Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Mga bagong immunological at mass spectrometric na pamamaraan para sa kumplikadong pagsusuri ng patuloy na oligosaccharides sa corn stover na ginagamot sa AFEX.Ang Lignocellulosic biomass ay isang napapanatiling alternatibo sa mga fossil fuel at malawakang ginagamit upang bumuo ng mga biotechnologies para sa produksyon ng mga produkto tulad ng pagkain, feed, fuel at kemikal.Ang susi sa mga teknolohiyang ito ay ang pagbuo ng mga cost-competitive na proseso para sa pag-convert ng mga kumplikadong carbohydrates na naroroon sa mga cell wall ng halaman sa mga simpleng asukal tulad ng glucose, xylose at arabinose.Dahil napakatigas ng lignoselulosic biomass, dapat itong sumailalim sa mga thermochemical treatment (hal., ammonia fiber exfoliation (AFEX), dilute acids (DA), ionic liquids (IL)) at biological treatments (hal., enzymatic hydrolysis at microbial fermentation) na magkakasama para makuha ang ninanais na produkto..Gayunpaman, kapag ang mga komersyal na fungal enzymes ay ginagamit sa proseso ng hydrolysis, 75-85% lamang ng mga natutunaw na asukal na nabuo ay monosaccharides, at ang natitirang 15-25% ay natutunaw, intractable oligosaccharides, na hindi palaging magagamit sa mga microorganism.Noong nakaraan, matagumpay naming nahiwalay at napurify ang natutunaw na matigas na oligosaccharides gamit ang kumbinasyon ng carbon at diatomaceous earth separation at size exclusion chromatography, at sinisiyasat din ang kanilang enzyme inhibitory properties.Napag-alaman namin na ang mga oligosaccharides na naglalaman ng mas mataas na antas ng polymerization (DP) methylated uronic acid substitutions ay mas mahirap iproseso gamit ang commercial enzyme blends kaysa sa mababang DP at neutral na oligosaccharides.Dito naiulat namin ang paggamit ng ilang karagdagang mga pamamaraan, kabilang ang glycan profiling gamit ang monoclonal antibodies (mAbs) na tiyak sa planta ng biomass glycans upang makilala ang mga glycan bond sa mga plant cell wall at enzymatic hydrolysates, matrix-assisted laser desorption ionization, time-of-flight mass- spectrometry..Ang MALDI-TOF-MS) ay gumagamit ng structure-informative diagnostic peak na nakuha sa pamamagitan ng spectroscopy pagkatapos ng pangalawang pagkabulok ng mga negatibong ion, gas chromatography at mass spectrometry (GC-MS) upang makilala ang mga oligosaccharide bond na may at walang derivatization.Dahil sa maliit na sukat ng oligosaccharides (DP 4–20), ang mga molekulang ito ay mahirap gamitin para sa mAb binding at characterization.Upang mapagtagumpayan ang problemang ito, nag-apply kami ng isang bagong biotin conjugation-based na oligosaccharide immobilization na pamamaraan na matagumpay na nilagyan ng label ang karamihan ng mababang DP na natutunaw na oligosaccharides sa ibabaw ng microplate, na pagkatapos ay ginamit sa isang mataas na throughput mAb system para sa tiyak na pagsusuri ng ligation.Ang bagong paraan na ito ay magpapadali sa pagbuo ng mas advanced na high throughput glycome assays sa hinaharap na maaaring magamit upang ihiwalay at makilala ang mga oligosaccharides na naroroon sa mga biomarker para sa mga layuning diagnostic.
Ang Lignocellulosic biomass, na binubuo ng agrikultura, panggugubat, damo at makahoy na materyales, ay isang potensyal na feedstock para sa produksyon ng mga bio-based na produkto, kabilang ang pagkain, feed, gasolina at chemical precursors upang makagawa ng mas mataas na halaga ng mga produkto1.Ang mga carbohydrate (tulad ng cellulose at hemicellulose) na nasa mga pader ng selula ng halaman ay na-depolymerize sa monosaccharides sa pamamagitan ng kemikal na pagproseso at biotransformation (tulad ng enzymatic hydrolysis at microbial fermentation).Kasama sa mga karaniwang pre-treatment ang ammonia fiber expansion (AFEX), dilute acid (DA), ionic liquid (IL), at steam explosion (SE), na gumagamit ng kumbinasyon ng mga kemikal at init upang bawasan ang produksyon ng lignoselulosa sa pamamagitan ng pagbubukas ng mga cell wall ng halaman3,4.katigasan ng ulo ng matter, 5. Ang enzymatic hydrolysis ay isinasagawa sa mataas na solids load gamit ang commercial active carbohydrate-containing enzymes (CAZymes) at microbial fermentation gamit ang mga transgenic yeast o bacteria upang makagawa ng bio-based na mga panggatong at kemikal 6 .
Ang mga CAZyme sa mga komersyal na enzyme ay binubuo ng isang kumplikadong pinaghalong mga enzyme na synergistically na pumuputol ng mga kumplikadong carbohydrate-sugar bond upang bumuo ng mga monosaccharides2,7.Tulad ng iniulat namin kanina, ang kumplikadong network ng mga aromatic polymers ng lignin na may carbohydrates ay ginagawang lubos na hindi maaapektuhan, na humahantong sa hindi kumpletong conversion ng asukal, na nag-iipon ng 15-25% ng sex oligosaccharides na hindi ginawa sa panahon ng enzymatic hydrolysis ng pretreated biomass.Ito ay isang karaniwang problema sa iba't ibang pamamaraan ng biomass pretreatment.Ang ilang mga dahilan para sa bottleneck na ito ay kinabibilangan ng enzyme inhibition sa panahon ng hydrolysis, o ang kawalan o mababang antas ng mahahalagang mahahalagang enzyme na kinakailangan upang masira ang mga sugar bond sa biomass ng halaman.Ang pag-unawa sa komposisyon at istrukturang katangian ng mga asukal, tulad ng mga sugar bond sa oligosaccharides, ay makakatulong sa amin na mapabuti ang conversion ng asukal sa panahon ng hydrolysis, na ginagawang cost-competitive ang mga biotechnological na proseso sa mga produktong galing sa petrolyo.
