Faafetai mo le asiasi ile Nature.com.O le su'esu'ega o lo'o e fa'aogaina e fa'atapula'aina le lagolago a le CSS.Mo le poto sili ona lelei, matou te fautuaina oe e te faʻaogaina se suʻesuʻega fou (pe faʻamalo le Faiga Faʻatasi i Internet Explorer).I le taimi nei, ina ia mautinoa le faʻaauauina o le lagolago, matou te tuʻuina atu le saite e aunoa ma sitaili ma JavaScript.
Metotia fou fa'ama'i fa'ama'i ma tele spectrometric mo su'esu'ega lavelave o oligosaccharides tumau i totonu o saga fa'ato'a fa'ata'ita'iina ile AFEX.Lignocellulosic biomass ose suiga gafataulimaina i suau'u fossil ma e fa'aaogaina lautele e atia'e ai biotechnologies mo le gaosiga o oloa e pei o mea'ai, fafaga, suau'u ma vaila'au.O le ki i nei tekinolosi o le atinaʻeina lea o faiga faʻatauvaʻa mo le faʻaliliuina o gaʻo gaʻo lavelave o loʻo i totonu o puipui o laau toto i suka faigofie e pei o le kulukose, xylose ma le arabinose.Ona o le lignoscellulosic biomass e matua fa'ama'a'a, e tatau ona faia i togafitiga vevela (eg, ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) ma togafitiga fa'aola (eg, enzymatic hydrolysis ma microbial fermentation) fa'atasi e maua ai le oloa e mana'omia..Ae peitaʻi, pe a faʻaaogaina enzymes faʻatau pisinisi i le faʻaogaina o le hydrolysis, e naʻo le 75-85% o suka soluble ua fausia o monosaccharides, ma o le 15-25% o totoe e soluble, oligosaccharides intractable, lea e le o taimi uma e maua ai microorganisms.I le taimi muamua, ua tatou fa'amavae ma fa'amamāina soluble oligosaccharides ma'a'a e fa'aaoga ai le tu'ufa'atasiga o le carbon ma le diatomaceous earth separation ma le tele o le chromatography, ma su'esu'e fo'i a latou enzyme inhibitory properties.Ua matou iloa o le oligosaccharides o loʻo i ai le maualuga maualuga o le polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions e sili atu ona faigata ona faʻaogaina ma faʻafefiloi enzyme faʻapisinisi nai lo le maualalo o le DP ma le oligosaccharides le mautonu.O iinei matou te lipotia ai le faʻaogaina o nisi auala faʻaopoopo, e aofia ai le glycan profiling e faʻaaoga ai monoclonal antibodies (mAbs) faʻapitoa e totō ai biomass glycans e faʻamaonia ai fusi glycan i totonu o puipui o laau toto ma enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass- spectrometry..MALDI-TOF-MS) fa'aogaina fa'amatalaga fa'apitoa fa'ata'ita'iga e maua mai ile spectroscopy pe a mae'a le pala lona lua o ion le lelei, kesi chromatography ma le tele o spectrometry (GC-MS) e fa'ailoa ai sootaga o le oligosaccharide ma e aunoa ma se fa'atupuina.Ona o le laʻititi laʻititi o oligosaccharides (DP 4-20), o nei molelaʻau e faigata ona faʻaoga mo le mAb faʻapipiʻiina ma faʻamatalaga.Ina ia foia lenei faʻafitauli, matou te faʻaaogaina se auala fou o le oligosaccharide immobilization o le biotin conjugation lea na faʻamaonia lelei ai le tele o le maualalo o le DP soluble oligosaccharides i luga o le microplate surface, lea na faʻaaogaina i le maualuga o le mAb system mo suʻesuʻega faʻapitoa.O lenei auala fou o le a faafaigofieina ai le atinaʻeina o suʻega glycome maualuga maualuga i le lumanaʻi e mafai ona faʻaogaina e faʻaesea ma faʻamaonia ai oligosaccharides o loʻo iai i biomarkers mo faʻamoemoega faʻamaonia.
Lignocellulosic biomass, e fa'atatau i fa'ato'aga, vaomatua, mutia ma mea fafie, ose fa'ameamea e mafai ona gaosia mo le gaosiga o oloa fa'aolaola, e aofia ai mea'ai, fafaga, suau'u ma vaila'au muamua e maua ai oloa maualuga atu lona tau1.Carbohydrates (e pei o le cellulose ma le hemicellulose) o loʻo i totonu o puipui o laau toto e faʻamavaeina i le monosaccharides e ala i le gaosiga o vailaʻau ma le biotransformation (e pei o le enzymatic hydrolysis ma microbial fermentation).O togafitiga masani masani e aofia ai le faʻalauteleina o le ammonia fiber (AFEX), faʻamaʻi faʻamaʻi (DA), vai ionic (IL), ma le paʻu o le ausa (SE), lea e faʻaogaina ai le tuʻufaʻatasia o vailaʻau ma le vevela e faʻaitiitia ai le gaosiga o le lignoselulose e ala i le tatalaina o puipui puipui o laau3,4.ma'a'a o mea, 5. Enzymatic hydrolysis o lo'o fa'atinoina i se uta malo maualuga e fa'aaoga ai enzymes o lo'o i ai le ga'o (CAZymes) fa'apisinisi ma fa'afefeteina microbial e fa'aaoga ai fefete transgenic po'o siama e gaosia ai suau'u ma vaila'au fa'aolaola 6 .
