Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Metodi ġodda immunoloġiċi u spettrometriċi tal-massa għal analiżi kumplessa ta 'oligosaccharides persistenti fi stover tal-qamħ ittrattat minn qabel b'AFEX.Il-bijomassa lignoċellulożika hija alternattiva sostenibbli għall-fjuwils fossili u tintuża ħafna biex tiżviluppa bijoteknoloġiji għall-produzzjoni ta 'prodotti bħall-ikel, l-għalf, il-fjuwils u l-kimiċi.Iċ-ċavetta għal dawn it-teknoloġiji hija l-iżvilupp ta 'proċessi kost-kompetittivi għall-konverżjoni ta' karboidrati kumplessi preżenti fil-ħitan taċ-ċelluli tal-pjanti f'zokkor sempliċi bħal glukożju, xylose u arabinose.Minħabba li l-bijomassa lignocellulosic hija iebsa ħafna, għandha tkun soġġetta għal trattamenti termokimiċi (eż., tqaxxir tal-fibra tal-ammonja (AFEX), aċidi dilwiti (DA), likwidi joniċi (IL)) u trattamenti bijoloġiċi (eż., idroliżi enżimatika u fermentazzjoni mikrobjali) flimkien biex jinkiseb il-prodott mixtieq..Madankollu, meta enzimi fungali kummerċjali jintużaw fil-proċess ta 'idroliżi, 75-85% biss taz-zokkor li jinħall iffurmat huma monosaccharides, u l-15-25% li jifdal huma oligosaccharides solubbli, intrattabbli, li mhux dejjem huma disponibbli għall-mikro-organiżmi.Preċedentement, aħna rnexxielna iżolati u purifikati oligosakkaridi stubborn solubbli bl-użu ta 'kombinazzjoni ta' separazzjoni tal-karbonju u tad-diatomaceous earth u kromatografija ta 'esklużjoni tad-daqs, u investigajna wkoll il-proprjetajiet inibitorji tal-enżimi tagħhom.Sibna li oligosakkaridi li fihom grad ogħla ta 'polimerizzazzjoni (DP) sostituzzjonijiet ta' aċidu uroniku methylated huma aktar diffiċli biex jiġu pproċessati b'taħlitiet ta 'enżimi kummerċjali minn oligosakkaridi DP baxx u newtrali.Hawnhekk nirrapportaw l-użu ta 'diversi metodi addizzjonali, inkluż il-profiling ta' glycan bl-użu ta 'antikorpi monoklonali (mAbs) speċifiċi għal glycans tal-bijomassa tal-pjanti biex jikkaratterizzaw bonds glycan f'ħitan taċ-ċelluli tal-pjanti u idrolisati enżimatiċi, jonizzazzjoni ta' desorbiment bil-laser assistita minn matriċi, spettrometrija tal-massa tal-ħin tat-titjira..MALDI-TOF-MS) juża qċaċet dijanjostiċi informattivi ta 'struttura miksuba permezz ta' spettroskopija wara tħassir sekondarju ta 'jonji negattivi, kromatografija tal-gass u spettrometrija tal-massa (GC-MS) biex jikkaratterizza bonds oligosakkaridi bi u mingħajr derivatizzazzjoni.Minħabba d-daqs żgħir tal-oligosaccharides (DP 4-20), dawn il-molekuli huma diffiċli biex jintużaw għall-irbit u l-karatterizzazzjoni tal-mAb.Biex negħlbu din il-problema, applikajna metodu ġdid ta 'immobilizzazzjoni tal-oligosakkaridi bbażat fuq il-konjugazzjoni tal-bijotina li ttikkettja b'suċċess il-maġġoranza tal-oligosakkaridi solubbli b'DP baxx fuq il-wiċċ tal-mikroplate, li mbagħad intuża f'sistema mAb ta' throughput għoli għal analiżi ta 'ligazzjoni speċifika.Dan il-metodu ġdid se jiffaċilita l-iżvilupp ta 'assaġġi tal-glikoma ta' throughput għoli aktar avvanzati fil-futur li jistgħu jintużaw biex jiżolaw u jikkaratterizzaw oligosakkaridi preżenti fil-bijomarkaturi għal skopijiet dijanjostiċi.
Il-bijomassa linjoċellulożika, magħmula minn materjali agrikoli, tal-forestrija, tal-ħaxix u tal-injam, hija materja prima potenzjali għall-produzzjoni ta' prodotti b'bażi ​​bijoloġika, inklużi ikel, għalf, fjuwil u prekursuri kimiċi biex jiġu prodotti prodotti ta' valur ogħla1.Karboidrati (bħal ċelluloża u emicellulose) preżenti fil-ħitan taċ-ċelluli tal-pjanti huma depolimerizzati f'monosaccharides permezz ta 'proċessar kimiku u bijotrasformazzjoni (bħal idroliżi enżimatika u fermentazzjoni mikrobjali).Pretrattamenti komuni jinkludu espansjoni tal-fibra tal-ammonja (AFEX), aċidu dilwit (DA), likwidu joniku (IL), u splużjoni tal-fwar (SE), li jużaw taħlita ta 'kimiċi u sħana biex inaqqsu l-produzzjoni tal-linjoċelluloża billi jiftħu l-ħitan taċ-ċelluli tal-pjanti3,4.stubbornness tal-materja, 5. L-idroliżi enżimatika titwettaq b'tagħbija għolja ta' solidi bl-użu ta' enzimi kummerċjali attivi li fihom karboidrati (CAZymes) u fermentazzjoni mikrobjali bl-użu ta' ħmira jew batterji transġeniċi biex jipproduċu fjuwils u kimiċi b'bażi ​​bijoloġika 6 .