Ang pagtukoy sa istruktura ng mga carbohydrate ay mahirap at nangangailangan ng kumbinasyon ng mga pamamaraan tulad ng liquid chromatography (LC)11,12, nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)13, capillary electrophoresis (CE)14,15,16 at mass spectrometry (MS)17., labing-walo.Ang mga pamamaraan ng MS tulad ng time-of-flight mass spectrometry na may laser desorption at ionization gamit ang isang matrix (MALDI-TOF-MS) ay isang versatile na paraan para sa pagtukoy ng mga istruktura ng carbohydrate.Kamakailan, ang Collision-Induced Dissociation (CID) tandem MS ng sodium ion adducts ay pinakamalawak na ginagamit upang tukuyin ang mga fingerprint na tumutugma sa mga posisyon ng attachment ng oligosaccharide, mga anomeric na configuration, sequence, at mga branching na posisyon 20, 21 .
Ang pagsusuri ng glycan ay isang mahusay na tool para sa malalim na pagkilala sa mga bono ng carbohydrate22.Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng mga monoclonal antibodies (mAbs) na nakadirekta sa planta ng cell wall glycan bilang mga probe upang maunawaan ang mga kumplikadong ugnayan ng carbohydrate.Higit sa 250 mAbs ang available sa buong mundo, na idinisenyo laban sa iba't ibang linear at branched oligosaccharides gamit ang iba't ibang saccharides24.Maraming mAb ang malawakang ginamit upang makilala ang istraktura, komposisyon, at pagbabago ng pader ng selula ng halaman, dahil may mga makabuluhang pagkakaiba depende sa uri ng selula ng halaman, organ, edad, yugto ng pag-unlad, at kapaligiran ng paglago25,26.Kamakailan lamang, ang pamamaraang ito ay ginamit upang maunawaan ang mga populasyon ng vesicle sa mga sistema ng halaman at hayop at ang kani-kanilang mga tungkulin sa transportasyon ng glycan na tinutukoy ng mga subcellular marker, yugto ng pag-unlad, o pampasigla sa kapaligiran, at upang matukoy ang aktibidad ng enzymatic.Ang ilan sa iba't ibang istruktura ng glycans at xylans na natukoy ay kinabibilangan ng pectin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), mixed bond glucans (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG) , glucuronic acid-arabinoxylan (GArbXgaan) at arabinoxylan (GArbXga29)
Gayunpaman, sa kabila ng lahat ng pagsusumikap sa pananaliksik na ito, iilan lamang sa mga pag-aaral ang nakatutok sa likas na katangian ng akumulasyon ng oligosaccharide sa panahon ng high solids load (HSL) hydrolysis, kabilang ang paglabas ng oligosaccharide, mga pagbabago sa haba ng oligomeric chain sa panahon ng hydrolysis, iba't ibang mababang DP polymers, at ang kanilang mga kurba.mga pamamahagi 30,31,32.Samantala, kahit na ang pagsusuri ng glycan ay napatunayang isang kapaki-pakinabang na tool para sa isang komprehensibong pagsusuri ng istraktura ng glycan, mahirap suriin ang nalulusaw sa tubig na mababang DP oligosaccharides gamit ang mga pamamaraan ng antibody.Ang mas maliit na DP oligosaccharides na may molekular na timbang na mas mababa sa 5-10 kDa ay hindi nagbubuklod sa ELISA plates 33, 34 at nahuhugasan bago magdagdag ng antibody.
Dito, sa kauna-unahang pagkakataon, ipinakita namin ang isang ELISA assay sa avidin-coated plates gamit ang monoclonal antibodies, na pinagsasama ang isang one-step na biotinylation procedure para sa natutunaw na refractory oligosaccharides na may glycome analysis.Ang aming diskarte sa pagsusuri ng glycome ay napatunayan ng MALDI-TOF-MS at GC-MS na batay sa pagsusuri ng mga pantulong na ugnayan ng oligosaccharide gamit ang trimethylsilyl (TMS) derivatization ng mga hydrolyzed na komposisyon ng asukal.Ang makabagong diskarte na ito ay maaaring mabuo bilang isang high-throughput na pamamaraan sa hinaharap at makahanap ng mas malawak na aplikasyon sa biomedical na pananaliksik35.
Ang mga post-translational na pagbabago ng mga enzyme at antibodies, tulad ng glycosylation,36 ay nakakaapekto sa kanilang biological na aktibidad.Halimbawa, ang mga pagbabago sa glycosylation ng serum proteins ay may mahalagang papel sa nagpapaalab na arthritis, at ang mga pagbabago sa glycosylation ay ginagamit bilang diagnostic marker37.Ang iba't ibang mga glycan ay naiulat sa panitikan na madaling lumitaw sa iba't ibang mga sakit, kabilang ang mga talamak na nagpapaalab na sakit ng gastrointestinal tract at atay, mga impeksyon sa viral, ovarian, dibdib, at mga kanser sa prostate38,39,40.Ang pag-unawa sa istruktura ng mga glycan gamit ang mga pamamaraan ng glycan na nakabase sa antibody na ELISA ay magbibigay ng karagdagang kumpiyansa sa diagnosis ng sakit nang hindi gumagamit ng mga kumplikadong pamamaraan ng MS.
