Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт.Сез кулланган браузер версиясенең CSS ярдәме чикләнгән.Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез).Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
AFEX белән эшләнгән кукуруз мичендәге өзлексез олигосакаридларны катлаулы анализлау өчен яңа иммунологик һәм масса спектрометрик ысуллар.Лигноселлоз биомассасы - казылма ягулыкка тотрыклы альтернатива һәм азык-төлек, азык, ягулык һәм химия кебек продуктлар җитештерү өчен биотехнологияләр үстерү өчен киң кулланыла.Бу технологияләрнең ачкычы - үсемлек күзәнәк стеналарында булган катлаулы углеводларны глюкоза, ксилоза һәм арабиноза кебек гади шикәрләргә әверелдерү өчен көндәшлеккә сәләтле процесслар эшләү.Лигноселлоз биомассасы бик каты булганга, термохимик дәвалауларга (мәсәлән, аммиак җепселләре эксфолиациясенә), эретелгән кислоталарга (DA), ион сыеклыкларына (IL) һәм биологик дәвалау ысулларына (мәсәлән, энзиматик гидролиз һәм микробиаль ферментация) кушылырга тиеш..Ләкин, гидролиз процессында коммерция гөмбә ферментлары кулланылганда, барлыкка килгән шикәрнең 75-85% ы гына моносахаридлар, калган 15-25% эри торган, эшкәртелмәгән олигосакаридлар, алар һәрвакыт микроорганизмнар өчен мөмкин түгел.Элегерәк без углерод һәм диатомазлы җирне аеру һәм зурлыкны чыгару хроматографиясе комбинациясен кулланып, эри торган каты олигосакаридларны уңышлы изоляцияләдек һәм чистарттык, шулай ук ​​аларның ферментларның ингибитор үзлекләрен тикшердек.Без ачыкладык, югары полимеризация (DP) метилизацияләнгән урон кислотасын алмаштыручы олигосакаридлар түбән DP һәм нейтраль олигосакаридларга караганда коммерция ферментлары белән эшкәртү авыррак.Монда без берничә өстәмә ысул куллану турында хәбәр итәбез, шул исәптән үсемлек күзәнәк стеналарында һәм энзиматик гидролизатларда гликан бәйләнешләрен характерлау өчен моноклональ антителалар (mAbs) кулланып гликан профиле, очыш вакытында масса-спектрометрия..MALDI-TOF-MS) тискәре ионнарның, газ хроматографиясенең һәм масса спектрометриясенең (GC-MS) икенчел бозылуыннан соң спектроскопия белән алынган структур-информацион диагностик чокларны куллана, олигосакарид бәйләнешләрен дериватизациясез һәм характерлый.Олигосакаридларның кечкенә күләме аркасында (DP 4–20), бу молекулаларны mAb бәйләү һәм характеризацияләү өчен куллану кыен.Бу проблеманы җиңәр өчен, без яңа биотин коньигуация нигезендәге олигосакарид иммобилизация ысулын кулландык, ул микроплат өслегендә аз DP эри торган олигосакаридларны уңышлы билгеләде, аннары махсус лига анализы өчен югары үткәргеч mAb системасында кулланылды.Бу яңа ысул киләчәктә тагын да алдынгы югары үткәргеч гликом анализларын үстерергә ярдәм итәчәк, диагностик максатларда биомаркларда булган олигосакаридларны изоляцияләү һәм характерлау өчен кулланыла ала.
Лигноселлоз биомассасы, авыл хуҗалыгы, урман хуҗалыгы, үлән һәм агач материаллардан тора, био-нигезле продуктлар җитештерү өчен потенциаль терлек азыгы, шул исәптән азык-төлек, азык, ягулык һәм химик прекурсорлар.Plantсемлек күзәнәк стеналарында булган углеводлар (целлюлоза һәм гемицеллоза кебек) моносахаридларга химик эшкәртү һәм биотрансформация (мәсәлән, энзиматик гидролиз һәм микробиаль ферментация) ярдәмендә деполимерлаштырыла.Гомуми алдан дәвалау үз эченә аммиак җепселен киңәйтү (AFEX), эретелгән кислота (DA), ион сыеклыгы (IL), һәм пар шартлавы (SE) керә, алар химик матдәләр һәм җылылык комбинациясен кулланалар, үсемлек күзәнәк стеналарын ачып, лигноселлоза җитештерүне киметү өчен.матдәләрнең үзсүзлелеге, 5. Энзиматик гидролиз коммерция каты углеводлы ферментлар (CAZymes) һәм микробиаль ферментация ярдәмендә био-ягулык һәм химик матдәләр җитештерү өчен югары каты йөк белән башкарыла.
Коммерция ферментларындагы CAZymes ферментларның катлаулы катнашмасыннан тора, моносахаридлар формалаштыру өчен катлаулы углевод-шикәр бәйләнешләрен синергистик рәвештә яралар.Алдарак хәбәр иткәнебезчә, углеводлар белән лигнинның хуш исле полимерлары челтәре аларны бик тыгызрак ясыйлар, бу шикәрнең тулы конверсиясенә китерә, алдан ясалган биомассаның энзиматик гидролизы вакытында җитештерелмәгән секс олигосакаридларының 15-25% туплый.Бу төрле биомассаны алдан куллану ысуллары белән уртак проблема.Бу кыенлыкның кайбер сәбәпләренә гидролиз вакытында ферментларны тыю, яисә үсемлек биомассасында шикәр бәйләнешен өзәр өчен кирәк булган төп ферментларның булмавы яки түбән дәрәҗәсе керә.Шикәрнең составын һәм структур үзенчәлекләрен аңлау, олигосакаридлардагы шикәр бәйләнеше кебек, гидролиз вакытында шикәр әйләнешен яхшыртырга ярдәм итәчәк, биотехнологик процессларны нефть продуктлары белән көндәшлеккә сәләтле итә.