O CAZymes i enzymes fa'atau pisinisi o lo'o fausia i se fa'afefiloi lavelave o enzymes o lo'o tu'ufa'atasia e pipii fa'atasi ai fusi ga'o ga'o-suka e fai ai monosaccharides2,7.E pei ona matou lipotia muamua, o le fesoʻotaʻiga lavelave o polymers manogi o le lignin ma gaʻo gaʻo e sili ona faigata, lea e oʻo atu ai i le le atoatoa o le liua o le suka, faʻaputuina 15-25% o feusuaʻiga oligosaccharides e leʻo gaosia i le taimi o le enzymatic hydrolysis o le biomass pretreated.Ole fa'afitauli masani lea ile tele ole faiga ole fa'agaioiga ole biomass.O nisi o mafua'aga o lenei fa'ama'i e aofia ai le taofiofia o le enzyme i le taimi o le hydrolysis, po'o le leai po'o le maualalo o le maualuga o enzymes taua e mana'omia e motusia ai le suka i le biomass laau.O le malamalama i le tu'ufa'atasiga ma uiga fa'atulagaina o suka, e pei o le suka i totonu o le oligosaccharides, o le a fesoasoani ia i tatou e fa'aleleia le suiga o le suka i le taimi o le hydrolysis, ma fa'atauva ai faiga fa'akomekolosi fa'atasi ma oloa e maua mai le suauu.
O le fuafuaina o le fausaga o ga'o ga'o e lu'itau ma e mana'omia ai se tu'ufa'atasiga o metotia e pei ole chromatography vai (LC)11,12, fa'aniukilia fa'amaneta resonance spectroscopy (NMR) 13, capillary electrophoresis (CE) 14,15,16 ma le tele spectrometry (MS)17.,sefulu ma le valu.Metotia MS e pei ole taimi-o-vaalele tele spectrometry ma leisa desorption ma ionization e faaaoga ai se matrix (MALDI-TOF-MS) o se auala tele mo le faailoaina fausaga carbohydrate.Talu ai nei, Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS o le sodium ion addducts ua sili ona faʻaaogaina e faʻamaonia ai tamatamailima e fetaui ma tulaga faʻapipiʻi oligosaccharide, faʻasologa o anomeric, faʻasologa, ma tulaga lala 20, 21.
O le su'esu'ega o le Glycan ose meafaigaluega sili ona lelei mo le fa'ailoaina loloto o fa'amauga ga'o22.O lenei metotia e fa'aoga ai monoclonal antibodies (mAbs) e fa'atonuina e toto le glycan puipui puipui e fai ma su'esu'ega e malamalama ai i so'oga lavelave ga'o.E sili atu i le 250 mAbs o lo'o avanoa i le lalolagi atoa, ua mamanuina e faasaga i laina eseese ma lala oligosaccharides e fa'aaoga ai saccharides eseese24.O le tele o mAbs ua faʻaaogaina lautele e faʻaalia ai le fausaga, tuʻufaʻatasia, ma suiga o le puipui o le laau, ona o loʻo i ai se eseesega tele e faʻatatau i le ituaiga o sela, okeni, tausaga, tulaga tuputupu aʻe, ma le tuputupu aʻe o le siosiomaga25,26.Talu ai nei lava, o lenei metotia na faʻaaogaina e malamalama ai i le faitau aofaʻi o vesicle i totonu o laʻau ma manu ma a latou matafaioi i le felauaiga o le glycan e pei ona fuafuaina e faʻailoga subcellular, laasaga o atinaʻe, poʻo le faʻaleleia o le siosiomaga, ma fuafua ai le gaioiga o le enzymatic.O nisi o fausaga eseese o glycans ma xylans ua faailoaina e aofia ai pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (GArbXga2) ma le arabinoxylan (GArbX)
Ae ui i lea, e ui lava i nei taumafaiga uma suʻesuʻega, e naʻo ni nai suʻesuʻega na taulaʻi i le natura o le faʻaputuina o le oligosaccharide i le taimi o le mamafa o le mamafa o le mamafa (HSL), e aofia ai le faʻamalolo o le oligosaccharide, o le umi o le filifili o le oligomeric i le taimi o le hydrolysis, eseese DP polymers, ma o latou pupuni.tufatufaga 30,31,32.I le taimi nei, e ui lava o le suʻesuʻega o le glycan ua faʻamaonia e avea o se meafaigaluega aoga mo se suʻesuʻega atoatoa o le fausaga o le glycan, e faigata ona iloilo le vai-soluble low DP oligosaccharides e faʻaaoga ai metotia antibody.Oligosaccharides DP laiti ma le mamafa mole e itiiti ifo i le 5-10 kDa e le fusifusia i papatusi ELISA 33, 34 ma fufulu ese aʻo leʻi faʻaopoopoina le antibody.
O iinei, mo le taimi muamua, matou te faʻaalia se suʻesuʻega ELISA i luga o avidin-coated plates e faʻaaoga ai monoclonal antibodies, tuʻufaʻatasia se tasi-laasaga biotinylation taualumaga mo soluble refractory oligosaccharides ma glycome suʻesuʻega.O la matou faiga i le su'esu'ega o le glycome na fa'amaonia e le MALDI-TOF-MS ma le GC-MS fa'avae su'esu'ega o feso'ota'iga o le oligosaccharide fa'atasi e fa'aaoga ai le trimethylsilyl (TMS) fa'ata'ita'iga o fa'asusuga suka hydrolyzed.O lenei faiga fou e mafai ona atia'e e avea o se auala maualuga i le lumana'i ma maua ai le fa'aoga lautele i su'esu'ega biomedical35.
O suiga ole fa'aliliuga ole enzymes ma antibodies, e pei ole glycosylation,36 e a'afia ai a latou gaioiga fa'aola.Mo se fa'ata'ita'iga, o suiga i le glycosylation o polotini o le toto e iai sona sao taua i le gasegase oona, ma o suiga i le glycosylation e fa'aaogaina e fai ma fa'ailoga fa'ama'i37.O glycans eseese ua lipotia mai i tusitusiga e faigofie ona aliali mai i faʻamaʻi eseese, e aofia ai faʻamaʻi faʻamaʻi masani o le gastrointestinal tract ma le ate, faʻamaʻi viral, ovarian, susu, ma prostate cancers38,39,40.O le malamalama i le fausaga o glycans e faʻaogaina ai le antibody-based glycan ELISA metotia o le a maua ai le faʻamautinoaga faʻaopoopo i faʻamaʻi faʻamaʻi e aunoa ma le faʻaogaina o metotia MS lavelave.
