) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ కంటెంట్ (మరియు నాన్-ప్రోటీన్ నైట్రోజన్ యొక్క సహకారాన్ని తీసివేయడం) ద్వారా ఎంజైమ్ ప్రోటీన్ సాంద్రతలు నిర్ణయించబడ్డాయి.డయాటోమాసియస్ ఎర్త్ 545 EMD మిల్లిపోర్ (బిల్లెరికా, MA) నుండి కొనుగోలు చేయబడింది.యాక్టివేటెడ్ కార్బన్ (DARCO, 100 మెష్ గ్రాన్యూల్స్), అవిసెల్ (PH-101), బీచ్ జిలాన్ మరియు అన్ని ఇతర రసాయనాలు సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్ (సెయింట్ లూయిస్, MO) నుండి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.
AFEX ప్రీట్రీట్‌మెంట్ GLBRC (బయోమాస్ కన్వర్షన్ రీసెర్చ్ లాబొరేటరీ, MSU, లాన్సింగ్, MI, USA)లో నిర్వహించబడింది.ప్రీ-ట్రీట్మెంట్ 140 ° C. వద్ద 15 నిమిషాలు నిర్వహించబడింది.46 నివాస సమయం 1:1 నిష్పత్తిలో అన్‌హైడ్రస్ అమ్మోనియా నుండి బయోమాస్ 60% (w/w) వద్ద స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ బెంచ్‌టాప్ బ్యాచ్ రియాక్టర్‌లో లోడ్ అవుతోంది (పార్ ఇన్‌స్ట్రుమెంట్స్ కంపెనీ).ఇది 30 నిమిషాలు పట్టింది.రియాక్టర్ 140 ° Cకి తీసుకురాబడింది మరియు అమ్మోనియా వేగంగా విడుదల చేయబడింది, బయోమాస్ త్వరగా గది ఉష్ణోగ్రతకు తిరిగి రావడానికి వీలు కల్పిస్తుంది.AFEX ప్రీ-ట్రీటెడ్ కార్న్ స్టోవర్ (ACS) కూర్పు చికిత్స చేయని మొక్కజొన్న స్టోవర్ (UT-CS) మాదిరిగానే ఉంది.
అధిక ఘనపదార్థాలు ACSH 25% (w/w) (సుమారు 8% డెక్స్ట్రాన్ లోడింగ్) పెద్ద ఎత్తున ఒలిగోసకరైడ్‌ల ఉత్పత్తికి ప్రారంభ పదార్థంగా తయారు చేయబడింది.Cellic® Ctec2 10 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్ (ప్రీట్రీట్ బయోమాస్‌లో), Htec2 (నోవోజైమ్స్, ఫ్రాంక్లిన్టన్, NC), 5 mg ప్రోటీన్/g గ్లూకాన్ మరియు మల్టీఫెక్ట్ పెక్టినేస్ (Genencor Inc, USA)తో సహా వాణిజ్య ఎంజైమ్ మిశ్రమాన్ని ఉపయోగించి ACS యొక్క ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ జరిగింది.)), 5 mg ప్రోటీన్/గ్రా డెక్స్ట్రాన్.ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ 3 లీటర్లు, pH 4.8, 50 ° C మరియు 250 rpm పని వాల్యూమ్‌తో 5-లీటర్ బయోఇయాక్టర్‌లో నిర్వహించబడింది.96 గంటల పాటు జలవిశ్లేషణ చేసిన తర్వాత, హైడ్రోలైజ్ చేయని ఘనపదార్థాలను తొలగించడానికి 30 నిమిషాల పాటు 6000 ఆర్‌పిఎమ్ వద్ద సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా మరియు తర్వాత 14000 ఆర్‌పిఎమ్ వద్ద 30 నిమిషాల పాటు హైడ్రోలైజేట్ సేకరించబడింది.హైడ్రోలైజేట్ 0.22 మిమీ ఫిల్టర్ బీకర్ ద్వారా శుభ్రమైన వడపోతకు లోబడి ఉంటుంది.ఫిల్టర్ చేయబడిన హైడ్రోలైజేట్ 4 ° C. వద్ద శుభ్రమైన సీసాలలో నిల్వ చేయబడుతుంది మరియు తరువాత కార్బన్‌పై భిన్నం చేయబడింది.