Углеводларның структурасын билгеләү авыр һәм сыек хроматография (LC) 11,12, атом магнит резонансы спектроскопиясе (NMR) 13, капиллярлы электрофорез (CE) 14,15,16 һәм масса спектрометрия (MS) 17 кебек методларның берләшүен таләп итә., унсигез.Лазер дезорпциясе белән матрица (MALDI-TOF-MS) ярдәмендә очыш вакытында масса спектрометрия кебек MS ысуллары углевод структураларын ачыклау өчен күпкырлы ысул.Күптән түгел, натрий ион кушылмаларының бәрелешү-индуктив диссоциациясе (CID) тандемы, олигосакарид кушылу позицияләренә, аномерик конфигурацияләргә, эзлеклелектә һәм тармак позицияләренә туры килгән бармак эзләрен ачыклау өчен иң киң кулланылды.
Гликан анализы углевод бәйләнешләрен тирәнтен ачыклау өчен искиткеч корал22.Бу ысул катлаулы углевод бәйләнешләрен аңлау өчен зоналар стенасы гликанына юнәлтелгән моноклональ антителалар (mAbs) куллана.Төрле сакаридлар кулланып, төрле сызыклы һәм таралган олигосакаридларга каршы эшләнгән, бөтен дөнья буенча 250 мАбс бар.Берничә mAbs үсемлек күзәнәк стенасының структурасын, составын һәм модификациясен характерлау өчен киң кулланылган, чөнки үсемлек күзәнәкләренең төренә, органына, яшенә, үсеш этабына, үсеш мохитенә карап зур аермалар бар25,26.Күптән түгел бу ысул үсемлек һәм хайван системаларындагы весикул популяцияләрен һәм гликан транспортындагы аларның ролен аңлау өчен кулланылды, субсекуляр маркерлар, үсеш этаплары яки экологик стимуллар, һәм энзиматик активлыкны билгеләү өчен.Ачыкланган гликаннар һәм киланнарның төрле структураларына пектин (П), килан (X), маннан (М), ксилоглюканнар (XylG), катнаш бәйләнеш глюканнары (MLG), арабиноксилан (ArbX), галактоманнан (GalG), глюкурон кислотасы-арабиноксилан (GArbX) һәм арабино-галактика керәләр.
Ләкин, бу тикшеренү эшләренә карамастан, берничә тикшерү генә каты каты йөк (HSL) гидролизы вакытында олигосакарид туплануның табигатенә юнәлтелгән, шул исәптән олигосакарид чыгару, гидролиз вакытында олигомерик чылбыр озынлыгы, төрле түбән DP полимерлары һәм аларның кәкреләре.тарату 30,31,32.Шул ук вакытта, гликан анализы гликан структурасын комплекслы анализлау өчен файдалы корал икәнлеген исбат итсә дә, антитело ысуллары ярдәмендә суда эри торган аз DP олигосакаридларын бәяләү кыен.Молекуляр авырлыгы 5-10 кДадан ким булган кечерәк DP олигосакаридлары 33, 34 ELISA тәлинкәләренә бәйләнми һәм антитела кушылганчы юыла.
Монда, без беренче тапкыр моноклональ антителалар кулланып, авидин белән капланган тәлинкәләрдә ELISA анализын күрсәтәбез, эри торган олигосакаридлар өчен бер этаплы биотиниляция процедурасын гликом анализы белән берләштерәбез.Гликом анализына безнең караш MALDI-TOF-MS һәм GC-MS нигезендә гидролизацияләнгән шикәр композицияләренең триметилсилил (TMS) дериватизациясе ярдәмендә тулы олигосакарид бәйләнешләрен анализлау белән расланды.Бу инновацион алым киләчәктә югары үткәрү ысулы буларак эшләнергә һәм биомедицина тикшеренүләрендә киң кулланылыш табарга мөмкин35.
Гликозиляция кебек ферментларның һәм антителаларның тәрҗемәдән соң үзгәртүләре аларның биологик эшчәнлегенә тәэсир итә.Мәсәлән, зарарлы аксымнарның гликозиляциясенең үзгәрүе ялкынсынучан артритта мөһим роль уйный, һәм гликозиляция үзгәрүләре диагностик маркерлар буларак кулланыла37.Әдәбиятта төрле гликаннарның төрле авыруларда җиңел күренүе турында хәбәр ителде, ашказаны-эчәк тракты һәм бавырның хроник ялкынсыну авырулары, вируслы инфекцияләр, аналык, күкрәк һәм простат яман шеш авырулары38,39,40.Антитело нигезендәге гликан ELISA ысулларын кулланып гликаннарның структурасын аңлау катлаулы MS ысулларын кулланмыйча, авыру диагностикасына өстәмә ышаныч бирәчәк.