O a matou suʻesuʻega talu ai na faʻaalia ai o le oligosaccharides faʻamaʻaʻa na tumau pea le le faʻaaogaina pe a maeʻa le togafitiga ma le faʻaogaina o le enzymatic hydrolysis (Ata 1).I la matou galuega na fa'asalalauina muamua, na matou fausia ai se auala e fa'agaoioia ai le malala fa'ato'aga e fa'amavae ai oligosaccharides mai le AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.I le mae'a ai o le fa'amavaeina ma le tu'ueseeseina, sa toe fa'avasegaina le oligosaccharides i le tele o le chromatography e le aofia ai (SEC) ma aoina i le fa'asologa o le mamafa mole.Sugar monomers ma oligomers na fa'asa'oloto mai togafitiga eseese sa su'esu'eina ile su'esu'ega o le suka.Pe a faʻatusatusa le mea o loʻo i totonu o le suka oligomers e maua mai i auala eseese muamua, o le i ai o le oligosaccharides faʻamaʻaʻa o se faʻafitauli masani i le liua o le biomass i monosaccharides ma e mafai ona taʻitaʻia ai le faʻaitiitia o le suka o le itiiti ifo i le 10-15% ma e oʻo lava i le 18%.US.O lenei metotia e faʻaaogaina mo le faʻateleina o le gaosiga o le oligosaccharide vaega ninii.O le taunuuga o le ACH ma ona vaega mulimuli ane ma le mamafa mole mole eseese na faʻaaogaina e fai ma mea faʻataʻitaʻi mo le faʻavasegaina o oligosaccharides i lenei galuega.
Ina ua mae'a le togafitiga ma le fa'asusuina o le enzymatic, sa tumau pea le oligosaccharides e le'i fa'asalaina.O iinei (A) o se auala tuueseese oligosaccharide lea e vavae ese ai oligosaccharides mai le AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) e faʻaaoga ai se moega faʻapipiʻi o le carbon activated ma le diatomaceous earth;(B) Metotia mo le tuueseeseina o oligosaccharides.O le oligosaccharides na toe vavaeeseina e le tele o le chromatography e le aofia ai (SEC);(C) Saccharide monomers ma oligomers ua fa'asa'oloto mai togafitiga eseese (diluted acid: DA, ionic liquid: IL ma AFEX).Enzymatic hydrolysis tulaga: maualuga le utaina o le 25% (w/w) (e tusa ma le 8% glucan uta), 96 itula hydrolysis, 20 mg/g fa'atauga enzyme fa'atau (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) ma le (D) Sugar monomers ma oligomers o kulukose, xylose ma arabinose-fa'asa'oloto mai le AFEX presttreated AFEX .
O le su'esu'ega o le Glycan ua fa'amaonia e avea o se meafaigaluega aoga mo se su'esu'ega atoatoa o le glycans i fa'aputuga fa'ate'aina mai toega o mea olaola.Ae ui i lea, o saccharides solu vai e le o fa'aalia i le fa'aogaina o lenei metotia masani41 ona o le oligosaccharides maualalo mole mole mamafa e faigata ona fa'afefe i luga o papatusi ELISA ma e fufulu ese a'o le'i fa'aopoopoina le antibody.O le mea lea, mo le fusifusia o le antibody ma le fa'avasegaina, sa fa'aaogaina se metotia biotinylation e tasi e fa'aofuina ai soluble, oligosaccharides e le o fa'atumauina i luga o ipu ELISA ua ufiufi avidin.O lenei metotia na faʻataʻitaʻiina i le faʻaaogaina o le ACSH na faia muamua ma se vaega e faʻatatau i lona mamafa mole (poʻo le tikeri o le polymerization, DP).O le biotinylation e tasi-laasaga na faʻaaogaina e faʻateleina ai le fesoʻotaʻiga o le oligosaccharide e ala i le faʻaopoopoina o le biotin-LC-hydrazide i le faʻaitiitia o le faʻamaʻi o le carbohydrate (Fig. 2).I le fofo, o le vaega o le hemiacetal i le faʻaitiitia o le pito e faʻafefe ma le vaega o le hydrazide o le biotin-LC-hydrazide e fausia ai se fusi o le hydrazone.I le i ai o le sui faʻaitiitia NaCNBH3, o le faʻamauina o le hydrazone ua faʻaitiitia i se mea faʻamautu faʻamautu biotinylated.Faatasi ai ma le fesuiaiga o le suka e faʻaitiitia ai le pito, o le fusifusia o le maualalo o le DP oligosaccharides i le ELISA na mafai ona mafai, ma i la matou suʻesuʻega na faia lenei mea i luga o avidin-coated plates e faʻaaoga ai mAbs faʻatatau i le glycan.
Suʻesuʻeina o faʻamaʻi monoclonal e faʻavae ile ELISA mo oligosaccharides biotinylated.O iinei (A) tu'ufa'atasiga biotinylation o oligosaccharides ma mulimuli ane su'esu'ega ELISA fa'atasi ma glycan-target mAbs i luga o NeutrAvidin fa'apipi'i ipu ma (B) fa'aalia se laasaga e tasi mo le biotinylation o mea fa'aalia.
O ipu faʻapipiʻi Avidin faʻatasi ma oligosaccharide-conjugated antibodies na faʻaopoopoina i faʻamaʻi muamua ma lona lua ma fufuluina i se auala malamalama ma le taimi.A mae'a le fusifusia o le antibody, fa'aopoopo i ai le mea'ai TMB e fa'amu ai le ipu.Na iu lava ina taofi le tali i le sulfuric acid.Sa su'esu'eina papatusi fa'asusu e fa'aaoga ai le ELISA faitau e fa'amautu ai le malosi fa'amauina o fa'ama'i ta'itasi e iloa ai le feso'ota'iga fa'aantibody fa'apitoa.Mo fa'amatalaga ma fa'asologa o le fa'ata'ita'iga, va'ai le vaega tutusa "Material and Methods".