Ang aming nakaraang pag-aaral ay nagpakita na ang matigas na oligosaccharides ay nanatiling unhydrolyzed pagkatapos ng pretreatment at enzymatic hydrolysis (Larawan 1).Sa aming naunang nai-publish na trabaho, bumuo kami ng isang activated charcoal solid-phase extraction method para ihiwalay ang oligosaccharides mula sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH)8.Pagkatapos ng paunang pagkuha at paghihiwalay, ang mga oligosaccharides ay higit na nahati sa pamamagitan ng laki ng pagbubukod ng chromatography (SEC) at nakolekta sa pagkakasunud-sunod ng timbang ng molekular.Ang mga monomer ng asukal at oligomer na inilabas mula sa iba't ibang mga pretreatment ay nasuri sa pamamagitan ng pagsusuri sa komposisyon ng asukal.Kapag inihambing ang nilalaman ng mga oligomer ng asukal na nakuha sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan ng pretreatment, ang pagkakaroon ng matigas na oligosaccharides ay isang pangkaraniwang problema sa conversion ng biomass sa monosaccharides at maaaring humantong sa isang pagbawas sa ani ng asukal ng hindi bababa sa 10-15% at kahit hanggang sa 18%.US.Ang pamamaraang ito ay ginagamit para sa karagdagang malakihang produksyon ng mga oligosaccharide fraction.Ang nagresultang ACH at ang mga kasunod na fraction nito na may iba't ibang molekular na timbang ay ginamit bilang pang-eksperimentong materyal para sa pagkilala ng oligosaccharides sa gawaing ito.
Pagkatapos ng pretreatment at enzymatic hydrolysis, ang patuloy na oligosaccharides ay nanatiling unhydrolysed.Narito ang (A) ay isang paraan ng paghihiwalay ng oligosaccharide kung saan ang mga oligosaccharides ay nakahiwalay sa AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) gamit ang isang naka-pack na kama ng activated carbon at diatomaceous earth;(B) Paraan para sa paghihiwalay ng oligosaccharides.Ang mga oligosaccharides ay higit na pinaghiwalay ng size exclusion chromatography (SEC);(C) Saccharide monomer at oligomer na inilabas mula sa iba't ibang pretreatment (diluted acid: DA, ionic liquid: IL at AFEX).Mga kondisyon ng enzymatic hydrolysis: high solids loading na 25% (w/w) (humigit-kumulang 8% glucan loading), 96 hours hydrolysis, 20 mg/g commercial enzyme loading (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 ratio) at ( D) Sugar monomer at oligomer ng glucose, xylose at arabinose-release mula sa AFEX prestated na AFEX corn.
Ang pagsusuri ng Glycan ay napatunayang isang kapaki-pakinabang na tool para sa isang komprehensibong pagsusuri sa istruktura ng mga glycan sa mga extract na nakahiwalay sa mga solidong residu ng biomass.Gayunpaman, ang mga saccharide na nalulusaw sa tubig ay hindi gaanong kinakatawan gamit ang tradisyonal na pamamaraang ito41 dahil ang mababang molecular weight oligosaccharides ay mahirap i-immobilize sa mga plato ng ELISA at nahuhugasan bago magdagdag ng antibody.Samakatuwid, para sa antibody binding at characterization, ginamit ang isang one-step na biotinylation na paraan upang magsuot ng natutunaw, hindi sumusunod na oligosaccharides sa mga plato ng ELISA na pinahiran ng avidin.Ang pamamaraang ito ay nasubok gamit ang aming dati nang ginawang ACSH at isang bahagi batay sa timbang ng molekular nito (o antas ng polymerization, DP).Ang isang hakbang na biotinylation ay ginamit upang mapataas ang oligosaccharide binding affinity sa pamamagitan ng pagdaragdag ng biotin-LC-hydrazide sa pagbabawas ng dulo ng carbohydrate (Fig. 2).Sa solusyon, ang hemiacetal group sa pagbabawas ng dulo ay tumutugon sa hydrazide group ng biotin-LC-hydrazide upang bumuo ng isang hydrazone bond.Sa pagkakaroon ng reducing agent NaCNBH3, ang hydrazone bond ay nababawasan sa isang matatag na biotinylated end product.Sa pagbabago ng pagtatapos ng pagbabawas ng asukal, ang pagbubuklod ng mababang DP oligosaccharides sa mga plato ng ELISA ay naging posible, at sa aming pag-aaral ay ginawa ito sa mga plate na pinahiran ng avidin gamit ang mga mAb na naka-target sa glycan.
Pag-screen ng mga monoclonal antibodies batay sa ELISA para sa biotinylated oligosaccharides.Dito (A) ang pinagsamang biotinylation ng oligosaccharides at kasunod na ELISA screening na may glycan-targeted mAbs sa NeutrAvidin coated plates at (B) ay nagpapakita ng isang hakbang na pamamaraan para sa biotinylation ng mga produkto ng reaksyon.
Ang mga plato na pinahiran ng Avidin na may mga oligosaccharide-conjugated antibodies ay pagkatapos ay idinagdag sa pangunahin at pangalawang antibodies at hinugasan sa isang light- at time-sensitive na medium.Matapos makumpleto ang pagbubuklod ng antibody, idagdag ang TMB substrate upang i-incubate ang plato.Ang reaksyon ay sa wakas ay tumigil sa sulfuric acid.Ang mga incubated plate ay nasuri gamit ang isang ELISA reader upang matukoy ang lakas ng pagbubuklod ng bawat antibody upang makita ang antibody-specific na cross-linking.Para sa mga detalye at parameter ng eksperimento, tingnan ang kaukulang seksyong "Mga Materyales at Paraan".