Элеккеге тикшерүебез күрсәткәнчә, каты олигосакаридлар алдан ук һәм энзиматик гидролиздан соң гидролизацияләнмәгән (1 нче рәсем).Элегерәк бастырылган эшебездә без олигосакаридларны AFEX алдан эшләнгән кукуруз саклагыч гидролизатыннан (ACSH) 8 аеру өчен күмер каты фазалы чыгару ысулын эшләдек.Башта чыгару һәм аерудан соң, олигосакаридлар тагын да зурлыкны чыгару хроматографиясе (SEC) белән бүленделәр һәм молекуляр авырлык тәртибендә җыелдылар.Төрле алдан әйтелгән шикәр мономерлары һәм олигомерлар шикәр составы анализы белән анализланды.Төрле алдан эшкәртү ысуллары белән алынган шикәр олигомерларының эчтәлеген чагыштырганда, каты олигосакаридларның булуы биомассаны моносахаридларга әверелдерүдә киң таралган проблема булып, шикәр җитештерүнең ким дигәндә 10-15% кимүенә һәм хәтта 18% ка кадәр кимүенә китерергә мөмкин.АКШ.Бу ысул олигосакарид фракцияләрен тагын да зур күләмдә җитештерү өчен кулланыла.Нәтиҗә ясалган ACH һәм аның төрле молекуляр авырлыктагы фракцияләре бу әсәрдә олигосакаридларны характерлау өчен эксперименталь материал буларак кулланылды.
Алдан әзерләү һәм энзиматик гидролиздан соң, өзлексез олигосакаридлар сусыз калды.Монда (А) - олигосакаридны аеру ысулы, анда олигосакаридлар AFEX алдан әзерләнгән кукуруз саклагыч гидролизатыннан (ACSH) активлаштырылган углерод һәм диатомаз җирнең пакетлы караваты ярдәмендә изоляцияләнә;Б) Олигосакаридларны аеру ысулы.Олигосакаридлар алга таба хроматография (SEC) белән аерылды;(C) Сакарид мономерлары һәм олигомерлар төрле препаратлардан азат ителәләр (эретелгән кислота: DA, ион сыеклыгы: IL һәм AFEX).Энзиматик гидролиз шартлары: 25% (w / w) каты каты йөкләү (якынча 8% глюкан йөкләү), 96 сәгать гидролиз, 20 мг / г коммерция ферментларын йөкләү (Ctec2: Htec2: MP-2: 1: 1 нисбәте) һәм (D) Шикәр мономерлары һәм глюкоза, ксилоза һәм арабиноз AFEX алдан эшкәртелгән кукуруз саклагычыннан чыгарылган.
Гликан анализы каты биомасс калдыкларыннан изоляцияләнгән экстрактларда гликаннарны комплекслы структур анализлау өчен файдалы корал булуын исбатлады.Ләкин, суда эри торган сакаридлар бу традицион ысул ярдәмендә аз тәкъдим ителә41, чөнки аз молекуляр авырлыктагы олигосакаридларны ELISA тәлинкәләрендә күчерү авыр һәм антитела кушылганчы юыла.Шуңа күрә, антителаны бәйләү һәм характеризацияләү өчен, авидин белән капланган ELISA тәлинкәләрендә эри торган, туры килмәгән олигосакаридларны каплау өчен бер адымлы биотиниляция ысулы кулланылды.Бу ысул элек җитештерелгән ACSH һәм аның молекуляр авырлыгына (яки полимеризация дәрәҗәсенә, DP) фракция ярдәмендә сынады.Бер этаплы биотиниляция углеводның кыскарту очына биотин-LC-гидразид кушып олигосакарид бәйләнешен арттыру өчен кулланылды (2 нче рәсем).Чишелештә, гемиацеталь группа кыскарту очында биотин-LC-гидразид гидразид төркеме белән реакциядә гидразон бәйләнешен барлыкка китерә.NaCNBH3 киметүче агент булганда, гидразон бәйләнеше тотрыклы биотинилатланган продуктка төшә.Шикәрне киметү очын модификацияләү белән, аз DP олигосакаридларын ELISA тәлинкәләренә бәйләү мөмкин булды, һәм безнең тикшерүдә бу гликан максатлы mAbs кулланып авидин белән капланган тәлинкәләрдә эшләнде.
Биотинилатланган олигосакаридлар өчен ELISA нигезендә моноклональ антителаларны тикшерү.Монда (А) олигосакаридларның биотиниляциясе һәм аннан соң ELISA скринкасы NeutrAvidin капланган тәлинкәләрдә гликанлы максатлы mAbs белән һәм (B) реакция продуктларының биотиниляциясе өчен бер этаплы процедура күрсәтә.
Олигосакарид-коньигуацияләнгән антителалар белән авидин белән капланган тәлинкәләр беренчел һәм икенчел антителаларга кушылды һәм җиңел һәм вакытка сизгер шартларда юылды.Антитело бәйләү тәмамлангач, тәлинкәне инкубацияләү өчен TMB субстратын өстәгез.Ниһаять, реакция күкерт кислотасы белән туктатылды.Инкубацияләнгән тәлинкәләр ELISA укучысы ярдәмендә анализланган, антителла белән үзара бәйләнешне ачыклау өчен, һәр антителаның бәйләү көчен билгеләү өчен.Экспериментның детальләре һәм параметрлары өчен “Материаллар һәм методлар” бүлеген карагыз.