NREL ప్రయోగశాల విశ్లేషణ విధానాల ప్రకారం సారం-ఆధారిత బయోమాస్ నమూనాల కూర్పు యొక్క విశ్లేషణ: కూర్పు విశ్లేషణ కోసం నమూనాల తయారీ (NREL/TP-510-42620) మరియు బయోమాస్‌లో స్ట్రక్చరల్ కార్బోహైడ్రేట్లు మరియు లిగ్నిన్‌ల నిర్ధారణ (NREL/TP-510 - 42618)47.
హైడ్రోలైజేట్ స్ట్రీమ్ యొక్క ఒలిగోసాకరైడ్ విశ్లేషణ ఆటోక్లేవ్-ఆధారిత యాసిడ్ జలవిశ్లేషణ పద్ధతిని ఉపయోగించి 2 ml స్కేల్‌లో నిర్వహించబడింది.10 ml స్క్రూ క్యాప్ కల్చర్ ట్యూబ్‌లో 69.7 µl 72% సల్ఫ్యూరిక్ యాసిడ్‌తో హైడ్రోలైజేట్ నమూనాను కలపండి మరియు 121 °C వద్ద బెంచ్‌టాప్‌పై 1 గం వరకు పొదిగేది, మంచు మీద చల్లబరుస్తుంది మరియు అధిక పనితీరు గల లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) సీసాలోకి ఫిల్టర్ చేయండి.యాసిడ్-హైడ్రోలైజ్డ్ నమూనాలోని మొత్తం చక్కెర సాంద్రత నుండి నాన్-హైడ్రోలైజ్డ్ శాంపిల్‌లోని మోనోశాకరైడ్‌ల సాంద్రతను తీసివేయడం ద్వారా ఒలిగోశాకరైడ్‌ల సాంద్రత నిర్ణయించబడుతుంది.
యాసిడ్ హైడ్రోలైజ్డ్ బయోమాస్‌లోని గ్లూకోజ్, జిలోజ్ మరియు అరబినోస్ సాంద్రతలు బయో-రాడ్ అమినెక్స్ HPX-87H కాలమ్‌పై ఆటోసాంప్లర్, కాలమ్ హీటర్, ఐసోక్రటిక్ పంప్ మరియు రిఫ్రాక్టివ్ ఇండెక్స్ డిటెక్టర్‌తో కూడిన షిమాడ్జు హెచ్‌పిఎల్‌సి సిస్టమ్‌ను ఉపయోగించి విశ్లేషించబడ్డాయి.కాలమ్ 50°C వద్ద నిర్వహించబడింది మరియు నీటిలో 0.6 ml/min 5 mM H2SO4తో ఎల్యూట్ చేయబడింది.ప్రవాహం.
హైడ్రోలైజేట్ సూపర్‌నాటెంట్ మోనోమర్ మరియు ఒలిగోసాకరైడ్ కంటెంట్ కోసం పలుచన చేయబడింది మరియు విశ్లేషించబడింది.ఎంజైమాటిక్ జలవిశ్లేషణ తర్వాత పొందిన మోనోమెరిక్ చక్కెరలు బయో-రాడ్ (హెర్క్యులస్, CA) అమినెక్స్ HPX-87P కాలమ్ మరియు యాష్ గార్డ్ కాలమ్‌తో కూడిన HPLC చేత విశ్లేషించబడ్డాయి.కాలమ్ ఉష్ణోగ్రత 80 ° C వద్ద నిర్వహించబడుతుంది, నీటిని 0.6 ml/min ప్రవాహం రేటుతో మొబైల్ దశగా ఉపయోగించారు.రెఫ్స్‌లో వివరించిన పద్ధతుల ప్రకారం 121 ° C వద్ద పలుచన ఆమ్లంలో జలవిశ్లేషణ ద్వారా ఒలిగోసాకరైడ్‌లు నిర్ణయించబడ్డాయి.41, 48, 49.