Ipinakita namin ang utility ng bagong binuo na pamamaraan na ito para sa mga tiyak na aplikasyon sa pamamagitan ng pagkilala sa natutunaw na oligosaccharides na naroroon sa ACSH pati na rin sa mga krudo at purified na oligosaccharide na mga fraction na nakahiwalay sa lignoscellulosic hydrolysates.Tulad ng ipinapakita sa Figure 3, ang pinakakaraniwang epitope-substituted xylans na natukoy sa ACSH gamit ang bioacylated glycome assay na pamamaraan ay karaniwang uronic (U) o methyluronic (MeU) at pectic arabinogalactans.Karamihan sa kanila ay natagpuan din sa aming nakaraang pag-aaral sa pagsusuri ng mga glycans ng non-hydrolyzed solids (UHS)43.
Ang pagtuklas ng mga recalcitrant oligosaccharide epitope gamit ang isang monoclonal antibody na nakadirekta sa cell wall glycan.Ang "neutral" na fraction ay ang ACN fraction at ang "acidic" fraction ay ang FA fraction.Ang mas maliwanag na pula sa heatmap ay nagpapahiwatig ng mas mataas na nilalaman ng epitope, at ang mas maliwanag na asul ay nagpapahiwatig ng isang blangkong background.Ang mga halaga ng kulay sa sukat ay batay sa mga hilaw na halaga ng OD para sa mga formulation N=2.Ang mga pangunahing epitope na kinikilala ng mga antibodies ay ipinapakita sa kanan.
Ang mga non-cellulose na istrukturang ito ay hindi ma-cleaved ng mga pinakakaraniwang cellulase at hemicellulase sa nasubok na commercial enzyme mixture, na kinabibilangan ng mga pinakakaraniwang ginagamit na commercial enzymes.Samakatuwid, ang mga bagong auxiliary enzymes ay kinakailangan para sa kanilang hydrolysis.Kung wala ang mga kinakailangang non-cellulose accessory enzymes, ang mga non-cellulose bond na ito ay pumipigil sa kumpletong conversion sa monosaccharides, kahit na ang kanilang mga magulang na sugar polymers ay malawak na na-hydrolyzed sa mas maikling mga fragment at natutunaw gamit ang mga commercial enzyme mixtures.
Ang karagdagang pag-aaral ng pamamahagi ng signal at ang lakas ng pagbubuklod nito ay nagpakita na ang mga nagbubuklod na epitope ay mas mababa sa mataas na DP sugar fractions (A, B, C, DP hanggang 20+) kaysa sa mababang DP fractions (D, E, F, DP) sa mga dimer) (Fig. 1).Ang mga acid fragment ay mas karaniwan sa mga non-cellulose epitope kaysa sa mga neutral na fragment.Ang mga phenomena na ito ay naaayon sa pattern na naobserbahan sa aming nakaraang pag-aaral, kung saan ang mataas na DP at acid moieties ay mas lumalaban sa enzymatic hydrolysis.Samakatuwid, ang pagkakaroon ng mga non-cellulose glycan epitopes at U at MeU substitutions ay maaaring lubos na mag-ambag sa katatagan ng oligosaccharides.Dapat pansinin na ang kahusayan sa pagbubuklod at pagtuklas ay maaaring maging problema para sa mababang DP oligosaccharides, lalo na kung ang epitope ay isang dimeric o trimeric oligosaccharide.Maaari itong masuri gamit ang komersyal na oligosaccharides na may iba't ibang haba, bawat isa ay naglalaman lamang ng isang epitope na nagbubuklod sa isang partikular na mAb.
Kaya, ang paggamit ng mga antibodies na tukoy sa istraktura ay nagsiwalat ng ilang uri ng mga recalcitrant bond.Depende sa uri ng antibody na ginamit, ang naaangkop na pattern ng ligation, at ang lakas ng signal na ginagawa nito (pinakarami at hindi bababa sa sagana), maaaring makilala ang mga bagong enzyme at maidagdag nang semi-quantitative sa pinaghalong enzyme para sa mas kumpletong glycoconversion.Ang pagkuha ng pagsusuri ng ACSH oligosaccharides bilang isang halimbawa, maaari tayong lumikha ng isang database ng mga glycan bond para sa bawat biomass na materyal.Dapat pansinin dito na ang iba't ibang pagkakaugnay ng mga antibodies ay dapat isaalang-alang, at kung ang kanilang pagkakaugnay ay hindi kilala, ito ay lilikha ng ilang mga paghihirap kapag inihambing ang mga signal ng iba't ibang mga antibodies.Bilang karagdagan, ang paghahambing ng mga glycan bond ay maaaring pinakamahusay na gumana sa pagitan ng mga sample para sa parehong antibody.Ang mga matigas na bonong ito ay maaaring maiugnay sa database ng CAZyme, kung saan matutukoy natin ang mga enzyme, pumili ng mga kandidatong enzyme at masuri ang mga enzyme na nakakasira ng bono, o bumuo ng mga microbial system upang ipahayag ang mga enzyme na ito para magamit sa mga biorefinery44.