Бу яңа эшләнгән ысулның махсус кушымталар өчен файдалы булуын күрсәтәбез, ACSHда булган эри торган олигосакаридларны, шулай ук ​​лигноселлозик гидролизатлардан изоляцияләнгән чиста һәм чистартылган олигосакарид фракцияләрен.3 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, биоасилатланган гликом анализлау ысулларын кулланып ACSH-та ачыкланган иң еш эпитоп белән алмаштырылган киланнар гадәттә уроник (U) яки метилуроник (MeU) һәм пектик арабиногалактаннар.Аларның күбесе шулай ук ​​гидролизацияләнмәгән каты катламнарның (UHS) гликаннарын анализлау буенча алдагы өйрәнүебездә табылды.
Күзәнәк стенасы гликанына юнәлтелгән моноклональ антитела ярдәмендә кабат олигосакарид эпитопларын ачыклау."Нейтраль" фракция - ACN фракциясе һәм "кислоталы" фракция - ФА фракциясе.Heatылылык картасында яктырак кызыллар эпитопның эчтәлеген күрсәтәләр, яктырак блюзлар буш фонны күрсәтәләр.Масштабдагы төс кыйммәтләре N = 2 формуляцияләре өчен чимал OD кыйммәтләренә нигезләнгән.Антитело белән танылган төп эпитоплар уңда күрсәтелгән.
Бу целлюлоза булмаган структуралар иң еш кулланыла торган коммерция ферментларын үз эченә алган сынау коммерция фермент катнашмасында иң еш очрый торган целлюлазалар һәм гемицеллулазлар белән ярылып булмый.Шуңа күрә аларның гидролизы өчен яңа ярдәмче ферментлар кирәк.Кирәк булмаган целлюлоза булмаган аксессуар ферментлары булмаса, бу целлюлоза булмаган бәйләнешләр моносахаридларга тулысынча конверсиягә комачаулыйлар, хәтта ата-аналарының шикәр полимерлары кыска фрагментларга гидролизацияләнсәләр дә, коммерция ферментлары катнашмалары белән эреләнсәләр дә.
Алга таба сигнал таратуны һәм аның бәйләү көчен күрсәтте, бәйләүче эпитоплар югары DP шикәр фракцияләрендә (A, B, C, DP 20+ кадәр) түбән DP фракцияләренә караганда (D, E, F, DP) түбәнрәк булганнар (1 нче рәсем).Кислота фрагментлары нейтраль фрагментларга караганда целлюлоза булмаган эпитопларда еш очрый.Бу күренешләр алдагы өйрәнүебездә күзәтелгән үрнәк белән туры килә, анда югары DP һәм кислота моиетлары энзиматик гидролизга чыдамрак иде.Шуңа күрә, целлюлоза булмаган гликан эпитоплары һәм U һәм MeU алмашлыклары булу олигосакаридларның тотрыклылыгына зур өлеш кертә ала.Әйтергә кирәк, бәйләү һәм ачыклау эффективлыгы түбән DP олигосакаридлары өчен проблемалы булырга мөмкин, аеруча эпитоп димерик яки тримерик олигосакарид булса.Бу төрле озынлыктагы коммерция олигосакаридлары ярдәмендә сынап карарга мөмкин, аларның һәрберсендә билгеле бер mAb белән бәйләнгән бер эпитоп бар.
Шулай итеп, структурага хас антителалар куллану кайбер төр бәйләнешләрне ачты.Кулланылган антитела төренә, тиешле лигация үрнәгенә һәм ул ясаган сигналның көченә карап (яңа һәм иң аз) яңа ферментларны ачыкларга һәм тулы гликоконверсия өчен фермент катнашмасына ярым санлы кушылырга мөмкин.Мисал итеп ACSH олигосакаридларына анализ ясап, без һәр биомассалы материал өчен гликан бәйләнешләре базасын булдыра алабыз.Монда әйтергә кирәк, антителаларның төрле якынлыгы исәпкә алынырга тиеш, һәм аларның якынлыгы билгесез булса, бу төрле антителалар сигналларын чагыштырганда билгеле кыенлыклар тудырачак.Моннан тыш, гликан бәйләнешләрен чагыштыру бер үк антитела өчен үрнәкләр арасында иң яхшы эшләргә мөмкин.Аннары бу каты бәйләнешләр CAZyme мәгълүмат базасына бәйләнергә мөмкин, аннан без ферментларны ачыклый алабыз, кандидат ферментларын сайлый алабыз һәм бәйләнешне өзүче ферментларны сынап карый алабыз, яки бу ферментларны биорфинириядә куллану өчен микробиаль системалар булдыра алабыз44.
Иммунологик ысулларның лигноселлозик гидролизатларда булган аз молекуляр авырлыктагы олигосакаридларны характерлау өчен альтернатив ысулларны ничек тулыландыруларын бәяләү өчен, без MALDI (4 нче рәсем, S1-S8) эшләдек һәм бер үк панельдә GC-MS нигезендә TMS алынган сакаридларны анализладык (5 нче рәсем) олигосакарид өлешендә.MALDI олигосакарид молекулаларының массалы бүленеше максатчан структурага туры килү-килмәвен чагыштыру өчен кулланыла.Инҗирдә.4 ACN-A һәм ACN-B нейтраль компонентларның MC күрсәтә.ACN-Анализ пентоза шикәрләренең DP 4–8 (4 нче рәсем) дән DP 22 (S1 рәсем) кадәр булуын раслады, аларның авырлыгы MeU-xylan олигосакаридларына туры килә.ACN-B анализы DP 8-15 белән пентоза һәм глюкоксилан сериясен раслады.Шигырь S3 кебек өстәмә материалда, FA-C кислоталы хәрәкәт массасы тарату карталарында (Me) U алмаштырылган пентоза шикәрләре диапазоны 8-15 DP белән күрсәтелә, алар ELISA нигезендә mAb скринкасында табылган ксиланнар белән туры килә.Эпитоплар эзлекле.