Matou te faʻaalia le aoga o lenei auala fou faʻavae mo faʻaoga faʻapitoa e ala i le faʻamalamalamaina o oligosaccharides soluble o loʻo i totonu o le ACSH faʻapea foʻi ma vaega o le oligosaccharide mama ma faʻamamaina e vavae ese mai le lignoscellulosic hydrolysates.E pei ona faʻaalia i le Ata 3, o xylans e sili ona faʻaaogaina epitope e faʻaalia i le ACSH e faʻaaoga ai metotia o suʻega glycome bioacylated e masani lava o le uronic (U) poʻo le methyluronic (MeU) ma pectic arabinogalactans.O le tele o ia mea na maua foi i la matou suʻesuʻega talu ai i le suʻesuʻeina o glycans o mea e le-hydrolyzed solids (UHS)43.
Su'esu'ega o epitope oligosaccharide toe fa'afo'i le fa'aogaina o le antibody monoclonal e fa'asino ile glycan puipui puipui.O le vaega "neutral" o le vaega ACN ma le vaega "acid" o le vaega FA.O lanu mumu pupula i luga o le fa'afanua vevela e fa'aalia ai le maualuga o mea epitope, ae o lanu moana susulu e fa'ailoa mai ai se avanoa avanoa.Fa'ailoga lanu ile fua fa'atatau ile fua ole OD mo fa'asologa N=2.O epitopes autu e iloa e antibodies o loʻo faʻaalia i le itu taumatau.
O nei fausaga e le o le cellulose e le mafai ona vavaeina e le tele o cellulases ma hemicellulases i totonu o le faʻafefiloi o enzyme faʻatau pisinisi, lea e aofia ai enzymes faʻapisinisi e masani ona faʻaaogaina.O le mea lea, e manaʻomia ni enzymes fesoasoani fou mo la latou hydrolysis.A aunoa ma ni enzymes fesoasoani e le o se cellulose e mana'omia, o nei mea e le-cellulose e taofia ai le liua atoatoa i le monosaccharides, e tusa lava pe faʻafefeteina matua polymers suka i ni vaega pupuu ma faʻamavae e faʻaaoga ai faʻafefiloi enzyme faapisinisi.
O isi suʻesuʻega o le tufatufaina atu o faailoilo ma lona malosi faʻamaufaʻailoga na faʻaalia ai o faʻamaufaʻailoga epitope e maualalo i vaega maualuga o le suka DP (A, B, C, DP e oʻo atu i le 20+) nai lo vaega maualalo o le DP (D, E, F, DP) i dimers) (Fig 1).O vaega o le acid e sili atu ona taatele i epitopes e le o le cellulose nai lo vaega e le tutusa.O nei mea faʻapitoa e ogatasi ma le mamanu na matauina i la matou suʻesuʻega talu ai, lea e maualuga ai le DP ma le acid moieties na sili atu ona tetee i le enzymatic hydrolysis.O le mea lea, o le i ai o epitopes glycan non-cellulose ma sui U ma MeU e mafai ona fesoasoani tele i le mautu o le oligosaccharides.E tatau ona maitauina o le fusia ma le iloa lelei e mafai ona avea ma faʻafitauli mo le maualalo o le DP oligosaccharides, aemaise lava pe a fai o le epitope o se dimeric poʻo trimeric oligosaccharide.E mafai ona faʻataʻitaʻiina lenei mea i le faʻaaogaina o oligosaccharides faʻapisinisi o umi eseese, o loʻo i ai naʻo le tasi epitope e fusifusia i se mAb patino.
O le mea lea, o le faʻaogaina o faʻamaʻi faʻapitoa faʻapitoa na faʻaalia ai ni ituaiga o faʻamaufaʻailoga faʻafefe.Faʻalagolago i le ituaiga o antibody e faʻaaogaina, o le faʻaogaina o le faʻasologa talafeagai, ma le malosi o le faʻailoga e maua mai (tele ma sili ona tele), e mafai ona iloa enzymes fou ma faʻaopoopo semi-quantitatively i le paluga enzyme mo le glycoconversion atoatoa.I le avea o se faʻataʻitaʻiga o suʻesuʻega o le ACSH oligosaccharides, e mafai ona matou fatuina se faʻamaumauga o faʻamaufaʻailoga glycan mo mea taʻitasi biomass.E tatau ona maitauina iinei e tatau ona amanaʻia le eseesega o fesoʻotaʻiga o antibodies, ma afai e le o iloa lo latou vavalalata, o le a tupu ai ni faʻafitauli faʻapitoa pe a faʻatusatusa faʻailoga o antibodies eseese.E le gata i lea, o le fa'atusatusaina o fusi glycan atonu e sili ona aoga i le va o fa'ata'ita'iga mo le antibody tutusa.O nei fusi fa'ama'a'a e mafai ona fa'afeso'ota'i i le CAZyme database, lea e mafai ona tatou iloa ai enzymes, filifili enzymes suitulaga ma su'ega mo enzymes e soli ai fusi, po'o le atina'eina o microbial system e fa'aalia ai nei enzymes mo le fa'aoga i biorefineries44.