మునుపు వివరించిన విధానాలు 27, 43, 50, 51 ఉపయోగించి ముడి, AFEX ముందుగా చికిత్స చేయబడిన మరియు అన్ని నాన్-హైడ్రోలైజ్డ్ బయోమాస్ అవశేషాలపై (సీరియల్ సెల్ వాల్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌ల ఉత్పత్తి మరియు వాటి mAb స్క్రీనింగ్‌తో సహా) శాకరైడ్ విశ్లేషణ జరిగింది.గ్లైకోమ్ విశ్లేషణ కోసం, మొక్కల కణ గోడ పదార్థం యొక్క ఆల్కహాల్-కరగని అవశేషాలు బయోమాస్ అవశేషాల నుండి తయారు చేయబడతాయి మరియు అమ్మోనియం ఆక్సలేట్ (50 mM), సోడియం కార్బోనేట్ (50 mM మరియు 0.5% w/v), CON వంటి దూకుడు కారకాలతో సీరియల్ వెలికితీతకు లోబడి ఉంటాయి.(1M మరియు 4M, రెండూ 1% w/v సోడియం బోరోహైడ్రైడ్‌తో) మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా యాసిడ్ క్లోరైట్52,53.సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌కు దర్శకత్వం వహించిన mAb50ల సంక్లిష్ట ప్యానెల్‌కు వ్యతిరేకంగా ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌లు ELISAకి లోబడి ఉన్నాయి మరియు mAb బైండింగ్ ప్రతిచర్యలు హీట్ మ్యాప్‌గా ప్రదర్శించబడ్డాయి.ప్లాంట్ సెల్ వాల్ గ్లైకాన్‌ను లక్ష్యంగా చేసుకునే mAbs ప్రయోగశాల స్టాక్‌ల (CCRC, JIM మరియు MAC సిరీస్) నుండి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.
ఒలిగోసాకరైడ్ల యొక్క ఒక-దశ బయోటైనిలేషన్.బయోటిన్-ఎల్‌సి-హైడ్రాజైడ్‌తో కార్బోహైడ్రేట్ల సంయోగం క్రింది విధానాన్ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO, 70 μl)లో 1 నిమిషం పాటు 65 ° C. వద్ద తీవ్రంగా కదిలించడం మరియు వేడి చేయడం ద్వారా కరిగించబడుతుంది.గ్లాసియల్ ఎసిటిక్ యాసిడ్ (30 µl) జోడించబడింది మరియు మిశ్రమాన్ని సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ (6.4 mg/100 µmol) పై పోస్తారు మరియు సుమారు 1 నిమిషం పాటు 65 ° C. వద్ద వేడి చేసిన తర్వాత పూర్తిగా కరిగించబడుతుంది.అప్పుడు, 5 నుండి 8 μl ప్రతిచర్య మిశ్రమం ఎండిన ఒలిగోసాకరైడ్ (1-100 nmol) కు జోడించబడింది, ఇది తగ్గించే చివరలో లేబుల్ యొక్క 10 రెట్లు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ మోలార్‌ను పొందుతుంది.ప్రతిచర్య 2 గంటలకు 65 ° C వద్ద నిర్వహించబడింది, ఆ తర్వాత నమూనాలు వెంటనే శుద్ధి చేయబడ్డాయి.తగ్గింపు లేకుండా లేబులింగ్ ప్రయోగాలలో సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ ఉపయోగించబడలేదు మరియు నమూనాలు 2.5 గంటల పాటు 65 ° C. వద్ద స్పందించబడ్డాయి.