ACSда булган эри торган олигосакаридларның MALDI-MS спектры.Монда, (A) ACN-Метилатланган урон кислотасы (DP 4-8) булган аз авырлыктагы фракцияләр глюкуроксилан олигосакаридларын һәм (B) ACN-B киланны һәм метилатланган урон кислотасы олигосакаридларны глюкуроксилан белән алыштырдылар (DP 8-15).
Олы огосакаридларның гликан калдыкларының составына анализ.Монда (A) GC-MS анализы ярдәмендә алынган төрле олигосакарид фракцияләренең TMS сакарид составы.Б) Олигосакаридларда булган төрле TMS-шикәр структуралары.ACN - нейтраль олигосакаридлар һәм ФА - кислота олигосакаридлары булган ферул кислотасы фракциясе булган ацетонитрил фракциясе.
Тагын бер кызыклы нәтиҗә LC-MS олигосакарид фракциясен анализлаудан алынган, S9 рәсемдә күрсәтелгәнчә (методларны электрон өстәмә материалда күрергә мөмкин).Гексоза һәм -OAc төркемнәренең фрагментлары ACN-B фракциясен бәйләү вакытында берничә тапкыр күзәтелде.Бу табыш гликомда һәм MALDI-TOF анализында күзәтелгән фрагментлашуны гына расламый, шулай ук ​​алдан ук лигноселлоз биомассасында углеводлы туемнар турында яңа мәгълүмат бирә.
Без шулай ук ​​TMS шикәр дериватизациясе ярдәмендә олигосакарид фракциясенең шикәр составын анализладык.GC-MS кулланып, без олигосакарид фракциясендә нейрон (туемсыз) һәм кислоталы шикәр (GluA һәм GalA) составын билгеләдек (5 нче рәсем).Глюкурон кислотасы C һәм D кислоталы компонентларында, галактурон кислотасы А һәм В кислоталы компонентларында очрый, икесе дә кислоталы шикәрнең югары DP компонентлары.Бу нәтиҗәләр безнең ELISA һәм MALDI мәгълүматларыбызны раслап кына калмый, ә олигосакарид туплау турындагы элеккеге тикшеренүләребезгә дә туры килә.Шуңа күрә, без заманча биологик үрнәкләрдә олигосакаридларның биотиниляциясен һәм аннан соң ELISA скринкасын кулланып заманча иммунологик ысуллар җитәрлек дип саныйбыз.
ELISA нигезендә mAb скринклау ысуллары берничә төрле ысул белән расланганлыктан, без бу яңа санлы ысулның потенциалын тагын да өйрәнергә теләдек.Ике коммерция олигосакарид, ксилохексахарид олигосакарид (XHE) һәм 23-α-L-арабинофураносил-ксилотриоз (A2XX) сатып алындылар һәм күзәнәк стенасы гликанына юнәлтелгән яңа mAb ысулы ярдәмендә сынадылар.6-нчы рәсемдә биотинилатланган бәйләүче сигнал һәм олигосакарид концентрациясенең бүрәнә концентрациясе арасында сызыклы бәйләнеш күрсәтелгән, бу Langmuir adsorption моделен тәкъдим итә.MAbs арасында CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, һәм CCRC-M151 XHE белән корреляцияләнгән, һәм CCRC-M108, CCRC-M109, һәм LM11 A2XX белән 1 нм 100 нано диапазонында корреляцияләнгән.Эксперимент вакытында антителаларның мөмкинлеге чикләнгәнлектән, һәр олигосакарид концентрациясе белән чикләнгән экспериментлар үткәрелде.Монда әйтергә кирәк, кайбер антителалар субстрат белән бер үк олигосакаридка бик төрле реакция ясыйлар, мөгаен, алар бераз төрле эпитопларга бәйләнгәнгә һәм бик төрле бәйләнешкә ия булырга мөмкин.Эпитопны төгәл ачыклау механизмнары һәм нәтиҗәләре яңа mAb ысулы реаль үрнәкләргә кулланылганда катлаулырак булачак.
Ике коммерция олигосакарид төрле гликанга юнәлтелгән mAbs ачыклау диапазонын билгеләү өчен кулланылды.Монда, олигосакарид концентрациясенең бүрәнә концентрациясе белән сызыклы корреляцияләр Langmuir (A) XHE өчен mAb һәм (B) A2XX белән mAb белән adsorption үрнәкләрен күрсәтәләр.Тиешле эпитоплар анализда субстратлар буларак кулланылган коммерция олигосакаридларының структураларын күрсәтәләр.
Гликанга юнәлтелгән моноклональ антителалар куллану (гликокомик анализ яки ELISA нигезендә mAb скринкасы) үсемлек биомассасын тәшкил иткән төп күзәнәк стенасы гликаннарын тирән характерлау өчен көчле корал.Ләкин, классик гликан анализы зур күзәнәк стенасы гликаннарын гына характерлый, чөнки күпчелек олигосакаридлар ELISA тәлинкәләрендә эффектив мобилизацияләнми.Бу тикшеренүдә, AFEX белән эшләнгән кукуруз миче энзиматик рәвештә югары каты эчтәлектә гидролизацияләнде.Шикәр анализы гидролизаттагы күзәнәк стенасы углеводларының составын ачыклау өчен кулланылды.Ләкин, гидролизатларда кечерәк олигосакаридларга mAb анализы бәяләнми, һәм ELISA тәлинкәләрендә олигосакаридларны эффектив күчерү өчен өстәмә кораллар кирәк.