Ina ia iloilo pe faʻafefea ona faʻafesoʻotaʻi e metotia faʻamaʻi auala faʻapitoa mo le faʻavasegaina o le oligosaccharides mamafa mole maualalo o loʻo i ai i le lignoscellulosic hydrolysates, na matou faia MALDI (Fig. 4, S1-S8) ma le auiliiliga o saccharides e maua mai i le TMS e faʻavae i luga o le GC-MS i luga o le laulau tutusa (Fig 5) oligosaccharide vaega.MALDI o loʻo faʻaaogaina e faʻatusatusa pe o le tele o le tufatufaina o molelaʻau oligosaccharide e fetaui ma le fausaga faʻamoemoeina.I luga o le fig.4 o loʻo faʻaalia ai le MC o vaega le mautonu ACN-A ma ACN-B.O suʻesuʻega a le ACN-A na faʻamaonia ai le tele o suka pentose mai le DP 4-8 (Fig. 4) i le DP 22 (Fig. S1), o ona mamafa e fetaui ma MeU-xylan oligosaccharides.O suʻesuʻega a le ACN-B na faʻamaonia ai le pentose ma le glucoxylan faʻatasi ma le DP 8-15.I mea faʻaopoopo e pei o le Ata S3, FA-C acidic moiety mass distribution faafanua o loʻo faʻaalia ai le tele o (Me) U sui pentose sugars ma le DP o le 8-15 e ogatasi ma le xylans sui o loʻo maua ile suʻesuʻega mAb faʻavae ELISA.O epitopes e tumau.
MALDI-MS alaleo o soluble oligosaccharides le tausisia o lo'o iai ile ACS.O iinei, (A) ACN-A vaega maualalo o le mamafa o loʻo i ai methylated uronic acid (DP 4-8) sui glucuroxylan oligosaccharides ma (B) ACN-B xylan ma methylated uronic acid oligosaccharides suia i le glucuroxylan (DP 8-15).
Iloiloga o le tuufaatasiga o le glycan toega o oligosaccharides refractory.O iinei (A) TMS saccharide tuufaatasiga o vaega ninii oligosaccharide eseese maua mai le GC-MS su'esu'ega.(B) Fa'atulagaina o suka eseese e maua mai i le TMS o lo'o iai ile oligosaccharides.ACN – vaega vaega o le acetonitrile o lo'o iai oligosaccharides e le tutusa ma FA-vaega ferulic acid o lo'o iai oligosaccharides acid.
O le isi faaiuga manaia na maua mai i le LC-MS suʻesuʻega o le vaega o le oligosaccharide, e pei ona faʻaalia i le Ata S9 (auala e mafai ona vaʻaia i mea faʻapipiʻi eletise).O vaega o le hexose ma le -OAc vaega na matauina pea lava pea i le taimi o le faʻaogaina o le vaega ACN-B.O lenei sailiga e le gata ina faʻamaonia ai le vaeluaga o loʻo matauina i le glycome ma le MALDI-TOF suʻesuʻega, ae o loʻo tuʻuina atu ai foʻi faʻamatalaga fou e uiga i mea e maua mai i le carbohydrate i totonu o le lignoscellulosic biomass muamua.
Sa matou su'esu'eina fo'i le tu'ufa'atasiga o le suka o le vaega o le oligosaccharide e fa'aaoga ai le TMS suka suka.I le faʻaaogaina o le GC-MS, na matou fuafuaina ai le tuʻufaʻatasia o neural (non-derivative) ma suka suka (GluA ma GalA) i le vaega o le oligosaccharide (Fig. 5).Glucuronic acid e maua i vaega acidic C ma D, a'o galacturonic acid e maua i vaega acidic A ma B, o ia mea uma e lua o vaega DP maualuga o suka suka.O nei taunuʻuga e le gata ina faʻamaonia a matou ELISA ma MALDI faʻamaumauga, ae o loʻo ogatasi foi ma a matou suʻesuʻega muamua o le faʻaputuina o le oligosaccharide.O le mea lea, matou te talitonu o metotia faʻaonaponei faʻaonaponei e faʻaaoga ai le biotinylation o oligosaccharides ma suʻesuʻega ELISA mulimuli ane e lava e iloa ai oligosaccharides toe faʻafefeteina i totonu o faʻataʻitaʻiga olaola eseese.
Talu ai o metotia suʻesuʻe mAb faʻavae ELISA ua faʻamaonia e le tele o metotia eseese, matou te manaʻo e suʻesuʻe atili le gafatia o lenei metotia faʻafuainumera fou.E lua oligosaccharides pisinisi, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) ma le 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), na faʻatau ma faʻataʻitaʻiina e faʻaaoga ai se auala fou mAb e faʻatatau i le glycan puipui puipui.O le ata 6 o loʻo faʻaalia ai se fesoʻotaʻiga laina i le va o le faʻamaufaʻailoga o le biotinylated ma le faʻaogaina o le oligosaccharide, faʻaalia ai se faʻataʻitaʻiga Adsorption Langmuir.Faatasi ai ma mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, ma CCRC-M151 faʻatasi ma XHE, ma CCRC-M108, CCRC-M109, ma LM11 faʻatasi ma A2XX i luga o le 1 nm i le 100 nano.Ona o le faʻatapulaʻaina o le maua o faʻamaʻi i le taimi o le faʻataʻitaʻiga, faʻatapulaʻa faʻataʻitaʻiga na faia i faʻatonuga taʻitasi o le oligosaccharide.E tatau ona maitauina iinei o nisi antibodies e matua ese lava le tali atu i le oligosaccharide tutusa e fai ma mea'ai, masalo ona e fusifusia i ni epitopes eseese ma e mafai ona i ai ni sootaga vavalalata eseese.O faiga ma a'afiaga o fa'amatalaga sa'o epitope o le a sili atu ona lavelave pe a fa'aoga le auala fou mAb i fa'ata'ita'iga moni.
E lua oligosaccharides fa'apisinisi na fa'aogaina e fa'amautu ai le va'aiga o mAbs e fa'atatau i le glycan.O iinei, o fesoʻotaʻiga laina faʻatasi ma le faʻaogaina o le oligosaccharide faʻasologa o loʻo faʻaalia ai Langmuir adsorption mamanu mo (A) XHE ma mAb ma (B) A2XX ma mAb.O epitopes tutusa e faʻaalia ai fausaga o le oligosaccharides faʻapisinisi faʻaaogaina e fai ma mea e fai ai le suʻega.