Upang masuri kung paano umakma ang mga immunological na pamamaraan sa mga alternatibong pamamaraan para sa pagkilala sa mababang molecular weight oligosaccharides na nasa lignoscellulosic hydrolysates, nagsagawa kami ng MALDI (Fig. 4, S1-S8) at pagsusuri ng TMS-derived saccharides batay sa GC-MS sa parehong panel (Fig. 5) na bahagi ng oligosaccharide.Ang MALDI ay ginagamit upang ihambing kung ang mass distribution ng oligosaccharide molecules ay tumutugma sa nilalayon na istraktura.Sa fig.Ipinapakita ng 4 ang MC ng mga neutral na sangkap na ACN-A at ACN-B.Kinumpirma ng pagsusuri ng ACN-A ang isang hanay ng mga pentose sugar mula sa DP 4–8 (Fig. 4) hanggang DP 22 (Fig. S1), na ang mga timbang ay tumutugma sa MeU-xylan oligosaccharides.Kinumpirma ng pagsusuri ng ACN-B ang serye ng pentose at glucoxylan na may DP 8-15.Sa pandagdag na materyal tulad ng Figure S3, ang FA-C acidic moiety mass distribution na mga mapa ay nagpapakita ng hanay ng (Me)U substituted pentose sugars na may DP na 8-15 na pare-pareho sa mga substituted xylan na matatagpuan sa ELISA-based mAb screening.Ang mga epitope ay pare-pareho.
MALDI-MS spectrum ng mga natutunaw na hindi sumusunod na oligosaccharides na nasa ACS.Dito, (A) ACN-A low weight range fractions na naglalaman ng methylated uronic acid (DP 4-8) substituted glucuroxylan oligosaccharides at (B) ACN-B xylan at methylated uronic acid oligosaccharides na pinalitan ng glucuroxylan (DP 8-15).
Pagsusuri ng komposisyon ng glycan residue ng refractory oligosaccharides.Dito (A) TMS saccharide na komposisyon ng iba't ibang mga fraction ng oligosaccharide na nakuha gamit ang pagsusuri ng GC-MS.(B) Mga istruktura ng iba't ibang mga asukal na nagmula sa TMS na nasa oligosaccharides.ACN – acetonitrile fraction na naglalaman ng neutral oligosaccharides at FA – ferulic acid fraction na naglalaman ng acid oligosaccharides.
Ang isa pang kawili-wiling konklusyon ay nakuha mula sa pagsusuri ng LC-MS ng bahagi ng oligosaccharide, tulad ng ipinapakita sa Figure S9 (makikita ang mga pamamaraan sa elektronikong pandagdag na materyal).Ang mga fragment ng hexose at -OAc na mga grupo ay paulit-ulit na naobserbahan sa panahon ng ligation ng ACN-B fraction.Ang paghahanap na ito ay hindi lamang nagpapatunay sa fragmentation na naobserbahan sa pagsusuri ng glycome at MALDI-TOF, ngunit nagbibigay din ng bagong impormasyon tungkol sa mga potensyal na derivatives ng carbohydrate sa pretreated na lignoscellulosic biomass.
Sinuri din namin ang komposisyon ng asukal ng bahagi ng oligosaccharide gamit ang derivatization ng asukal sa TMS.Gamit ang GC-MS, natukoy namin ang komposisyon ng neural (non-derivative) at acidic na asukal (GluA at GalA) sa oligosaccharide fraction (Fig. 5).Ang glucuronic acid ay matatagpuan sa acidic na mga bahagi C at D, habang ang galacturonic acid ay matatagpuan sa acidic na mga bahagi A at B, na parehong mataas ang DP na bahagi ng acidic na asukal.Ang mga resultang ito ay hindi lamang nagpapatunay sa aming data ng ELISA at MALDI, ngunit naaayon din sa aming mga nakaraang pag-aaral ng akumulasyon ng oligosaccharide.Samakatuwid, naniniwala kami na ang mga modernong pamamaraan ng immunological gamit ang biotinylation ng oligosaccharides at kasunod na screening ng ELISA ay sapat na upang makita ang natutunaw na recalcitrant oligosaccharides sa iba't ibang mga biological sample.
Dahil ang mga pamamaraan ng screening ng mAb na nakabase sa ELISA ay napatunayan ng maraming iba't ibang mga pamamaraan, nais naming higit pang galugarin ang potensyal ng bagong pamamaraang dami na ito.Dalawang komersyal na oligosaccharides, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) at 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ay binili at nasubok gamit ang isang bagong diskarte sa mAb na nagta-target sa cell wall glycan.Ipinapakita ng Figure 6 ang isang linear na ugnayan sa pagitan ng biotinylated na nagbubuklod na signal at ang konsentrasyon ng log ng konsentrasyon ng oligosaccharide, na nagmumungkahi ng isang posibleng modelo ng adsorption ng Langmuir.Kabilang sa mga mAb, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, at CCRC-M151 na nauugnay sa XHE, at CCRC-M108, CCRC-M109, at LM11 na nauugnay sa A2XX sa saklaw ng 1 nm hanggang 100 nano.Dahil sa limitadong pagkakaroon ng mga antibodies sa panahon ng eksperimento, ang mga limitadong eksperimento ay isinagawa sa bawat konsentrasyon ng oligosaccharide.Dapat pansinin dito na ang ilang mga antibodies ay lubos na naiiba sa reaksyon sa parehong oligosaccharide bilang isang substrate, marahil dahil sila ay nagbubuklod sa bahagyang magkakaibang mga epitope at maaaring magkaroon ng ibang magkakaibang mga nagbubuklod na affinity.Ang mga mekanismo at implikasyon ng tumpak na pagkilala sa epitope ay magiging mas kumplikado kapag ang bagong diskarte sa mAb ay inilapat sa mga tunay na sample.
Dalawang komersyal na oligosaccharides ang ginamit upang matukoy ang hanay ng pagtuklas ng iba't ibang glycan-targeting mAbs.Dito, ang mga linear na ugnayan na may konsentrasyon ng log ng konsentrasyon ng oligosaccharide ay nagpapahiwatig ng mga pattern ng adsorption ng Langmuir para sa (A) XHE na may mAb at (B) A2XX na may mAb.Ang kaukulang mga epitope ay nagpapahiwatig ng mga istruktura ng komersyal na oligosaccharides na ginamit bilang mga substrate sa assay.