ELISA పూత మరియు బయోటైనిలేటెడ్ ఒలిగోసాకరైడ్ల నమూనాలను కడగడం.అవిడిన్-కోటెడ్ ప్లేట్‌లోని ప్రతి బావికి 25 μl బయోటైనిలేటెడ్ నమూనాలు (ప్రతి సాంద్రీకృత నమూనాలో 100 μl 5 ml 0.1 M ట్రిస్ బఫర్ ద్రావణం (TBS)లో కరిగించబడుతుంది) జోడించబడ్డాయి.నియంత్రణ బావులు 0.1 M TBSలో 10 μg/ml గాఢతతో 50 μl బయోటిన్‌తో పూత పూయబడ్డాయి.డీయోనైజ్డ్ నీటిని ఖాళీ కొలతలకు పూతగా ఉపయోగించారు.టాబ్లెట్ చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటలు పొదిగేది.ప్రోగ్రామ్ నంబర్‌ని ఉపయోగించి 0.1 M TBSలో 0.1% స్కిమ్డ్ మిల్క్‌తో ప్లేట్‌ను 3 సార్లు కడగాలి.గ్రేనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం 11.
ప్రాధమిక ప్రతిరోధకాలను చేర్చడం మరియు కడగడం.ప్రతి బావికి 40 µl ప్రాథమిక యాంటీబాడీని జోడించండి.చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు మైక్రోప్లేట్‌ను పొదిగించండి.గ్రేనియర్ ఫ్లాట్ 3A కోసం వాష్ ప్రోగ్రామ్ #11ని ఉపయోగించి ప్లేట్‌లను 0.1M TBSలో 0.1% పాలతో 3 సార్లు కడుగుతారు.
సెకండరీ యాంటీబాడీని వేసి కడగాలి.ప్రతి బావికి 50 µl మౌస్/ఎలుక సెకండరీ యాంటీబాడీని (0.1 M TBSలో 1:5000 0.1% పాలలో కరిగించబడుతుంది) జోడించండి.చీకటిలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 1 గంట పాటు మైక్రోప్లేట్‌ను పొదిగించండి.మైక్రోప్లేట్‌లను గ్రేనియర్ ఫ్లాట్ 5A ప్లేట్ వాష్ ప్రోగ్రామ్ #12 ఉపయోగించి 0.1 M TBSలో 0.1% పాలతో 5 సార్లు కడుగుతారు.
ఒక ఉపరితల జోడించడం.50 µl యొక్క 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB)ని బేస్ సబ్‌స్ట్రేట్‌కి జోడించండి (2 చుక్కల బఫర్, 3 చుక్కల TMB, 2 చుక్కల హైడ్రోజన్ పెరాక్సైడ్ 15 ml డీయోనైజ్డ్ వాటర్‌కి జోడించడం ద్వారా).TMB సబ్‌స్ట్రేట్‌ను సిద్ధం చేయండి.మరియు ఉపయోగం ముందు సుడిగుండం).మైక్రోప్లేట్‌ను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించండి.చీకటిలో.
దశను పూర్తి చేసి, టాబ్లెట్‌ను చదవండి.ప్రతి బావికి 50 µl 1 N సల్ఫ్యూరిక్ ఆమ్లాన్ని జోడించండి మరియు ELISA రీడర్‌ని ఉపయోగించి 450 నుండి 655 nm వరకు శోషణను రికార్డ్ చేయండి.
డీయోనైజ్డ్ నీటిలో ఈ విశ్లేషణల యొక్క 1 mg/ml ద్రావణాలను సిద్ధం చేయండి: అరబినోస్, రామ్‌నోస్, ఫ్యూకోస్, జిలోస్, గెలాక్టురోనిక్ యాసిడ్ (GalA), గ్లూకురోనిక్ యాసిడ్ (GlcA), మన్నోస్, గ్లూకోజ్, గెలాక్టోస్, లాక్టోస్, N-ఎసిటైల్‌మన్నోసమైన్, N-acetylmannosamine.(glcNAc), N-ఎసిటైల్గలాక్టోసమైన్ (galNAc), ఇనోసిటాల్ (అంతర్గత ప్రమాణం).టేబుల్ 1లో చూపిన 1 mg/mL చక్కెర ద్రావణాలను జోడించడం ద్వారా రెండు ప్రమాణాలు తయారు చేయబడ్డాయి. మొత్తం నీటిని తొలగించే వరకు (సాధారణంగా దాదాపు 12-18 గంటలు) నమూనాలు -80° C. వద్ద స్తంభింపజేయబడతాయి మరియు లైయోఫైలైజ్ చేయబడతాయి.