O le fa'aogaina o glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis poʻo le ELISA-based mAb screening) o se meafaigaluega malosi mo le faʻamalamalamaina loloto o le tele o glycans puipui tele o loʻo fausia ai laau olaola.Ae ui i lea, o le su'esu'ega masani o le glycan e na'o le fa'avasegaina o glycans puipui lapopo'a, ona o le tele o oligosaccharides e le lelei le fa'aogaina i luga o papatusi ELISA.I totonu o lenei su'esu'ega, na fa'asusuina fa'ama'i fa'ama'i fa'ama'i fa'ama'i AFEX i se mea e maua ai le malosi.Sa fa'aogaina le su'esu'ega o le suka e iloa ai le tu'ufa'atasiga o ga'o ga'o ga'o puipui i le hydrolyzate.Ae ui i lea, o suʻesuʻega mAb o oligosaccharides laiti i hydrolysates e faʻatauvaʻa, ma e manaʻomia meafaigaluega faʻaopoopo e faʻaogaina lelei ai oligosaccharides i luga o papatusi ELISA.
Matou te lipotia iinei se auala fou ma le lelei o le oligosaccharide immobilization mo le mAb suʻesuʻeina e ala i le tuʻufaʻatasia o le oligosaccharide biotinylation sosoo ai ma le ELISA suʻesuʻega i luga o NeutrAvidin ™ faʻapipiʻiina papatusi.O le immobilized biotinylated oligosaccharides na faʻaalia le lava o fesoʻotaʻiga mo le antibody e mafai ai ona vave ma lelei le suʻesuʻeina o oligosaccharides toe faʻafoʻi.Iloiloga o le tuufaatasiga o nei oligosaccharides faʻamaʻaʻa e faʻavae i luga o le tele o spectrometry na faʻamaonia ai taunuʻuga o lenei auala fou ile immunoscreening.O le mea lea, o nei suʻesuʻega o loʻo faʻaalia ai o le tuʻufaʻatasiga o le oligosaccharide biotinylation ma le suʻesuʻeina o le ELISA faʻatasi ai ma glycan-targeted monoclonal antibodies e mafai ona faʻaogaina e iloa ai fesoʻotaʻiga i oligosaccharides ma e mafai ona faʻaaogaina lautele i isi suʻesuʻega biochemical e faʻaalia ai le fausaga o le oligosaccharides.
Ole auala ole su'esu'eina ole glycan ole biotin ole lipoti muamua lea e mafai ona su'esu'eina le fa'amautu o noataga ga'o ga'o ole oligosaccharides solu ile biomass o la'au.E fesoasoani lea e malamalama ai pe aisea ua matua maaa ai nisi vaega o le biomass pe a oo mai i le gaosiga o le paio.O lenei metotia e faʻatumu ai se avanoa taua i metotia suʻesuʻega o le glycome ma faʻalauteleina lona faʻaogaina i se lautele lautele o substrates i tua atu o laau oligosaccharides.I le lumanaʻi, e mafai ona matou faʻaogaina robotics mo le biotinylation ma faʻaoga le metotia na matou atinaʻeina mo suʻesuʻega maualuga o faʻataʻitaʻiga e faʻaaoga ai le ELISA.
O vaomago saito (CS) o lo'o totoina mai fatu o le Pioneer 33A14 na seleseleina i le 2010 mai Kramer Farms i Ray, Colorado.Faatasi ai ma le faʻatagaga a le pule o le fanua, e mafai ona faʻaogaina lenei biomass mo suʻesuʻega. O fa'ata'ita'iga sa teuina mago <6% susū i taga sipi-loka i le potu vevela. O fa'ata'ita'iga sa teuina mago <6% susū i taga sipi-loka i le potu vevela. Образцы хранились сухими при влажности < 6% i пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. O fa'ata'ita'iga sa teuina fa'amago i le <6% susū i totonu o taga sipi i le vevela o le potu.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. O faʻataʻitaʻiga o loʻo teuina i taga sipi i le vevela o le potu ma le susu <6%.O le suʻesuʻega na tausisia taʻiala a le lotoifale ma le atunuʻu.Sa faia su'esu'ega tu'ufa'atasi e fa'aaoga ai le NREL protocol.O le tuufaatasiga na maua e aofia ai le 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protein ma le 13. 4% lefulefu.
Cellic® CTec2 (138 mg protein / ml, lot VCNI 0001) o se paluga lavelave o cellulase, β-glucosidase ma Cellic® HTec2 (157 mg protein / ml, lot VHN00001) mai Novozymes (Franklinton, NC, ISA)).Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), o se faʻafefiloi lavelave o enzymes faʻaleagaina pectin, na foaʻi mai e le DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, ISA).O fa'aputuga ole polotini e fa'atatau i le fuaina o mea e maua i le porotini (ma to'ese le sao o le nitrogen non-protein) e fa'aaoga ai le Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Diatomaceous earth 545 na fa'atau mai EMD Millipore (Billerica, MA).Kaponi fa'agaoioia (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, ma isi vaila'au uma na fa'atau mai Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX mua'i togafitiga na faia i le GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, ISA).Na faia muamua togafitiga ile 140 ° C. mo le 15 minute.46 taimi e nofo ai ile 1:1 ratio ole ammonia anhydrous i le biomass ile 60% (w/w) o lo'o fa'apipi'i i totonu o se masini fa'a'a'a'a fa'ameamea (Parr Instruments Company).E 30 minute na alu ai.Na aumai le reactor i le 140 ° C ma sa vave ona faʻasaʻoloto le ammonia, faʻatagaina le biomass e vave toe foʻi i le vevela potu.O le tu'ufa'atasiga ole AFEX na mua'i togafitiina stover sana (ACS) sa tutusa lelei ma le UT-CS.