Без монда роман һәм эффектив олигосакарид имобилизация ысулы турында хәбәр итәбез, олигосакарид биотиниляциясен кушып, NeutrAvidin ™ капланган тәлинкәләрдә ELISA скринкасы.Иммобилизацияләнгән биотинилатланган олигосакаридлар антитела өчен җитәрлек якынлык күрсәттеләр, олигосакаридларны тиз һәм нәтиҗәле табу өчен.Масса спектрометриясенә нигезләнгән бу каты олигосакаридларның составын анализлау иммуноскринингка бу яңа караш нәтиҗәләрен раслады.Шулай итеп, бу тикшеренүләр шуны күрсәтә: олигосакарид биотиниляциясе һәм ELISA скринкасының гликан максатлы моноклональ антителалар белән кушылуы олигосакаридлар арасындагы бәйләнешне ачыклау өчен кулланыла ала һәм олигосакаридлар структурасын характерлаучы башка биохимик тикшеренүләрдә киң кулланыла ала.
Бу биотинга нигезләнгән гликан профильләштерү ысулы үсемлек биомассасында эри торган олигосакаридларның углеводлы бәйләнешләрен тикшерә алган беренче доклад.Бу биомассаның кайбер өлешләренең ни өчен биоягулык җитештерүгә килгәндә шулкадәр каты булуын аңларга ярдәм итә.Бу ысул гликом анализ ысулларында мөһим бушлыкны тутыра һәм үсемлек олигосакаридларыннан тыш киң субстратларга куллана.Киләчәктә без робототехниканы биотиниляция өчен куллана алабыз һәм ELISA ярдәмендә үрнәкләрне югары анализлау өчен эшләгән ысулны куллана алабыз.
Пионер 33A14 гибрид орлыкларыннан үскән кукуруз саламы (CS) 2010 елда Колорадо штатындагы Рейдагы Крамер фермаларыннан җыеп алынган.Ownир хуҗасы рөхсәте белән бу биомассаны тикшерү өчен кулланырга мөмкин. Theрнәкләр бүлмә температурасында коры <6% дым сакланган. Theрнәкләр бүлмә температурасында коры <6% дым сакланган. Об чанцы хранились сухим при влажности <6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной шине. Samрнәкләр бүлмә температурасында сыдырылган капчыкларда <6% дымлылыкта коры сакланган.6 在 室温 6 6 <6% 的 水分 储存 在 自封袋。。6 在 室温 下 以 6 <6% Об чанцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной че с влажностью <6%. Samрнәкләр дымлылык белән бүлмә температурасында сыдырма капчыкларда саклана <6%.Тикшеренү җирле һәм милли күрсәтмәләргә туры килде.Композицион анализ NREL протоколы ярдәмендә башкарылды.Композициядә 31,4% глюкан, 18,7% ксилан, 3,3% арабинан, 1,2% галактан, 2,2% ацетил, 14,3% лигнин, 1,7% аксым һәм 13 4% көл барлыгы ачыкланган.
Cellic® CTec2 (138 мг протеин / мл, VCNI 0001) - Новозималардан (Франклинтон, NC, АКШ) целлюлаз, β-глюкозида һәм Cellic® HTec2 (157 мг белок / мл, VHN00001) катлаулы катнашмасы.Multifect Pectinase® (72 мг белок / мл), пектин деградацияләүче ферментларның катлаулы кушылмасы, DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, АКШ) бүләк итте.Фермент протеин концентрацияләре Кельдахл азот анализы ярдәмендә протеинның күләмен бәяләү (һәм протеин булмаган азотның өлешен алу) белән билгеләнде (AOAC методы 2001.11, Сөт Бер Кооператив Инк., Итака, Нью-Йорк, АКШ).Diatomaceous 545 EMD Миллипордан (Биллерика, MA) сатып алынган.Активлаштырылган углерод (DARCO, 100 меш грануласы), Авицель (PH-101), буш ксилан һәм башка барлык химик матдәләр Сигма-Алдричтан (Сент-Луис, МО) сатып алынган.
AFEX алдан әйтү GLBRC (Биомассаны үзгәртү тикшеренү лабораториясе, MSU, Lansing, MI, АКШ) башкарылды.Алдан дәвалау 140 минутта 15 минут дәвамында үткәрелде.46 яшәү вакыты 1: 1 сусыз аммиакның биомассага 60% (вт / с) дат басмаган корыч эскәмия партия реакторына йөкләүдә (Parr Instruments Company).Бу 30 минут.Реактор 140 ° C ка китерелде һәм аммиак тиз арада чыгарылды, бу биомассаны бүлмә температурасына тиз кайтырга мөмкинлек бирде.AFEX алдан эшкәртелгән кукуруз саклагычының (ACS) составы эшкәртелмәгән кукуруз саклагычына охшаган (UT-CS).
