Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Nové imunologické a hmotnostne spektrometrické metódy pre komplexnú analýzu perzistentných oligosacharidov v kukuričných stonkách vopred ošetrených AFEX.Lignocelulózová biomasa je trvalo udržateľnou alternatívou k fosílnym palivám a široko sa používa na vývoj biotechnológií na výrobu produktov, ako sú potraviny, krmivá, palivá a chemikálie.Kľúčom k týmto technológiám je vývoj nákladovo konkurencieschopných procesov na premenu komplexných sacharidov prítomných v stenách rastlinných buniek na jednoduché cukry, ako je glukóza, xylóza a arabinóza.Pretože lignocelulózová biomasa je veľmi tvrdohlavá, na získanie požadovaného produktu sa musí podrobiť termochemickým úpravám (napr. exfoliácia amoniakových vlákien (AFEX), zriedené kyseliny (DA), iónové kvapaliny (IL)) a biologickým úpravám (napr. enzymatická hydrolýza a mikrobiálna fermentácia)..Keď sa však v procese hydrolýzy použijú komerčné fungálne enzýmy, iba 75 až 85 % vytvorených rozpustných cukrov sú monosacharidy a zvyšných 15 až 25 % sú rozpustné, nepoddajné oligosacharidy, ktoré nie sú vždy dostupné pre mikroorganizmy.Predtým sme úspešne izolovali a purifikovali rozpustné tvrdohlavé oligosacharidy pomocou kombinácie separácie uhlíka a kremeliny a chromatografie s vylučovacou veľkosťou a tiež sme skúmali ich enzýmové inhibičné vlastnosti.Zistili sme, že oligosacharidy obsahujúce substitúcie metylovanej urónovej kyseliny s vyšším stupňom polymerizácie (DP) sa ťažšie spracovávajú komerčnými zmesami enzýmov ako oligosacharidy s nízkym DP a neutrálne oligosacharidy.Tu uvádzame použitie niekoľkých ďalších metód, vrátane profilovania glykánov pomocou monoklonálnych protilátok (mAb) špecifických pre glykány rastlinnej biomasy na charakterizáciu glykánových väzieb v stenách rastlinných buniek a enzymatických hydrolyzátoch, laserovej desorpčnej ionizácii s pomocou matrice, hmotnostnej spektrometrii s časom letu..MALDI-TOF-MS) využíva štruktúrne informatívne diagnostické píky získané spektroskopiou po sekundárnom rozpade záporných iónov, plynovou chromatografiou a hmotnostnou spektrometriou (GC-MS) na charakterizáciu oligosacharidových väzieb s a bez derivatizácie.Kvôli malej veľkosti oligosacharidov (DP 4–20) je ťažké použiť tieto molekuly na väzbu a charakterizáciu mAb.Na prekonanie tohto problému sme použili novú metódu imobilizácie oligosacharidov založenú na biotínovej konjugácii, ktorá úspešne označila väčšinu rozpustných oligosacharidov s nízkym DP na povrchu mikrodoštičky, ktorá sa potom použila vo vysokovýkonnom systéme mAb na špecifickú ligačnú analýzu.Táto nová metóda v budúcnosti uľahčí vývoj pokročilejších vysokovýkonných testov glykómov, ktoré možno použiť na izoláciu a charakterizáciu oligosacharidov prítomných v biomarkeroch na diagnostické účely.
Lignocelulózová biomasa zložená z poľnohospodárskych, lesníckych, trávnych a drevných materiálov je potenciálnou surovinou na výrobu biologických produktov vrátane potravín, krmív, palív a chemických prekurzorov na výrobu produktov vyššej hodnoty1.Sacharidy (ako je celulóza a hemicelulóza) prítomné v stenách rastlinných buniek sa chemickým spracovaním a biotransformáciou (ako je enzymatická hydrolýza a mikrobiálna fermentácia) depolymerizujú na monosacharidy.Bežné predbežné úpravy zahŕňajú expanziu amoniakových vlákien (AFEX), zriedenú kyselinu (DA), iónovú kvapalinu (IL) a výbuch pary (SE), ktoré využívajú kombináciu chemikálií a tepla na zníženie produkcie lignocelulózy otvorením bunkových stien rastlín3,4.tvrdohlavosť hmoty, 5. Enzymatická hydrolýza sa vykonáva pri vysokom zaťažení tuhými látkami s použitím komerčných aktívnych enzýmov obsahujúcich sacharidy (CAZymes) a mikrobiálna fermentácia s použitím transgénnych kvasiniek alebo baktérií na výrobu biopalív a chemikálií 6 .
CAZymy v komerčných enzýmoch sú zložené z komplexnej zmesi enzýmov, ktoré synergicky štiepia komplexné väzby sacharid-cukor za vzniku monosacharidov2,7.Ako sme už uviedli, komplexná sieť aromatických polymérov lignínu so sacharidmi ich robí vysoko neovládateľnými, čo vedie k neúplnej konverzii cukru, pričom sa hromadí 15-25 % pohlavných oligosacharidov, ktoré nevznikajú počas enzymatickej hydrolýzy predspracovanej biomasy.Toto je bežný problém rôznych metód predúpravy biomasy.Niektoré dôvody pre túto prekážku zahŕňajú inhibíciu enzýmov počas hydrolýzy alebo neprítomnosť alebo nízke hladiny základných esenciálnych enzýmov, ktoré sú potrebné na prerušenie cukrových väzieb v rastlinnej biomase.Pochopenie zloženia a štrukturálnych charakteristík cukrov, ako sú napríklad väzby cukrov v oligosacharidoch, nám pomôže zlepšiť konverziu cukru počas hydrolýzy, vďaka čomu budú biotechnologické procesy cenovo konkurencieschopné s produktmi získanými z ropy.