Ang paggamit ng glycan-targeted monoclonal antibodies (glycocomic analysis o ELISA-based mAb screening) ay isang mahusay na tool para sa malalim na paglalarawan ng karamihan sa mga pangunahing cell wall glycans na bumubuo sa biomass ng halaman.Gayunpaman, ang pagsusuri ng klasikal na glycan ay nagpapakilala lamang sa mas malalaking cell wall glycans, dahil ang karamihan sa mga oligosaccharides ay hindi mahusay na hindi kumikilos sa mga plato ng ELISA.Sa pag-aaral na ito, ang AFEX-pretreated corn stover ay enzymatically hydrolyzed sa isang mataas na solids content.Ang pagsusuri ng asukal ay ginamit upang matukoy ang komposisyon ng mga recalcitrant cell wall carbohydrates sa hydrolyzate.Gayunpaman, ang pagsusuri ng mAb ng mas maliit na oligosaccharides sa hydrolysates ay minamaliit, at ang mga karagdagang tool ay kinakailangan upang epektibong i-immobilize ang mga oligosaccharides sa ELISA plates.
Iniuulat namin dito ang isang nobela at mahusay na paraan ng immobilization ng oligosaccharide para sa mAb screening sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng oligosaccharide biotinylation na sinusundan ng ELISA screening sa NeutrAvidin™ coated plates.Ang immobilized biotinylated oligosaccharides ay nagpakita ng sapat na pagkakaugnay para sa antibody upang paganahin ang mabilis at mahusay na pagtuklas ng recalcitrant oligosaccharides.Ang pagsusuri sa komposisyon ng mga matigas na oligosaccharides na ito batay sa mass spectrometry ay nakumpirma ang mga resulta ng bagong diskarte na ito sa immunoscreening.Kaya, ang mga pag-aaral na ito ay nagpapakita na ang kumbinasyon ng oligosaccharide biotinylation at ELISA screening na may glycan-targeted monoclonal antibodies ay maaaring magamit upang makita ang mga crosslink sa oligosaccharides at maaaring malawak na mailapat sa iba pang mga biochemical na pag-aaral na nagpapakilala sa istraktura ng oligosaccharides.
Ang biotin-based glycan profiling method na ito ay ang unang ulat na may kakayahang mag-imbestiga sa mga recalcitrant carbohydrate bond ng natutunaw na oligosaccharides sa biomass ng halaman.Nakakatulong itong maunawaan kung bakit napakatigas ng ulo ng ilang bahagi ng biomass pagdating sa paggawa ng biofuel.Pinupuno ng pamamaraang ito ang isang mahalagang puwang sa mga pamamaraan ng pagsusuri ng glycome at pinalawak ang aplikasyon nito sa isang mas malawak na hanay ng mga substrate na lampas sa mga oligosaccharides ng halaman.Sa hinaharap, maaari kaming gumamit ng robotics para sa biotinylation at gamitin ang paraan na aming binuo para sa high-throughput na pagsusuri ng mga sample gamit ang ELISA.
Ang corn straw (CS) na lumago mula sa Pioneer 33A14 hybrid seeds ay inani noong 2010 mula sa Kramer Farms sa Ray, Colorado.Sa pahintulot ng may-ari ng lupa, ang biomass na ito ay maaaring gamitin para sa pananaliksik. Ang mga sample ay inimbak na tuyo <6% na kahalumigmigan sa mga zip-lock na bag sa temperatura ng silid. Ang mga sample ay inimbak na tuyo <6% na kahalumigmigan sa mga zip-lock na bag sa temperatura ng silid. Образцы хранились сухими при влажности < 6% sa пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. Ang mga sample ay inimbak na tuyo sa <6% na kahalumigmigan sa mga naka-ziper na bag sa temperatura ng silid.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Ang mga sample ay naka-imbak sa mga siper na bag sa temperatura ng silid na may kahalumigmigan <6%.Ang pag-aaral ay sumunod sa lokal at pambansang mga alituntunin.Ang pagsusuri sa komposisyon ay isinagawa gamit ang NREL protocol.Ang komposisyon ay natagpuang naglalaman ng 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% protina at 13. 4% abo.
Ang Cellic® CTec2 (138 mg protein/ml, lot VCNI 0001) ay isang kumplikadong pinaghalong cellulase, β-glucosidase at Cellic® HTec2 (157 mg protein/ml, lot VHN00001) mula sa Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Ang Multifect Pectinase® (72 mg protein/mL), isang kumplikadong timpla ng pectin degrading enzymes, ay naibigay ng DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Ang mga konsentrasyon ng protina ng enzyme ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagtantya ng nilalaman ng protina (at pagbabawas ng kontribusyon ng non-protein nitrogen) gamit ang Kjeldahl nitrogen analysis (AOAC method 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Ang diatomaceous earth 545 ay binili mula sa EMD Millipore (Billerica, MA).Ang activated carbon (DARCO, 100 mesh granules), Avicel (PH-101), beech xylan, at lahat ng iba pang kemikal ay binili mula sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Ang AFEX pretreatment ay isinagawa sa GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Ang pre-treatment ay isinagawa sa 140° C. sa loob ng 15 minuto.46 residence time sa 1:1 ratio ng anhydrous ammonia sa biomass sa 60% (w/w) loading sa isang stainless steel benchtop batch reactor (Parr Instruments Company).Tumagal ng 30 minuto.Ang reactor ay dinala sa 140°C at ang ammonia ay mabilis na inilabas, na nagpapahintulot sa biomass na mabilis na bumalik sa temperatura ng silid.Ang komposisyon ng AFEX pre-treated corn stover (ACS) ay katulad ng sa untreated corn stover (UT-CS).