Oгары каты ACSH 25% (w / w) (якынча 8% декстран йөкләү) олигосакаридларны зур күләмдә җитештерү өчен башлангыч материал буларак әзерләнгән.ACS энзиматик гидролизы коммерция фермент катнашмасы ярдәмендә башкарылды, шул исәптән Cellic® Ctec2 10 мг белок / г глюкан (алдан ясалган биомассада), Htec2 (Новозимнар, Франклинтон, NC), 5 мг белок / г глюкан, һәм Мультифект Пектиназ (Genencor Inc, АКШ).).), 5 мг белок / г декстран.Энзиматик гидролиз 5 литрлы биореакторда эш күләме 3 литр, pH 4,8, 50 ° C һәм 250 әйләнеш белән башкарылды.96 сәгать гидролиздан соң, гидролизат центрифугация белән 6000 әйләнештә 30 минутка, аннары 14000 минутта 30 минут эчендә сусызланган каты матдәләрне чыгару өчен җыелды.Аннары гидролизат 0,22 мм фильтр чүкеч аша стериль фильтрлауга дучар ителде.Фильтрланган гидролизат стериль шешәләрдә 4 ° C сакланган, аннары углеродта вакланган.
NREL лаборатория анализы процедуралары нигезендә экстракт нигезендәге биомассалар үрнәген анализлау: композиция анализы өчен үрнәкләр әзерләү (NREL / TP-510-42620) һәм биомассада структур углеводлар һәм лигниннарны билгеләү (NREL / TP-510 - 42618) 47.
Гидролизат агымының олигосакарид анализы 2 мл масштабта автоклав нигезендәге кислота гидролиз ысулы ярдәмендә башкарылды.Гидролизат үрнәген 69,7 µл 72% күкерт кислотасы белән 10 мл винт капка культурасы трубасына кушыгыз һәм 121 ° C эскәмиядә 1 сәг.Олигосакаридларның концентрациясе гидролизацияләнмәгән үрнәктә моносахаридларның концентрациясен кислота-гидролизацияләнгән үрнәктәге шикәр концентрациясеннән алу белән билгеләнде.
Кислота гидролизацияләнгән биомассадагы глюкоза, ксилоза һәм арабиноз концентрацияләре Шимадзу HPLC системасы ярдәмендә анализланган, Bio-Rad Aminex HPX-87H баганасында автосамплер, багана җылыткыч, изократ насос һәм реактив индекс детекторы.Колонка 50 ° C температурада сакланган һәм 0,6 мл / мин 5 мм H2SO4 суда сузылган.агым.
Гидролизат супернатанты мономер һәм олигосакарид эчтәлеге өчен эретелгән һәм анализланган.Энзиматик гидролиздан соң алынган мономерик шикәрләр HPLC тарафыннан био-рад (Геркулес, Калифорния) Aminex HPX-87P баганасы һәм көл сакчысы баганасы белән җиһазланган.Колоннаның температурасы 80 ° C сакланган, су күчмә фаза буларак 0,6 мл / мин.Олигосакаридлар эретелгән кислоталардагы гидролиз белән 121 ° C температурада күрсәтелгән ысуллар буенча билгеләнде.41, 48, 49.
Сакарид анализы чимал, AFEX алдан эшкәртелгән һәм барлык гидролизацияләнмәгән биомасс калдыкларында (күзәнәк стенасы экстрактларын җитештерүне һәм аларның mAb скринкасын кертеп) алдан тасвирланган процедуралар ярдәмендә башкарылды, 27, 43, 50, 51.Гликом анализы өчен үсемлек күзәнәк стенасы материалының алкогольдә эри торган калдыклары биомасс калдыкларыннан әзерләнә һәм аммиак оксалаты (50 мм), натрий карбонат (50 мм һәм 0,5% w / v), CON кебек агрессив реагентлар белән серияле чыгарыла.(1М һәм 4М, икесе дә 1% w / v натрий борохидрид белән) һәм алда тасвирланганча кислота хлориты 52,53.Аннары экстрактлар ELISAга күзәнәк стенасы гликанына юнәлтелгән mAb50s катлаулы панельгә каршы бирелде, һәм mAb бәйләүче реакцияләр җылылык картасы итеп күрсәтелде.үсемлек күзәнәк стенасы гликанына каршы mAbs лаборатория запасларыннан алынган (CCRC, JIM һәм MAC серияләре).
Олигосакаридларның бер адымлы биотиниляциясе.Углеводларның биотин-LC-гидразид белән кушылуы түбәндәге процедура ярдәмендә башкарылды.Биотин-ЛК-гидразид (4,6 мг / 12 ммол) диметил сульфоксидында (DMSO, 70 μl) эретелгән һәм 65 минутта 1 минутка җылыту белән эретелгән.Глаций кислотасы (30 µл) кушылды һәм катнашма натрий цианоборохидридка (6,4 мг / 100 ммол) салынды һәм 65 минутта 1 минут чамасы җылытылганнан соң тулысынча эреп бетте.Аннары, 5-8 μл реакция катнашмасы кипкән олигосакаридка (1-100 нмол) кушылды, этикеткаларның 10 тапкыр яки күбрәк моляр артыгын алу өчен.Реакция 65 ° C температурада 2 сәгать дәвамында үткәрелде, аннан соң үрнәкләр шунда ук чистартылды.Маркировкалау экспериментларында бернинди натрий цианоборохидрид кулланылмады, һәм үрнәкләр 65 ° C температурада 2,5 сәгать дәвамында реакцияләнде.