Malosi maualuga ACSH 25% (w/w) (tusa ma le 8% dextran loading) sa saunia e fai ma mea amata mo le gaosiga tele o oligosaccharides.Enzymatic hydrolysis o le ACS na faia i le faʻaaogaina o se faʻafefiloi faʻapisinisi faʻapisinisi e aofia ai le Cellic® Ctec2 10 mg protein / g glucan (i le biomass pretreated), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein / g glucan, ma Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg polotini/g dextran.Enzymatic hydrolysis na faia i se 5-lita bioreactor ma se voluma galue o le 3 lita, pH 4.8, 50 ° C ma le 250 rpm.A maeʻa le hydrolysis mo le 96 itula, o le hydrolyzate na aoina i le centrifugation i le 6000 rpm mo le 30 minute ona sosoo ai lea ma le 14000 rpm mo le 30 minute e aveese ai solids unhydrolysed.O le hydrolyzate na fa'auluina i le fa'amama mama e ala i se fagu faamama 0.22 mm.O le hydrolyzate ua fa'amama sa teu i totonu o fagu mama'i i le 4° C. ona fa'avaevae lea ile kaponi.
Su'esu'ega o le tu'ufa'atasiga o fa'ata'ita'iga o le biomass fa'avae fa'avae e tusa ai ma faiga su'esu'e a le falesu'esu'e a le NREL: tapenaga o fa'ata'ita'iga mo su'esu'ega tu'ufa'atasi (NREL/TP-510-42620) ma le fa'amautuina o ga'o ga'o ma lignin ile biomass (NREL/TP-510 - 42618)47.
O le su'esu'ega o le oligosaccharide o le vai o le hydrolyzate sa faia i luga o le fua 2 ml e fa'aaoga ai se metotia fa'asusu fa'a-autoclave.Fa'afefiloi le fa'ata'ita'iga hydrolyzate ma le 69.7 µl o le sulfuric acid 72% i totonu o se fa'alava fa'aaogāina 10 ml sikulima ma fa'asusu mo le 1 itula i luga o le laulau i le 121 °C, malulu i luga o le aisa ma fa'amama i totonu o se vial chromatography vai maualuga (HPLC).O le maualuga o le oligosaccharides na fuafuaina e ala i le toesea o le faʻaogaina o le monosaccharides i le faʻataʻitaʻiga e le o le hydrolyzed mai le aofaʻi o le suka i le faʻataʻitaʻiga o le acid-hydrolyzed.
O le kulukose, xylose, ma le arabinose concentrations i le acid hydrolysed biomass na suʻesuʻeina e ala i le faʻaogaina o le Shimadzu HPLC faʻapipiʻiina i se autosampler, faʻavevela o le koluma, pamu isocratic, ma le suʻesuʻega faʻamaufaʻailoga i luga ole koluma Bio-Rad Aminex HPX-87H.O le koluma na tausia i le 50 ° C ma faʻafefe i le 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 i le vai.tafe.
O le hydrolyzate supernatant sa fa'afefeteina ma su'esu'eina mo le monomer ma le oligosaccharide.Monomeric sugars na maua ina ua maeʻa le enzymatic hydrolysis na suʻesuʻeina e le HPLC faʻapipiʻiina i le Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P koluma ma se koluma leoleo lefulefu.O le vevela o le koluma na faʻatumauina i le 80 ° C, o le vai na faʻaaogaina e avea ma vaega feaveaʻi ma le tafe o le 0.6 ml / min.Oligosaccharides na faʻamoemoeina e ala i le hydrolysis i le dilute acid i le 121 ° C e tusa ai ma metotia o loʻo faʻamatalaina i refs.41, 48, 49.
Saccharide suʻesuʻega sa faia i luga o le mata, AFEX muaʻi togafitia ma mea uma e le o faʻasalaina biomass toega (e aofia ai le gaosiga o faʻasologa o puipui puipui puipui ma latou suʻesuʻega mAb) e faʻaaoga ai taualumaga na faʻamatalaina muamua 27, 43, 50, 51 .Mo le su'esu'ega o le glycome, o mea e le mafai ona fa'afefeteina o le 'ava malosi o mea puipui puipui o lo'o saunia mai toega biomass ma fa'asaga i fa'asologa fa'asolosolo fa'atasi ai ma fa'alavelave fa'atupu fa'atupu fa'alavelave e pei o le ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM ma le 0.5% w/v), CON.(1M ma le 4M, fa'atasi uma ma le 1% w/v sodium borohydride) ma le acid chlorite e pei ona faamatalaina muamua52,53.O faʻamatalaga na tuʻuina atu i le ELISA e faʻasaga i se vaega lavelave o mAb50s faʻasino i le glycan puipui puipui, ma faʻaalia le faʻaogaina o le mAb o se faʻafanua vevela.mAbs fa'atatau i le glycan pa puipui o la'au na fa'atau mai falesu'esu'e (CCRC, JIM ma MAC fa'asologa).
Biotinylation tasi-laasaga o oligosaccharides.O le tuʻufaʻatasiga o gaʻo ma le biotin-LC-hydrazide na faia i le faʻaogaina o le faʻagasologa o loʻo mulimuli mai.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) na faʻamavaeina i le dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) e ala i le faʻamalosi malosi ma le vevela i le 65 ° C. mo le 1 min.Na fa'aopoopoina le suka acetic acid (30 μl) ma sasaa le paluga i luga o le sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 μmol) ma fa'amavae atoa pe a uma ona fa'amafanafana i le 65° C. mo le tusa ma le 1 minute.Ma, mai le 5 i le 8 μl o le faʻafefiloi faʻafefe na faʻaopoopoina i le oligosaccharide mago (1-100 nmol) e maua ai le 10-fold pe sili atu molar sili atu o le igoa i luga o le faʻaitiitiga pito.O le tali na faia i le 65 ° C mo le 2 h, ina ua maeʻa ona faʻamamaina vave faʻataʻitaʻiga.E leai se sodium cyanoborohydride na faʻaaogaina i faʻataʻitaʻiga faʻailoga e aunoa ma se faʻaititia, ma faʻataʻitaʻiga na faʻaalia i le 65 ° C. mo le 2.5 itula.