Stanovenie štruktúry uhľohydrátov je náročné a vyžaduje kombináciu metód ako kvapalinová chromatografia (LC)11,12, nukleárna magnetická rezonančná spektroskopia (NMR)13, kapilárna elektroforéza (CE)14,15,16 a hmotnostná spektrometria (MS)17.,osemnásť.MS metódy, ako je hmotnostná spektrometria s časom letu s laserovou desorpciou a ionizáciou pomocou matrice (MALDI-TOF-MS), sú všestrannou metódou na identifikáciu sacharidových štruktúr.Nedávno sa na identifikáciu odtlačkov zodpovedajúcich pozíciám pripojenia oligosacharidov, anomérnym konfiguráciám, sekvenciám a pozíciám vetvenia 20, 21 najčastejšie používa kolízia indukovaná disociácia (CID) tandemová MS aduktov sodíkových iónov.
Glykánová analýza je vynikajúci nástroj na hĺbkovú identifikáciu sacharidových väzieb22.Táto metóda využíva monoklonálne protilátky (mAb) namierené proti glykánu rastlinnej bunkovej steny ako sondy na pochopenie komplexných sacharidových väzieb.Na celom svete je dostupných viac ako 250 mAb navrhnutých proti rôznym lineárnym a rozvetveným oligosacharidom s použitím rôznych sacharidov24.Na charakterizáciu štruktúry, zloženia a modifikácií bunkovej steny rastlín sa široko používa niekoľko mAb, pretože existujú významné rozdiely v závislosti od typu rastlinnej bunky, orgánu, veku, vývojového štádia a rastového prostredia25,26.Nedávno sa táto metóda použila na pochopenie populácií vezikúl v rastlinných a živočíšnych systémoch a ich príslušných úloh v transporte glykánu, ako je určené subcelulárnymi markermi, vývojovými štádiami alebo environmentálnymi stimulmi, a na stanovenie enzymatickej aktivity.Niektoré z rôznych štruktúr glykánov a xylánov, ktoré boli identifikované, zahŕňajú pektín (P), xylán (X), manán (M), xyloglukány (XylG), glukány so zmiešanou väzbou (MLG), arabinoxylán (ArbX), galaktomannan (GalG), kyselina glukurónová-arabinoxylán (GArbX) a 2arabino-2arabino.
Napriek všetkému tomuto výskumnému úsiliu sa však len niekoľko štúdií zameralo na povahu akumulácie oligosacharidov počas hydrolýzy s vysokým obsahom pevných látok (HSL), vrátane uvoľňovania oligosacharidov, zmien dĺžky oligomérneho reťazca počas hydrolýzy, rôznych polymérov s nízkym DP a ich kriviek.distribúcie 30,31,32.Medzitým, hoci sa glykánová analýza ukázala ako užitočný nástroj na komplexnú analýzu glykánovej štruktúry, je ťažké vyhodnotiť vo vode rozpustné oligosacharidy s nízkym DP použitím protilátkových metód.Menšie DP oligosacharidy s molekulovou hmotnosťou menšou ako 5-10 kDa sa neviažu na ELISA doštičky 33, 34 a pred pridaním protilátky sa odmyjú.
Tu po prvýkrát demonštrujeme test ELISA na platniach potiahnutých avidínom s použitím monoklonálnych protilátok, ktoré kombinujú jednostupňový biotinylačný postup pre rozpustné refraktérne oligosacharidy s analýzou glykomu.Náš prístup k analýze glykómov bol potvrdený analýzou komplementárnych oligosacharidových väzieb založenou na MALDI-TOF-MS a GC-MS pomocou trimetylsilylovej (TMS) derivatizácie kompozícií hydrolyzovaných cukrov.Tento inovatívny prístup sa môže v budúcnosti vyvinúť ako vysoko výkonná metóda a nájsť širšie uplatnenie v biomedicínskom výskume35.
Posttranslačné modifikácie enzýmov a protilátok, ako je glykozylácia,36 ovplyvňujú ich biologickú aktivitu.Napríklad zmeny v glykozylácii sérových proteínov hrajú dôležitú úlohu pri zápalovej artritíde a zmeny v glykozylácii sa používajú ako diagnostické markery37.V literatúre sa uvádza, že rôzne glykány sa ľahko objavujú pri rôznych ochoreniach, vrátane chronických zápalových ochorení gastrointestinálneho traktu a pečene, vírusových infekcií, rakoviny vaječníkov, prsníka a prostaty38,39,40.Pochopenie štruktúry glykánov pomocou metód glykánovej ELISA na báze protilátok poskytne dodatočnú dôveru v diagnostiku ochorenia bez použitia zložitých metód MS.