ELISA каплау һәм биотинилатланган олигосакарид үрнәкләрен юу.Авидин белән капланган тәлинкәнең һәр коесына 25 μл биотинилатланган үрнәкләр (5 мл 0,1 М Трис буфер эремәсендә (TBS) эретелгән һәр концентрацияләнгән үрнәкнең 100 μл) кушылды.Контроль скважиналар 50 μл биотин белән 10 μг / мл концентрациясендә 0,1 М ТБС белән капланган.Деонизацияләнгән су буш үлчәүләр өчен каплау рәвешендә кулланылган.Планшет караңгыда бүлмә температурасында 2 сәгать инкубацияләнде.Программаны кулланып, 0,1 М ТБС тәлинкәсен 0,1% сөт белән 3 тапкыр юыгыз.Гренье 3А өчен 11.
Беренчел антителаларны өстәү һәм юу.Wellәр коега 40 µл беренчел антитела кушыгыз.Караңгыда бүлмә температурасында микроплитны 1 сәгать инкубацияләгез.Аннары тәлинкәләр 3 тапкыр 0,1% сөт белән 0,1М ТБСта Греньер Фатир 3A өчен 1111 юу программасы ярдәмендә юылды.
Икенчел антитела өстәп юыгыз.Wellәр коега 50 µл тычкан / тычкан икенчел антитела кушыгыз (0,1% ТБСта 0,1% сөттә 1: 5000).Караңгыда бүлмә температурасында микроплитны 1 сәгать инкубацияләгез.Аннары микроплаталар 5 тапкыр 0,1% сөт белән 0,1 М ТБСта Греньер Фатир 5A тәлинкә юу программасы ярдәмендә юылды.
Субстрат өстәү.Төп субстратка 50 µл 3,3 ′, 5,5′-тетраметилбензидин (ТМБ) кушыгыз (2 тамчы буфер, 3 тамчы ТМБ, 2 тамчы водород пероксиды 15 мл деонизацияләнгән суга).ТМБ субстратын әзерләгез.һәм кулланганчы вортекс).Микроплитны бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләгез.Караңгыда.
Адымны тәмамлагыз һәм планшетны укыгыз.Wellәр скважинага 50 µл 1 Н күкерт кислотасы кушыгыз һәм ELISA укучысы ярдәмендә 450 - 655 нм үзләштерүне яздырыгыз.
Бу аналитикларның 1 мг / мл эремәләрен деионизацияләнгән суда әзерләгез: арабиноз, рамноз, фукоза, ксилоза, галактурон кислотасы (ГалА), глюкурон кислотасы (GlcA), манноза, глюкоза, галактоза, лактоза, N-ацетилманнозамин (манНак), N-ацетилглукозамин.(glcNAc), N-ацетилгалактозамин (galNAc), инозитол (эчке стандарт).Ике стандарт 1-нче таблицада күрсәтелгән 1 мг / мл шикәр эремәләрен кушып әзерләнде, үрнәкләр туңдырылды һәм лиофилизацияләнде -80 ° C, барлык су чыгарылганчы (гадәттә 12-18 сәгать).
Аналитик баланстагы винт капка трубаларына 100-500 µг үрнәк өстәгез.Өстәлгән сумманы язып алыгыз.Ampleрнәкне эретүче концентрациядә эретеп, аны сыек аликот итеп трубага өстәү яхшырак.Eachәрбер үрнәк труба өчен эчке стандарт буларак 20 мг 1 мг / мл инозитол кулланыгыз.Ampleрнәккә өстәлгән эчке стандарт күләме стандарт трубага кушылган эчке стандарт күләме белән бер булырга тиеш.
Винт капка касәсенә 8 мл сусыз метанол кушыгыз.Аннары 4 мл 3 Н. метанолик HCl эремәсе, капланган һәм селкенгән.Бу процесс су кулланмый.
Олигосакарид үрнәкләренә һәм стандарт TMS трубаларына 500 µl 1 M HCl метанол эремәсе кушыгыз.Samрнәкләр төнлә (168 сәгать) 80 ° C җылылык блогында инкубацияләнде.Метанолиз продуктын киптерү манифольды ярдәмендә бүлмә температурасында киптерегез.200 µl MeOH кушыгыз һәм яңадан киптерегез.Бу процесс ике тапкыр кабатлана.Ampleрнәккә 200 µл метанол, 100 µл пиридин һәм 100 µл сирик ангидрид кушыгыз һәм яхшылап кушыгыз.Samрнәкләр бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләнде.һәм киптерелгән.200 µл метанол кушыгыз һәм тагын киптерегез.
200 µл Три-Сил һәм җылылык белән капланган трубаны 20 минутка өстәргә.80 ° C, аннары бүлмә температурасына кадәр суытылды.Ampleрнәкне якынча 50 µл күләмендә киптерү өчен киптерү манифольдын кулланыгыз.Әйтергә кирәк, без үрнәкләрне тулысынча киптерергә рөхсәт итмәдек.
2 мл гексан кушыгыз һәм вортексинг белән яхшылап кушыгыз.Пастер пипеткаларының очларын (5-8 мм) пыяла йон кисәге белән 5-3 / 4 дюйм диаметрлы пипетка өстенә тутырыгыз.Samрнәкләр 3000 г 2 минутта центрифугацияләнде.Теләсә нинди эри торган калдыклар ява.-1рнәкне 100-150 µлга кадәр киптерегез.ГК-МСка якынча 1 μл күләмендә башлангыч температурада 80 ° C һәм башлангыч вакыт 2,0 минут (2 таблица).