Ang matataas na solids ACSH 25% (w/w) (humigit-kumulang 8% dextran loading) ay inihanda bilang panimulang materyal para sa malakihang produksyon ng oligosaccharides.Ang enzymatic hydrolysis ng ACS ay isinagawa gamit ang isang komersyal na pinaghalong enzyme kabilang ang Cellic® Ctec2 10 mg protein/g glucan (sa pretreated biomass), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg protein/g glucan, at Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg protina/g dextran.Ang enzymatic hydrolysis ay isinasagawa sa isang 5-litro na bioreactor na may gumaganang dami ng 3 litro, pH 4.8, 50 ° C at 250 rpm.Pagkatapos ng hydrolysis para sa 96 na oras, ang hydrolyzate ay nakolekta sa pamamagitan ng centrifugation sa 6000 rpm para sa 30 minuto at pagkatapos ay sa 14000 rpm para sa 30 minuto upang alisin ang unhydrolysed solids.Ang hydrolyzate ay isinailalim sa sterile filtration sa pamamagitan ng 0.22 mm filter beaker.Ang na-filter na hydrolyzate ay naka-imbak sa mga sterile na bote sa 4° C. at pagkatapos ay na-fraction sa carbon.
Pagsusuri ng komposisyon ng mga sample ng biomass na nakabatay sa extract ayon sa mga pamamaraan ng pagsusuri sa laboratoryo ng NREL: paghahanda ng mga sample para sa pagtatasa ng komposisyon (NREL/TP-510-42620) at pagpapasiya ng mga istrukturang carbohydrate at lignin sa biomass (NREL/TP-510 – 42618)47.
Ang pagsusuri sa oligosaccharide ng hydrolyzate stream ay isinagawa sa isang 2 ml scale gamit ang isang autoclave-based na paraan ng acid hydrolysis.Paghaluin ang hydrolyzate sample na may 69.7 µl ng 72% sulfuric acid sa isang 10 ml screw cap culture tube at i-incubate ng 1 h sa isang benchtop sa 121 °C, palamig sa yelo at salain sa isang high performance liquid chromatography (HPLC) vial .Ang konsentrasyon ng oligosaccharides ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagbabawas ng konsentrasyon ng monosaccharides sa non-hydrolyzed sample mula sa kabuuang konsentrasyon ng asukal sa acid-hydrolyzed sample.
Ang mga konsentrasyon ng glucose, xylose, at arabinose sa acid hydrolysed biomass ay nasuri gamit ang Shimadzu HPLC system na nilagyan ng autosampler, column heater, isocratic pump, at refractive index detector sa isang Bio-Rad Aminex HPX-87H column.Ang haligi ay pinananatili sa 50 ° C at na-eluted na may 0.6 ml / min 5 mM H2SO4 sa tubig.daloy.
Ang hydrolyzate supernatant ay natunaw at nasuri para sa nilalaman ng monomer at oligosaccharide.Ang mga monomeric na asukal na nakuha pagkatapos ng enzymatic hydrolysis ay nasuri ng HPLC na nilagyan ng isang Bio-Rad (Hercules, CA) na haligi ng Aminex HPX-87P at isang haligi ng ash guard.Ang temperatura ng haligi ay pinananatili sa 80 ° C, ang tubig ay ginamit bilang mobile phase na may rate ng daloy na 0.6 ml / min.Ang mga oligosaccharides ay tinutukoy ng hydrolysis sa dilute acid sa 121 ° C ayon sa mga pamamaraan na inilarawan sa ref.41, 48, 49.
Ang pagsusuri sa Saccharide ay isinagawa sa raw, AFEX pre-treated at lahat ng non-hydrolysed biomass residues (kabilang ang produksyon ng mga serial cell wall extract at kanilang mAb screening) gamit ang naunang inilarawan na mga pamamaraan 27, 43, 50, 51 .Para sa pagsusuri ng glycome, ang mga nalalabi na hindi matutunaw sa alkohol ng materyal sa dingding ng cell ng halaman ay inihanda mula sa mga residu ng biomass at sumasailalim sa serial extraction na may mga lalong agresibong reagents tulad ng ammonium oxalate (50 mM), sodium carbonate (50 mM at 0.5% w/v), CON.(1M at 4M, parehong may 1% w/v sodium borohydride) at acid chlorite tulad ng inilarawan dati52,53.Ang mga extract ay isinailalim sa ELISA laban sa isang kumplikadong panel ng mAb50s na nakadirekta sa cell wall glycan, at ang mga reaksyon na nagbubuklod ng mAb ay ipinakita bilang isang mapa ng init.Ang mAbs na nagta-target ng plant cell wall glycan ay binili mula sa mga stock ng laboratoryo (CCRC, JIM at MAC series).
Isang hakbang na biotinylation ng oligosaccharides.Ang conjugation ng carbohydrates na may biotin-LC-hydrazide ay isinagawa gamit ang sumusunod na pamamaraan.Ang biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) ay natunaw sa dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) sa pamamagitan ng masiglang paghalo at pag-init sa 65° C. sa loob ng 1 min.Ang glacial acetic acid (30 µl) ay idinagdag at ang timpla ay ibinuhos sa sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) at ganap na natunaw pagkatapos magpainit sa 65° C. nang humigit-kumulang 1 minuto.Pagkatapos, mula 5 hanggang 8 μl ng pinaghalong reaksyon ay idinagdag sa pinatuyong oligosaccharide (1-100 nmol) upang makakuha ng 10-tiklop o higit pang molar na labis ng label sa ibabaw ng pagbabawas na dulo.Ang reaksyon ay isinasagawa sa 65 ° C para sa 2 h, pagkatapos nito ang mga sample ay agad na nalinis.Walang sodium cyanoborohydride ang ginamit sa mga eksperimento sa pag-label nang walang pagbabawas, at ang mga sample ay na-react sa 65° C. sa loob ng 2.5 oras.