Naša predchádzajúca štúdia ukázala, že tvrdohlavé oligosacharidy zostali po predbežnej úprave a enzymatickej hydrolýze nehydrolyzované (obrázok 1).V našej predtým publikovanej práci sme vyvinuli metódu extrakcie na pevnej fáze s aktívnym uhlím na izoláciu oligosacharidov z hydrolyzátu kukurice (ACSH) vopred upraveného AFEX.Po počiatočnej extrakcii a separácii boli oligosacharidy ďalej frakcionované vylučovacou chromatografiou (SEC) a zozbierané v poradí podľa molekulovej hmotnosti.Cukrové monoméry a oligoméry uvoľnené z rôznych predbežných úprav sa analyzovali analýzou zloženia cukru.Pri porovnaní obsahu cukrových oligomérov získaných rôznymi metódami predúpravy je prítomnosť tvrdohlavých oligosacharidov bežným problémom pri premene biomasy na monosacharidy a môže viesť k zníženiu výťažku cukru minimálne o 10 – 15 % a dokonca až o 18 %.USA.Táto metóda sa používa na ďalšiu výrobu oligosacharidových frakcií vo veľkom meradle.Výsledný ACH a jeho následné frakcie s rôznymi molekulovými hmotnosťami boli použité ako experimentálny materiál na charakterizáciu oligosacharidov v tejto práci.
Po predbežnej úprave a enzymatickej hydrolýze zostali perzistentné oligosacharidy nehydrolyzované.Tu (A) je metóda separácie oligosacharidov, pri ktorej sa oligosacharidy izolujú z hydrolyzátu kukuričnej stonky (ACSH) vopred upraveného AFEX s použitím náplne aktívneho uhlia a kremeliny;(B) Metóda separácie oligosacharidov.Oligosacharidy sa ďalej separovali vylučovacou chromatografiou (SEC);(C) Sacharidové monoméry a oligoméry uvoľnené z rôznych predbežných úprav (riedená kyselina: DA, iónová kvapalina: IL a AFEX).Podmienky enzymatickej hydrolýzy: vysoký obsah pevných látok 25 % (w/w) (približne 8 % obsah glukánu), 96-hodinová hydrolýza, komerčná náplň enzýmu 20 mg/g (pomer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) a (D) monoméry cukru a oligoméry glukózy, xylózy a arabinózy (predkukurica sa uvoľňuje z AFEX stoverSACSAFEX).
Glykánová analýza sa ukázala ako užitočný nástroj pre komplexnú štrukturálnu analýzu glykánov v extraktoch izolovaných z pevných zvyškov biomasy.Vo vode rozpustné sacharidy sú však pri použití tejto tradičnej metódy nedostatočne zastúpené41, pretože oligosacharidy s nízkou molekulovou hmotnosťou sa ťažko imobilizujú na platniach ELISA a pred pridaním protilátky sa vymyjú.Preto sa na väzbu a charakterizáciu protilátky použila jednokroková biotinylačná metóda na potiahnutie rozpustných, nevyhovujúcich oligosacharidov na avidínom potiahnutých ELISA platniach.Táto metóda bola testovaná s použitím nášho predtým vyrobeného ACSH a frakcie založenej na jeho molekulovej hmotnosti (alebo stupni polymerizácie, DP).Jednostupňová biotinylácia sa použila na zvýšenie väzbovej afinity oligosacharidu pridaním biotín-LC-hydrazidu na redukujúci koniec uhľohydrátu (obr. 2).V roztoku hemiacetálová skupina na redukujúcom konci reaguje s hydrazidovou skupinou biotín-LC-hydrazidu za vzniku hydrazónovej väzby.V prítomnosti redukčného činidla NaCNBH3 sa hydrazónová väzba redukuje na stabilný biotinylovaný konečný produkt.S modifikáciou konca redukujúceho cukor sa stala možná väzba oligosacharidov s nízkym DP na doštičky ELISA a v našej štúdii sa to uskutočnilo na platniach potiahnutých avidínom s použitím mAb zacielených na glykán.
Skríning monoklonálnych protilátok založený na ELISA na biotinylované oligosacharidy.Tu (A) kombinovaná biotinylácia oligosacharidov a následný skríning ELISA s glykánom zacielenými mAb na doštičkách potiahnutých NeutrAvidínom a (B) ukazuje jednostupňový postup biotinylácie reakčných produktov.
Doštičky potiahnuté avidínom s protilátkami konjugovanými s oligosacharidmi sa potom pridali k primárnym a sekundárnym protilátkam a premyli sa v médiu citlivom na svetlo a čas.Po dokončení väzby protilátky pridajte substrát TMB, aby sa platňa inkubovala.Reakcia sa nakoniec zastavila kyselinou sírovou.Inkubované doštičky sa analyzovali pomocou čítačky ELISA, aby sa určila väzbová sila každej protilátky, aby sa detegovalo zosieťovanie špecifické pre protilátku.Podrobnosti a parametre experimentu nájdete v príslušnej časti „Materiály a metódy“.