CAZymes f'enzimi kummerċjali huma komposti minn taħlita kumplessa ta' enzimi li b'mod sinerġiku jaqbdu rabtiet kumplessi ta' karboidrati-zokkor biex jiffurmaw monosaccharides2,7.Kif irrapurtajna qabel, in-netwerk kumpless ta 'polimeri aromatiċi ta' lignin bil-karboidrati jagħmilhom intrattabbli ħafna, li jwassal għal konverżjoni mhux kompluta taz-zokkor, li jakkumula 15-25% ta 'oligosakkaridi sesswali li mhumiex prodotti waqt idroliżi enżimatika tal-bijomassa pretrattata.Din hija problema komuni b'diversi metodi ta 'pretrattament tal-bijomassa.Xi raġunijiet għal dan il-konġestjoni jinkludu l-inibizzjoni tal-enżimi waqt l-idroliżi, jew in-nuqqas jew il-livelli baxxi ta 'enzimi essenzjali essenzjali li huma meħtieġa biex jiksru r-rabtiet taz-zokkor fil-bijomassa tal-pjanti.Il-fehim tal-kompożizzjoni u l-karatteristiċi strutturali taz-zokkor, bħall-bonds taz-zokkor fl-oligosakkaridi, se jgħinna ntejbu l-konverżjoni taz-zokkor waqt l-idroliżi, u jagħmlu l-proċessi bijoteknoloġiċi kost-kompetittivi mal-prodotti derivati ​​miż-żejt.
Id-determinazzjoni tal-istruttura tal-karboidrati hija ta 'sfida u teħtieġ taħlita ta' metodi bħal kromatografija likwida (LC)11,12, spettroskopija ta 'reżonanza manjetika nukleari (NMR)13, elettroforeżi kapillari (CE)14,15,16 u spettrometrija tal-massa (MS)17.,tmintax.Metodi MS bħall-ispettrometrija tal-massa tal-ħin tat-titjira b'desorbiment bil-lejżer u jonizzazzjoni bl-użu ta 'matriċi (MALDI-TOF-MS) huma metodu versatili għall-identifikazzjoni ta' strutturi tal-karboidrati.Riċentement, l-MS tandem tad-Dissoċjazzjoni Indotta minn Ħabtiet (CID) ta 'adducts tal-jone tas-sodju intuża l-aktar biex jidentifika marki tas-swaba' li jikkorrispondu għal pożizzjonijiet ta 'twaħħil ta' oligosaccharide, konfigurazzjonijiet anomeriċi, sekwenzi u pożizzjonijiet ta 'fergħat 20, 21.
L-analiżi tal-glycan hija għodda eċċellenti għall-identifikazzjoni fil-fond tal-bonds tal-karboidrati22.Dan il-metodu juża antikorpi monoklonali (mAbs) diretti lejn glycan tal-ħajt taċ-ċelluli tal-pjanti bħala sondi biex jifhmu r-rabtiet kumplessi tal-karboidrati.Aktar minn 250 mAbs huma disponibbli madwar id-dinja, iddisinjati kontra diversi oligosakkaridi lineari u ramifikati li jużaw diversi saccharides24.Diversi mAbs intużaw ħafna biex jikkaratterizzaw l-istruttura, il-kompożizzjoni u l-modifiki tal-ħajt taċ-ċelluli tal-pjanti, peress li hemm differenzi sinifikanti skont it-tip taċ-ċelluli tal-pjanti, l-organu, l-età, l-istadju tal-iżvilupp u l-ambjent tat-tkabbir25,26.Aktar reċentement, dan il-metodu intuża biex jifhem il-popolazzjonijiet tal-vesikuli fis-sistemi tal-pjanti u l-annimali u r-rwoli rispettivi tagħhom fit-trasport tal-glycan kif determinat minn markaturi subċellulari, stadji ta 'żvilupp, jew stimuli ambjentali, u biex jiddeterminaw attività enżimatika.Uħud mill-istrutturi differenti ta 'glycans u xylans li ġew identifikati jinkludu pektin (P), xylan (X), mannan (M), xyloglucans (XylG), glucans ta' bond imħallta (MLG), arabinoxylan (ArbX), galactomannan (GalG), glucuronic acid-arabinoxylan (GArbX) u arabino-Galactan (ArbX)2.
Madankollu, minkejja dawn l-isforzi kollha ta 'riċerka, ftit studji biss iffokaw fuq in-natura ta' akkumulazzjoni ta 'oligosaccharide waqt idroliżi ta' tagħbija għolja ta 'solidi (HSL), inkluż ir-rilaxx ta' oligosaccharide, bidliet fit-tul tal-katina oligomerika matul l-idroliżi, diversi polimeri DP baxxi, u l-kurvi tagħhom.distribuzzjonijiet 30,31,32.Sadanittant, għalkemm l-analiżi tal-glycan wriet li hija għodda utli għal analiżi komprensiva tal-istruttura tal-glycan, huwa diffiċli li jiġu evalwati oligosaccharides DP baxx li jinħall fl-ilma bl-użu ta 'metodi ta' antikorpi.Oligosaccharides DP iżgħar b'piż molekulari ta 'inqas minn 5-10 kDa ma jorbtux mal-pjanċi ELISA 33, 34 u jinħaslu qabel iż-żieda ta' l-antikorpi.
Hawnhekk, għall-ewwel darba, aħna nuru analiżi ELISA fuq pjanċi miksija b'avidin bl-użu ta 'antikorpi monoklonali, li tgħaqqad proċedura ta' bijotinilazzjoni f'pass wieħed għal oligosakkaridi refrattarji solubbli b'analiżi tal-glicome.L-approċċ tagħna għall-analiżi tal-glicome ġie vvalidat minn analiżi bbażata fuq MALDI-TOF-MS u GC-MS ta 'rabtiet oligosakkaridi komplementari bl-użu ta' derivatizzazzjoni ta 'trimethylsilyl (TMS) ta' kompożizzjonijiet taz-zokkor idrolizzat.Dan l-approċċ innovattiv jista' jiġi żviluppat bħala metodu ta' prestazzjoni għolja fil-futur u jsib applikazzjoni usa' fir-riċerka bijomedika35.
Modifiki ta 'wara t-traduzzjoni ta' enżimi u antikorpi, bħal glycosylation,36 jaffettwaw l-attività bijoloġika tagħhom.Pereżempju, bidliet fil-glikosilazzjoni tal-proteini tas-serum għandhom rwol importanti fl-artrite infjammatorja, u bidliet fil-glikosilazzjoni huma użati bħala markaturi dijanjostiċi37.Ġew irrappurtati diversi glycans fil-letteratura li jidhru faċilment f'varjetà ta 'mard, inkluż mard infjammatorju kroniku tal-passaġġ gastrointestinali u tal-fwied, infezzjonijiet virali, kanċer tal-ovarji, tas-sider u tal-prostata38,39,40.Il-fehim tal-istruttura ta 'glycans bl-użu ta' metodi ta 'glycan ELISA bbażati fuq antikorpi se jipprovdi kunfidenza addizzjonali fid-dijanjosi tal-mard mingħajr l-użu ta' metodi MS kumplessi.
L-istudju preċedenti tagħna wera li oligosakkaridi stubborn baqgħu mhux idrolizzati wara trattament minn qabel u idroliżi enżimatika (Figura 1).Fix-xogħol ippublikat qabel tagħna, żviluppajna metodu ta 'estrazzjoni ta' faħam solidu attivat biex tiżola oligosakkaridi minn idrolizzat stover tal-qamħirrum trattat minn qabel (ACSH)8 AFEX.Wara l-estrazzjoni u s-separazzjoni inizjali, l-oligosakkaridi ġew frazzjonati aktar bil-kromatografija tal-esklużjoni tad-daqs (SEC) u miġbura f'ordni tal-piż molekulari.Il-monomeri taz-zokkor u l-oligomeri rilaxxati minn diversi trattamenti minn qabel ġew analizzati b'analiżi tal-kompożizzjoni taz-zokkor.Meta tqabbel il-kontenut ta 'oligomeri taz-zokkor miksuba b'diversi metodi ta' trattament minn qabel, il-preżenza ta 'oligosaccharides stubborn hija problema komuni fil-konverżjoni tal-bijomassa għal monosaccharides u tista' twassal għal tnaqqis fir-rendiment taz-zokkor ta 'mill-inqas 10-15% u anke sa 18%.L-Istati Uniti.Dan il-metodu huwa użat għal aktar produzzjoni fuq skala kbira ta 'frazzjonijiet oligosaccharide.L-ACH li rriżulta u l-frazzjonijiet sussegwenti tiegħu b'piżijiet molekulari differenti intużaw bħala materjal sperimentali għall-karatterizzazzjoni tal-oligosaccharides f'dan ix-xogħol.
Wara trattament minn qabel u idroliżi enżimatika, oligosakkaridi persistenti baqgħu mhux idrolizzati.Hawnhekk (A) huwa metodu ta 'separazzjoni ta' oligosakkaridi li fih oligosakkaridi huma iżolati minn idrolizzat stover tal-qamħirrum trattat minn qabel (ACSH) bl-użu ta 'sodda ippakkjata ta' karbonju attivat u earth diatomaceous;(B) Metodu għas-separazzjoni tal-oligosaccharides.L-oligosaccharides ġew separati aktar permezz ta' kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs (SEC);(C) Monomeri u oligomeri tas-sakkaridi rilaxxati minn diversi trattamenti minn qabel (aċidu dilwit: DA, likwidu joniku: IL u AFEX).Kundizzjonijiet ta 'idroliżi enżimatika: tagħbija ta' solidi għolja ta '25% (w/w) (bejn wieħed u ieħor 8% ta' tagħbija ta 'glucan), 96 siegħa idroliżi, tagħbija ta' enzima kummerċjali ta '20 mg/g (proporzjon Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) u (D) Monomeri taz-zokkor u oligomeri ta' glucose, xylosed pre-rilaxxat minn glucose, EX xylose corn rilaxx minn arabinose-Stod AC).
L-analiżi tal-glycan uriet li hija għodda utli għal analiżi strutturali komprensiva tal-glycans f'estratti iżolati minn residwi solidi tal-bijomassa.Madankollu, sakkaridi li jinħallu fl-ilma huma sottorappreżentati bl-użu ta 'dan il-metodu tradizzjonali41 minħabba li oligosakkaridi ta' piż molekulari baxx huma diffiċli biex jiġu immobilizzati fuq pjanċi ELISA u jinħaslu qabel iż-żieda tal-antikorpi.Għalhekk, għall-irbit u l-karatterizzazzjoni tal-antikorpi, intuża metodu ta 'bijotinilazzjoni f'pass wieħed biex jiksi oligosakkaridi li jinħallu u mhux konformi fuq pjanċi ELISA miksija b'avidin.Dan il-metodu ġie ttestjat bl-użu tal-ACSH prodott qabel tagħna u frazzjoni bbażata fuq il-piż molekulari tiegħu (jew il-grad ta 'polimerizzazzjoni, DP).Il-bijotinilazzjoni f'pass wieħed intuża biex tiżdied l-affinità tal-irbit tal-oligosaccharide billi żżid il-bijotin-LC-hydrazide mat-tarf li jnaqqas il-karboidrat (Fig. 2).F'soluzzjoni, il-grupp hemiacetal fit-tarf li jnaqqas jirreaġixxi mal-grupp hydrazide ta 'biotin-LC-hydrazide biex jifforma bond hydrazone.Fil-preżenza tal-aġent li jnaqqas NaCNBH3, ir-rabta hydrazone titnaqqas għal prodott finali bijotinilat stabbli.Bil-modifika tat-tarf li jnaqqas iz-zokkor, it-twaħħil ta 'oligosaccharides DP baxxi ma' pjanċi ELISA sar possibbli, u fl-istudju tagħna dan sar fuq pjanċi miksija b'avidin bl-użu ta 'mAbs immirati għal glycan.
Skrinjar ta' antikorpi monoklonali bbażati fuq ELISA għal oligosakkaridi bijotinilati.Hawnhekk (A) bijotinilazzjoni magħquda ta 'oligosaccharides u screening ELISA sussegwenti b'mAbs immirati għal glycan fuq pjanċi miksija NeutrAvidin u (B) turi proċedura ta' pass wieħed għall-bijotinilazzjoni ta 'prodotti ta' reazzjoni.
Pjanċi miksija b'avidin b'antikorpi konjugati bl-oligosaccharide imbagħad ġew miżjuda ma 'antikorpi primarji u sekondarji u maħsula f'mezz sensittiv għad-dawl u l-ħin.Wara li l-irbit tal-antikorpi jkun tlesta, żid is-sottostrat TMB biex inkuba l-pjanċa.Ir-reazzjoni kienet finalment waqfet bl-aċidu sulfuriku.Il-pjanċi inkubati ġew analizzati bl-użu ta 'qarrej ELISA biex tiddetermina s-saħħa ta' rbit ta 'kull antikorp biex tiskopri cross-linking speċifiku għall-antikorpi.Għad-dettalji u l-parametri tal-esperiment, ara t-taqsima korrispondenti "Materjali u Metodi".
Aħna nuru l-utilità ta 'dan il-metodu żviluppat ġdid għal applikazzjonijiet speċifiċi billi nikkaratterizzaw l-oligosaccharides solubbli preżenti f'ACSH kif ukoll fi frazzjonijiet ta' oligosaccharide mhux raffinati u purifikati iżolati minn idrolisati lignoċellulożiċi.Kif muri fil-Figura 3, l-aktar komuni xylans sostitwiti bl-epitopi identifikati f'ACSH bl-użu ta 'metodi ta' analiżi tal-glyccome bijoaċilat huma ġeneralment uroniċi (U) jew methyluronic (MeU) u pectic arabinogalactans.Ħafna minnhom instabu wkoll fl-istudju preċedenti tagħna dwar l-analiżi ta 'glycans ta' solidi mhux idrolizzati (UHS)43.
Sejbien ta' epitopi oligosakkaridi rekalċitranti bl-użu ta' antikorp monoklonali dirett lejn il-glikan tal-ħajt taċ-ċellula.Il-frazzjoni "newtrali" hija l-frazzjoni ACN u l-frazzjoni "aċiduża" hija l-frazzjoni FA.Ħomor isbaħ fuq il-mappa tas-sħana jindikaw kontenut ogħla ta 'epitopi, u blu isbaħ jindika sfond vojt.Il-valuri tal-kulur fuq l-iskala huma bbażati fuq valuri OD mhux maħduma għal formulazzjonijiet N=2.L-epitopi ewlenin rikonoxxuti mill-antikorpi huma murija fuq il-lemin.
Dawn l-istrutturi mhux taċ-ċelluloża ma setgħux jiġu mqassma mill-aktar ċellulases u hemicellulases komuni fit-taħlita ta 'enżimi kummerċjali ttestjati, li tinkludi l-enzimi kummerċjali l-aktar użati b'mod komuni.Għalhekk, huma meħtieġa enzimi awżiljarji ġodda għall-idroliżi tagħhom.Mingħajr l-enzimi aċċessorji mhux taċ-ċelluloża meħtieġa, dawn ir-rabtiet mhux taċ-ċelluloża jipprevjenu l-konverżjoni sħiħa għal monosaccharides, anke jekk il-polimeri taz-zokkor ġenitur tagħhom jiġu idrolizzati b'mod estensiv fi frammenti iqsar u maħlula bl-użu ta 'taħlitiet ta' enżimi kummerċjali.
Studju ulterjuri tad-distribuzzjoni tas-sinjal u s-saħħa ta 'l-irbit tiegħu wera li l-epitopi li jorbtu kienu aktar baxxi fi frazzjonijiet ta' zokkor DP għoli (A, B, C, DP sa 20+) milli fi frazzjonijiet DP baxxi (D, E, F, DP) f'dimeri) (Fig. 1).Frammenti ta 'aċidu huma aktar komuni f'epitopi mhux taċ-ċelluloża minn frammenti newtrali.Dawn il-fenomeni huma konsistenti mal-mudell osservat fl-istudju preċedenti tagħna, fejn DP għoli u porzjonijiet ta 'aċidu kienu aktar reżistenti għall-idroliżi enżimatika.Għalhekk, il-preżenza ta 'epitopi glycan mhux taċ-ċelluloża u sostituzzjonijiet U u MeU jistgħu jikkontribwixxu ħafna għall-istabbiltà tal-oligosakkaridi.Għandu jiġi nnutat li l-effiċjenza tal-irbit u l-iskoperta tista 'tkun problematika għal oligosaccharides DP baxx, speċjalment jekk l-epitope huwa oligosaccharide dimeriku jew trimeriku.Dan jista 'jiġi ttestjat bl-użu ta' oligosakkaridi kummerċjali ta 'tulijiet differenti, kull wieħed ikun fih epitope wieħed biss li jingħaqad ma' mAb speċifiku.
Għalhekk, l-użu ta 'antikorpi speċifiċi għall-istruttura żvela ċerti tipi ta' bonds rekalċitranti.Skont it-tip ta 'antikorp użat, il-mudell ta' ligation xieraq, u s-saħħa tas-sinjal li jipproduċi (l-aktar u l-inqas abbundanti), enzimi ġodda jistgħu jiġu identifikati u miżjuda b'mod semi-kwantitattiv mat-taħlita tal-enżimi għal glycoconversion aktar kompleta.Nieħdu l-analiżi tal-oligosakkaridi ACSH bħala eżempju, nistgħu noħolqu database ta 'bonds glycan għal kull materjal tal-bijomassa.Għandu jiġi nnutat hawnhekk li għandha titqies l-affinità differenti tal-antikorpi, u jekk l-affinità tagħhom mhix magħrufa, dan joħloq ċerti diffikultajiet meta jitqabblu s-sinjali ta 'antikorpi differenti.Barra minn hekk, il-paragun tal-bonds tal-glycan jista 'jaħdem l-aħjar bejn kampjuni għall-istess antikorp.Dawn ir-rabtiet iebsa jistgħu mbagħad jiġu konnessi mad-database CAZyme, li minnha nistgħu nidentifikaw l-enzimi, nagħżlu enzimi kandidati u nittestjaw għal enzimi li jkissru bonds, jew niżviluppaw sistemi mikrobjali biex jesprimu dawn l-enzimi għall-użu fil-bijoraffineriji44.
Biex tevalwa kif metodi immunoloġiċi jikkumplimentaw metodi alternattivi għall-ikkaratterizzazzjoni ta 'oligosaccharides ta' piż molekulari baxx preżenti f'idrolisati lignocellulosic, wettaqna MALDI (Fig. 4, S1-S8) u analiżi ta 'sakkaridi derivati ​​minn TMS ibbażati fuq GC-MS fuq l-istess panel (Fig. 5) oligosaccharide parti.MALDI jintuża biex iqabbel jekk id-distribuzzjoni tal-massa tal-molekuli oligosaccharide taqbilx mal-istruttura maħsuba.Fuq il-fig.4 juri l-MC tal-komponenti newtrali ACN-A u ACN-B.Analiżi ACN-A kkonfermat firxa ta 'zokkor pentose li jvarjaw minn DP 4-8 (Fig. 4) sa DP 22 (Fig. S1), li l-piżijiet tagħhom jikkorrispondu għal MeU-xylan oligosaccharides.L-analiżi ACN-B ikkonfermat is-serje pentose u glucoxylan b'DP 8-15.F'materjal supplimentari bħall-Figura S3, il-mapep tad-distribuzzjoni tal-massa tal-parti aċiduża FA-C juru firxa ta 'zokkor pentose sostitwit (Me)U b'DP ta' 8-15 li huma konsistenti mal-xylans sostitwiti misjuba fl-iskrinjar tal-mAb ibbażat fuq ELISA.L-epitopi huma konsistenti.
Spettru MALDI-MS ta 'oligosaccharides solubbli mhux konformi preżenti fl-ACS.Hawnhekk, (A) frazzjonijiet ta 'firxa ta' piż baxx ACN-A li fihom aċidu uroniku methylated (DP 4-8) glucuroxylan oligosaccharides sostitwiti u (B) ACN-B xylan u oligosaccharides aċidu uroniku methylated sostitwiti b'glucuroxylan (DP 8-15).
Analiżi tal-kompożizzjoni tar-residwu ta 'glycan ta' oligosaccharides refrattorji.Hawnhekk (A) TMS saccharide kompożizzjoni ta 'diversi frazzjonijiet oligosaccharide miksuba bl-użu ta' analiżi GC-MS.(B) Strutturi ta 'diversi zokkor derivati ​​minn TMS preżenti fl-oligosaccharides.ACN – frazzjoni tal-aċetonitrile li fiha oligosakkaridi newtrali u FA – frazzjoni tal-aċidu ferulic li fiha oligosakkaridi tal-aċidu.
Inġibdet konklużjoni interessanti oħra mill-analiżi LC-MS tal-frazzjoni oligosaccharide, kif muri fil-Figura S9 (il-metodi jistgħu jidhru fil-materjal supplimentari elettroniku).Frammenti ta 'gruppi hexose u -OAc ġew osservati ripetutament waqt il-ligazzjoni tal-frazzjoni ACN-B.Din is-sejba mhux biss tikkonferma l-frammentazzjoni osservata fl-analiżi tal-glyccome u MALDI-TOF, iżda tipprovdi wkoll informazzjoni ġdida dwar derivattivi potenzjali tal-karboidrati fil-bijomassa lignocellulosic ittrattata minn qabel.
Aħna analizzat ukoll il-kompożizzjoni taz-zokkor tal-frazzjoni oligosaccharide bl-użu tad-derivalizzazzjoni taz-zokkor TMS.Bl-użu GC-MS, iddeterminajna l-kompożizzjoni ta 'zokkor newrali (mhux derivati) u aċidużi (GluA u GalA) fil-frazzjoni oligosaccharide (Fig. 5).L-aċidu glukuroniku jinsab fil-komponenti aċidużi Ċ u D, filwaqt li l-aċidu galacturonic jinstab fil-komponenti aċidużi A u B, li t-tnejn huma komponenti DP għolja ta 'zokkor aċiduż.Dawn ir-riżultati mhux biss jikkonfermaw id-dejta ELISA u MALDI tagħna, iżda huma wkoll konsistenti mal-istudji preċedenti tagħna tal-akkumulazzjoni tal-oligosaccharide.Għalhekk, aħna nemmnu li metodi immunoloġiċi moderni li jużaw bijotinilazzjoni ta 'oligosakkaridi u screening ELISA sussegwenti huma biżżejjed biex jiskopru oligosakkaridi rekalċitranti solubbli f'diversi kampjuni bijoloġiċi.
Peress li l-metodi ta 'screening ta' mAb ibbażati fuq ELISA ġew ivvalidati b'diversi metodi differenti, ridna nesploraw aktar il-potenzjal ta 'dan il-metodu kwantitattiv ġdid.Żewġ oligosaccharides kummerċjali, xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) u 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX), ġew mixtrija u ttestjati bl-użu ta 'approċċ ġdid ta' mAb immirat lejn il-glycan tal-ħajt taċ-ċellula.Il-Figura 6 turi korrelazzjoni lineari bejn is-sinjal tal-irbit bijotinilat u l-konċentrazzjoni log tal-konċentrazzjoni tal-oligosaccharide, li tissuġġerixxi mudell ta 'adsorbiment Langmuir possibbli.Fost l-mAbs, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148, u CCRC-M151 korrelatati ma 'XHE, u CCRC-M108, CCRC-M109, u LM11 korrelatati ma' A2XX fuq medda ta '1 nm sa 100 nano.Minħabba d-disponibbiltà limitata ta 'antikorpi matul l-esperiment, saru esperimenti limitati b'kull konċentrazzjoni ta' oligosaccharide.Għandu jiġi nnutat hawnhekk li xi antikorpi jirreaġixxu b'mod differenti ħafna għall-istess oligosaccharide bħala substrat, preżumibbilment minħabba li jorbtu ma 'epitopi kemmxejn differenti u jista' jkollhom affinitajiet ta 'rbit differenti ħafna.Il-mekkaniżmi u l-implikazzjonijiet ta 'identifikazzjoni preċiża tal-epitopi se jkunu ħafna aktar kumplessi meta l-approċċ il-ġdid tal-mAb jiġi applikat għal kampjuni reali.
Żewġ oligosaccharides kummerċjali ġew użati biex jiddeterminaw il-firxa ta 'skoperta ta' diversi mAbs li jimmiraw il-glycan.Hawnhekk, korrelazzjonijiet lineari mal-konċentrazzjoni log tal-konċentrazzjoni ta 'oligosaccharide jindikaw mudelli ta' assorbiment ta 'Langmuir għal (A) XHE b'mAb u (B) A2XX b'mAb.L-epitopi korrispondenti jindikaw l-istrutturi tal-oligosaccharides kummerċjali użati bħala sottostrati fl-assaġġ.
L-użu ta 'antikorpi monoklonali mmirati lejn glycan (analiżi glikokomika jew screening mAb ibbażat fuq ELISA) huwa għodda qawwija għall-karatterizzazzjoni fil-fond tal-biċċa l-kbira tal-glikani ewlenin tal-ħajt taċ-ċelluli li jiffurmaw il-bijomassa tal-pjanti.Madankollu, l-analiżi tal-glycan klassika tikkaratterizza biss glycans akbar tal-ħajt taċ-ċelluli, peress li l-biċċa l-kbira tal-oligosakkaridi mhumiex immobilizzati b'mod effiċjenti fuq pjanċi ELISA.F'dan l-istudju, stover tal-qamħirrum trattat minn qabel AFEX ġie idrolizzat b'mod enżimatiku b'kontenut għoli ta 'solidi.Analiżi taz-zokkor intużat biex tiddetermina l-kompożizzjoni tal-karboidrati tal-ħajt taċ-ċelluli rekalċitranti fl-idrolizzat.Madankollu, l-analiżi mAb ta 'oligosaccharides iżgħar fl-idrolisati hija sottovalutata, u huma meħtieġa għodod addizzjonali biex jimmobilizzaw b'mod effettiv oligosaccharides fuq pjanċi ELISA.
Aħna nirrapportaw hawnhekk metodu ta 'immobilizzazzjoni ġdid u effiċjenti ta' oligosaccharide għall-iskrinjar tal-mAb billi nikkombinaw il-bijotinilazzjoni tal-oligosaccharide segwita minn screening ELISA fuq pjanċi miksija NeutrAvidin™.L-oligosakkaridi bijotinilati immobilizzati wrew affinità suffiċjenti għall-antikorp biex jippermettu skoperta rapida u effiċjenti ta 'oligosakkaridi rikalċitranti.Analiżi tal-kompożizzjoni ta 'dawn l-oligosakkaridi stubborn ibbażati fuq spettrometrija tal-massa kkonfermat ir-riżultati ta' dan l-approċċ ġdid għall-immunoscreening.Għalhekk, dawn l-istudji juru li l-kombinazzjoni ta 'biotinylation oligosaccharide u screening ELISA ma' antikorpi monoklonali mmirati lejn glycan jistgħu jintużaw biex jiskopru crosslinks fl-oligosaccharides u jistgħu jiġu applikati b'mod wiesa 'fi studji bijokimiċi oħra li jikkaratterizzaw l-istruttura ta' oligosaccharides.
Dan il-metodu ta 'profiling ta' glycan ibbażat fuq il-bijotina huwa l-ewwel rapport kapaċi jinvestiga r-rabtiet ta 'karboidrati rekalċitranti ta' oligosakkaridi solubbli fil-bijomassa tal-pjanti.Dan jgħin biex wieħed jifhem għaliex xi partijiet tal-bijomassa huma tant iebsa meta niġu għall-produzzjoni tal-bijofjuwil.Dan il-metodu jimla vojt importanti fil-metodi ta 'analiżi tal-glicome u jestendi l-applikazzjoni tiegħu għal firxa usa' ta 'sottostrati lil hinn mill-oligosakkaridi tal-pjanti.Fil-ġejjieni, nistgħu nużaw ir-robotika għall-bijotinilazzjoni u nużaw il-metodu li żviluppajna għal analiżi ta 'rendiment għoli ta' kampjuni bl-użu ta 'ELISA.
It-tiben tal-qamħirrum (CS) imkabbar minn żrieragħ ibridi Pioneer 33A14 inħasad fl-2010 minn Kramer Farms f'Ray, Colorado.Bil-permess tas-sid tal-art, din il-bijomassa tista’ tintuża għar-riċerka. Il-kampjuni ġew maħżuna niexfa < 6% umdità f'boroż zip-lock f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni ġew maħżuna niexfa < 6% umdità f'boroż zip-lock f'temperatura tal-kamra. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтнат. Il-kampjuni ġew maħżuna niexfa f'umdità <6% f'boroż biż-żippijiet f'temperatura tal-kamra.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Il-kampjuni jinħażnu f'boroż biż-żippijiet f'temperatura tal-kamra b'umdità < 6%.L-istudju kien konformi mal-linji gwida lokali u nazzjonali.L-analiżi tal-kompożizzjoni saret bl-użu tal-protokoll NREL.Il-kompożizzjoni nstabet li fiha 31.4% glucan, 18.7% xylan, 3.3% arabinan, 1.2% galactan, 2.2% acetyl, 14.3% lignin, 1.7% proteina u 13.4% irmied.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, lott VCNI 0001) hija taħlita kumplessa ta 'cellulase, β-glucosidase u Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, lott VHN00001) minn Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), taħlita kumplessa ta 'enzimi degradanti tal-pectin, ġiet mogħtija minn DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini tal-enżimi ġew determinati billi jiġi stmat il-kontenut tal-proteini (u titnaqqas il-kontribuzzjoni tan-nitroġenu mhux tal-proteini) bl-użu tal-analiżi tan-nitroġenu Kjeldahl (metodu AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).L-art tad-dijatoma 545 inxtrat minn EMD Millipore (Billerica, MA).Karbonju attivat (DARCO, granuli ta 'malji 100), Avicel (PH-101), xylan tal-fagu, u l-kimiċi l-oħra kollha nxtraw minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
It-trattament minn qabel AFEX sar fi GLBRC (Laboratorju ta 'Riċerka dwar il-Konverżjoni tal-Bijomassa, MSU, Lansing, MI, USA).It-trattament minn qabel sar f'140° C għal 15-il minuta.46 ħin ta 'residenza fi proporzjon ta' 1:1 ta 'ammonja anidruża għal bijomassa f'tagħbija ta' 60% (w/w) f'reattur tal-lott tal-bank tal-istainless steel (Parr Instruments Company).Ħadu 30 minuta.Ir-reattur tressaq għal 140 ° C u l-ammonja ġiet rilaxxata malajr, u ppermettiet li l-bijomassa terġa 'lura malajr għat-temperatura tal-kamra.Il-kompożizzjoni ta 'stuker tal-qamħirrum AFEX ittrattat minn qabel (ACS) kienet simili għal dik ta' stover tal-qamħirrum mhux ittrattat (UT-CS).
Solidi għoljin ACSH 25% (w/w) (bejn wieħed u ieħor 8% tagħbija ta 'dextran) kien ippreparat bħala materjal tal-bidu għall-produzzjoni fuq skala kbira ta' oligosaccharides.L-idroliżi enżimatika ta 'ACS twettqet bl-użu ta' taħlita ta 'enżimi kummerċjali inkluż Cellic® Ctec2 10 mg proteina / g glucan (f'bijomassa pretrattata), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina / g glucan, u Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteina/g dextran.L-idroliżi enżimatika twettqet f'bijoreattur ta '5 litri b'volum tax-xogħol ta' 3 litri, pH 4.8, 50 ° C u 250 rpm.Wara l-idroliżi għal 96 siegħa, l-idrolizzat inġabar permezz ta’ ċentrifugazzjoni f’6000 rpm għal 30 minuta u mbagħad f’14000 rpm għal 30 minuta biex jitneħħew solidi mhux idrolizzati.L-idrolizzat imbagħad ġie soġġett għal filtrazzjoni sterili permezz ta 'beaker tal-filtru ta' 0.22 mm.L-idrolizzat iffiltrat kien maħżun fi fliexken sterili f'4° C. u mbagħad frazzjonat fuq il-karbonju.
Analiżi tal-kompożizzjoni ta’ kampjuni ta’ bijomassa bbażati fuq estratt skont proċeduri ta’ analiżi tal-laboratorju NREL: preparazzjoni ta’ kampjuni għall-analiżi tal-kompożizzjoni (NREL/TP-510-42620) u determinazzjoni ta’ karboidrati strutturali u lignin fil-bijomassa (NREL/TP-510 – 42618)47.
L-analiżi ta 'l-oligosaccharide tan-nixxiegħa ta' idrolizzat saret fuq skala ta '2 ml bl-użu ta' metodu ta 'idroliżi ta' l-aċidu bbażat fuq awtoklavi.Ħallat il-kampjun ta' idrolizzat ma' 69.7 µl ta' 72% aċidu sulfuriku f'tubu ta' kultura ta' 10 ml bil-kamin u inkuba għal 1 siegħa fuq benchtop f'121 °C, kessaħ fuq is-silġ u ffiltra f'kunjett ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC).Il-konċentrazzjoni ta 'oligosaccharides ġiet iddeterminata billi titnaqqas il-konċentrazzjoni ta' monosaccharides fil-kampjun mhux idrolizzat mill-konċentrazzjoni totali taz-zokkor fil-kampjun idrolizzat bl-aċidu.
Il-konċentrazzjonijiet ta 'glukożju, xylose, u arabinose fil-bijomassa idrolizzata bl-aċidu ġew analizzati bl-użu ta' sistema HPLC Shimadzu mgħammra b'autosampler, heater tal-kolonna, pompa iżokratika, u detector ta 'indiċi rifrattiv fuq kolonna Bio-Rad Aminex HPX-87H.Il-kolonna nżammet f'50°C u ġiet elużita b'0.6 ml/min 5 mM H2SO4 fl-ilma.fluss.
Is-supernatant idrolizzat ġie dilwit u analizzat għall-kontenut ta 'monomeru u oligosaccharide.Zokkor monomeriku miksub wara idroliżi enżimatika ġew analizzati b'HPLC mgħammra b'kolonna Aminex HPX-87P Bio-Rad (Hercules, CA) u kolonna ta' protezzjoni għall-irmied.It-temperatura tal-kolonna nżammet fi 80 ° C, l-ilma ntuża bħala l-fażi mobbli b'rata ta 'fluss ta' 0.6 ml/min.Oligosaccharides ġew determinati bl-idroliżi f'aċidu dilwit f'121 ° C skond il-metodi deskritti f'refs.41, 48, 49.
L-analiżi tas-sakkaridi saret fuq ir-residwi tal-bijomassa mhux ipproċessati, ittrattati minn qabel AFEX u kollha mhux idrolizzati (inkluża l-produzzjoni ta 'estratti serjali tal-ħajt taċ-ċelluli u l-iskrinjar tal-mAb tagħhom) bl-użu ta' proċeduri deskritti qabel 27, 43, 50, 51.Għall-analiżi tal-glyccome, residwi li ma jinħallux fl-alkoħol tal-materjal tal-ħajt taċ-ċelluli tal-pjanti huma ppreparati minn residwi tal-bijomassa u soġġetti għal estrazzjoni serjali b'reaġenti dejjem aktar aggressivi bħal ammonju ossalat (50 mM), karbonat tas-sodju (50 mM u 0.5% w/v), CON.(1M u 4M, it-tnejn b'1% w/v sodium borohydride) u aċidu klorit kif deskritt qabel52,53.L-estratti mbagħad ġew soġġetti għal ELISA kontra panel kumpless ta 'mAb50s dirett lejn il-glycan tal-ħajt taċ-ċellula, u r-reazzjonijiet ta' rbit ta 'mAb ġew ippreżentati bħala mappa tas-sħana.L-mAbs li jimmiraw il-glycan tal-ħajt taċ-ċelluli tal-pjanti nxtraw minn ħażniet tal-laboratorju (serje CCRC, JIM u MAC).
Bijotinilazzjoni f'pass wieħed ta 'oligosaccharides.Il-konjugazzjoni ta 'karboidrati ma' biotin-LC-hydrazide saret bl-użu tal-proċedura li ġejja.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg / 12 μmol) ġie maħlul f'dimethyl sulfoxide (DMSO, 70 μl) permezz ta 'taħwid qawwi u tisħin f'65 ° C. għal 1 min.Aċidu aċetiku glaċjali (30 µl) ġie miżjud u t-taħlita tferra 'fuq is-sodium cyanoborohydride (6.4 mg/100 µmol) u maħlula kompletament wara li tissaħħan f'65 ° C għal madwar minuta.Imbagħad, minn 5 sa 8 μl tat-taħlita ta 'reazzjoni ġiet miżjuda ma' l-oligosaccharide imnixxef (1-100 nmol) biex tikseb eċċess molari ta '10 darbiet jew aktar tat-tikketta fuq it-tarf li jnaqqas.Ir-reazzjoni twettqet f'65 ° C għal 2 sigħat, wara li l-kampjuni ġew ippurifikati immedjatament.L-ebda sodium cyanoborohydride ma ntuża fl-esperimenti tat-tikkettjar mingħajr tnaqqis, u l-kampjuni ġew irreaġitti f'65 ° C. għal 2.5 sigħat.
Kisi ELISA u ħasil ta' kampjuni ta' oligosakkaridi bijotinilati.25 μl ta 'kampjuni bijotinilati (100 μl ta' kull kampjun ikkonċentrat dilwit f'5 ml ta 'soluzzjoni buffer Tris 0.1 M (TBS)) ġew miżjuda ma' kull bir tal-pjanċa miksija bl-avidin.Bjar ta 'kontroll kienu miksija b'50 μl ta' bijotina f'konċentrazzjoni ta '10 μg / ml f'0.1 M TBS.Ilma dejonizzat intuża bħala kisi għal kejl vojt.Il-pillola ġiet inkubata għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra fid-dlam.Aħsel il-pjanċa 3 darbiet b'0.1% ħalib xkumat f'0.1 M TBS billi tuża l-programm nru.11 għal Grenier flat 3A.
Żieda u ħasil ta 'antikorpi primarji.Żid 40 µl ta' antikorp primarju ma' kull bir.Inkuba l-mikroplate għal siegħa f'temperatura ambjentali fid-dlam.Il-pjanċi mbagħad ġew maħsula 3 darbiet b'0.1% ħalib f'0.1M TBS bl-użu tal-programm tal-ħasil #11 għal Grenier Flat 3A.
Żid l-antikorp sekondarju u aħsel.Żid 50 µl ta' antikorp sekondarju ġurdien/far (dilwit 1:5000 f'0.1% ħalib f'0.1 M TBS) f'kull bir.Inkuba l-mikroplate għal siegħa f'temperatura ambjentali fid-dlam.Il-mikroplates imbagħad ġew maħsula 5 darbiet b'0.1% ħalib f'0.1 M TBS bl-użu tal-programm Grenier Flat 5A tal-ħasil tal-pjanċa #12.
Żieda ta 'sottostrat.Żid 50 µl ta’ 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) mas-sottostrat bażi (billi żżid 2 qatriet ta’ buffer, 3 qatriet ta’ TMB, 2 qatriet ta’ hydrogen peroxide ma’ 15 ml ta’ ilma dejonizzat).Ipprepara s-sottostrat TMB.u vortex qabel l-użu).Inkuba l-mikroplate f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta.Fid-dlam.
Imla l-pass u aqra l-pillola.Żid 50 µl ta' aċidu sulfuriku 1 N f'kull bir u rreġistra l-assorbiment minn 450 sa 655 nm bl-użu ta' qarrej ELISA.
Ipprepara soluzzjonijiet ta '1 mg/ml ta' dawn l-analiti f'ilma dejonizzat: arabinose, rhamnose, fucose, xylose, galacturonic acid (GalA), glucuronic acid (GlcA), mannose, glucose, galactose, lactose, N-acetylmannosamine (manNAc), N-acetylglucosamine.(glcNAc), N-acetylgalactosamine (galNAc), inositol (standard intern).Żewġ standards ġew ippreparati billi żżid is-soluzzjonijiet taz-zokkor 1 mg/mL murija fit-Tabella 1. Il-kampjuni huma ffriżati u lajofilizzati f'-80 ° C. sakemm l-ilma kollu jitneħħa (ġeneralment madwar 12-18-il siegħa).
Żid 100–500 µg ta' kampjun ma' tubi ta' kamin fuq bilanċ analitiku.Irreġistra l-ammont miżjud.L-aħjar huwa li tħoll il-kampjun f'konċentrazzjoni speċifika ta 'solvent u żidha mat-tubu bħala alikwot likwidu.Uża 20 µl ta' 1 mg/ml inositol bħala standard intern għal kull tubu tal-kampjun.L-ammont ta 'standard intern miżjud mal-kampjun għandu jkun l-istess bħall-ammont ta' standard intern miżjud mat-tubu standard.
Żid 8 ml ta’ metanol anidru ma’ kunjett b’tapp bil-kamin.Imbagħad 4 ml ta' 3 N. soluzzjoni metanolika HCl, mgħottija u mħawwda.Dan il-proċess ma jużax l-ilma.
Żid 500 µl ta' soluzzjoni ta' metanol 1 M HCl mal-kampjuni ta' oligosaccharide u tubi TMS standard.Il-kampjuni ġew inkubati matul il-lejl (168 siegħa) fi 80° C. fi blokka termali.Nixxef il-prodott tal-metanoliżi f'temperatura tal-kamra billi tuża manifold tat-tnixxif.Żid 200 µl MeOH u erġa nixxef.Dan il-proċess huwa ripetut darbtejn.Żid 200 µl ta’ metanol, 100 µl ta’ piridina u 100 µl ta’ anidride aċetika mal-kampjun u ħawwad sew.Il-kampjuni ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta.u mnixxef.Żid 200 µl ta' metanol u erġa' nixxef.
Żid 200 µl ta' Tri-Sil u saħħan tubu mgħotti għal 20 minuta.80°C, imbagħad imkessaħ għat-temperatura tal-kamra.Uża manifold tat-tnixxif biex nixxef aktar il-kampjun għal volum ta' madwar 50 µl.Huwa importanti li wieħed jinnota li ma ħallejniex il-kampjuni jinxfu kompletament.
Żid 2 ml ta' hexane u ħawwad sew billi tħawwad.Imla l-ponot tal-pipetti Pasteur (5-8 mm) b’biċċa suf tal-ħġieġ billi ddaħħal is-suf tal-ħġieġ fuq pipetta ta’ dijametru ta’ 5-3/4 pulzieri.Il-kampjuni ġew ċentrifugati fi 3000 g għal 2 minuti.Kwalunkwe residwi li ma jinħallux huma preċipitati.Nixxef il-kampjun għal 100-150 µl.Volum ta 'madwar 1 μl ġie injettat fil-GC-MS f'temperatura inizjali ta' 80 °C u ħin inizjali ta '2.0 minuti (Tabella 2).