ELISA coating at paghuhugas ng mga sample ng biotinylated oligosaccharides.25 μl ng biotinylated sample (100 μl ng bawat concentrated sample na natunaw sa 5 ml ng 0.1 M Tris buffer solution (TBS)) ay idinagdag sa bawat balon ng avidin-coated plate.Ang mga control well ay pinahiran ng 50 μl ng biotin sa isang konsentrasyon na 10 μg / ml sa 0.1 M TBS.Ang deionized na tubig ay ginamit bilang isang patong para sa mga blangkong sukat.Ang tablet ay incubated para sa 2 oras sa temperatura ng kuwarto sa madilim.Hugasan ang plato ng 3 beses gamit ang 0.1% skimmed milk sa 0.1 M TBS gamit ang program no.11 para sa Grenier flat 3A.
Pagdaragdag at paghuhugas ng mga pangunahing antibodies.Magdagdag ng 40 µl ng pangunahing antibody sa bawat balon.I-incubate ang microplate sa loob ng 1 oras sa temperatura ng kuwarto sa dilim.Pagkatapos ay hinugasan ang mga plato ng 3 beses gamit ang 0.1% na gatas sa 0.1M TBS gamit ang wash program #11 para sa Grenier Flat 3A.
Magdagdag ng pangalawang antibody at hugasan.Magdagdag ng 50 µl ng pangalawang antibody ng mouse/daga (natunaw na 1:5000 sa 0.1% na gatas sa 0.1 M TBS) sa bawat balon.I-incubate ang microplate sa loob ng 1 oras sa temperatura ng kuwarto sa dilim.Ang mga microplate ay hinugasan ng 5 beses gamit ang 0.1% na gatas sa 0.1 M TBS gamit ang Grenier Flat 5A plate wash program #12.
Pagdaragdag ng substrate.Magdagdag ng 50 µl ng 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) sa base substrate (sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 2 patak ng buffer, 3 patak ng TMB, 2 patak ng hydrogen peroxide sa 15 ml ng deionized na tubig).Ihanda ang TMB substrate.at puyo ng tubig bago gamitin).I-incubate ang microplate sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto.Sa dilim.
Kumpletuhin ang hakbang at basahin ang tablet.Magdagdag ng 50 µl ng 1 N sulfuric acid sa bawat balon at itala ang absorbance mula 450 hanggang 655 nm gamit ang ELISA reader.
Maghanda ng 1 mg/ml na solusyon ng mga analyte na ito sa deionized na tubig: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine .(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (panloob na pamantayan).Dalawang pamantayan ang inihanda sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 1 mg/mL na solusyon sa asukal na ipinapakita sa Talahanayan 1. Ang mga sample ay nagyelo at na-lyophilize sa -80° C. hanggang sa maalis ang lahat ng tubig (karaniwan ay mga 12-18 oras).
Magdagdag ng 100–500 µg ng sample sa mga screw cap tube sa isang analytical balance.Itala ang halagang idinagdag.Pinakamainam na matunaw ang sample sa isang tiyak na konsentrasyon ng solvent at idagdag ito sa tubo bilang isang likidong aliquot.Gumamit ng 20 µl ng 1 mg/ml inositol bilang panloob na pamantayan para sa bawat sample tube.Ang halaga ng panloob na pamantayan na idinagdag sa sample ay dapat na kapareho ng halaga ng panloob na pamantayan na idinagdag sa karaniwang tubo.
Magdagdag ng 8 ml ng anhydrous methanol sa isang screw cap vial.Pagkatapos ay 4 ml ng 3 N. methanolic HCl solution, nilagyan ng takip at inalog.Ang prosesong ito ay hindi gumagamit ng tubig.
Magdagdag ng 500 µl ng 1 M HCl methanol solution sa mga sample ng oligosaccharide at karaniwang TMS tubes.Ang mga sample ay incubated magdamag (168 oras) sa 80° C. sa isang thermal block.Patuyuin ang produktong methanolysis sa temperatura ng silid gamit ang drying manifold.Magdagdag ng 200 µl MeOH at patuyuin muli.Ang prosesong ito ay paulit-ulit nang dalawang beses.Magdagdag ng 200 µl ng methanol, 100 µl ng pyridine at 100 µl ng acetic anhydride sa sample at haluing mabuti.Ang mga sample ay natupok sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto.at pinatuyo.Magdagdag ng 200 µl ng methanol at patuyuin muli.
Magdagdag ng 200 µl ng Tri-Sil at magpainit ng tubo sa loob ng 20 minuto.80°C, pagkatapos ay pinalamig sa temperatura ng silid.Gumamit ng drying manifold upang higit pang patuyuin ang sample sa dami na humigit-kumulang 50 µl.Mahalagang tandaan na hindi namin pinahintulutan ang mga sample na ganap na matuyo.
Magdagdag ng 2 ml ng hexane at haluing mabuti sa pamamagitan ng vortexing.Punan ang mga dulo ng Pasteur pipette (5-8 mm) ng isang piraso ng glass wool sa pamamagitan ng pagpasok ng glass wool sa ibabaw ng 5-3/4 inch diameter pipette.Ang mga sample ay na-centrifuge sa 3000 g sa loob ng 2 minuto.Ang anumang hindi matutunaw na nalalabi ay namuo.Patuyuin ang sample sa 100-150 µl.Ang isang dami ng humigit-kumulang 1 μl ay na-injected sa GC-MS sa isang paunang temperatura ng 80 ° C at isang paunang oras ng 2.0 minuto (Talahanayan 2).