Využiteľnosť tejto novo vyvinutej metódy pre špecifické aplikácie demonštrujeme charakterizáciou rozpustných oligosacharidov prítomných v ACSH, ako aj v surových a purifikovaných oligosacharidových frakciách izolovaných z lignocelulózových hydrolyzátov.Ako je znázornené na obrázku 3, najbežnejšie xylány substituované epitopom identifikované v ACSH pomocou metód bioacylovaného glykomu sú zvyčajne urónové (U) alebo metylurónové (MeU) a pektínové arabinogalaktány.Väčšina z nich sa našla aj v našej predchádzajúcej štúdii o analýze glykánov nehydrolyzovaných pevných látok (UHS)43.
Detekcia odolných oligosacharidových epitopov s použitím monoklonálnej protilátky namierenej proti glykánu bunkovej steny.„Neutrálna“ frakcia je frakcia ACN a „kyslá“ frakcia je frakcia FA.Jasnejšie červené na tepelnej mape označujú vyšší obsah epitopu a jasnejšie modré označujú prázdne pozadie.Hodnoty farieb na stupnici sú založené na surových hodnotách OD pre formulácie N=2.Hlavné epitopy rozpoznávané protilátkami sú zobrazené vpravo.
Tieto necelulózové štruktúry nemohli byť štiepené najbežnejšími celulázami a hemicelulázami v testovanej komerčnej zmesi enzýmov, ktorá zahŕňa najbežnejšie používané komerčné enzýmy.Na ich hydrolýzu sú preto potrebné nové pomocné enzýmy.Bez nevyhnutných necelulózových pomocných enzýmov tieto necelulózové väzby zabraňujú úplnej premene na monosacharidy, aj keď sú ich pôvodné cukrové polyméry extenzívne hydrolyzované na kratšie fragmenty a rozpustené s použitím komerčných enzýmových zmesí.
Ďalšie štúdium distribúcie signálu a jeho väzbovej sily ukázalo, že väzbové epitopy boli nižšie vo frakciách cukru s vysokým DP (A, B, C, DP do 20+) ako vo frakciách s nízkym DP (D, E, F, DP) v diméroch) (obr. 1).Kyslé fragmenty sú bežnejšie v necelulózových epitopoch ako neutrálne fragmenty.Tieto javy sú v súlade so vzorom pozorovaným v našej predchádzajúcej štúdii, kde vysoké DP a kyslé časti boli odolnejšie voči enzymatickej hydrolýze.Prítomnosť necelulózových glykánových epitopov a substitúcií U a MeU preto môže výrazne prispieť k stabilite oligosacharidov.Je potrebné poznamenať, že účinnosť väzby a detekcie môže byť problematická pre oligosacharidy s nízkym DP, najmä ak je epitopom dimérny alebo trimérny oligosacharid.Toto možno testovať použitím komerčných oligosacharidov rôznych dĺžok, z ktorých každý obsahuje iba jeden epitop, ktorý sa viaže na špecifickú mAb.
Použitie štruktúrne špecifických protilátok teda odhalilo určité typy nepoddajných väzieb.V závislosti od typu použitej protilátky, vhodného vzoru ligácie a sily signálu, ktorý produkuje (najčastejší a najmenej hojný), môžu byť identifikované nové enzýmy a pridané semikvantitatívne do zmesi enzýmov na úplnejšiu glykokonverziu.Ak vezmeme ako príklad analýzu ACSH oligosacharidov, môžeme vytvoriť databázu glykánových väzieb pre každý materiál biomasy.Tu je potrebné poznamenať, že by sa mala brať do úvahy rozdielna afinita protilátok, a ak ich afinita nie je známa, spôsobí to určité ťažkosti pri porovnávaní signálov rôznych protilátok.Okrem toho porovnanie glykánových väzieb môže fungovať najlepšie medzi vzorkami pre rovnakú protilátku.Tieto tvrdohlavé väzby sa potom môžu prepojiť s databázou CAZyme, z ktorej môžeme identifikovať enzýmy, vybrať kandidátske enzýmy a testovať enzýmy rušiace väzbu alebo vyvinúť mikrobiálne systémy na expresiu týchto enzýmov na použitie v biorafinériách44.
Na vyhodnotenie toho, ako imunologické metódy dopĺňajú alternatívne metódy na charakterizáciu oligosacharidov s nízkou molekulovou hmotnosťou prítomných v lignocelulózových hydrolyzátoch, sme vykonali MALDI (obr. 4, S1-S8) a analýzu sacharidov odvodených od TMS na základe GC-MS na tej istej časti panelu (obr. 5) oligosacharidov.MALDI sa používa na porovnanie, či sa hmotnostná distribúcia molekúl oligosacharidov zhoduje so zamýšľanou štruktúrou.Na obr.4 znázorňuje MC neutrálnych zložiek ACN-A a ACN-B.Analýza ACN-A potvrdila rozsah pentózových cukrov v rozmedzí od DP 4–8 (obr. 4) po DP 22 (obr. S1), ktorých hmotnosti zodpovedajú MeU-xylánovým oligosacharidom.Analýza ACN-B potvrdila sériu pentóz a glukoxylánov s DP 8-15.V doplnkovom materiáli, ako je obrázok S3, mapy distribúcie hmotnosti kyslých častí FA-C ukazujú rozsah (Me)U substituovaných pentózových cukrov s DP 8-15, ktoré sú v súlade so substituovanými xylánmi nájdenými pri skríningu mAb na báze ELISA.Epitopy sú konzistentné.
MALDI-MS spektrum rozpustných nevyhovujúcich oligosacharidov prítomných v ACS.Tu sú (A) ACN-A frakcie s nízkym rozsahom hmotnosti obsahujúce metylovanú kyselinu urónovú (DP 4-8) substituované glukuroxylánové oligosacharidy a (B) ACN-B xylán a oligosacharidy metylovanej urónovej kyseliny substituované glukucuroxylánom (DP 8-15).
Analýza zloženia glykánového zvyšku refraktérnych oligosacharidov.Tu (A) TMS sacharidové zloženie rôznych oligosacharidových frakcií získaných pomocou GC-MS analýzy.(B) Štruktúry rôznych cukrov odvodených od TMS prítomných v oligosacharidoch.ACN – acetonitrilová frakcia obsahujúca neutrálne oligosacharidy a FA – frakcia kyseliny ferulovej obsahujúca kyslé oligosacharidy.
Ďalší zaujímavý záver bol vyvodený z LC-MS analýzy oligosacharidovej frakcie, ako je znázornené na obrázku S9 (metódy je možné vidieť v elektronickom doplnkovom materiáli).Fragmenty hexózových a -OAc skupín boli opakovane pozorované počas ligácie ACN-B frakcie.Toto zistenie nielen potvrdzuje fragmentáciu pozorovanú pri analýze glykómu a MALDI-TOF, ale poskytuje aj nové informácie o potenciálnych sacharidových derivátoch v predspracovanej lignocelulózovej biomase.
Analyzovali sme tiež zloženie cukru oligosacharidovej frakcie pomocou derivatizácie cukru TMS.Pomocou GC-MS sme stanovili zloženie nervových (nederivátových) a kyslých cukrov (GluA a GalA) v oligosacharidovej frakcii (obr. 5).Kyselina glukurónová sa nachádza v kyslých zložkách C a D, zatiaľ čo kyselina galakturónová sa nachádza v kyslých zložkách A a B, pričom obe sú zložkami kyslých cukrov s vysokým DP.Tieto výsledky nielen potvrdzujú naše údaje ELISA a MALDI, ale sú tiež v súlade s našimi predchádzajúcimi štúdiami akumulácie oligosacharidov.Preto sa domnievame, že moderné imunologické metódy využívajúce biotinyláciu oligosacharidov a následný skríning ELISA sú dostatočné na detekciu rozpustných rekalcitrantných oligosacharidov v rôznych biologických vzorkách.
Pretože skríningové metódy mAb založené na ELISA boli validované niekoľkými rôznymi metódami, chceli sme ďalej preskúmať potenciál tejto novej kvantitatívnej metódy.Dva komerčné oligosacharidy, xylohexasacharidový oligosacharid (XHE) a 23-a-L-arabinofuranozyl-xylotrióza (A2XX), boli zakúpené a testované pomocou nového prístupu mAb zacieleného na glykán bunkovej steny.Obrázok 6 ukazuje lineárnu koreláciu medzi biotinylovaným väzbovým signálom a logaritmickou koncentráciou oligosacharidovej koncentrácie, čo naznačuje možný Langmuirov adsorpčný model.Spomedzi mAb korelovali CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 a CCRC-M151 s XHE a CCRC-M108, CCRC-M109 a LM11 korelovali s A2XX v rozsahu 1001 nmV dôsledku obmedzenej dostupnosti protilátok počas experimentu sa uskutočnili obmedzené experimenty s každou koncentráciou oligosacharidu.Tu je potrebné poznamenať, že niektoré protilátky reagujú veľmi odlišne na rovnaký oligosacharid ako substrát, pravdepodobne preto, že sa viažu na mierne odlišné epitopy a môžu mať veľmi odlišné väzbové afinity.Mechanizmy a dôsledky presnej identifikácie epitopu budú oveľa zložitejšie, keď sa nový prístup mAb použije na skutočné vzorky.
Na stanovenie rozsahu detekcie rôznych mAb zacielených na glykán sa použili dva komerčné oligosacharidy.Tu lineárne korelácie s log koncentráciou oligosacharidovej koncentrácie naznačujú Langmuirove adsorpčné profily pre (A) XHE s mAb a (B) A2XX s mAb.Zodpovedajúce epitopy označujú štruktúry komerčných oligosacharidov použitých ako substráty v teste.
Použitie monoklonálnych protilátok zacielených na glykán (glykokomická analýza alebo skríning mAb založený na ELISA) je výkonným nástrojom na hĺbkovú charakterizáciu väčšiny hlavných glykánov bunkovej steny, ktoré tvoria rastlinnú biomasu.Klasická glykánová analýza však charakterizuje iba väčšie glykány bunkovej steny, pretože väčšina oligosacharidov nie je účinne imobilizovaná na platniach ELISA.V tejto štúdii boli kukuričné ​​stonky vopred upravené AFEX enzymaticky hydrolyzované pri vysokom obsahu pevných látok.Analýza cukru sa použila na stanovenie zloženia uhľohydrátov nepoddajných bunkovej steny v hydrolyzáte.Analýza mAb menších oligosacharidov v hydrolyzátoch je však podceňovaná a na účinnú imobilizáciu oligosacharidov na platniach ELISA sú potrebné ďalšie nástroje.
Uvádzame tu novú a účinnú metódu imobilizácie oligosacharidov na skríning mAb kombináciou biotinylácie oligosacharidov, po ktorej nasleduje skríning ELISA na doštičkách potiahnutých NeutrAvidinom™.Imobilizované biotinylované oligosacharidy vykazovali dostatočnú afinitu k protilátke, aby umožnili rýchlu a účinnú detekciu vzdorujúcich oligosacharidov.Analýza zloženia týchto tvrdohlavých oligosacharidov založená na hmotnostnej spektrometrii potvrdila výsledky tohto nového prístupu k imunoskríningu.Tieto štúdie teda demonštrujú, že kombinácia biotinylácie oligosacharidov a skríningu ELISA s monoklonálnymi protilátkami zacielenými na glykán sa môže použiť na detekciu zosieťovaní v oligosacharidoch a môže sa široko použiť v iných biochemických štúdiách charakterizujúcich štruktúru oligosacharidov.
Táto metóda profilovania glykánov na báze biotínu je prvou správou schopnou skúmať nepoddajné sacharidové väzby rozpustných oligosacharidov v rastlinnej biomase.To pomáha pochopiť, prečo sú niektoré časti biomasy také tvrdohlavé, pokiaľ ide o výrobu biopalív.Táto metóda vypĺňa dôležitú medzeru v metódach analýzy glykomu a rozširuje jej použitie na širší rozsah substrátov mimo rastlinných oligosacharidov.V budúcnosti môžeme použiť robotiku na biotinyláciu a použiť metódu, ktorú sme vyvinuli na vysokovýkonnú analýzu vzoriek pomocou ELISA.
Kukuričná slama (CS) vypestovaná z hybridných semien Pioneer 33A14 bola zozbieraná v roku 2010 z Kramer Farms v Ray, Colorado.So súhlasom vlastníka pozemku je možné túto biomasu využiť na výskum. Vzorky sa skladovali v suchom stave s vlhkosťou < 6 % vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote. Vzorky sa skladovali v suchom stave s vlhkosťou < 6 % vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote. Образцы хранились сухими при влажности < 6% v пакетах с застежкой-молнией прентранекой Vzorky sa skladovali v suchu pri <6 % vlhkosti vo vreckách so zipsom pri izbovej teplote.样品在室温下以干燥< 6 % 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6 % Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре <6%. с влажно. Vzorky sa skladujú vo vreckách na zips pri izbovej teplote s vlhkosťou < 6 %.Štúdia bola v súlade s miestnymi a národnými usmerneniami.Kompozičná analýza sa uskutočnila pomocou protokolu NREL.Zistilo sa, že kompozícia obsahuje 31,4 % glukánu, 18,7 % xylánu, 3,3 % arabinanu, 1,2 % galaktánu, 2,2 % acetylu, 14,3 % lignínu, 1,7 % proteínu a 13,4 % popola.
Cellic® CTec2 (138 mg proteínu/ml, šarža VCNI 0001) je komplexná zmes celulázy, β-glukozidázy a Cellic® HTec2 (157 mg proteínu/ml, šarža VHN00001) od Novozymes (Franklinton, NC, USA)).Multifect Pectinase® (72 mg proteínu/ml), komplexná zmes enzýmov degradujúcich pektín, bola darovaná spoločnosťou DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, USA).Koncentrácie enzýmového proteínu sa stanovili odhadom obsahu proteínu (a odčítaním príspevku neproteínového dusíka) pomocou Kjeldahlovej dusíkovej analýzy (spôsob AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA).Kremelina 545 bola zakúpená od EMD Millipore (Billerica, MA).Aktívne uhlie (DARCO, 100 mesh granule), Avicel (PH-101), bukový xylán a všetky ostatné chemikálie boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Predúprava AFEX bola vykonaná v GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, USA).Predúprava sa uskutočňovala pri 140 °C počas 15 minút.46 v nerezovom stolnom vsádzkovom reaktore (Parr Instruments Company).Trvalo to 30 minút.Reaktor sa zahrial na 140 °C a amoniak sa rýchlo uvoľnil, čo umožnilo, aby sa biomasa rýchlo vrátila na teplotu miestnosti.Zloženie AFEX predupravenej kukuričnej stonky (ACS) bolo podobné zloženiu neošetrenej kukuričnej stonky (UT-CS).
ACSH s vysokým obsahom pevných látok 25 % (hmotn./hmotn.) (približne 8 % dextránu) sa pripravil ako východiskový materiál na výrobu oligosacharidov vo veľkom meradle.Enzymatická hydrolýza ACS sa uskutočnila s použitím komerčnej zmesi enzýmov vrátane Cellic® Ctec2 10 mg proteínu/g glukánu (v predspracovanej biomase), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteínu/g glukánu a Multifect Pectinase (Genencor Inc, USA).).), 5 mg proteínu/g dextránu.Enzymatická hydrolýza sa uskutočnila v 5-litrovom bioreaktore s pracovným objemom 3 litre, pH 4,8, 50 °C a 250 ot./min.Po hydrolýze počas 96 hodín sa hydrolyzát zozbieral centrifugáciou pri 6000 otáčkach za minútu počas 30 minút a potom pri 14000 otáčkach za minútu počas 30 minút, aby sa odstránili nehydrolyzované pevné látky.Hydrolyzát sa potom podrobil sterilnej filtrácii cez 0,22 mm filtračnú kadičku.Prefiltrovaný hydrolyzát sa skladoval v sterilných fľašiach pri 4 °C a potom sa frakcionoval na uhlíku.
Analýza zloženia vzoriek biomasy na báze extraktu podľa postupov laboratórnej analýzy NREL: príprava vzoriek na analýzu zloženia (NREL/TP-510-42620) a stanovenie štruktúrnych sacharidov a lignínu v biomase (NREL/TP-510 – 42618)47.
Oligosacharidová analýza prúdu hydrolyzátu sa uskutočnila v 2 ml mierke s použitím metódy kyslej hydrolýzy na báze autoklávu.Zmiešajte vzorku hydrolyzátu so 69,7 µl 72 % kyseliny sírovej v 10 ml kultivačnej skúmavke so skrutkovacím uzáverom a inkubujte 1 hodinu na stole pri 121 °C, ochlaďte na ľade a prefiltrujte do liekovky pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC).Koncentrácia oligosacharidov bola stanovená odčítaním koncentrácie monosacharidov v nehydrolyzovanej vzorke od celkovej koncentrácie cukru vo vzorke hydrolyzovanej kyselinou.
Koncentrácie glukózy, xylózy a arabinózy v biomase hydrolyzovanej kyselinou sa analyzovali pomocou systému Shimadzu HPLC vybaveného automatickým vzorkovačom, ohrievačom kolóny, izokratickou pumpou a detektorom indexu lomu na kolóne Bio-Rad Aminex HPX-87H.Kolóna sa udržiavala pri 50 °C a eluovala sa 0,6 ml/min 5 mM H2S04 vo vode.tok.
Supernatant hydrolyzátu sa zriedil a analyzoval na obsah monoméru a oligosacharidu.Monomérne cukry získané po enzymatickej hydrolýze sa analyzovali pomocou HPLC vybavenej kolónou Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P a kolónou chrániacou popol.Teplota kolóny sa udržiavala na 80 °C, ako mobilná fáza sa použila voda s prietokom 0,6 ml/min.Oligosacharidy boli stanovené hydrolýzou v zriedenej kyseline pri 121 °C podľa metód opísaných v ref.41, 48, 49.
Sacharidová analýza sa uskutočnila na surových, AFEX predspracovaných a všetkých nehydrolyzovaných zvyškoch biomasy (vrátane produkcie sériových extraktov bunkových stien a ich mAb skríningu) použitím skôr opísaných postupov 27, 43, 50, 51.Na analýzu glykomu sa zo zvyškov biomasy pripravia zvyšky nerozpustné v alkohole z materiálu rastlinnej bunkovej steny a podrobia sa sériovej extrakcii čoraz agresívnejšími činidlami, ako je šťavelan amónny (50 mM), uhličitan sodný (50 mM a 0,5 % w/v), CON.(1M a 4M, obidva s 1 % hmotn./obj. borohydridu sodného) a kyslý chloritan, ako už bolo opísané52,53.Extrakty sa potom podrobili testu ELISA proti komplexnému panelu mAb50 zameraných na glykán bunkovej steny a väzbové reakcie mAb sa prezentovali ako tepelná mapa.mAb zacielené na glykán rastlinnej bunkovej steny boli zakúpené z laboratórnych zásob (série CCRC, JIM a MAC).
Jednostupňová biotinylácia oligosacharidov.Konjugácia uhľohydrátov s biotín-LC-hydrazidom sa uskutočnila pomocou nasledujúceho postupu.Biotín-LC-hydrazid (4,6 mg/12 μmol) sa rozpustil v dimetylsulfoxide (DMSO, 70 μl) za intenzívneho miešania a zahrievania na 65 °C počas 1 minúty.Pridala sa ľadová kyselina octová (30 ul) a zmes sa naliala na kyanoborohydrid sodný (6,4 mg/100 umol) a po zahrievaní na 65 °C počas približne 1 minúty sa úplne rozpustila.Potom sa k sušenému oligosacharidu (1-100 nmol) pridalo 5 až 8 ul reakčnej zmesi, aby sa získal 10-násobný alebo väčší molárny nadbytok značky nad redukujúcim koncom.Reakcia sa uskutočňovala pri 65 °C počas 2 hodín, po ktorých boli vzorky okamžite purifikované.Pri značiacich experimentoch sa nepoužil žiadny kyanoborohydrid sodný bez redukcie a vzorky sa nechali reagovať pri 65 °C počas 2,5 hodiny.
ELISA poťahovanie a premývanie vzoriek biotinylovaných oligosacharidov.25 μl biotinylovaných vzoriek (100 μl každej koncentrovanej vzorky zriedenej v 5 ml 0,1 M roztoku Tris pufra (TBS)) sa pridalo do každej jamky platne potiahnutej avidínom.Kontrolné jamky boli potiahnuté 50 ul biotínu v koncentrácii 10 ug/ml v 0,1 M TBS.Deionizovaná voda bola použitá ako povlak na slepé merania.Tableta sa inkubovala 2 hodiny pri teplote miestnosti v tme.Platničku premyte 3-krát 0,1 % odstredeným mliekom v 0,1 M TBS pomocou programu č.11 pre byt Grenier 3A.
Pridávanie a premývanie primárnych protilátok.Do každej jamky pridajte 40 µl primárnej protilátky.Mikroplatničku inkubujte 1 hodinu pri izbovej teplote v tme.Doštičky sa potom trikrát premyli 0,1 % mliekom v 0,1 M TBS s použitím umývacieho programu #11 pre Grenier Flat 3A.
Pridajte sekundárnu protilátku a premyte.Do každej jamky pridajte 50 ul myšacej/krysej sekundárnej protilátky (zriedenej 1:5000 v 0,1 % mlieku v 0,1 M TBS).Mikroplatničku inkubujte 1 hodinu pri izbovej teplote v tme.Mikrodoštičky sa potom 5-krát premyli 0,1 % mliekom v 0,1 M TBS s použitím programu premývania doštičiek Grenier Flat 5A #12.
Pridanie substrátu.Pridajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidínu (TMB) do základného substrátu (pridaním 2 kvapiek tlmivého roztoku, 3 kvapiek TMB, 2 kvapiek peroxidu vodíka do 15 ml deionizovanej vody).Pripravte substrát TMB.a vortexujte pred použitím).Inkubujte mikroplatničku pri izbovej teplote 30 minút.V tme.
Dokončite krok a prečítajte si tablet.Pridajte 50 ul 1 N kyseliny sírovej do každej jamky a zaznamenajte absorbanciu od 450 do 655 nm pomocou čítačky ELISA.
Pripravte 1 mg/ml roztoky týchto analytov v deionizovanej vode: arabinóza, ramnóza, fukóza, xylóza, kyselina galakturónová (GalA), kyselina glukurónová (GlcA), manóza, glukóza, galaktóza, laktóza, N-acetylmanózamín (manNAc), N-acetylglukózamín.(glcNAc), N-acetylgalaktozamín (galNAc), inozitol (vnútorný štandard).Dva štandardy sa pripravili pridaním 1 mg/ml cukrových roztokov uvedených v tabuľke 1. Vzorky sa zmrazili a lyofilizovali pri -80 °C, kým sa neodstránila všetka voda (zvyčajne asi 12 až 18 hodín).
Pridajte 100 – 500 µg vzorky do skúmaviek so skrutkovacím uzáverom na analytických váhach.Zaznamenajte pridané množstvo.Najlepšie je rozpustiť vzorku v špecifickej koncentrácii rozpúšťadla a pridať ju do skúmavky ako tekutý alikvot.Pre každú skúmavku použite 20 µl 1 mg/ml inozitolu ako vnútorný štandard.Množstvo vnútorného štandardu pridaného do vzorky musí byť rovnaké ako množstvo vnútorného štandardu pridaného do skúmavky so štandardom.
Pridajte 8 ml bezvodého metanolu do injekčnej liekovky so skrutkovacím uzáverom.Potom 4 ml 3 N metanolického roztoku HCl, uzavretý a pretrepaný.Tento proces nepoužíva vodu.
Pridajte 500 ul 1 M roztoku HCI v metanole do vzoriek oligosacharidov a štandardných skúmaviek TMS.Vzorky sa inkubovali cez noc (168 hodín) pri 80 °C v tepelnom bloku.Produkt metanolýzy sa suší pri teplote miestnosti pomocou sušiaceho potrubia.Pridajte 200 ul MeOH a znova vysušte.Tento proces sa opakuje dvakrát.Do vzorky pridajte 200 ul metanolu, 100 ul pyridínu a 100 ul anhydridu kyseliny octovej a dobre premiešajte.Vzorky sa inkubovali pri teplote miestnosti počas 30 minút.a sušené.Pridajte 200 ul metanolu a znova vysušte.
Pridajte 200 µl Tri-Sil a skúmavku zahrievajte 20 minút.80 °C, potom sa ochladí na teplotu miestnosti.Pomocou sušiaceho potrubia ďalej vysušte vzorku na objem približne 50 µl.Je dôležité poznamenať, že vzorky sme nenechali úplne vyschnúť.
Pridajte 2 ml hexánu a dobre premiešajte vortexovaním.Naplňte hroty Pasteurových pipiet (5-8 mm) kúskom sklenenej vlny vložením sklenenej vlny na vrch pipety s priemerom 5-3/4 palca.Vzorky boli centrifugované pri 3000 g počas 2 minút.Všetky nerozpustné zvyšky sa vyzrážajú.Vysušte vzorku na 100-150 µl.Objem približne 1 μl bol vstreknutý do GC-MS pri počiatočnej teplote 80 °C a počiatočnom čase 2,0 minúty (tabuľka 2).