ELISA ufiufi ma fufuluina o faʻataʻitaʻiga o oligosaccharides biotinylated.25 μl o faʻataʻitaʻiga biotinylated (100 μl o faʻataʻitaʻiga faʻapitoa taʻitasi ua faʻafefiloi i le 5 ml o le 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) na faʻaopoopoina i vaieli taʻitasi o le ipu avidin-coated.O vaieli faʻatonutonu na faʻapipiʻiina i le 50 μl o le biotin i le maualuga o le 10 μg / ml i le 0.1 M TBS.Na fa'aaogaina vai fa'aonaona e fai ma ufiufi mo fua avanoa.O le laulau na fa'asusu mo le 2 itula i le vevela o le potu i le pogisa.Fufulu fa'atolu le ipu i le 0.1% susu fa'amama ile 0.1 M TBS fa'aaoga le polokalame Nu.11 mo Grenier flat 3A.
Fa'aopoopo ma le fufuluina o fa'ama'i muamua.Faaopopo le 40 µl o le antibody muamua i vaieli taitasi.Taofi le microplate mo le 1 itula ile vevela ole potu ile pogisa.Ona fufulu fa'atolu lea o ipu i le 0.1% susu ile 0.1M TBS ile fa'aogaina ole polokalame fufulu #11 mo Grenier Flat 3A.
Faaopopo le antibody lona lua ma fufulu.Fa'aopoopo le 50 µl o le isumu/iole lona lua antibody (fa'afefiloi 1:5000 ile 0.1% susu ile 0.1 M TBS) ile vaieli ta'itasi.Taofi le microplate mo le 1 itula ile vevela ole potu ile pogisa.Ona fufulu fa'a 5 fa'a 5 taimi i le susu 0.1% ile 0.1 M TBS ile fa'aogaina ole Grenier Flat 5A polokalame fufulu ipu #12.
Fa'aopoopoina se mea'ai.Fa'aopoopo le 50 µl o le 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) i le mea fa'avae (e ala i le fa'aopoopoina o le 2 mataua o le pa'u, 3 mataua o le TMB, 2 mataua o le hydrogen peroxyide i le 15 ml o le vai fa'afefe).Saunia le mea'ai TMB.ma vortex aʻo leʻi faʻaaogaina).Tu'u le microplate ile vevela ole potu mo le 30 minute.I le pogisa.
Faauma le laasaga ma faitau le laulau.Faaopopo le 50 µl o le 1 N sulfuric acid i vaieli taitasi ma faamaumau le mitiia mai le 450 i le 655 nm e faaaoga ai le ELISA reader.
Sauni 1 mg/ml vaifofo o nei au'ili'ili ile vai fa'asao: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (tulaga i totonu).E lua tulaga na saunia e ala i le faʻaopoopoina o le 1 mg/mL suka vaifofo o loʻo faʻaalia i le Laulau 1. O faʻataʻitaʻiga e faʻamaisa ma lyophilized i le -80 ° C. seia oʻo ina aveese uma vai (e masani lava pe a ma le 12-18 itula).
Fa'aopoopo le 100–500 µg o fa'ata'ita'iga e fa'avili fa'alava fa'au i luga o se paleni su'esu'e.Faamaumau le aofaiga ua faaopoopo.E sili atu le faʻamavaeina o le faʻataʻitaʻiga i se faʻatonuga faʻapitoa o le solvent ma faʻaopopo i le paipa e pei o se aliquot vai.Fa'aaogā le 20 µl ole 1 mg/ml inositol e fai ma fa'ata'ita'iga i totonu mo paipa fa'ata'ita'i ta'itasi.O le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga i totonu e faʻaopoopo i le faʻataʻitaʻiga e tatau ona tutusa ma le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga i totonu e faʻaopoopo i le paipa masani.
Fa'aopoopo le 8 ml o le methanol e leai se vai i totonu o se vial tapuni.Ona 4 ml ole 3 N. methanolic HCl solution, ufiufi ma luluina.O lenei faiga e le fa'aogaina ai le vai.
Faaopopo le 500 µl ole 1 M HCl methanol solution ile oligosaccharide samples ma paipa TMS masani.O faʻataʻitaʻiga na faʻapipiʻiina i le po (168 itula) i le 80 ° C. i totonu o se poloka vevela.Fa'amago le mea e gaosia ai le methanolysis i le vevela o le potu e fa'aaoga ai se fa'amamago.Fa'aopopo le 200 µl MeOH ma toe fa'agogo.O lenei faiga e toe fai faalua.Fa'aopoopo le 200 µl o le methanol, 100 µl o le pyridine ma le 100 µl o le acetic anhydride i le fa'ata'ita'iga ma fa'afefiloi lelei.O faʻataʻitaʻiga na faʻatumauina i le vevela o le potu mo le 30 minute.ma mago.Fa'aopoopo le 200 µl o le methanol ma toe fa'agogo.
Fa'aopoopo le 200 µl o le Tri-Sil ma fa'avevela fa'alava mo le 20 minute.80°C, ona faamaalili lea i le vevela potu.Fa'aaogā se fa'amamago e fa'amamago atili ai le fa'ata'ita'iga i se voluma e tusa ma le 50 µl.E taua le maitauina na matou le faʻatagaina faʻataʻitaʻiga e faʻamago atoa.
Faaopopo le 2 ml o le hexane ma faʻafefiloi lelei e ala i le vortexing.Faatumu pito o paipa Pasteur (5-8 mm) i se fasi fulufulu tioata e ala i le faaofiina o le fulufulu tioata i luga o se paipa e 5-3/4 inisi le lautele.O faʻataʻitaʻiga na faʻamalo i le 3000 g mo le 2 minute.So'o se toega e le mafai ona fa'afefeteina e fa'afefe.Fa'amago le fa'ata'ita'iga ile 100-150 µl.O se voluma e tusa ma le 1 μl na tui i totonu o le GC-MS i le vevela muamua o le 80 ° C ma le taimi muamua o 2.0 minute (Table 2).