విశ్లేషణాత్మక బ్యాలెన్స్‌లో క్యాప్ ట్యూబ్‌లను స్క్రూ చేయడానికి 100–500 μg నమూనాను జోడించండి.జోడించిన మొత్తాన్ని రికార్డ్ చేయండి.ద్రావకం యొక్క నిర్దిష్ట సాంద్రతలో నమూనాను కరిగించడం మరియు దానిని ద్రవ ఆల్కాట్‌గా ట్యూబ్‌కు జోడించడం ఉత్తమం.ప్రతి నమూనా ట్యూబ్‌కు 20 µl 1 mg/ml ఇనోసిటాల్‌ను అంతర్గత ప్రమాణంగా ఉపయోగించండి.నమూనాకు జోడించబడిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తం తప్పనిసరిగా ప్రామాణిక ట్యూబ్‌కు జోడించబడిన అంతర్గత ప్రమాణం మొత్తం సమానంగా ఉండాలి.
ఒక స్క్రూ క్యాప్ సీసాలో 8 ml అన్‌హైడ్రస్ మిథనాల్ జోడించండి.తర్వాత 4 మి.లీ.ల 3 N. మిథనాలిక్ HCl ద్రావణం, మూతపెట్టి కదిలించబడుతుంది.ఈ ప్రక్రియ నీటిని ఉపయోగించదు.
ఒలిగోసాకరైడ్ నమూనాలు మరియు ప్రామాణిక TMS ట్యూబ్‌లకు 500 µl 1 M HCl మిథనాల్ ద్రావణాన్ని జోడించండి.నమూనాలను రాత్రిపూట (168 గంటలు) 80 ° C. వద్ద థర్మల్ బ్లాక్‌లో పొదిగించారు.మెథనోలిసిస్ ఉత్పత్తిని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఎండబెట్టడం మానిఫోల్డ్ ఉపయోగించి ఆరబెట్టండి.200 µl MeOHని జోడించి మళ్లీ ఆరబెట్టండి.ఈ ప్రక్రియ రెండుసార్లు పునరావృతమవుతుంది.200 µl మిథనాల్, 100 µl పిరిడిన్ మరియు 100 µl ఎసిటిక్ అన్‌హైడ్రైడ్‌ను నమూనాలో వేసి బాగా కలపాలి.నమూనాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాలు పొదిగించారు.మరియు ఎండబెట్టి.200 µl మిథనాల్ వేసి మళ్లీ ఆరబెట్టండి.
200 μl ట్రై-సిల్ మరియు 20 నిమిషాల పాటు వేడిచేసిన ట్యూబ్‌ని జోడించండి.80 ° C, ఆపై గది ఉష్ణోగ్రతకు చల్లబడుతుంది.సుమారు 50 µl వాల్యూమ్‌కు నమూనాను మరింత పొడిగా చేయడానికి ఎండబెట్టడం మానిఫోల్డ్‌ను ఉపయోగించండి.మేము నమూనాలను పూర్తిగా ఆరబెట్టడానికి అనుమతించలేదని గమనించడం ముఖ్యం.
2 మి.లీ హెక్సేన్ వేసి బాగా కలపాలి.5-3/4 అంగుళాల వ్యాసం కలిగిన పైపెట్ పైన గాజు ఉన్నిని చొప్పించడం ద్వారా పాశ్చర్ పైపెట్‌ల (5-8 మిమీ) చిట్కాలను గాజు ఉన్ని ముక్కతో పూరించండి.నమూనాలను 2 నిమిషాలకు 3000 గ్రా వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.ఏదైనా కరగని అవశేషాలు అవక్షేపించబడతాయి.నమూనాను 100-150 μl వరకు ఆరబెట్టండి.80 °C ప్రారంభ ఉష్ణోగ్రత వద్ద మరియు 2.0 నిమిషాల ప్రారంభ సమయం (టేబుల్ 2) వద్ద సుమారు 1 μl వాల్యూమ్ GC-MSలోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడింది.