د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ وړاندې کړو.
د جوار په سټور کې د دوامداره اولیګوساکرایډونو پیچلي تحلیل لپاره نوي معافیتي او ډله ایز سپیکټرومیټریک میتودونه د AFEX سره دمخه درملنه شوي.لیګنوسیلوزیک بایوماس د فوسیل سونګ موادو لپاره دوامداره بدیل دی او په پراخه کچه د محصولاتو لکه خواړه ، تغذیه ، سونګ توکو او کیمیاوي توکو تولید لپاره د بایو ټیکنالوژۍ رامینځته کولو لپاره کارول کیږي.د دې ټیکنالوژیو کلیدي د نبات په حجرو کې موجود پیچلي کاربوهایډریټ په ساده شکرو لکه ګلوکوز، xylose او arabinose بدلولو لپاره د لګښت رقابتي پروسو پراختیا ده.ځکه چې lignocellulosic بایوماس خورا سخت دی، دا باید د تودوکیمیکل درملنې تابع وي (د بیلګې په توګه، د امونیا فایبر اکسفولیشن (AFEX)، د ډیلیوټ اسیدونو (DA)، ionic مایعاتو (IL)) او بیولوژیکي درملنې (د بیلګې په توګه، انزیمیک هایدرولیسس او مایکروبیل خمیر) د مطلوب محصول په ترکیب کې..په هرصورت، کله چې سوداګریز فنګسي انزایمونه د هایدرولیسس په پروسه کې کارول کیږي، یوازې 75-85٪ محلول شوي شکرونه مونوساکرایډونه دي، او پاتې 15-25٪ محلول کېدونکي، غیر فعال اولیګوساکرایډونه دي، کوم چې تل مایکروجنیزمونو ته شتون نلري.مخکې، موږ په بریالیتوب سره د محلول ضد اولیګوساکرایډونه د کاربن او ډیاتومیسس د ځمکې جلا کولو او د اندازې جلا کولو کروماتګرافي په کارولو سره جلا او پاک کړي، او د دوی د انزایم مخنیوی ملکیتونه یې هم څیړلي.موږ وموندله چې oligosaccharides چې د لوړې درجې پولیمرائزیشن (DP) میتیلیټ یورونیک اسید بدیلونه لري د ټیټ DP او غیر جانبدار اولیګوساکرایډونو په پرتله د سوداګریزو انزایمونو ترکیبونو سره پروسس کول خورا ستونزمن دي.دلته موږ د ډیری اضافي میتودونو کارولو راپور ورکوو، پشمول د ګلیکان پروفایل کول د مونوکلونل انټي باډیز (mAbs) په کارولو سره چې د نبات بایوماس ګلایکان لپاره ځانګړي دي ترڅو د نبات حجرو دیوالونو او انزیماتیک هایدرولیسیټونو کې د ګلایکان بانډ مشخص کړي ، د میټریکس په مرسته لیزر ډیسورپشن آیونیزیشن ، د الوتنې وخت ماس ​​سپیکرومیټري..MALDI-TOF-MS) د جوړښت - معلوماتي تشخیصي چوټي کاروي چې د سپیکٹروسکوپي لخوا ترلاسه شوي د منفي آئنونو ، ګاز کروماتګرافي او ډله ایز سپیکرومیټري (GC-MS) د ثانوي تخریب وروسته ترلاسه شوي ترڅو د oligosaccharide بانډونو سره او پرته له اخراج سره مشخص کړي.د oligosaccharides (DP 4-20) کوچنۍ اندازې له امله، دا مالیکولونه د mAb پابندۍ او ځانګړتیا لپاره کارول ستونزمن دي.د دې ستونزې د له منځه وړلو لپاره، موږ د بایوټین کنجګیشن پر بنسټ د oligosaccharides immobilization میتود پلي کړ چې په بریالیتوب سره د مایکروپلیټ سطح کې د ټیټ DP محلول اولیګوساکرایډونو اکثریت لیبل شوی، کوم چې بیا د ځانګړي لیګیشن شننې لپاره د لوړې Throput mAb سیسټم کې کارول کیده.دا نوې طریقه به په راتلونکي کې د ډیرو پرمختللو لوړ پوړ ګالیکوم ارزونو پراختیا اسانه کړي چې د تشخیصي موخو لپاره په بایومارکرونو کې موجود اولیګوساکرایډونو جلا کولو او ځانګړتیا لپاره کارول کیدی شي.
لیګنوسیلوزیک بایوماس، د کرنې، ځنګلونو، واښو او لرګیو موادو څخه جوړ شوی، د بایو-اساس محصولاتو تولید لپاره یو احتمالي تغذیه ده، په شمول د لوړ ارزښت محصولاتو تولید لپاره خواړه، خواړه، سونګ او کیمیاوي مخکیني.کاربوهایډریټ (لکه سیلولوز او هیمسیلوز) د نبات د حجرو په دیوالونو کې شتون لري د کیمیاوي پروسس کولو او بایوټرانسفارمیشن (لکه انزیماتیک هایدرولیسس او مایکروبیل خمیر) له لارې په مونوساکرایډونو کې ډیپولیمیریز کیږي.عام پری درملنې کې د امونیا فایبر توسع (AFEX)، ډیلیوټ اسید (DA)، ionic مایع (IL)، او د بخار چاودنه (SE) شامل دي، کوم چې د کیمیاوي موادو او تودوخې ترکیب کاروي ترڅو د نبات د حجرو دیوالونو په پرانیستلو سره د لیګنوسیلوز تولید کم کړي 3,4.د مادې ضد، 5. انزیماتیک هایدرولیسس د سوداګریزو فعال کاربوهایډریټ لرونکي انزایمونو (CAZymes) او مایکروبیل خمیر په کارولو سره د بایو میشته سونګ موادو او کیمیاوي موادو تولید لپاره د ټرانجینک خمیر یا باکتریا په کارولو سره په لوړ جامد بار کې ترسره کیږي.
په سوداګریزو انزایمونو کې CAZymes د انزایمونو پیچلي مخلوط څخه جوړ شوي دي چې په ترکیب سره د پیچلي کاربوهایډریټ - شکر بانډونه ماتوي ترڅو مونوساکرایډونه 2,7 جوړوي.لکه څنګه چې موږ مخکې راپور ورکړ، د کاربوهایډریټ سره د لیګنین اروماتیک پولیمر پیچلې شبکه دوی خورا زړه راښکونکي کوي، کوم چې د شوګر د ناببره تبادلې لامل کیږي، د 15-25٪ جنسي اولیګوساکرایډونو راټولول چې د پریټریټ شوي بایوماس انزیماتیک هایدرولیسس په جریان کې نه تولید کیږي.دا د بیالبیلو بایوماس پری درملنې میتودونو سره یوه عامه ستونزه ده.د دې خنډ ځینې لاملونه د هایدرولیسس په جریان کې د انزایمونو مخنیوی ، یا د لازمي لازمي انزایمونو نشتوالی یا ټیټه کچه شامل دي چې د نبات بایوماس کې د شکر بانډ ماتولو لپاره اړین دي.د شکرو د جوړښت او ساختماني ځانګړتیاوو درک کول، لکه په اولیګوساکرایډونو کې د شوګر بانډونه، به موږ سره د هایدرولیسس په جریان کې د بورې تبادلې ته وده ورکولو کې مرسته وکړي، د بایو ټیکنالوژیکي پروسې لګښتونه د پټرولیم څخه ترلاسه شوي محصولاتو سره سیالي کوي.
د کاربوهایډریټ جوړښت معلومول ننګونه ده او د میتودونو ترکیب ته اړتیا لري لکه د مایع کروماتګرافي (LC) 11,12، اټومي مقناطیسي ریزونانس سپیکٹروسکوپي (NMR) 13، کیپیلري الیکٹروفورسس (CE) 14,15,16 او ډله ایز سپیکرومیټري (MS)17.،اتلس.د MS میتودونه لکه د الوتنې وخت ماس ​​سپیکرومیټري د لیزر ډیسورپشن سره او د میټریکس (MALDI-TOF-MS) په کارولو سره آیونیزیشن د کاربوهایډریټ جوړښتونو پیژندلو لپاره یو څو اړخیز میتود دی.په دې وروستیو کې، د سوډیم آئن اضافه کولو د ټکر-انډول شوي تحلیل (CID) تندم MS په پراخه کچه د ګوتو نښې پیژندلو لپاره کارول شوي چې د oligosaccharide ضمیمه موقعیتونو، anomeric ترتیبونو، ترتیبونو، او د شاخ کولو پوستونو 20، 21 سره مطابقت لري.
د ګلایکان تحلیل د کاربوهایډریټ بانډونو ژورې پیژندنې لپاره عالي وسیله ده 22.دا طریقه د مونوکلونل انټي باډیز (mAbs) کاروي چې د حجرو دیوال ګلایکان کښت ته لارښوونه کوي ترڅو د پیچلي کاربوهایډریټ اړیکې پوه شي.په ټوله نړۍ کې له 250 mAbs څخه ډیر شتون لري چې د مختلف ساکرایډونو په کارولو سره د مختلف خطي او شاخونو اولیګوساکرایډونو پروړاندې ډیزاین شوي.ډیری mAbs په پراخه کچه د نبات د حجرو دیوال جوړښت، جوړښت، او تعدیلاتو مشخص کولو لپاره کارول شوي، ځکه چې د نبات د حجرو ډول، عضوي، عمر، پراختیایي مرحله، او د ودې چاپیریال 25,26 پورې اړه لري د پام وړ توپیرونه شتون لري.په دې وروستیو کې، دا طریقه د نبات او څارویو سیسټمونو کې د ویسیکل نفوس او د ګلیکان ټرانسپورټ کې د دوی اړوند رولونو د پوهیدو لپاره کارول کیږي لکه څنګه چې د فرعي سیلولر مارکرونو، پرمختیایي مرحلو، یا چاپیریال محرکاتو لخوا ټاکل کیږي، او د انزایمیک فعالیت مشخص کول.د ګلایکان او زایلان ځینې مختلف جوړښتونه چې پیژندل شوي دي عبارت دي له pectin (P)، xylan (X)، مانان (M)، xyloglucans (XylG)، مخلوط بانډ ګلوکانس (MLG)، arabinoxylan (ArbX)، galactomannan (GalG)، glucuronic acid-arabinoxylan (arabinooxylan) GA9-Arabinooxylan (arabinooxylan)
په هرصورت، د دې ټولو څیړنیزو هڅو سره سره، یوازې یو څو مطالعاتو د لوړ سولیډ بار (HSL) هایدرولیسس په جریان کې د اولیګوساکرایډ جمع کولو نوعیت باندې تمرکز کړی، پشمول د oligosaccharide خوشې کول، د هایدرولیسس په جریان کې د اولیګومریک چین اوږدوالی بدلون، مختلف ټیټ DP پولیمرونه، او د دوی منحني.توزیع 30,31,32.په عین حال کې، که څه هم د ګلایکان تحلیل د ګلایکان جوړښت د هراړخیز تحلیل لپاره ګټور وسیله ثابته شوې، دا ستونزمنه ده چې د انټي باډي میتودونو په کارولو سره د اوبو محلول ټیټ DP oligosaccharides ارزونه وکړي.کوچني DP oligosaccharides چې مالیکولر وزن یې له 5-10 kDa څخه کم وي د ELISA پلیټونو 33, 34 سره نه تړل کیږي او د انټي باډي اضافه کولو دمخه مینځل کیږي.
دلته، د لومړي ځل لپاره، موږ د مونوکلونل انټي باډي په کارولو سره د ایوډین لیپت شوي پلیټونو په اړه د ELISA ارزونه وښایه، د ګلایکوم تحلیل سره د محلول ریفراکټري اولیګوساکرایډونو لپاره د یو ګام بایوټینیلیشن پروسیجر سره یوځای کول.د ګلایکوم تحلیل لپاره زموږ چلند د MALDI-TOF-MS او GC-MS لخوا د بشپړونکي اولیګوساکرایډ لینکونو تحلیل لخوا تایید شوی و چې د هایډرولیز شوګر ترکیبونو د تری میتیلیسیل (TMS) اخذ کولو په کارولو سره.دا نوښتګر چلند کولی شي په راتلونکي کې د لوړې کچې میتود په توګه رامینځته شي او د بایو میډیکل څیړنو کې پراخه غوښتنلیک ومومي35.
د انزایمونو او انټي باډیزونو د ژباړې وروسته بدلونونه، لکه ګلایکوسیلیشن، د دوی بیولوژیکي فعالیت اغیزه کوي.د مثال په توګه، د سیروم پروټینونو ګلایکوسیلیشن کې بدلونونه د التهابي مفصلونو کې مهم رول لوبوي، او د ګلایکوسیلیشن بدلونونه د تشخیصي مارکر په توګه کارول کیږي 37.په ادبیاتو کې بیلابیل ګلایکان راپور شوي چې په مختلف ناروغیو کې په اسانۍ سره څرګندیږي ، پشمول د معدې او ځیګر اوږدمهاله التهابي ناروغۍ ، ویروس انتانات ، د تخمدان ، سینې او پروستات سرطان 38,39,40.د انټي باډي پراساس ګلایکان ELISA میتودونو په کارولو سره د ګلایکان جوړښت پوهیدل به د پیچلي MS میتودونو کارولو پرته د ناروغۍ تشخیص کې اضافي باور چمتو کړي.
زموږ پخوانۍ مطالعې وښودله چې ضد اولیګوساکرایډونه د پری درملنې او انزیماتیک هایدرولیسس (شکل 1) وروسته غیر هایډرولیز پاتې دي.زموږ په مخکیني خپاره شوي کار کې، موږ د AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) 8 څخه د oligosaccharides جلا کولو لپاره د چارکول جامد پړاو د استخراج یوه فعاله طریقه جوړه کړه.د ابتدايي استخراج او جلا کولو وروسته، oligosaccharides نور د اندازې جلا کولو کروماتګرافي (SEC) لخوا ویشل شوي او د مالیکول وزن په ترتیب سره راټول شوي.د شوګر مونومر او اولیګومرونه چې د مختلف پری درملنې څخه خوشې شوي د شکر ترکیب تحلیل لخوا تحلیل شوي.کله چې د شکرې اولیګومرونو مینځپانګې پرتله کړئ چې د درملنې مختلف میتودونو لخوا ترلاسه شوي ، د ضد اولیګوساکرایډونو شتون مونوساکرایډونو ته د بایوماس بدلولو کې یوه عامه ستونزه ده او کولی شي د بورې حاصل لږترلږه 10-15٪ او حتی تر 18٪ پورې کم کړي.امریکادا طریقه د oligosaccharide برخو د نور لوی پیمانه تولید لپاره کارول کیږي.په دې کار کې د oligosaccharides ځانګړتیا لپاره د تجربوي موادو په توګه د مختلفو مالیکولر وزنونو سره پایله شوې ACH او د هغې وروسته برخې کارول شوي.
د مخکینۍ درملنې او انزیماتیک هایدرولیسس وروسته، دوامداره اولیګوساکرایډونه غیر هایدرولیس پاتې شول.دلته (A) د oligosaccharides د جلا کولو طریقه ده په کوم کې چې oligosaccharides د AFEX-pretreated corn stover hydrolyzate (ACSH) څخه جلا شوي د فعال کاربن او ډیاتومیسیوس ځمکې د بسته بندۍ په کارولو سره؛(ب) د oligosaccharides د جلا کولو طریقه.oligosaccharides نور د اندازې جلا کولو کروماتګرافي (SEC) په واسطه جلا شوي؛(C) Saccharide monomers او oligomers چې د مختلفو pretreatments څخه خوشې شوي (د خړوب شوي اسید: DA، ionic مایع: IL او AFEX).د انزیماتیک هایدرولیسیز شرایط: د 25٪ (w/w) لوړ سالډ بار کول (تقریبا 8٪ glucan loading)، 96 hour hydrolysis، 20 mg/g تجارتي انزایم لوډ کول (Ctec2:Htec2:MP-2:1:1 تناسب) او (D) د شکرې او د شکرې څخه خوشې شوي او د شکرې څخه د 20 ملی ګرامه 2:1:1 نسبت EX مخکې درملنه شوي جوار سټور (ACS).
د ګلایکان تحلیل د جامد بایوماس پاتې شونو څخه جلا شوي استخراج کې د ګلایکان د جامع جوړښتي تحلیل لپاره ګټور وسیله ثابت شوې.په هرصورت، په اوبو کې محلول کېدونکي ساکرایډونه د دې دودیز میتود په کارولو سره کم ښودل شوي41 ځکه چې د ټیټ مالیکول وزن اولیګوساکرایډونه د ELISA پلیټونو کې متحرک کول ستونزمن دي او د انټي باډي اضافه کولو دمخه مینځل کیږي.له همدې امله، د انټي باډي د پابندۍ او ځانګړتیا لپاره، د یو ګام بایوټینیلیشن طریقه کارول شوې وه ترڅو د avidin-coated ELISA پلیټونو کې محلول شوي، غیر مطابقت لرونکي اولیګوساکرایډونه کوټ کړي.دا طریقه زموږ د مخکینۍ تولید شوي ACSH او د هغې د مالیکولر وزن (یا د پولیمرائزیشن درجې، DP) پر بنسټ د یوې برخې په کارولو سره ازموینه شوې.یو ګام بایوټینیلیشن د کاربوهایډریټ کمولو پای ته د بایوټین-LC-hydrazide په اضافه کولو سره د oligosaccharide پابند تړاو زیاتولو لپاره کارول شوی و (انځور 2).په حل کې، د کمولو په پای کې د hemiacetal ګروپ د بایوټین-LC-hydrazide د هایدرازایډ ګروپ سره غبرګون کوي ​​ترڅو د هایدرازون بانډ جوړ کړي.د کمولو اجنټ NaCNBH3 په شتون کې، د هایدروزون بانډ یو باثباته بایوټینیل شوي پای محصول ته کم شوی.د بورې کمولو پای کې ترمیم سره ، د ELISA پلیټونو ته د ټیټ DP اولیګوساکرایډونو پابند کول ممکن شو ، او زموږ په مطالعې کې دا د ګلیکان په نښه شوي mAbs په کارولو سره د ایویډین لیپت شوي پلیټونو کې ترسره شوي.
د بایوټینیل شوي اولیګوساکرایډونو لپاره د ELISA پر بنسټ د مونوکلونل انټي باډي سکرینینګ.دلته (A) د oligosaccharides ګډ بایوټینیلیشن او ورپسې د ELISA سکرینینګ د ګلیکان په نښه شوي mAbs سره په NeutrAvidin لیپت شوي پلیټونو کې او (B) د عکس العمل محصولاتو بایوټینیلیشن لپاره یو ګام پروسیجر ښیې.
د oligosaccharide-conjugated انټي باډونو سره د Avidin-coated plates بیا په لومړني او ثانوي انټي باډيونو کې اضافه شوي او په رڼا او د وخت حساس منځني مینځل شوي.وروسته له دې چې د انټي باډي بائنډنګ بشپړ شي، د TMB سبسټریټ اضافه کړئ ترڅو پلیټ انکیوب کړي.غبرګون په پای کې د سلفوریک اسید سره ودرول شو.انکیوب شوي پلیټونه د ELISA ریډر په کارولو سره تحلیل شوي ترڅو د هر انټي باډي پابند ځواک وټاکي ترڅو د انټي باډي ځانګړي کراس لینکینګ کشف کړي.د تجربې د جزیاتو او پیرامیټونو لپاره، اړونده برخه "توکي او میتودونه" وګورئ.
موږ د ځانګړي غوښتنلیکونو لپاره د دې نوي رامینځته شوي میتود ګټورتیا په ACSH کې موجود محلول شوي اولیګوساکرایډونو او همدارنګه په خام او پاک شوي اولیګوساکرایډونو کې د lignocellulosic hydrolysates څخه جلا شوي تحلیلونو مشخص کولو سره څرګندوو.لکه څنګه چې په 3 شکل کې ښودل شوي، په ACSH کې د بایواسیلیټ ګلایکوم ارزونې میتودونو په کارولو سره پیژندل شوي ترټولو عام ایپیټوپ بدل شوي xylans معمولا uronic (U) یا methyluronic (MeU) او pectic arabinogalactans دي.ډیری یې زموږ په تیرو مطالعاتو کې د غیر هایډرولیز شوي سولډونو (UHS) 43 ګلایکان تحلیل کې هم موندل شوي.
د مونوکلونل انټي باډي په کارولو سره د recalcitrant oligosaccharide epitopes کشف کول د حجرو دیوال ګلایکان ته لارښود شوی."بې طرفه" برخه د ACN برخه ده او "تیزاب" برخه د FA برخه ده.د تودوخې په نقشه کې روښانه سورونه د لوړې برخې مینځپانګې په ګوته کوي ، او روښانه بلیوز یو خالي شالید په ګوته کوي.په پیمانه کې د رنګ ارزښتونه د N=2 فورمولونو لپاره د خام OD ارزښتونو پراساس دي.د انټي باډیز لخوا پیژندل شوي اصلي اپیټوپونه په ښي خوا کې ښودل شوي.
دا غیر سیلولوز جوړښتونه نشي کولی د ازمول شوي سوداګریز انزایمونو مخلوط کې د خورا عام سیلولوزونو او هیمیسیلولازونو لخوا پاک شي ، کوم چې ترټولو عام کارول شوي تجارتي انزایمونه شامل دي.له همدې امله، د دوی د هایدرولیسس لپاره نوي مرستندویه انزایمونه اړین دي.د اړتیا وړ غیر سیلولوز لاسرسي انزایمونو پرته ، دا غیر سیلولوز بانډونه مونوساکرایډونو ته د بشپړ بدلون مخه نیسي ، حتی که د دوی اصلي شوګر پولیمر په پراخه کچه په لنډو ټوټو کې هایډرولیز شوي وي او د سوداګریزو انزایمونو ترکیبونو په کارولو سره تحلیل شوي وي.
د سیګنال توزیع او د هغې د پابندۍ ځواک نورې مطالعې ښودلې چې د پابندۍ ایپیټوپونه د لوړ DP شوګر برخو کې ټیټ وو (A, B, C, DP تر 20+ پورې) د ټیټ DP برخو (D, E, F, DP) په dimers کې) (انځور 1).د اسید ټوټې په غیر سیلولوز ایپیټوپس کې د غیر جانبدار برخو په پرتله خورا عام دي.دا پدیده د هغه نمونې سره سمون لري چې زموږ په تیرو څیړنو کې لیدل شوي، چیرې چې د لوړ DP او تیزاب مایعات د انزیماتیک هایدرولیسس په وړاندې ډیر مقاومت درلود.له همدې امله، د غیر سیلولوز ګلیکان ایپیټوپس او د U او MeU بدیلونو شتون د اولیګوساکرایډونو په ثبات کې خورا مرسته کولی شي.دا باید په پام کې ونیول شي چې د ټيټ DP اولیګوساکرایډونو لپاره د پابندۍ او کشف موثریت ستونزه کیدی شي ، په ځانګړي توګه که چیرې epitope dimeric یا trimeric oligosaccharides وي.دا د مختلف اوږدوالي سوداګریز oligosaccharides په کارولو سره ازمول کیدی شي، هر یو یوازې یو epitope لري چې د ځانګړي mAb سره تړاو لري.
په دې توګه، د جوړښت ځانګړي انټي باډونو کارول د بیاکتنې بانډونو ځانګړي ډولونه په ګوته کړل.د استعمال شوي انټي باډي ډول پورې اړه لري، د مناسب ligation نمونه، او د سیګنال ځواک چې دا تولیدوي (ډیر او لږ تر لږه ډیر)، نوي انزایمونه پیژندل کیدی شي او د انزایم مخلوط ته نیمه کمیتي اضافه شي ترڅو د بشپړ ګلایکو بدلون لپاره.د مثال په توګه د ACSH oligosaccharides تحلیل په پام کې نیولو سره، موږ کولی شو د هر بایوماس موادو لپاره د ګلایکان بانډ ډیټابیس جوړ کړو.دلته باید یادونه وشي چې د انټي باډیز مختلف تړاو باید په پام کې ونیول شي، او که د دوی تړاو معلوم نه وي، دا به د مختلف انټي باډونو سیګنالونو پرتله کولو کې ځینې ستونزې رامینځته کړي.سربیره پردې ، د ګلایکان بانډونو پرتله کول ممکن د ورته انټي باډي لپاره د نمونو ترمینځ غوره کار وکړي.دا ضد بانډونه بیا د CAZyme ډیټابیس سره تړل کیدی شي، له کوم څخه چې موږ کولی شو انزایمونه وپیژنو، امیدوار انزایمونه وټاکو او د بانډ ماتولو انزایمونو لپاره ازموینه وکړو، یا مایکروبیل سیسټمونه رامینځته کړو ترڅو دا انزایمونه په بایو ریفینریز کې د کارولو لپاره څرګند کړي.
د دې ارزولو لپاره چې څنګه معافیتي میتودونه د ټیټ مالیکولر وزن اولیګوساکرایډونو مشخص کولو لپاره بدیل میتودونه بشپړوي چې په lignocellulosic hydrolysates کې شتون لري، موږ MALDI (Fig. 4, S1-S8) او د TMS څخه اخیستل شوي ساکرایډونو تحلیل په ورته پینل کې د GC-MS پر بنسټ ترسره کړ.MALDI د پرتله کولو لپاره کارول کیږي چې ایا د oligosaccharide مالیکولونو ډله ایز ویش د ټاکل شوي جوړښت سره سمون لري.په انځر.4 د ACN-A او ACN-B بې طرفه برخو MC ښیي.د ACN-A تحلیل د DP 4-8 (Fig. 4) څخه تر DP 22 (Fig. S1) پورې د پینټوز شکر یو لړ تایید کړی، چې وزن یې د MeU-xylan oligosaccharides سره مطابقت لري.د ACN-B تحلیل د DP 8-15 سره د پینټوز او ګلوکوکسیلان لړۍ تایید کړه.په اضافي موادو کې لکه S3 شکل کې، د FA-C تیزابي moiety ډله ایز توزیع نقشه د (Me)U د 8-15 د DP سره د پینټوز شکر یو لړ ښیي چې د ELISA-based mAb سکرینینګ کې موندل شوي بدیل شوي xylans سره مطابقت لري.Epitopes یو شان دي.
MALDI-MS د محلول وړ غیر موافق اولیګوساکرایډونو سپیکٹرم ACS کې شتون لري.دلته، (A) ACN-A د ټیټ وزن رینج برخې چې میتیل شوي یورونیک اسید لري (DP 4-8) د ګلوکوروکسیلان اولیګوساکرایډونو ځای په ځای شوي او (B) ACN-B xylan او میتیل شوي یورونیک اسید اولیګوساکرایډونه د ګلوکوروکسلان (DP 8-15) سره ځای په ځای شوي.
د ریفراکټري اولیګوساکرایډونو د ګلایکان پاتې شونو ترکیب تحلیل.دلته (A) د مختلف oligosaccharide برخو TMS saccharide ترکیب د GC-MS تحلیل په کارولو سره ترلاسه شوی.(B) د مختلفو TMS څخه ترلاسه شوي شکر جوړښتونه چې په oligosaccharides کې شتون لري.ACN – acetonitrile fraction چې neutral oligosaccharides لري او FA – فیرولیک اسید فرکشن چې اسید oligosaccharides لري.
بله په زړه پورې پایله د oligosaccharide برخې د LC-MS تحلیل څخه اخیستل شوې، لکه څنګه چې په شکل S9 کې ښودل شوي (میتودونه په بریښنایی تکمیلي موادو کې لیدل کیدی شي).د هیکسوز او -OAc ګروپونو ټوټې په مکرر ډول د ACN-B برخې د ligation په جریان کې لیدل شوي.دا موندنه نه یوازې د ګلایکوم او MALDI-TOF تحلیلونو کې لیدل شوي ټوټې تاییدوي، بلکې په پریټریټ شوي لیګنوسیلوزیک بایوماس کې د احتمالي کاربوهایډریټ مشتقاتو په اړه نوي معلومات هم وړاندې کوي.
موږ د TMS شوګر مشتق کولو په کارولو سره د اولیګوساکرایډ برخې د شکر ترکیب هم تحلیل کړ.د GC-MS په کارولو سره، موږ د عصبي (غیر مشتق) او تیزابي شکرونو (GluA او GalA) ترکیب د oligosaccharide جزییات (انځور 5) کې مشخص کړ.ګلوکورونیک اسید په تیزابي اجزاو C او D کې موندل کیږي ، پداسې حال کې چې ګلیکټورونیک اسید په تیزابي اجزاو A او B کې موندل کیږي چې دواړه د تیزابي شکرو لوړ DP اجزا دي.دا پایلې نه یوازې زموږ د ELISA او MALDI ډیټا تاییدوي ، بلکه زموږ د oligosaccharide جمع کولو پخوانیو مطالعاتو سره هم مطابقت لري.له همدې امله، موږ باور لرو چې عصري معافیتي میتودونه د oligosaccharides بایوټینیلیشن او ورپسې د ELISA سکرینینګ په کارولو سره په بیالبیلو بیولوژیکي نمونو کې د حل کېدونکي ریکالیسټرانټ اولیګوساکرایډونو کشف کولو لپاره کافي دي.
څرنګه چې د ELISA-based mAb سکرینینګ میتودونه د ډیری مختلف میتودونو لخوا تایید شوي، موږ غوښتل د دې نوي کمیتي میتود احتمال نور هم وپلټو.دوه سوداګریز oligosaccharides، xylohexasaccharide oligosaccharide (XHE) او 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose (A2XX)، د حجرو دیوال ګلایکان په نښه کولو لپاره د نوي mAb طریقې په کارولو سره اخیستل شوي او ازمول شوي.شکل 6 د بایوټینیل شوي پابند سیګنال او د oligosaccharide غلظت د ننوتلو غلظت تر مینځ یو خطي اړیکه ښیې، د احتمالي Langmuir جذب ماډل وړاندیز کوي.د mAbs په منځ کې، CCRC-M137، CCRC-M138، CCRC-M147، CCRC-M148، او CCRC-M151 د XHE سره تړاو لري، او CCRC-M108، CCRC-M109، او LM11 د A2XX سره د 01m څخه تر 01m پورې تړاو لري.د تجربې په جریان کې د انټي باډیز محدود شتون له امله، د هر اولیګوساکرایډ غلظت سره محدودې تجربې ترسره شوې.دلته باید یادونه وشي چې ځینې انټي باډي د سبسټریټ په توګه ورته اولیګوساکرایډ ته خورا مختلف عکس العمل ښیې ، احتمال لري ځکه چې دوی یو څه مختلف ایپیټوپونو پورې تړلي او کولی شي خورا مختلف پابند تړاو ولري.د دقیق پیژندنې میکانیزمونه او اغیزې به خورا پیچلې وي کله چې د MAb نوې طریقه په اصلي نمونو کې پلي کیږي.
دوه سوداګریز اولیګوساکرایډونه د مختلف ګلیکان - نښه کولو mAbs کشف کولو حد ټاکلو لپاره کارول شوي.دلته، د oligosaccharide غلظت د log غلظت سره خطي ارتباط د (A) XHE د mAb سره او (B) A2XX د mAb سره د Langmuir جذب نمونې په ګوته کوي.اړونده نسخې د سوداګریزو اولیګوساکرایډونو جوړښتونه په ګوته کوي چې په ارزونه کې د سبسټریټ په توګه کارول کیږي.
د ګلایکان په نښه شوي مونوکلونل انټي باډیز کارول (د ګلیکوکومیک تحلیل یا د ELISA-based mAb سکرینینګ) د ډیری لوی حجرو دیوال ګلایکان د ژورې ځانګړتیا لپاره قوي وسیله ده چې د نبات بایوماس جوړوي.په هرصورت، د کلاسیک ګلایکان تحلیل یوازې د لوی حجرو دیوال ګلایکان ځانګړتیاوي، ځکه چې ډیری اولیګوساکرایډونه په ELISA پلیټونو کې په اغیزمنه توګه متحرک ندي.په دې څیړنه کې، د AFEX-pretreated corn stover په انزایمیک ډول د لوړ جامد محتوياتو سره هایډرولیز شوی و.د شکر تحلیل په هایدروولیزیټ کې د بیاکتنې حجرو دیوال کاربوهایډریټ ترکیب ټاکلو لپاره کارول شوی و.په هرصورت، په هایدرولیسیټونو کې د کوچنیو oligosaccharides mAb تحلیل کم اټکل شوی، او د ELISA پلیټونو کې د oligosaccharides اغیزمن کولو لپاره اضافي وسایلو ته اړتیا لیدل کیږي.
موږ دلته د oligosaccharide بایوټینیلیشن سره یوځای کولو سره د MAb سکرینینګ لپاره د نوي او موثر اولیګوساکرایډ متحرک کولو میتود راپور ورکوو چې په NeutrAvidin ™ لیپت شوي پلیټونو کې د ELISA سکرینینګ تعقیبوي.غیر متحرک بایوټینیل شوي اولیګوساکرایډونه د انټي باډي لپاره کافي تړاو وښود ترڅو د بیاکتنې اولیګوساکرایډونو ګړندي او مؤثره کشف وړ کړي.د ډله ایز سپیکرومیټري پراساس د دې ضد اولیګوساکرایډونو ترکیب تحلیل د معافیت سکرینینګ ته د دې نوې تګلارې پایلې تایید کړې.په دې توګه، دا څیړنې ښیي چې د oligosaccharides بایوټینیلیشن او د ELISA سکرینینګ ترکیب د ګلیکان په نښه شوي مونوکلونل انټي باډیز کې د کراس لینکس کشف کولو لپاره کارول کیدی شي او په نورو بایو کیمیکل مطالعاتو کې په پراخه کچه کارول کیدی شي چې د oligosaccharides جوړښت مشخص کوي.
دا د بایوټین پر بنسټ د ګلیکان پروفایل کولو میتود لومړی راپور دی چې د نبات بایوماس کې د محلول شوي اولیګوساکرایډونو د بیاکتنې کاربوهایډریټ بانډونو تحقیق کولو وړتیا لري.دا د دې په پوهیدو کې مرسته کوي چې ولې د بایوماس ځینې برخې دومره سختې دي کله چې د بایو تیلو تولید ته راځي.دا میتود د ګلایکوم تحلیل میتودونو کې یو مهم تشه ډکوي او د نبات اولیګوساکرایډونو هاخوا پراخه فرعي سټراټونو ته خپل غوښتنلیک غزوي.په راتلونکي کې، موږ ممکن د بایوټینیلیشن لپاره روبوټکس وکاروو او هغه طریقه وکاروو چې موږ د ELISA په کارولو سره د نمونو د لوړې کچې تحلیل لپاره رامینځته کړي.
د جوارو ډډ (CS) د Pioneer 33A14 هایبرډ تخمونو څخه کرل شوي په 2010 کې د رې، کولوراډو کې د کریمر فارمونو څخه راټول شوي.د ځمکې د مالک په اجازې سره، دا بایوماس د څیړنې لپاره کارول کیدی شي. نمونې د خونې په تودوخې کې د زپ لاک کڅوړو کې د 6٪ رطوبت څخه په وچه کې زیرمه شوي. نمونې د خونې په تودوخې کې د زپ لاک کڅوړو کې د 6٪ رطوبت څخه په وچه کې زیرمه شوي. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре. نمونې د خونې په تودوخې کې په زپ شوي کڅوړو کې د <6٪ رطوبت سره وچې زیرمه شوي.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中.样品在室温下以干燥<6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. نمونې په زپ کڅوړو کې د خونې د حرارت درجه کې د 6٪ څخه کم رطوبت سره زیرمه کیږي.څیړنه د محلي او ملي لارښوونو سره مطابقت لري.جوړښتي تحلیل د NREL پروتوکول په کارولو سره ترسره شو.په ترکیب کې 31.4٪ ګلوکان، 18.7٪ xylan، 3.3٪ arabinan، 1.2٪ galactan، 2.2٪ acetyl، 14.3٪ lignin، 1.7٪ پروټین او 13. 4٪ ایش شتون درلود.
Cellic® CTec2 (138 mg پروټین/ml, lot VCNI 0001) د نووزیمز (Franklinton, NC, USA) څخه د سیلولیز، β-glucosidase او Cellic® HTec2 (157 mg پروټین/ml، lot VHN00001) یو پیچلی مخلوط دی.Multifect Pectinase® (72 mg پروټین/mL)، د پیکټین تخریب کونکي انزایمونو پیچلي ترکیب، د DuPont صنعتي بایو ساینس (Palo Alto, CA, USA) لخوا مرسته شوې.د انزایم پروتین غلظت د Kjeldahl نایتروجن تحلیل (AOAC میتود 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, USA) په کارولو سره د پروټین مینځپانګې اټکل کولو (او د غیر پروټین نایټروجن ونډې کمولو) لخوا ټاکل شوي.Diatomaceous earth 545 د EMD ملی پور (Billerica, MA) څخه اخیستل شوی.فعال کاربن (DARCO، 100 میش گرینول)، Avicel (PH-101)، beech xylan، او نور ټول کیمیاوي مواد د سیګما-الډریچ (سینټ لوئس، MO) څخه اخیستل شوي.
د AFEX پری درملنه په GLBRC (د بایوماس تبادلې څیړنې لابراتوار، MSU، Lansing، MI، USA) کې ترسره شوې.مخکې درملنه د 15 دقیقو لپاره په 140 درجې سانتي ګراد کې ترسره شوه.46 د استوګنې وخت په 1:1 تناسب کې د انهایډروس امونیا او بایوماس سره په 60٪ (w/w) کې د سټینلیس سټیل بنچټاپ بیچ ریکتور کې بار کول (Parr Instruments Company).دا 30 دقیقې وخت نیسي.ریکټر 140 ° C ته راوړل شو او امونیا په چټکۍ سره خوشې شوه، بایو ماس ته اجازه ورکوي چې ژر تر ژره د خونې تودوخې ته راستانه شي.د AFEX دمخه درملنه شوي جوار سټور (ACS) ترکیب د جوارو غیر درملنې شوي جوار (UT-CS) سره ورته و.
لوړ جامد ACSH 25% (w/w) (نږدې 8% dextran loading) د oligosaccharides د لوی تولید لپاره د پیل شوي موادو په توګه چمتو شوي.د ACS انزیماتیک هایدرولیسس د تجارتي انزایمونو مخلوط په کارولو سره ترسره شو چې پکې د Cellic® Ctec2 10 mg پروټین/g ګلوکان (په تیاره شوي بایوماس کې)، Htec2 (Novozymes، Franklinton, NC)، 5 mg protein/g glucan، او Multifect Pectinase (Gencor Inc, USA).).)، 5 mg پروټین/g dextran.انزیماتیک هایدرولیسس په 5 لیټره بایوریکټر کې د 3 لیټرو ، pH 4.8 ، 50 درجې C او 250 rpm کاري حجم سره ترسره شو.د 96 ساعتونو لپاره د هایدرولیسس وروسته، هایدرولیسیټ د 6000 rpm سره د 30 دقیقو لپاره او بیا په 14000 rpm کې د 30 دقیقو لپاره د سینټرفیوګریشن لخوا راټول شوی ترڅو غیر هایډرولیز شوي جامدونه لرې کړي.هایدرولیسیټ بیا د 0.22 ملی میتر فلټر بیکر له لارې تعقیم فلټریشن سره مخ شو.فلټر شوی هایدرولیسیټ په 4 درجو سانتي ګراد کې په جراثیمي بوتلونو کې زیرمه شوی و او بیا په کاربن کې ټوټه ټوټه شوی.
د NREL لابراتوار تحلیلي پروسیجرونو سره سم د استخراج پر بنسټ د بایوماس نمونو ترکیب تحلیل: د ترکیب تحلیل لپاره د نمونو چمتو کول (NREL/TP-510-42620) او په بایوماس کې د ساختماني کاربوهایډریټ او لیګنین ټاکل (NREL/TP-510) - 4718.
د هایدرولیسیټ جریان د اولیګوساکریډ تحلیل د آټوکلیو پراساس اسید هایدرولیسس میتود په کارولو سره د 2 ملی لیتر پیمانه ترسره شوی.د هایدرولیسیټ نمونه د 69.7 µl 72٪ سلفوریک اسید سره په 10 ملی لیتر سکرو کیپ کلچر ټیوب کې مخلوط کړئ او په 121 سانتي مترو کې په بینچ ټاپ کې د 1 ساعت لپاره سینګار کړئ ، په یخ کې یخ کړئ او د لوړ فعالیت مایع کروماتګرافي (HPLC) شیشې کې فلټر کړئ.د oligosaccharides غلظت د اسید-هایډرولیز شوي نمونې کې د بورې ټول غلظت څخه په غیر هایدرولیس شوي نمونه کې د مونوساکرایډونو غلظت کمولو سره ټاکل شوی.
ګلوکوز، xylose، او arabinose غلظت په تیزاب هایدرولیسډ بایوماس کې د شیمادزو HPLC سیسټم په کارولو سره تحلیل شوي چې د بایو-راډ امینیکس HPX-87H کالم کې د آټوسیمپلر ، کالم هیټر ، اسوکراټیک پمپ ، او انعکاس شاخص کشف کونکي سره مجهز شوي.کالم په 50 سانتي ګراد کې ساتل شوی او په اوبو کې د 0.6 ml/min 5 mM H2SO4 سره جلا شوی.جریان
د هایدرولیسیټ سپرناټینټ د مونومر او اولیګوساکرایډ مینځپانګې لپاره تحلیل او تحلیل شوی.مونومیریک شکرونه چې د انزیماتیک هایدرولیسز وروسته ترلاسه شوي د HPLC لخوا د بایو راډ (Hercules, CA) Aminex HPX-87P کالم او د ایش ساتونکي کالم سره مجهز شوي تحلیل شوي.د کالم تودوخه په 80 ° C کې ساتل شوې وه، اوبه د ګرځنده پړاو په توګه د 0.6 ml/min د جریان اندازه سره کارول کیده.Oligosaccharides په 121 ° C کې د ډیلیوټ اسید کې د هایدرولیسس لخوا په ریف کې بیان شوي میتودونو سره سم ټاکل شوي.۴۱، ۴۸، ۴۹.
د ساکرایډ تحلیل په خام، د AFEX دمخه درملنه شوي او ټولو غیر هایدرولیس شوي بایوماس پاتې شونو (پشمول د سیریل حجرو دیوال استخراج او د دوی د mAb سکرینینګ تولید) باندې د مخکینۍ بیان شوي طرزالعمل 27, 43, 50, 51 په کارولو سره ترسره شو.د ګلایکوم تحلیل لپاره، د نبات د حجرو د دیوال موادو الکول نه حل کیدونکي پاتې شونه د بایوماس له پاتې شونو څخه چمتو شوي او د مخ په زیاتیدونکي تیریدونکي ریجنټونو لکه امونیم آکسالیٹ (50 mm)، سوډیم کاربونیټ (50 mM او 0.5% w/v)، CON سره د سیریل استخراج تابع دي.(1M او 4M، دواړه د 1% w/v سوډیم بورهایډرایډ سره) او اسید کلورایټ لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 52,53.بیا استخراجونه د MAb50s د پیچلي پینل په وړاندې د ELISA تابع شوي چې د حجرو دیوال ګلایکان ته لارښود شوي، او د mAb پابند غبرګونونه د تودوخې نقشې په توګه وړاندې شوي.mAbs د نبات حجرو دیوال ګلایکان په نښه کول د لابراتوار ذخیره (CCRC، JIM او MAC لړۍ) څخه اخیستل شوي.
د oligosaccharides یو ګام بایوټینیلیشن.د بایوټین-LC-hydrazide سره د کاربوهایډریټ ترکیب د لاندې پروسیجر په کارولو سره ترسره شو.Biotin-LC-hydrazide (4.6 mg/12 μmol) په ډیمیتیل سلفوکسایډ (DMSO, 70 μl) کې د 1 دقیقې لپاره په 65 درجې سانتي مترو کې د قوي محرک او تودوخې په واسطه حل شوي.ګلیشییل اسیتیک اسید (30 µl) اضافه شوی او مخلوط په سوډیم سیانوبوروهایډرایډ (6.4 mg/100 µmol) کې اچول شوی او د 1 دقیقې لپاره په 65 درجې C. تودوخې وروسته په بشپړ ډول منحل شوی.بیا، له 5 څخه تر 8 μl پورې د عکس العمل مخلوط په وچ شوي اولیګوساکرایډ (1-100 nmol) کې اضافه شوي ترڅو د کمولو پای کې د لیبل 10 یا ډیر دالر ترلاسه کړي.عکس العمل په 65 ° C کې د 2 ساعتونو لپاره ترسره شو ، وروسته له هغه چې نمونې سمدلاسه پاکې شوې.هیڅ سوډیم سیانوبوروهایډرایډ د لیبل کولو تجربو کې پرته له کمښت څخه کار اخیستل شوی و، او نمونې د 2.5 ساعتونو لپاره په 65 درجې C. کې عکس العمل ښودل شوي.
د ELISA پوښل او د بایوټینیل شوي اولیګوساکرایډ نمونې مینځل.25 μl بایوټینیل شوي نمونې (د هرې متمرکزې نمونې 100 μl د 0.1 M Tris بفر محلول (TBS) په 5 ملی لیتر کې حل شوي) د ایویډین لیپت شوي پلیټ هرې څاه ته اضافه شوي.د کنټرول څاګانې په 0.1 M TBS کې د 10 μg/ml په غلظت کې د 50 μl بایوټین سره پوښل شوي.Deionized اوبه د خالي اندازه کولو لپاره د پوښ په توګه کارول کیده.ټابلیټ په تیاره کې د خونې په حرارت کې د 2 ساعتونو لپاره کیښودل شو.پلیټ 3 ځله د 0.1% سکم شوي شیدو سره په 0.1 M TBS کې د پروګرام نمبر په کارولو سره وینځئ.د ګرینیر فلیټ 3A لپاره 11.
د لومړني انټي باډي اضافه کول او مینځل.هر څاه ته 40 µl لومړني انټي باډي اضافه کړئ.مایکروپلیټ د 1 ساعت لپاره د خونې په تودوخې کې په تیاره کې وینځئ.بیا پلیټونه د ګرینیر فلیټ 3A لپاره د واش پروګرام #11 په کارولو سره په 0.1M TBS کې د 0.1% شیدو سره 3 ځله مینځل شوي.
ثانوي انټي باډي اضافه کړئ او وینځئ.هر څاه ته 50 µl د موږک / موږک ثانوي انټي باډي (1:5000 په 0.1% شیدو کې په 0.1 M TBS کې مینځل شوي) اضافه کړئ.مایکروپلیټ د 1 ساعت لپاره د خونې په تودوخې کې په تیاره کې وینځئ.مایکرو پلیټونه بیا د ګرینیر فلیټ 5A پلیټ واش پروګرام #12 په کارولو سره په 0.1 M TBS کې 5 ځله د 0.1% شیدو سره مینځل شوي.
د سبسټریټ اضافه کول.50 µl د 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) بیس سبسټریټ ته اضافه کړئ (د بفر 2 څاڅکي، د TMB 3 څاڅکي، 2 څاڅکي هایدروجن پیرو اکسایډ 15 ملی لیتر ډیونیز شوي اوبو ته اضافه کولو سره).د TMB سبسټریټ چمتو کړئ.او د استعمال څخه مخکې vortex).مایکروپلیټ د خونې په حرارت درجه کې د 30 دقیقو لپاره وخورئ.په تیاره کې.
ګام بشپړ کړئ او ټابلیټ ولولئ.هر څاه ته 50 µl 1 N سلفوریک اسید اضافه کړئ او د ELISA ریډر په کارولو سره د 450 څخه تر 655 nm پورې جذب ثبت کړئ.
د دې تحلیلونو 1 mg/ml محلول په deionized اوبو کې چمتو کړئ: arabinose، rhamnose، Fucose، xylose، galacturonic acid (GalA)، ګلوکورونیک اسید (GlcA)، ماننوز، ګلوکوز، ګیلکټوز، لیکتوز، N-acetylmanosamine (mantyNAgluace-Nalcose)،(glcNAc)، N-acetylgalactosamine (galNAc)، inositol (داخلي معیاري).دوه معیارونه د 1 mg/mL شکر محلولونو په اضافه کولو سره چمتو شوي چې په 1 جدول کې ښودل شوي. نمونې منجمد شوي او په -80 ° C کې لیوفیلیز شوي دي تر هغه چې ټولې اوبه لرې شي (معمولا شاوخوا 12-18 ساعته).
د 100-500 µg نمونه اضافه کړئ ترڅو د کیپ ټیوب پیچل په تحلیلي توازن کې واچوئ.اضافه شوي مقدار ثبت کړئ.دا غوره ده چې نمونه د محلول په ځانګړي غلظت کې حل کړئ او په تیوب کې یې د مایع الکوت په توګه اضافه کړئ.د هر نمونې ټیوب لپاره د داخلي معیار په توګه 20 μl 1 mg/ml inositol وکاروئ.د داخلي معیار مقدار چې نمونې ته اضافه شوي باید ورته وي د داخلي معیار مقدار چې په معیاري ټیوب کې اضافه شوي.
8 ملی لیتر انهایډروس میتانول د سکرو کیپ شیش ته اضافه کړئ.بیا د 4 ملی لیتر 3 N. میتانولیک HCl محلول، پوښل شوی او ویښ شوی.دا پروسه اوبه نه کاروي.
500 µl د 1 M HCl میتانول محلول د oligosaccharide نمونو او معیاري TMS ټیوبونو کې اضافه کړئ.نمونې د شپې (168 ساعته) په 80 درجې سانتي ګراد کې په حرارتي بلاک کې سینګار شوي.د میتانولوسیس محصول د خونې په حرارت کې د وچولو څو ځله په کارولو سره وچ کړئ.200 μl MeOH اضافه کړئ او بیا وچ کړئ.دا پروسه دوه ځله تکرار کیږي.200 µl میتانول، 100 µl pyridine او 100 µl acetic anhydride نمونې ته اضافه کړئ او ښه مخلوط کړئ.نمونې د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره مینځل شوي.او وچ شوی.200 μl میتانول اضافه کړئ او بیا وچ کړئ.
200 μl Tri-Sil اضافه کړئ او د 20 دقیقو لپاره تودوخه ټیوب ګرم کړئ.80 ° C، بیا د خونې د حرارت درجه ته یخ شوی.د وچولو څو ځله وکاروئ ترڅو نمونه نوره هم وچه کړئ تر څو نږدې 50 μl حجم ته.دا مهمه ده چې یادونه وکړو چې موږ اجازه نه ورکوو چې نمونې په بشپړه توګه وچې شي.
2 ملی لیتر هیکسین اضافه کړئ او د ورټیکس کولو په واسطه ښه مخلوط کړئ.د 5-3/4 انچ قطر پایپټ په سر کې د شیشې وړۍ دننه کولو سره د پاسچر پایپټ (5-8 ملي میتر) لارښوونې د شیشې وړۍ سره ډک کړئ.نمونې د 2 دقیقو لپاره په 3000 ګرامه کې سینټرفیوج شوي.هر ډول نه منحل کیدونکي پاتې شونه تیریږي.نمونه 100-150 μl ته وچ کړئ.تقریبا 1 μl حجم په GC-MS کې د 80 ° C په لومړني تودوخې او د 2.0 دقیقو په لومړني وخت کې داخل شو (جدول 2).